Роль доменной структуры, ко-регуляторов и мишеней транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS в контроле развития бобово-ризобиального симбиоза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Долгих Александра Вячеславовна

• Долгих Александра Вячеславовна
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Долгих Александра Вячеславовна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Бобовые растения как важный компонент экосистемы, обеспечивающий биологическую фиксацию азота

1.2. Молекулярные механизмы узнавания партнеров по симбиозу

1.3. Развитие ризобиальной инфекции и регуляция формирования инфекционных нитей

1.4. Формирование симбиосом и дифференцировка бактерий в азотфиксирующие бактериоиды

1.5. Механизмы контроля органогенеза симбиотических клубеньков у бобовых растений

1.6. Фитогормональная регуляция развития азотфиксирующих клубеньков у бобовых растений

1.6.1. Цитокинины

1.6.2. Ауксины

1.6.3. Гиббереллины

1.6.4. Рецепция гиббереллинов и белки DELLA

1.6.5. Другие фитогормоны, участвующие в регуляции бобово-ризобиального симбиоза

1.7. Транскрипционный фактор IPD3/CYCLOPS

1.7.1. Структурная организация белка IPD3/CYCLOPS и его гомологи

1.7.2. Фенотипические изменения у мутантов бобовых грйЗ! сус1ор81 яушЗЗ

1.7.3. Фенотипические характеристики мутантов гороха по гену яутЗЗ

1.7.4. Мутанты М. №ипсаШ1а и Ь. ]аротсш по генам ipd3/cyclops

1.7.5. Взаимодействие 1РВ3/СУСЬОР8 с регуляторами фитогормонального контроля развития симбиоза

1.8. Роль комплекса CCaMK-CYCLOPS-DELLA в контроле развития арбускулярной микоризы

1.9. Мишени транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS

1.9.1. Изменение экспрессии генов у мутантов ipd3/cyclops/sym33 разных Бобовых

1.9.2. Гены, являющиеся прямыми мишенями IPD3/CYCLOPS и их ко-регуляторы

1.10. LAN — регулятор еще одного параллельного пути развития инфекции в клубеньках бобовых растений

1.11. Транскрипционные факторы и регуляторы, участвующие в контроле

органогенеза симбиотических клубеньков Бобовых

1.11.1 Участие регуляторов развития меристемы в контроле органогенеза

симбиотического клубенька

1.11.2. Роль белков суперсемейства TALE в контроле формирования симбиотических клубеньков

1.12. Системная регуляция клубенькообразования (авторегуляция)

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Растительный материал и бактериальные штаммы

2.1.1. Схема обработки растений раствором ГА3

2.2. Скрининг библиотек кДНК, в которых происходит транскрипция и синтез белка (белоксинтезирующих библиотек), с помощью дрожжевой-двугибридной системы библиотек

2.2.1. Дрожжевой штамм и протокол приготовления компетентных клеток

2.2.2. Трансформация компетентных клеток векторами pDEST22/pDEST32

2.2.3. Создание библиотек для высокопроизводительного секвенирования фрагментов, содержащих вставки кДНК в векторе pDEST22

2.3. Проверка взаимодействий между выявленными регуляторами

2.3.1. Получение конструкций с кодирующими последовательностями генов и PsGASAl (Psat4g056040), и PsN14 (Psat2g003800) в векторе pDEST22

2.3.2. Проверка способности к росту трансформантов на селективных средах

2.4. Создание композитных растений M. truncatula

2.5. Создание композитных растений гороха линии SGE и мутанта SGEFix--2

2.6. Гистологический анализ клубеньков, образовавшихся на трансгенных корнях

2.7. Создание конструкций для трансформации растений

2.8. Выделение растительной РНК

2.9. Синтез комплементарной ДНК (кДНК) и количественная ПЦР, совмещенная с обратной транскрипцией

2.10. Поиск гомологов IPD3/CYCLOPS в геномах бобовых и небобовых растений

2.11. Анализ экспрессии гомологов генов PsGASA1 (Рва14§0560400) и PsN14 ^а^003800) и поиск их гомологов

2.12. Оценка площади инфекционной зоны в клубеньках Ы. truncatula

А17, несущих конструкции MtBELL1-2-ШAi и GUS-OE

2.13. Локализация активности промотора гена MtBELL1-2

2.14. Составы сред, используемых для выращивания бактерий, дрожжей и

растений

2.14.1. Бактериальные среды

2.14.2 Растительные среды

2.14.3. Дрожжевые среды

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Оценка возможного участия транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS и 1РВ3-Нке в контроле органогенеза симбиотических

клубеньков

3.1.1. Поиск гомологов генов IPD3 и IPD3-like в геномах бобовых и небобовых растений

3.2. Оценка роли К-концевого, активационного и ДНК-связывающего доменов транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS в регуляции развития ризобиальной инфекции и формирования клубеньков у Бобовых с недетерминированным типом клубеньков

3.2.1. Комплементация мутанта SGEFix--2 (sym33-3) гороха с использованием полноразмерной кодирующей последовательности гена PsSym33 (IPD3/CYCLOPS), а также последовательностей, кодирующих К-концевой (ND), активационный (AD) и ДНК-связывающий (BD) домены

3.2.2. Комплементация мутанта ТЯ3 (ipd3-1)M. truncatula, дефектного по гену MtIPD3, конструкциями, содержащими полноразмерную и укороченные последовательности гена PsSym33

3.3. Скрининг библиотеки кДНК с помощью дрожжевой двугибридной системе для поиска ко-регуляторов транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS

3.3.1. Анализ литературных данных и доступных транскриптомных баз данных с целью поиска гомологов выявленных ко-регуляторов PsIPD3/CYCLOPS у других бобовых растений и оценки их уровня экспрессии при симбиозе

3.3.2. Проверка взаимодействий выявленных ко-регуляторов с помощью дрожжевой двугибридной системы (ДДС)

3.4. Взаимодействие транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS с основными регуляторами фитогормонального ответа при развитии симбиоза у гороха и М. 1гипсаШ1а

3.4.1. Оценка фенотипа мутанта SGEFix--2 (яушЗЗ-З) при обработке гиббереллиновой кислотой (ГА3)

3.4.2. Изучение возможность взаимодействия укороченных белков IPD3/CYCLOPS у мутантов и белков DELLA

3.4.3. Изучение возможных механизмов, вызывающих снижение количества формирующихся клубеньков, у растений гороха при обработке гиббереллинами, а также оценка участия PsIPD3/CYCLOPS в данной регуляции

3.5. Механизмы поддержания фитогормонального гомеостаза в клубеньке

и возможная роль IPD3/CYCLOPS в данном процессе

3.5.1. Изучение функциональной роли транскрипционного фактора BELL1-2 и его способности влиять на индукцию генов биосинтеза гиббереллина

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение

Благодарности

Список сокращений

АМ — арбускулярная микориза АФК — активные формы кислорода ГГДФ — геранилгеранилдифосфат ГА3 — гиббереллиновая кислота ДДС — дрожжевая двугибридная система ДМСО — диметилсульфоксид ИУК — индолилуксусная кислота ТФ — транскрипционный фактор

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль доменной структуры, ко-регуляторов и мишеней транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS в контроле развития бобово-ризобиального симбиоза»

ВВЕДЕНИЕ

Бобовые растения обладают уникальной способностью формировать симбиотические отношения с азотфиксирующими бактериями, известными как ризобии, а также с грибами арбускулярной микоризы. Бобово-ризобиальный симбиоз играет важнейшую роль в формировании почвенных экосистем, так как способствует обогащению почвы азотом и улучшению условий для роста экономически важных агрокультур (Тихонович и др., 2006). Таким образом, данный симбиоз не только способствует увеличению урожайности самих бобовых растений, но и улучшает качество почвы, что делает его важным элементом в устойчивом сельском хозяйстве и агрономии (Тихонович и др., 2011). В связи с этим изучение основных механизмов регуляции биологической азотфиксации для поиска новых подходов повышения ее эффективности является актуальной задачей.

Процесс инициации симбиоза с ризобиями начинается с взаимодействия бактерий с корневыми волосками бобовых растений. В результате этого взаимодействия корневые волоски деформируются и образуют плотный завиток, в котором развивается бактериальная колония (Brewin, 1991). С помощью специализированных структур, называемых инфекционными нитями, ризобии проникают в корень и достигают клеток формирующегося примордия клубенька. Внутри клубеньков происходит выход бактерий из инфекционных нитей и формирование новых симбиотических структур, известных как симбиосомы (Roy et al., 2020). Эти структуры обеспечивают обмен веществами между растением и бактериями: растения предоставляют ризобиям углеводы, а взамен получают фиксированный азот, который является важным питательным элементом для их роста (Clarke et al., 2014).

Формирование симбиоза происходит под влиянием сигнальных молекул ризобий липохитоолигосахаридной природы — Nod-факторов. Одними из наиболее ранних молекулярных реакций на узнавание этих

молекул являются изменение потоков ионов К+, Н+, Cl-, что приводит к деполяризации мембраны и первичному поступлению ионов Ca2+ в кончики клеток корневых волосков и возникновением вслед за этим периодических колебаний в концентрации Ca2+ в околоядерном пространстве и ядре (Oldroyd et al., 2008). Белок кальций/кальмодулин-зависимая киназа (CCaMK) преобразует Ca2+ сигнал, активируя белки-мишени посредством фосфорилирования. Основными мишенями CCaMK являются транскрипционные факторы и среди них центральную роль играет транскрипционный фактор IPD3/CYCLOPS (Lévy et al., 2004; Singh et al., 2014; Yano et al., 2008).

После CCaMK и IPD3/CYCLOPS в сигнальный каскад, активированный Nod-факторами, включаются несколько транскрипционных факторов, а именно NSP1 (Nodulation Signaling Pathway 1), NSP2 (Nodulation Signaling Pathway 2), ERN1 (ERF required for nodulation) и NIN (Nodule inception) (Jhu et al., 2023). Эти регуляторы транскрипции имеют решающее значение для инициации процесса органогенеза клубенька и развития ризобиальной инфекции и, как показали исследования, взаимосвязаны с фитогормональными сигнальными путями. Таким образом, одна из ключевых ролей передачи симбиотического сигнала на ранних этапах развития симбиоза заключается также в активации путей биосинтеза и рецепции фитогормонов, в первую очередь цитокининов, ауксинов, которые вовлечены в контроль клеточного цикла, необходимого для инициации клубенькообразования. Помимо них, важная роль в регуляции развития симбиоза принадлежит и гиббереллинам, которые влияют как на контроль развития ризобиальной инфекции, так и на индукцию органогенеза клубенька (Lin et al., 2020).

Активация транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS на самых ранних этапах развития симбиоза делает его важнейшей целью для изучения. Первые работы по изучению роли этого транскрипционного фактора были выполнены на модельном бобовом растении лядвенце японском (Lotus japonicus (Regel) K.Larsen). На корнях мутанта cyclops-3 кончики закрученных

корневых волосков колонизировались ризобиями, однако рост инфекционных нитей в них нарушался. Из-за этого характерного фенотипа мутанта соответствующий ген был назван CYCLOPS. Развитие полноценных клубеньков у данного мутанта было нарушено, но при этом наблюдалось образование примордиев клубеньков (Yano et al., 2008). В это же время ортолог этого гена был выявлен у люцерны слабоусеченной (Medicago truncatula Gaerth.), который получил название IPD3 (Interacting Protein of DMI3), поскольку он взаимодействовал с белком CCaMK (DMI3), а также у гороха посевного (Pisum sativum L.) (ген Sym33) (Messinese et al., 2007).

Несмотря на то, что транскрипционный фактор IPD3/CYCLOPS работает на самых ранних этапах развития бобово-ризобиального симбиоза, мутанты по данному гену имеют Fix- фенотип, тогда как мутанты Бобовых по гену nin, являющемуся мишенью IPD3/CYCLOPS, имеют фенотип Nod-(Soyano et al., 2014). Возможные причины этих различий в фенотипах мутантов остаются в настоящее время малоисследованными.

У мутанта M. truncatula (ipd3-1) формируются два типа клубеньков — примордий-подобные клубеньки, которые остаются неинфицированными, а также более развитые клубеньки, в которых наблюдается сформированная сеть инфекционных нитей, но выход бактерий из них оказывается нарушен (Horvath et al., 2011). Мутанты гороха по гену Sym33, являющемуся ортологом MtIPD3/LjCYCLOPS также характеризуются Fix- фенотипом и возможностью формировать несколько типов клубеньков разной степени развития (Tsyganov et al., 1998; Voroshilova et al., 2001).

Как мы отмечали ранее, остается загадкой вопрос об участии транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS в контроле развития органогенеза клубенька. Проведенные ранее Синг с коллегами эксперименты на модельном бобовом L. japonicus показали, что модифицированная версия белка CYCLOPS, где остатки серина по положениям S50 и S154 (по ним происходит фосфорилирование белка), были заменены на аспарагиновую кислоту D50 и D154, что моделировало фосфорилирование данных сайтов,

приводит к спонтанному формированию клубенька даже в отсутствие ризобий (Singh et al., 2014). Более того, такие спонтанные клубеньки формировались и у мутанта ccamk. Это убедительно указывает на то, что IPD3/CYCLOPS играет важную роль в контроле органогенеза клубенька.

Возможное объяснение Fix-, но не Nod- фенотипа у мутантов ipd3/cyclops было найдено, когда в опубликованной в 2018 работе Jin с соавторами было показано присутствие в геноме M. truncatula паралога гена MtIPD3 — гена MtIPD3-like. Полученный двойной мутант ipd3-2 ipd3l не был способен к формированию даже примордиев клубеньков (Jin et al., 2018). Тем не менее, с тех пор не было опубликовано ни одной работы, в которой бы сообщалось о нахождении и изучении ортологов IPD3-like у других Бобовых.

Изучение структурной организации IPD3/CYCLOPS показало, что этот белок весьма консервативен как среди бобовых, так и среди небобовых растений. На его C-конце находится неканоничный ДНК-связывающий домен "спиральная катушка" (от англ. coiled-coil), и функционирует данный транскрипционный фактор в форме гомодимера (Singh et al., 2014). Однако остается неясной функциональная роль N-концевого домена (ND) и активационного домена (AD) IPD3/CYCLOPS. Высказываются предположения, что эти домены могут играть разную роль в контроле инфекции и органогенеза, что указывает на возможное взаимодействие IPD3/CYCLOPS с ко-регуляторами, которые остаются неизвестными.

Анализ доступных литературных данных о фенотипических нарушениях у различных мутантов ipd3/cyclops гороха и M. truncatula показал, что мутации, которые приводят к появлению укороченных вариантов белка с присутствием только N-концевого (ND) и активационного доменов (AD) имеют наиболее сильные нарушения в развитие симбиоза, тогда как у мутантов с нарушениями в районе ДНК-связывающего домена наблюдается лишь нарушение выхода бактерий из инфекционной нити. Таким образом, именно ДНК-связывающий домен, по-видимому, играет основную роль в контроле данного процесса, тогда как N-концевой и активационный домены

могут быть важны для контроля других процессов при симбиозе.

У IPD3/CYCLOPS есть и хорошо известные ко-регуляторы. В частности, белок DELLA — важнейший регулятор гиббереллинового метаболизма. Показано, что взаимодействие DELLA с IPD3/CYCLOPS увеличивает эффективность фосфорилирования последнего белком CCaMK, то есть усиливает эффективность передачи кальциевого симбиотического сигнала (Jin et al., 2016). Однако неизвестно, какой именно домен IPD3/CYCLOPS участвует в связывании c белком DELLA. Помимо этого, мутанты ipd3/cyclops характеризуются значительным изменением гормонального статуса клубенька и снижением уровня экспрессии генов биосинтеза таких фитогормонов как цитокинины и гиббереллины. Поскольку DELLA является важным регулятором ответа растений на данные фитогормоны, то подобные нарушения у мутантов ipd3/cyclops могут быть объяснены нарушением взаимодействия с DELLA, что также является актуальной задачей для изучения.

Таким образом, целью данной работы являлось изучение роли различных доменов транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS гороха (P. sativum) и люцерны (M. truncatula), а также его ко-регуляторов в обеспечении ключевых функций IPD3/CYCLOPS в контроле развития бобово-ризобиального симбиоза.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Проведение филогенетического анализа гомологов IPD3/CYCLOPS и IPD3-like у бобовых и небобовых растений с целью выявления особенностей эволюции гомологов данных генов.

2. Оценка функциональной роли отдельных доменов IPD3/CYCLOPS (N-концевого, активационного и ДНК-связывающего) в регуляции

органогенеза клубеньков и развитии ризобиальной инфекции у Pisum sativum и Medicago truncatula путём комплементации мутантных линий.

3. Выявление потенциальных ко-регуляторов IPD3/CYCLOPS методом дрожжевой двугибридной системы (ДДС) и подтверждение специфичности их взаимодействия при независимом клонировании кодирующих последовательностей выявленных генов.

4. Исследование участие IPD3/CYCLOPS в гормональной регуляции симбиоза, в частности, взаимодействие с белками DELLA — основными компонентами гиббереллинового сигнального пути.

5. Определение мишеней IPD3/CYCLOPS среди транскрипционных факторов, участвующих в поддержании фитогормонального гомеостаза, и оценка функциональной роли фактора BELL1-2 в развитии симбиотических клубеньков.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследование структурно-функциональной организации транскрипционного фактора PsIPD3/CYCLOPS у гороха и его роли в регуляции бобово-ризобиального симбиоза. Впервые показано, что возможный ортолог гена MtIPD3-like, участвующего в развитии клубеньков у Medicago truncatula, отсутствует в геномах большинства представителей семейства Fabaceae, включая горох. Это указывает на эволюционную дивергенцию путей регуляции симбиоза у близких видов бобовых. Впервые выявлены новые ко-регуляторы (PsGASA1, PsN14) транскрипционного фактора PsIPD3/CYCLOPS, необходимые для контроля органогенеза и инфекционного процесса. Установлено, что N-концевой домен (ND) транскрипционного фактора PsIPD3/CYCLOPS необходим для контроля выхода ризобий из инфекционных нитей и формирования функционального клубенька. Домен ND может участвовать во взаимодействии с

потенциальными ко-регуляторами — белками PsGASA1 и PsN14, активирующимися на ранних стадиях развития симбиоза. Показано, что мутация ipd3/cyclops у гороха, приводящая к образованию укороченного белка, не нарушает способности к связыванию с регулятором гиббереллинового ответа PsDELLA1, что подтверждает сохранение способности белка участвовать в гормональной регуляции органогенеза. Впервые выявлена новая мишень IPD3/CYCLOPS — транскрипционный фактор BELL1-2, играющий ключевую роль в контроле размера инфекционной зоны и уровне экспрессии генов биосинтеза гиббереллинов у бобовых с недетерминированным типом клубеньков (гороха и M. truncatula). Исследовано совместное влияние IPD3/CYCLOPS, белков DELLA и BELL1-2 в фитогормональном контроле развития симбиотического клубенька. Полученные результаты существенно расширяют представления о молекулярных механизмах регуляции бобово-ризобиального симбиоза и вносят вклад в понимание особенностей регуляции бобово-ризобиального симбиоза с участием транскрипционных факторов и регуляторов гормонального ответа.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты полногеномного поиска гомологов генов IPD3/CYCLOPS и IPD3-like могут применяться при анализе эволюции данных генов у бобовых и небобовых растений. Полученные данные о роли отдельных доменов IPD3/CYCLOPS и его ко-регуляторов позволят направленно регулировать экспрессию генов, участвующих в контроле развития симбиоза, что открывает возможности для создания бобовых культур с повышенной эффективностью азотфиксации и устойчивостью к неблагоприятным факторам среды. Выявленные особенности взаимодействия IPD3/CYCLOPS с белками DELLA и BELL1 -2 позволят регулировать клубенькообразование с учетом фитогормонального статуса растения.

Положения, выносимые на защиту

1. Проведенный филогенетический анализ показывает, что возможные ортологи гена MtIPD3-like не обнаруживаются в геномах гороха, как и большинства видов Бобовых, что свидетельствует об альтернативном механизме регуляции органогенеза транскрипционным фактором ТРЭЗ/СУСЬОРБ у этих видов.

2. К-концевой домен транскрипционного фактора РБГРВЗ/СУСЬОРЗ у гороха необходим для контроля выхода бактерий из инфекционных капель при симбиозе, а также для связывания с потенциальными ко-регуляторами - белками РбОАЗМ (Psat4g056040) и РбШ4 (Psat2g003800).

3. Мутация sym33-3 в гене PsIPD3/CYCLOPS, приводящая к появлению раннего стоп-кодона и синтезу укороченного белка размером 453 аминокислот, не влияет на способность белка связываться с регулятором гиббереллинового ответа белком PsDELLA1, а также не нарушает способности к гиббереллин-индуцируемому снижению количества формирующихся клубеньков.

4. Потенциальной мишенью ГРЭЗ/СУСЬОРБ является транскрипционный фактор ВЕЬЬ1-2, подавление активности которого приводит к фенотипу, характеризующемуся увеличением зоны инфекции и снижению уровня экспрессии генов биосинтеза гиббереллина GA20ox у гороха и M. truncatula.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Бобовые растения как важный компонент экосистемы, обеспечивающий биологическую фиксацию азота

Биологическая фиксация азота является важным источником поступления данного макроэлемента в экосистему (Тихонович и др., 2006). В процессе биологической азотфиксации образуется около 200 миллионов тонн азота ежегодно (Peoples et al., 2009; Vitousek et al., 2001). Эффективная биологическая азотфиксация является важной альтернативой использованию минеральных удобрений и промышленной фиксации азота, способствуя повышению плодородия почвы и урожайности растений. Это связано с негативными последствиями интенсивного использования химических удобрений в сельском хозяйстве и экологическими проблемами. Избыточное применение минеральных азотных удобрений приводит к серьёзным экологическим последствиям, включая эвтрофикацию пресноводных и прибрежных экосистем, деградацию почвенных микробных сообществ и закисление почв. В связи с этим поиск новых подходов для повышения эффективности биологической азотфиксации является весьма актуальным и определяется «биологизацией» сельского хозяйства в последние десятилетия (Goyal et al., 2021; Тихонович и др., 2011).

Бобовые — это чрезвычайно широко распространенное семейство растений, представители которого встречаются на всех континентах, кроме Антарктиды (Синюшин, 2021). Ареал их распространения включает как влажные тропические леса и средиземноморские луга, так и саванны и полузасушливые регионы (Sprent et al., 2017). В настоящее время в семействе Бобовые (Fabaceae) выделяют 6 подсемейств, а именно Cercidoideae, Detarioideae, Dialioideae, Duparquetioideae, Papilionoideae и Caesalpinioideae (le Roux et al., 2022). При этом только в двух из шести подсемейств, а именно у представителей Papilionoideae и Caesalpinioideae обнаруживается способность к формированию симбиоза с азотфиксирующими бактериями (Sprent et al.,

2017). Помимо Бобовых, некоторые представители порядков Cucurbitales, Fagales и Rosales показывают способность к формированию симбиоза с актинобактериями рода Frankia, а род Parasponia (Rosales, Cannabaceae) показывает способность к формированию симбиоза с ризобиями (Griesmann et al., 201S; Van Velzen et al., 2019).

Подсемейство Мотыльковых (Papilionoideae) у бобовых растений наиболее богато видами и включает 5ОЗ рода и приблизительно 14 ООО видов, и вместе с тем чрезвычайно разнообразно по биогеографическому диапазону распространения (Choi et al., 2022). Мотыльковые хорошо известны своим экономическим вкладом в сельское хозяйство и пищевую промышленность, поскольку именно в данное подсемейство входят основные бобовые культуры, такие как соя (Glycine max (L.) Merr.), фасоль (Phaseolus vulgaris L.), бобы (Viciafaba L.), арахис (Arachis hypogaea L.), чечевица пищевая (Lens culinarius Medik.), горох посевной (Pisum sativum L.), нут (Cicer arietinum L.) и важная кормовая культура люцерна посевная (Medicago sativa L.) (Cardoso et al., 2012). Многие известные бобовые культуры относятся к монофилетической группе, которая характеризуется потерей одной копии инвертированного повтора размером 25 тысяч пар оснований в пластидном геноме (Lavin et al., 1990; Wojciechowski et al., 2004), получившей название IRLC (Inverted repeat-lacking clade) (Рис. 1).

Рисунок 1 — Филогения подсемейства Papilionoideae (Мотыльковые) (по Bruneau et al., 2013). Красная стрелка указывает на группу IRLC (Inverted repeat-lacking clade).

1.2. Mолекулярные механизмы узнавания партнеров по симбиозу

Эффективное развитие бобово-ризобиального симбиоза требует координации процессов, которые происходят в разных тканях корня, включая формирование инфекции в эпидерме и образование нового органа - клубенька из примордия, формирующегося из клеток перицикла, эндодермы и коры корня (Crespi et al., 2008). Корни бобовых растений выделяют в окружающую среду такие вторичные метаболиты, как флавоноиды, которые привлекают ризобий (Peck et al., 2006). Под влиянием флаваноидов у ризобий активируется синтез липохитоолигосахаридных молекул Nod-факторов, которые обычно содержат от трех до шести остатков N-ацетилглюкозамина с присоединенной на невосстанавливающем конце молекулы ненасыщенной жирной кислотой и рядом других заместителей (D'Haeze et al., 2002; Mergaert et al., 1997; Овцына и др., 2004). Ключевым событием в инициации симбиоза является узнавание растениями Nod-факторов, которое активирует ряд изменений, предшествующих развитию инфекции и формированию клубенька (Gourion et al., 2015; Oldroyd et al., 2011; Глянько, 2015). Химические модификации молекулы Nod-фактора придают им специфичность и способствуют избирательному узнаванию растением-хозяином определенных видов ризобий (Bek et al., 2010; Walker et al., 2020).

У модельного бобового L. japonicus в узнавании ризобиальных Nod-факторов ключевую роль играют рецепторные киназы LjNFRl (Nod Factor Receptor 1) и LjNFR5 (Nod Factor Receptor 5), характеризующиеся наличием внеклеточного домена с тремя LysM-мотивами (LysMl, LysM2, LysM3), трансмембранного домена и цитоплазматического серин/треонинового киназного домена (Madsen et al., 2003; Radutoiu et al., 2003). Однако у LjNFR5 киназный домен не является активным, что предполагает его работу в составе рецепторного комплекса с LjNFR1, который и передает сигнал в клетку. При этом именно внеклеточные LysM-мотивы данных рецепторов необходимы для распознавания остова Nod-фактора со специфичными заменами (Radutoiu et al., 2007). Анализ мутантов nfr1 и nfr5 показал, что обе мутации в равной

степени приводят к нарушению инициации клубенькообразования. У другого модельного бобового растения M. truncatula только у мутанта по гену MtNFP (Nod Factor Perception) (ортолог LjNFR5) наблюдается полное блокирование ответных реакций на инокуляцию, тогда как у мутанта по гену MtLYK3 (Lysin motif receptor-like Kinase 3) (гомолог LjNFR1) развиваются ранние ответные реакции, однако нарушается развитие инфекционных нитей и инфицирование тканей (Arrighi et al., 2006; Limpens et al., 2003). Недавно было установлено, что помимо рецептора MtLYK3 у этого бобового растения для узнавания Nod-факторов необходимы еще дополнительные рецепторы MtLYK2 (линия А17) и MtLYK2, MtLYK2bis (линия R108), которые также гомологичны LjNFRl. Таким образом, у M. truncatula в узнавание Nod-факторов вовлечены несколько рецепторных комплексов (Li et al., 2024; Luu et al., 2023). Сходным образом несколько гомологов гена LjNFR1 выявлены и у гороха - это рецепторные киназы PsSYM37 и PsK1, что также указывает на участие нескольких рецепторных комплексов в узнавании Nod-факторов у этого бобового со сходным с M. truncatula типом клубенькообразования (Kirienko et al., 2018; Zhukov et al., 2008).

В дальнейшую передачу сигнала после узнавания Nod-факторов LysM-содержащими рецептор-подобными киназами вовлечена еще одна рецепторная киназа с лейцин-богатыми повторами во внеклеточном домене -MtDMI2 (Does not Make Infection 2)/Lj SYMRK (Symbiosis Receptor-like Kinase) (Ané et al., 2002). Следующим компонентом сигнального пути является катионный канал MtDMIl (Does not Make Infection 1) у модельного бобового M. truncatula и его гомологи у L. japonicus LjCASTOR и LjPOLLUX, которые локализуются в ядерной оболочке и участвуют в регуляции поступления Ca2+ в ядро и возникновении колебаний уровня Ca2+ в ядре и околоядерном пространстве (Ané et al., 2004; Capoen et al., 2011; Imaizumi-Anraku et al., 2005; Sieberer et al., 2012; Wais et al., 2000). Используя метод комплементации мутантов, было показано, что ген MtDMI1 M. truncatula достаточен для замены как LjPOLLUX, так и LjCASTOR в L. japonicus. Вместе с тем, как LjPOLLUX,

так и LjCASTOR требуются для замены MtDMI1 в M. truncatula (Venkateshwaran et al., 2012).

Еще одним компонентом передачи сигнала, влияющим на транспорт кальция (Ca2+), являются кальций-регулируемые каналы, активируемые циклическими нуклеотидами MtCNGC15/ LjCNGC15 (Cyclic Nucleotide-Gated ion Channel 15) у бобовых растений (Dietrich et al., 2020). У M. truncatula три паралога MtCNGC15a, MtCNGC15b и MtCNGC15c могут работать в комплексе с каналом MtDMIl в ядерной оболочке и являются ключевыми регуляторами индукции колебаний уровня Ca2+ (Charpentier et al., 2016). Показано, что мутанты по генам cngc15a и cngc15c с усилением функций данных генов характеризовались значительным увеличением количества как формирующихся микроколоний, так и инфекционных нитей через 5 дней после инокуляции, а также увеличением количества формирующихся клубеньков (Cook et al., 2025). Оба канала MtDMI1 и MtCNGC15 регулируют поступление Ca2+ в ядро (Jacott et al., 2024).

Осцилляции уровня кальция (Ca2+) являются важным компонентом сигнального пути, активируемого в клетках эпидермы корней при первоначальном узнавании сигналов ризобий Nod-факторов (Sieberer et al., 2012). Колебания уровня Ca2+ в ядре, выражающиеся в виде высокоамплитудных сигналов, наблюдаются уже через 10 минут после воздействия факторов даже в низкой концентрации равной 10-12 M (Shaw et al., 2003).

Эти изменения в концентрации Ca2+ воспринимаются белком кальций/кальмодулин-зависимой киназой (CCaMK), который активируется посредством фосфорилирования при возникновении периодических изменений в концентрации кальция («кальциевых волн» от англ. Ca2+-spiking) (Рис. 2) (Lévy et al., 2004; Singh et al., 2012). У модельного бобового растения M. truncatula мутанты по гену MtDMI3, кодирующему CCaMK, характеризуются серьезными нарушениями в развитии ризобиальной инфекции (Messinese et al., 2007). Одной из специфичных особенностей

CCaMK по сравнению с CDPK (Calcium-Dependent Protein Kinases) является наличие домена связывания кальмодулина, перекрывающегося с автоингибирующим доменом. Способность CCaMK связывать как кальций, так и кальмодулин является ключевой особенностью, позволяющей этому белку декодировать кальциевый сигнал (Miller et al., 2014). Мутанты по гену ccamk характеризуются нарушением способности к инициации органогенеза клубеньков и инфицирования как ризобиями, так и грибами AM (Lévy et al., 2004). Тем не менее, у них сохраняются первичный вход кальция в клетку и деформации корневых волосков под влиянием обработки Nod-факторами (Mitra et al., 2004).

Рисунок 2 — Схема восприятия сигнальных молекул ризобий комплексом рецепторов и активации сигнального каскада, приводящего к развитию ризобиальной инфекции и органогенезу клубенька.

Флавоноиды, выделяемые корнями бобовых растений, действуют как сигналы ризобий в почве, активируя выработку Nod-факторов. Рецепторный комплекс

на поверхности корня обеспечивает распознавание Nod-факторов, что приводит к активации симбиотического сигнального каскада (по Jhu et al., 2023).

Экспрессия автоактивированных форм CCaMK — CCaMKT265D или SNF1 (CCaMK T265I) у мутантов symrk, castor, pollux или nup85/nup133, характеризующихся нарушением в генерации специфичных для симбиоза кальциевых волн, позволяла восстанавливать как бобово-ризобиальный симбиоз, так и симбиоз с грибами арбускулярной микоризы (АМ), доказывая, что основной целью генерации кальциевых осцилляций является активация CcaMK и комплекса транскрипционных факторов (Hayashi et al., 2010; Madsen et al., 2010).

Часть компонентов сигнального пути, задействованных в развитии ризобиального симбиоза, являются также необходимыми для формирования симбиотического взаимодействия с грибами АМ (Camps et al., 2015). Это указывает на существование общего эволюционно консервативного пути передачи сигнала (OCCn - общий симбиотический сигнальный путь), обеспечивающего распознавание двух типов симбионтов и запуск программ развития симбиотических структур. Симбиоз с грибами АМ представляет собой одну из наиболее древних и распространенных форм симбиоза растений с грибами отдела Glomeromycota (Strack et al., 2003). Для её установления и поддержания требуется строгая регуляция экспрессии генов растения-хозяина, обеспечивающая формирование специализированных внутриклеточных структур арбускул, в которых происходит основной обмен питательными веществами между растением и грибом (Леппянен и др., 2021; Юрков и др., 2017). ОССП включает ряд высококонсервативных компонентов, таких как трансмембранная рецептор-подобная киназа с лейцин-богатыми повторами во внеклеточном домене MtDMI2/LjSYMRK, ядерные ионные каналы MtDMI1/LjCASTOR, LjPOLLUX и кальций/кальмодулин-зависимую

протеинкиназу MtDMI3/LjCCaMK/ (Lévy et al., 2004; Venkateshwaran et al., 2012; Wais et al., 2000).

Aктивация CCaMK является важным звеном в трансформации кальциевого сигнала, поскольку фосфорилированная CCaMK стимулирует ряд транскрипционных факторов (например, IPD3 (Interacting Protein of DMI3)/CYCLOPS, NIN (Nodule Inception), NF-Y (Nuclear transcription factor Y), NSP1 (Nodulation Signaling Pathway 1), NSP2 (Nodulation Signaling Pathway 2), IPN2 (Interacting Protein of Nsp2), которые, в свою очередь, координируют экспрессию генов, необходимых для развития инфекции и формирования клубенька (Messinese et al., 2007; Singh et al., 2014) (Рис. 2). Транскрипционные факторы IPD3/CYCLOPS, а также NSP1 и NSP2 участвуют и в контроле развития симбиоза с грибами AМ, то есть являются компонентами ОССП. Однако при симбиозе с грибами AМ активируются и специфичные для этого типа симбиоза транскрипционные факторы семейства GRAS, такие как RAM1 (Reduced Arbuscular Mycorrhization 1) и RAD1 (Required for Arbuscule Development 1), обеспечивающие развитие и функционирование арбускул, что свидетельствует, по-видимому, о разной природе осцилляций Ca2+ при передаче сигнала от двух типов симбионтов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Долгих Александра Вячеславовна, 2026 год

/ / / /

Рисунок 24 — Схема амплификации фрагментов, содержащих вставку кДНК в векторе рБЕ8Т22 (Б), и отбора 5'-концевых фрагментов (Г) для приготовления библиотеки. Более детальная схема приготовления библиотеки представлена на Рисунке 11 в разделе Материалы и Методы.

Стратегия обогащения 5'-концевыми фрагментами была реализована в методике In-Frame-Y2H-Seq (Gu et al., 2022). В основе данной методики лежит использование измененного праймера для синтеза библиотек, содержащего на 3'-конце участок, комплиментарный фрагменту вектора, примыкающего к 5'-концу вставки. В результате библиотека оказывается обогащена 5'-фрагментами и появляется возможность идентифицировать правильность рамки считывания для большинства секвенированных фрагментов, что

значительно снижает затраты на секвенирование, поскольку помогает избавиться от прочтений, которые не могут быть использованы для анализа. С использованием этого подхода нами и была создана библиотека для секвенирования.

Полученные в результате секвенирования прочтения были использованы для выравнивания на геном гороха сорта Cameor v1 (Kreplak et al., 2019). В качестве референса нами были использованы контрольные образцы, полученные на основе плазмидной ДНК из клонов, трансформированных пустым вектором pDEST32 и библиотекой набора кДНК, клонированных в вектор pDEST22. Анализ данных включал такие шаги, как выравнивание прочтений на референсный геном и подсчет прочтений, приходящихся на ген, нормализация полученных значений с учетом размера библиотеки а также отбор тех генов, для которых соотношение приходящихся на них прочтений в библиотеке с pDEST32-PsSym33 было выше, чем в библиотеке, полученной после трансформации не содержащими вставок pDEST32.

Для отбора прочтений, в которых 5'-UTR не приводил к сдвигу рамки считывания, была осуществлена трансляция, а затем с помощью программы pblat выравнивание на аннотированные белковые последовательности генома гороха. В результате были отобраны гены, для которых соотношение выровненных на них прочтений из библиотеки pDEST32-PsSym33 и контрольной библиотеки (pDEST32-без вставок) было выше 5 и для этих прочтений не наблюдалось сдвига рамки считывания, приводящей к трансляции нецелевого белка.

В результате анализа среди потенциальных ко-регуляторов PsIPD3/CYCLOPS нами были выявлены гиббереллин-индуцируемый белок семейства GASA, нуклеозиддифосфаткиназа (NDPK1), несколько белков с неизвестной функцией, в том числе являющихся гомологами ранее изученных нодулинов бобового M. truncatula, а именно MtN14 и гистидин-богатые белки

с неизвестной функцией, а также ауксин-индуцируемый белок, являющийся гомологом нодулина MtN21 (Табл. 12).

Таблица 12 — Возможные ко-регуляторы транскрипционного фактора PsIPD3/CYCLOPS, найденные при скрининге белоксинтезирующей библиотеки в дрожжевой двугибридной системе.

Psat2g003800 Белок PsN14 (гомолог MtN14)

Psat2g034560 Белок из семейства аквапоринов MIP

Psat2g043240 УТФ-глюкозо-1 -фосфат уридилилтрансфераза

Psat2g087160 Нуклеозиддифосфаткиназа (NDPK1)

Psat2g142200 IPD3/CYCLOPS

Psat3g036920 60S рибосомальный белок

Psat4g056040 Белок, регулируемый гиббереллином (GASA)

Psat4g226280 Ауксин-индуцированный белок 5NG4 (MtN21)

Psat5g091040 Белок с неизвестной функцией

Psat5g091920 Белок с неизвестной функцией

Psat7g183160 Белок с NAC доменом

Psat7g163240 Белок с неизвестной функцией

Голубым цветом отмечены белки, отобранные для дальнейшего углубленного изучения.

3.3.1. Анализ литературных данных и доступных транскриптомных баз данных с целью поиска гомологов выявленных ко-регуляторов PsIPD3/CYCLOPS у других бобовых растений и оценки их уровня экспрессии при симбиозе

Среди белков, выявленных в результате анализа, наше внимание особенно привлекли два, один из которых относится к семейству гиббереллин-индуцируемых белков GASA (Psat4g056040), а второй хоть и является белком с неизвестной функцией (Psat2g003800), но имеет гомологию с ранее

охарактеризованным нодулином MtN14 у M. truncatula. В связи с высокой гомологией данный белок у гороха был назван PsN14.

Гены семейства GASA (от англ. Gibberellic acid-stimulated Arabidopsis) кодируют небольшие растительные белки, характеризующиеся наличием С-концевого домена из 60 аминокислот, включающего 12 остатков цистеина в консервативных положениях (Aubert et al., 1998). Эти остатки имеют решающее значение для поддержания структуры белка посредством образования дисульфидных связей (Yeung et al., 2016). Большинство генов GASA регулируется фитогормонами и свое название получили, так как первые открытые гены данного семейства генов у модельного растения A. thaliana индуцировались при обработке растений гиббереллинами (Herzog et al., 1995). Действительно, большая часть из них регулируется гиббереллинами, но для некоторых генов данного семейства показана индукция и при воздействии других фитогормонов, а именно ауксинов, брассиностероидов и абсцизовой кислоты (Taylor et al., 1994; Wang et al., 2009; Zhang et al., 2008).

Одной из интересных особенностей белков GASA, продемонстрированной в целом ряде работ, является их участие в защите от патогенов и способности разрушать мембраны микроорганизмов (Boonpa et al., 2018; Mao et al., 2011; Qiu et al., 2020). Однако функциональная роль GASA, по-видимому, многогранна и включает способность влиять на процессы роста и развития растения, а также повышения устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам (Nahirnak et al., 2012; Sun et al., 2013). Полногеномный анализ позволил выявить гены семейства GASA в геномах пшеницы (Triticum aestivum L.), табака (Nicotiana benthamiana Domin), тополя (Populus trichocarpa Torr. & A.Gray ex. Hook.), томата (Solanum lycopersicum L.) и ряда других организмов (Bouteraa et al., 2023; Su et al., 2023; Wu et al., 2022). Выявление данного семейства генов у филогенетически отдаленных организмов подчеркивает их эволюционную важность, а также указывает на их участие в фундаментальных процессах жизнедеятельности растительных организмов.

Поскольку в ходе скрининга по поиску ко-регуляторов IPD3/CYCLOPS мы выявили среди таких ко-регуляторов белок, относящийся к семейству GASA, мы решили более детально изучить представленность генов GASA в геноме гороха и M. truncatula. Ранее при полногеномном анализе в геноме M. truncatula обнаружено 26 генов, кодирующих белки семейства GASA (Gao et al., 2024). Взяв за основу последовательности данных белков, мы провели поиск гомологов этих белков у гороха с использованием программы Blastp. В результате было выявлено 30 белков, показывающих высокий процент сходства по аминокислотной последовательности с белками GASA M. truncatula (evalue <10-20). При построении филогенетического дерева на основе аминокислотных последовательностей выявленных гомологов было выяснено, что не для каждого белка M. truncatula находится ортолог у гороха, а на некоторые приходится по 2-3 предполагаемых ортолога (Рис. 25). В частности, обнаруженный нами в ходе скрининга ген с идентификатором Psat4g056040, имел наибольший процент сходства с геном MtGASAll M. truncatula, однако у гороха было выявлено еще 7 потенциальных гомологов данного гена. Однако, поскольку гены GASA ранее не были детально изучены у гороха, в дальнейшем мы дали ему название PsGASAl.

Рисунок 25 — Филогенетическое дерево, полученное на основе аминокислотных последовательностей белков семейства GASA у M. truncatula и их гомологов у гороха. Для построения дерева использовали метод Присоединения соседей (Neighbor joining). Числовые значения соответствует значениям уровня поддержки ветвей на основании 1000 бутстрепов.

С использованием доступных транскриптомных данных мы также провели анализ экспрессии генов GASA в корнях и клубеньках M. truncatula. Было выяснено, что среди всех генов GASA лишь гомолог гена, выявленного

при скрининге белоксинтезирующей библиотеки, а именно ген MtrunA17Chr40059421 (MtGASA11), показывает высокий уровень экспрессии в клубеньках (Рис. 26).

Рисунок 26 — Оценка уровня экспрессии генов семейства GASA в клубеньках бобового M. truncatula на сроке 14 дней после инокуляции и в корнях на основе доступных транскриптомных данных (Roux et al., 2014).

Красная стрелка указывает на данные экспрессии для гомолога гена

Psat4g056040 — MtrunA17Chr40059421 (MtGASA11).

При этом литературные данные о функциональной роли белков GASA в контроле процесса развития бобово-ризобиального отсутствуют. Тем не менее есть работы, показывающие, что в ответ на сверхэкспрессию некоторых регуляторов симбиоза, таких как CLE-пептиды у модельного бобового M. truncatula, наблюдается индукция генов GASA (Lebedeva et al., 2024). Также у M. sativa при сверхэкспрессии гена MsSN1 (Snakin 1), относящегося к семейству GASA, было выявлено повышение защитных ответов против

вирулентных штаммов грибов. Следует отметить, что сверхэкспрессия MsSN1 приводила к активации защитных реакций при инокуляции растений разными неспецифичными штаммами ризобий, но такая реакция отсутствовала при использовании специфичных симбионтов M. sativa (García et al., 2014). Таким образом, данные пептиды, по-видимому, могут быть важным компонентом узнавания специфических симбиотических партнеров, что делает их важным объектом для дальнейшего изучения.

Вторым белком, показавшим возможность взаимодействия с транскрипционным фактором IPD3/CYCLOPS гороха, стал белок с неизвестной функцией и идентификатором Psat2g003800. В связи с тем, что данный белок имеет гомологию с нодулином MtN14, он был назван PsN14. Для начала нами был проведен анализ на присутствие в нем функциональных доменов с помощью сервера InterProScan

(https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/). В результате в составе данного белка были аннотированы лишь домены, ассоциированные с неупорядоченной пространственной структурой белка ("disorder prediction domain") и сoil-домены. Интересно, что схожие домены наблюдаются в C-концевой части IPD3/CYCLOPS (Рис. 27).

А

» intrinsically Disordered Regions

» CoMed-Coils. Signal Peptides And Transmembrane Regions

Б

1 --------

»rdllltilltSllllllUISIIITIIIHIi'llfUilillKIIIiliillll'llhinill

» mtrtnsKatty Disordered Regions

» Cotled-Coib, Signal Peptides And Transmembrane Regions

Рисунок 27 — Визуализация доменной структуры белков PsIPD3/CYCLOPS (А) и Psat2g003800 (Б) по результатам поиска по базе данных InterProScan.

При поиске гомологов данного белка в геноме гороха мы выяснили, что данный ген является уникальным и не имеет паралогов. При дальнейшем поиске по базе данных NCBI было выяснено, что гомологи данного гена обнаруживаются у представителей Бобовых и лишь у некоторых представителей небобовых растений. Однако, в большинстве случаев ген является уникальным, то есть не имеет паралогов (Рис. 28).

Рисунок 28 — Филогенетическое дерево, построенное на основе аминокислотных последовательностей белков гомологов PsN14 (Psat2g003800). Для построения дерева использовали метод Присоединения соседей (Neighbor joining). Размер красных точек соответствует значениям уровня поддержки ветвей на основании 1000 бутстрепов.

С использованием сервера MEME Suite на основе аминокислотных последовательностей белка PsN14 (Psat2g003800) и его гомологов нами были

Papilionoideae Детерминированные клубеньки

Non-Fabaceae

Papilionoideae Недетерминированные клубеньки

выявлены универсальные мотивы, которые встречаются во всех представленных последовательностях. Такие консервативные домены были обнаружены в N-концевой и C-концевой частях белков. Однако, следует отметить, что C-концевой мотив (обозначен на рисунке голубым) помимо представителей подсемейства Papilionoideae встречается лишь у вида Bauhinia variegata (Рис. 29). Помимо этого, нами было отмечено присутствие мотива, специфичного для Бобовых подсемейства Papilionoideae c недетерминированным типом клубеньков (обозначен на рисунке фиолетовым цветом).

Рисунок 29 — Поиск консервативных мотивов в аминокислотных последовательностях гена Psat2g003800 и его гомологов у бобовых и небобовых растений с помощью программы MEME Suite.

Нами был проведен анализ литературных данных по изучению функций обнаруженного гена у различных Бобовых. Ранее с помощью Нозерн-блот гибридизации было показано, что ген, кодирующий у M. truncatula MtN14, экспрессируется в молодых клубеньках, но не в зрелых (14 дней после инокуляции). Повышенная экспрессия данного гена в была выявлена также в спонтанных клубеньках (мутант nar) (Gamas, 1996; Grosjean et al., 1997). Таким образом, изучение экспрессии гомолога PsN14 (Psat2g003800) у M. truncatula (MtrunA17Chr5g0447991) на основании анализа доступных транскриптомных данных показывает, что экспрессия данного гена индуцируется в ответ на инокуляцию корней ризобиями уже на ранних стадиях развития симбиотического процесса (Рис. 30А), но оказывается снижена в зрелых клубеньках (Рис. 30Б). Эти данные, говорят о том, что данный регулятор может участвовать в контроле органогенеза клубенька на самых ранних стадиях развития этого процесса.

Рисунок 30 — Анализ экспрессии гена MtN14 (MtrunA17Chr5g0447991) в корнях при инокуляции бактерией E. meliloti 1021 (А) и в клубеньках (14 дней после инокуляции) по сравнению с интактными корнями (контроль) (Б). Данные представлены в виде нормализованных значений количества прочтений на миллион (Counts Per Million, CPM), полученных при анализе доступных транскриптомных данных (Roux et al., 2014; Schiessl et al., 2019).

Таким образом, данные, полученные методом секвенирования РНК, подтверждают данные по измерению уровня экспрессии с помощью метода Нозерн-блот гибридизации, а индукция гена в спонтанных клубеньках у мутанта nar указывает, что данный ген может быть вовлечен в регуляцию органогенеза клубенька. Поиск по доступным транскриптомным данным показал, что экспрессия данного гена снижается в ответ на обработку нитратами (Guhl et al., 2021), а также снижается в клубеньках мутанта nad1 по сравнению с клубеньками дикого типа (Wang et al., 2016). Такая регуляция может указывать на важную роль данного гена в контроле развития бобово-ризобиального симбиоза и делает его интересным объектом для дальнейшего изучения.

3.3.2. Проверка взаимодействий выявленных ко-регуляторов с помощью дрожжевой двугибридной системы (ДДС)

Для того, чтобы подтвердить результат, полученный в ходе массового скрининга белоксинтезирующих библиотек, нами были независимо клонированы кодирующие последовательности генов Psat2g003800 (белок PsN14) и Psat4g056040 (белок PsGASAl) для проверки возможности взаимодействия с белком PsIPD3/CYCLOPS в ДДС. В результате проведенных исследований нами было показано, что найденные в ходе анализа библиотеки белки действительно показывают способность к взаимодействию, так как клоны, трансформированные данными конструкциями, показывают способность к росту на селективной среде в присутствии ингибитора 3-АТ. При оценке роста колоний на средах с концентрациями 80 мМ и 90 мМ 3-AT мы увидели, что рост клеток, трансформированных конструкцией pDEST32 с кодирующей последовательностью PsSym33 и вектором pDEST22 без вставки (контроль) при низкой плотности культуры оказывается подавлен, тогда как клетки, несущие конструкции pDEST22 с кодирующими последовательностями генов интереса активно растут на селективных средах (Рис. 31).

Рисунок 31 — Анализ возможности взаимодействия белков, кодируемых геном PsSym33 и его мутантной версии sym33-3 с возможными ко-регуляторами Psat4g056040 (белок PsGASA1) и Psat2g003800 (белок PsN14) в дрожжевой двугибридной системе. СД — ДНК-связывающий домен транскрипционного фактор ОЛЬ4 (вектор рОБ8Т32), ЛЭ — Активационный домен (вектор рОБ8Т22). В качестве селективной среды использовалась минимальная среда БС (Табл. 11) с ингибирующей концентрацией 3-АТ (80 или 90 мМ).

Помимо этого, нами была изучена возможность взаимодействия укороченного белка РвГРВЗ/СУСЬОРБ, соответствующего мутантному белку ЗОБЕ1х--2 (БутЗЗ-З), с белками РвОЛ8Л1 (Рва14в056040) и рбш4 (Рва12§003800). В результате анализа нами было продемонстрировано, что дрожжи, трансформированные конструкциями с кодирующими последовательностями генов интереса, показывают возможность роста на

селективной среде с высокой концентрацией ингибитора 3-АТ. Таким образом, данные белки потенциально могут взаимодействовать c PsIPD3/CYCLOPS и, вероятно, это взаимодействие происходит с N-концевой частью этого белка (на основании анализа взаимодействия с укороченной версией белка PsIPD3/CYCLOPS), что требует более детальных исследований.

Таким образом, нами впервые были выявлены два новых потенциальных ко-регулятора транскрипционного фактора PsIPD3/CYCLOPS. Анализ экспрессии гомологов данных генов у близкого вида M. truncatula показывает их активацию в процессе развития бобово-ризобиального симбиоза уже на самых ранних стадиях. Ген PsN14 и его гомологи у других Бобовых являются уникальными генами, то есть не имеют паралогов, что является достаточно редким явлением для растительных геномов. Этот факт, а также характер индукции экспрессии данного гена на ранних стадиях развития клубеньков делает его потенциальным фактором регуляции развития ранних стадий клубенькообразования. Проведенный филогенетический анализ указывает и на разделение последовательностей гомологов PsN14 у Бобовых с детерминированным и недетерминированным типом клубенькообразования в подсемействе Мотыльковые. Другой выявленный регулятор PsGASA1, который относится к семейству пептидов GASA, может быть важным для специфичного узнавания симбионтов, что было показано для отдельных членов этого семейства. Следовательно, именно взаимодействие PsIPD3/CYCLOPS с новыми ко-регуляторами может быть причиной Fix-фенотипа мутантов, что делает их интересной целью для дальнейшего изучения.

3.4. Взаимодействие транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS с основными регуляторами фитогормонального ответа при развитии симбиоза у гороха и M. truncatula

Влияние транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS на регуляцию сигнальных путей, активируемых фитогормонами в процессе развития

бобово-ризобиального симбиоза, продемонстрирована в ряде работ. В частности, показано значительное снижение в уровне экспрессии генов, ответственных за биосинтез таких фитогормонов как цитокинины и гиббереллины в клубеньках мутантов SGEFix--5 (sym33-2) и SGEFix--2 (sym33-3) гороха (Dolgikh et al., 2020). Совместно с этим, эксперименты по анализу содержания активных форм гиббереллинов и цитокининов, проведенные с использование специфических антител и репортерных конструкций, указывают на значительное снижение в содержании данных фитогормонов в клубеньках мутантов SGEFix--5 (sym33-2) и SGEFix--2 (sym33-3) гороха (Dolgikh et al., 2020; Serova et al., 2019). Таким образом, существующие данные о снижении цитокининов и гиббереллинов в клубеньках мутантов свидетельствуют о существенных нарушениях в биосинтезе и ответе растений на эти гормоны при нарушении функционирования транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS.

Взаимодействие с компонентами фитогормональных сигнальных путей достигается и путем прямого взаимодействия с белковыми регуляторами. В частности, показано, что белки DELLA, являющиеся важнейшими репрессорами гиббереллинового ответа у растений гороха и M. truncatula, показывают способность к непосредственному взаимодействию с транскрипционным фактором IPD3/CYCLOPS (Dolgikh et al., 2019; Jin et al., 2016). Однако, до сих пор остается неясным, влияет ли мутация в гене ipd3/sym33 на взаимодействие с белками DELLA и сохраняется ли ответ на экзогенное добавление цитокининов и гиббереллинов у мутантов.

3.4.1. Оценка фенотипа мутанта SGEFix--2 (sym33-3) при обработке гиббереллиновой кислотой (ГА3)

Одной из ответных реакций при экзогенном применении гиббереллиновой кислоты (ГА3) в концентрациях выше 10-6 M для обработки растений гороха является снижение количество формирующихся клубеньков (Ferguson et al., 2005; Serova et a!., 2019). Помимо этого, у некоторых сортов (в

частности, у гороха линии БОБ), применение ГА3 вызывает явление бифуркации меристемы (Бегоуа е1 а1., 2019). Однако до сих пор не было изучено, сохраняется ли наблюдаемый эффект при обработке мутантов гороха по гену sym33 (ipd3/cyclops) экзогенно добавленной ГА3. Для проверки этого влияния нами была проведена обработка растений гороха линии БОБ и мутантных растений 8ОББ1х--2 (sym33-3) ГА3 в концентрации 10-5 и 10-6 М. После проведения обработки ГА3 на фоне инокуляции ризобиями R. johnstonii ^. leguminosarum) 3841 (3 недели после инокуляции) нами был оценен фенотип клубеньков, подсчитано их количество, а также проведена оценка биомассы побегов растений.

В результате проведенных экспериментов нами было выявлено снижение в количестве формирующихся клубеньков как у растений гороха дикого типа линии БОБ при применении ГА3 в концентрации 10-6 М, так и в случае обработки мутантных растений 8ОББ1х--2 (sym33-3) не было выявлено статистически значимого снижения в количестве формируемых клубеньков, хотя и была замечена тенденция к их снижению (Рис. 32Л). Фенотипические изменения клубеньков дикого типа линии БОБ, возникающие при обработке ГА3, выражались в формировании цилиндрических клубеньков более крупного размера (Рис. 32Г). У некоторых клубеньков также наблюдали возникновение бифуркации меристемы (Рис. 32Д). У мутанта 8ОББ1х--2 (sym33-3) клубеньки с бифуркацией меристемы наблюдались лишь изредка и эффект этот был слабо выражен. Стоит также отметить, что наблюдаемые у мутанта явления бифуркации меристемы были менее похоже на ситуацию, наблюдаемую у дикого типа, они больше походили на разрастание, связанное с огибанием зоны развития инфекционных нитей, характерное для данного мутанта и в норме (УогоБЫ1оуа е1 а1., 2009). При применении более высокой концентрации ГА3 равной 10-5 М наблюдалось статистически значимое снижение в количестве формируемых клубеньков как у растений дикого типа, так и у мутанта, то есть ингибирование ГА3 сохранялось у мутанта (Рис. 32Б).

Тем не менее, стоит отметить, что данный эффект был менее выражен у мутантных растений по сравнению с растениями дикого типа.

Рисунок 32 — Оценка влияния обработки гиббереллиновой кислоты на клубенькообразование у растений гороха дикого типа линии 8СЕ и мутанта 8СЕР1х--2 (БутЗЗ-З). Количество клубеньков при обработке растений гиббереллиновой кислотой в концентрации 10-6 М (А) и 10-5 М (Б). п = 8-9, 3 независимые биологические повторности. Фенотипы клубеньков, обработанных 10-6 М ГА3 у дикого типа (Г) и мутанта (Е). Контрольные растения дикого типа, обработанные водой (В). Белые стрелки указывают на бифуркации меристемы. Масштабная линейка 500 мкм.

Важно отметить, что ранее эксперименты по влиянию ГА3 на развитие симбиоза с грибами арбускулярной микоризы (АМ) у модельного бобового М. №ипсаШ1а показали, что мутант ipd3/cyclops гораздо более чувствителен к негативному влиянию ГА3 при развитии симбиоза с грибами АМ и даже низких концентраций фитогормона (10-9 М) было достаточно, чтобы блокировать развитие данного процесса у мутантов, но не у растений дикого типа. Однако при бобово-ризобиальном симбиозе мы, напротив, увидели некоторое ослабление эффекта воздействия гиббереллинов и менее

выраженное снижение количества формируемых клубеньков при обработке мутанта sym33-3. Таким образом, транскрипционный фактор, кодируемый геном Sym33, по-видимому, не задействован в гиббереллин-зависимой регуляции количества формируемых клубеньков.

3.4.2. Изучение возможность взаимодействия укороченных белков IPD3/CYCLOPS у мутантов и белков DELLA

Мы изучили нарушается ли способность к взаимодействию у укороченной версии белка Рв1РВ3/СУСЬОР8, синтезируемой у мутанта БОББ1х--2 (sym33-3) с белками ЭБЬЬЛ. Ранее мы показали, что в процессе развития симбиоза с ризобиями у гороха самый высокий уровень экспрессии наблюдается у гена PsDELLA1 (Бо^кИ е1 а1., 2019). С использованием ДДС нами было показано, что белки рбвбььл1 и PsIPD3/CYCLOPS действительно могут взаимодействовать друг с другом у гороха. Для проверки возможности взаимодействия мутантной версии белка PsIPD3/CYCLOPS, формирующейся у мутанта БОББ1х--2 (зут33-3), нами также была использована ДДС. С этой целью кодирующая последовательность, содержащая преждевременный стоп-кодон, который соответствовал таковому у мутанта, была клонирована в вектор рБББТ32. Кодирующая последовательность гена PsDELLA1 была клонирована в вектор рБББТ22. В результате проведенного анализа дрожжевые клетки, содержащие обе последовательности синтезируемых белков, показали способность к росту на селективных средах, что свидетельствует о возможности взаимодействия мутантного белка Бут33-3 с белком PsDELLA1 в данной системе, как это было показано и для полноразмерного белка дикого типа PsIPD3/CYCLOPS (Бут33) (Рис. 33).

Рисунок 33 — Оценка возможности взаимодействия укороченного белка у мутанта Sym33-3 и полноразмерного белка PsIPD3/CYCLOPS (IPD3) c белком PsDELLA1 в дрожжевой двугибридной системе. СД — ДНК-связывающий домен транскрипционного фактор GAL4 (вектор рБББТ32), ЛБ — Активационный домен (вектор рБББТ22). В качестве селективной среды использовалась минимальная среда БС (Табл. 11) с ингибирующей концентрацией 3-АТ (80 или 90 мМ).

Мутанты della у гороха и M. truncatula характеризуются значительным снижением количества формирующихся клубеньков, однако полного их отсутствия не наблюдается (Ferguson et al., 2005; Jin et al., 2016). Даже у тройного мутанта M. truncatula della1della2della3, характеризующегося наличием мутации во всех трех генах DELLA, присутствующих в геноме, сохраняется возможность к формированию функциональных клубеньков, хотя и в значительно сниженном количестве. Эти данные указывают на то, что белки DELLA в процессе развития симбиоза ответственны за эффективное проведение симбиотического сигнала и усиление его ответа. В частности, взаимодействие с белками DELLA необходимо для увеличения

эффективности фосфорилирования белка IPD3/CYCLOPS посредством регулятора CCaMK, что обеспечивается формированием тройного комплекса с участием данных белков. Таким образом, нарушение связывания с белками DELLA может выражаться в снижении эффективности передачи симбиотического сигнала и, как следствие, приводить к снижению числа формируемых клубеньков у мутанта.

У мутантов SGEFix--2 (sym33-3) и SGEFix--5 (sym33-2) гороха наблюдается значительное снижение в количестве формируемых клубеньков. Это было продемонстрировано и в наших экспериментах (Рис. 32). Однако, учитывая сохранение способности к взаимодействию с белком PsDELLA у редуцированного белка PsIPD3/CYCLOPS мутанта SGEFix--2 (sym33-3), наблюдаемое в таком мутанте снижение количества клубеньков, по-видимому, связано с другими нарушениями. В частности, с отсутствием активации генов-мишеней из-за мутации в ДНК-связывающем домене. Тем не менее сохранение ответа на обработку экзогенными гиббереллинами у мутанта, которое приводило к сокращению количества формирующихся клубеньков, может объясняться сохранением возможности взаимодействия с белком PsDELLA.

3.4.3. Изучение возможных механизмов, вызывающих снижение количества формирующихся клубеньков, у растений гороха при обработке гиббереллинами, а также оценка участия PsIPD3/CYCLOPS в данной регуляции

В настоящее время имеется ряд данных, указывающих на то, что снижение количества клубеньков под влиянием экзогенной обработки гиббереллинами, может быть связано с системной регуляцией под влиянием активации гена транскрипционного фактора NIN. Под влиянием транскрипционного фактора NIN может происходить активация генов CLE пептидов: LjCLE-RS1 и LjCLE-RS2 у модельного бобового L. japonicus и их гомологов генов MtCLE12 и MtCLE13 у M. truncatula. Пептиды, кодируемые

генами семейства CLE, играют ключевую роль в системной регуляции клубенькообразования (авторегуляции симбиоза) и для транскрипционного фактора NIN показана его способность к прямой регуляции их экспрессии путем связывания с промоторами генов LjCLE-RS1 и LjCLE-RS2, а также MtCLE12 и MtCLE13 (Laffont et al., 2020; Soyano et al., 2014).

Известно, что ген NIN является прямой мишенью транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS (в промоторе гена NIN присутствует последовательность, с которой связывается транскрипционный фактор IPD3/CYCLOPS). Однако, до сих пор остается неясным, является ли IPD3/CYCLOPS необходимым для активации NIN не только при развитии инфекционного процесса, но и при органогенезе. Исследования показывают, что в клубеньках мутантов гороха SGEFix--2 (sym33-3) и SGEFix--5 (sym33-2) индукция NIN снижена более чем в 100 раз по сравнению с клубеньками дикого типа (Dolgikh et al., 2020). Следует отметить, что если у мутанта SGEFix--5 (sym33-2) индукция гена NIN в клубеньках отсутствует полностью, то у мутанта SGEFix--2 (sym33-3) была выявлена небольшая активация данного гена. Что коррелирует с небольшим числом клубеньков, останавливающихся на ранней стадии развития, у мутанта SGEFix--5 (sym33-2) (Цыганов и др., 2012; Цыганова и др., 2019). Вместе с тем, в клубеньках мутанта M. truncatula (ipd3-1) уровень индукции гена NIN не оказывается снижен, хотя данные клубеньки характеризуются полным нарушением способности к фиксации и отсутствием выхода бактерий из инфекционных нитей. В связи с этим в настоящее время остается неясным, какую роль играет IPD3/CYCLOPS-зависимая активация NIN при органогенезе клубеньков и существуют ли другие механизмы активации данного гена и в регуляции каких процессов они задействованы.

3.5. Механизмы поддержания фитогормонального гомеостаза в клубеньке и возможная роль IPD3/CYCLOPS в данном процессе

Фенотип, наблюдаемый у мутантов ipd3/cyclops, может отчасти объясняться и отсутствием индукции генов, которые в норме активируются этим транскрипционным фактором. Изучая список генов, экспрессия которых оказывается снижена в клубеньках мутанта SGEFix--2 (sym33-3) по сравнению с клубеньками растений дикого типа SGE по результатам анализа NGS-секвенирования РНК (RNA-seq анализ), мы выяснили, что среди таких генов обнаруживается несколько представителей белков суперсемейства TALE.

Известно, что члены суперсемейства белков TALE способны прямо и опосредованно контролировать экспрессию генов, контролирующих метаболизм фитогормонов гиббереллинов и цитокининов и включают семейство транскрипционных факторов KNOTTED1-like homeobox (KNOX), а также семейство BEL-like (BELL). Возможность представителей данного суперсемейства контролировать биосинтез генов, связанных с биосинтезом фитогормонов, а также данные о снижении уровня экспрессии нескольких представителей генов KNOX и BELL в клубеньках мутанта SGEFix--2 (sym33-3) сделало их перспективной целью для нашего исследования. К тому же, если роль белков KNOX в процессе бобово-ризобиального симбиоза была изучена ранее (Azarakhsh et al., 2015, 2020; Di Giacomo et al., 2017), то роль белков BELL оставалась неизученной.

В ходе полногеномного анализа по поиску генов семейства BELL в геноме гороха и M. truncatula нами было обнаружено присутствие 14 генов, относящихся к данному семейству у обоих видов (Рис. 34).

АТН1 A.lhaliana A MtrunA17_Chr1g0151681 ■ Psat6g019760 • BLH11 A-thaliana A MtrunAI 7_Chr3g0141931 ■ Psat5g015400 • BLH3 A.thaliana A BLH10 A.thaliana A BLH7 A.thaliana A BLH6A.thaliana A MtrunAI 7_Chr1g0155681 Psa16gQ07960 • MtrunAI 7_Chr3g0141941 Psat5g015360 • MtrunAI 7_Chr4g0025521 ■ Psa17g205080 • BLH5A.thaliana A BLH1 A.thaliana A MtrunAI 7_Chr7g0267481 Psat3g028480 • MtrunAI 7_Chr1g0177751 ■ Psat0s189g0030 • BEL1 A.thaliana A Psat7g031320 • MtrunAI 7_Chr8g0387321 ■ BLH4 A.thaliana SAW2 A BLH2 A.thaliana SAW1 A MtrunAI 7_Chr8g0373801 ■ Psat4g090560 • MtrunAI 7_Chr5g0403251 ■ Psat2g162960 • BLH9 A.thaliana BLR A MtrunAI 7_Chr4g0008591 ■ Psat7g241960 • MtrunAI 7_Chr7g0240371 ■ Psat3g133160 • BLH8 A.thaliana PNF A MtrunAI 7_Chr4g 0028701 Psat7g192320 • MtrunAI 7_Chr2g0327021 ■ Psa15g279880 •

Рисунок 34 — Филогенетическое дерево, построенное на основе выравнивания аминокислотных последовательностей белков семейства BEL-like M. truncatula, гороха и A. thaliana. Построение дерева осуществлялось с использованием метода Максимального правдоподобия (Maximum likelihood), значения меры поддержки ветвей получены на основе 1000 бутстрепов.

Основываясь на доступных данных анализа транскриптомов инокулированных корней и клубеньков для Ы. truncatula, нами была оценена экспрессия генов данного семейства на разных этапах развития бобово-ризобиального симбиоза и было показано, что наиболее активная индукция уже на ранних стадиях после инокуляции показана для генов MtBELL1-1,

МгВЕЬЬ1-2, МГБЕШ-4, МГБЕШ-5, МГБЕШ-7 и МГБЕШ-8 (1 - 7 сутки после инокуляции) (Рис. 35). При этом индукция для гена М1ВЕЬЬ1-2 была обнаружена не только на ранних стадиях развития симбиоза, но и в сформированных клубеньках. Это указывало на важную роль М1ВЕЬЬ1-2 в контроле развития симбиоза.

Рисунок 35 — Оценка экспрессии генов BELL в корнях и клубеньках M. truncatula при инокуляции ризобиями. Анализ экспрессии проведен на основании ранее опубликованных транскриптомных данных (Schiessl et al., 2019).

Для оценки уровня экспрессии гомологичных генов PsBELL в корнях гороха при инокуляции ризобиями, был проведен анализ количественная ПЦР, совмещенная с обратной транскрипцией. Динамика экспрессии генов PsBELL была оценена на разных стадиях развития симбиоза после инокуляции гороха сорта Сатеог бактериями Я. ]окт1опи 3841. Было обнаружено, что уровень экспрессии гена PsBELL1-2 был увеличен в инокулированных корнях по

сравнению с контрольными уже на начальных этапах развития симбиоза (через 5 дней после инокуляции) и достиг максимального уровня в клубеньках (14 дней), как было также показано для гомолога этого гена у M. truncatula на основе транскриптомного анализа (Рис. 36).

Рисунок 36 — Анализ экспрессии генов Р8ББЬЬ при инокуляции корней гороха сорта Сатеог ризобией Я. ]ок81ош 3841 методом количественной ПЦР, совмещенной с обратной транскрипцией. Для анализа использовали данные 3-х биологических повторностей для каждой группы. Для оценки статистической значимости использовали анализ Краскела-Уоллиса, разные буквы означают статистически различающиеся группы значений.

Таким образом, для двух видов бобовых была показана индукция генов Р$БЕЕЕ1-2 и М1БЕЬЬ1-2 как на начальных этапах развития симбиоза, так и в зрелых клубеньках. Полученные данные свидетельствовали о важной роли гена Р8БЕЬЬ1-21М1БЕЬЬ1-2 в процессе развития симбиоза. В связи с этим именно изучение влияния генов Р8БЕЬЬ1-21М1БЕЬЬ1-2 и сделали их важной целью для дальнейшего изучения.

3.5.1. Изучение функциональной роли транскрипционного фактора БЕЬЬ1-2 и его способности влиять на индукцию генов биосинтеза гиббереллина

Для изучения функциональной роли РбБЕЬЬ1-2 и его гомолога у М. 1гипсаШ1а М1БЕЬЬ1-2 нами в первую очередь была изучена локализация активности промотора гена М1БЕЬЬ1-2 путем создания конструкции, в которой под его контролем находился репортерный ген, кодирующий фермент Р-глюкоронидазу (рМ1БЕЬЬ1-2::ОШ5). С помощью данной конструкции была оценена активность промотора размером 3 т.п.о. до старт-кодона и было показано, что активность Р-глюкоронидазы, соответствующая синему окрашиванию, наиболее сильна в области зоны инфекции (Рис. 37А, Б).

Рисунок 37 — Локализация активности фермента ß-глюкоронидазы, кодируемой геном GUS под контролем промотора гена MtBELL1-2 (pMtBELL1-2::GUS) в клубеньках M. truncatula. На рисунке А изображен срез клубенька с локализацией активности ß-глюкоронидазы (синий цвет). Изображение получено с использованием светового микроскопа. На рисунке Б изображен тот же клубенек, но с большим увеличением в области зоны инфекции (ZII) и меристемы (ZI). Используемые обозначения: ZI — меристема клубенька, ZIIp — проксимальная часть зоны инфекции, ZIId — дистальная часть зоны инфекции, ZIII — зона азотфиксации. Шкала масштаба 100 мкм.

Использование данной конструкции для трансформации растений

гороха показало, что в трансгенных клубеньках мы наблюдали локализацию активности промотора pMtBELL1-2 в зоне инфекции, но не в зоне меристемы (сходным образом с клубеньками M. truncatula), что свидетельствует о консервативности регуляторных последовательностей в составе промотора (Рис. 38).

ZI

_ А

Рисунок 38 — Локализация активности фермента ß-глюкоронидазы, кодируемой геном GUS под контролем промотора гена MtBELL1-2 (pMtBELL1-2::GUS) в клубеньках гороха сорта Cameor. На рисунках А и Б изображен срез клубенька с локализацией активности ß-глюкоронидазы (синий цвет). Изображение получено с использованием светового микроскопа. Шкала масштаба 200 мкм. Используемые обозначения: ZI — меристема клубенька, ZII — зоны инфекции, ZIII — зона азотфиксации.

Для изучения функциональной роли BELL1-2 в процессе развития бобово-ризобиального симбиоза нами было изучено, какие фенотипические проявления могут быть связаны с подавлением уровня экспрессии данного гена. Для этого нами были созданы конструкции для снижения уровня экспрессии PsBELL1-2 и MtBELL1-2 с помощью метода РНК-интерференции у гороха и M. truncatula, соответственно.

В результате подавления уровня экспрессии гена MtBELL1-2 c помощью РНК-интерференции у M. truncatula, был обнаружен такой фенотипический

эффект как увеличение размера инфекционной зоны в клубеньках, содержащей разветвленную сеть инфекционных нитей (Рис. 39). Интересно, что сложная сеть инфекционных нитей характерна и для клубеньков мутанта М. 1гипсаШ1а ТЯ3 (ipd3-1), дефектного по гену ipd3. Учитывая, что согласно транскриптомным данным и данным количественного ПЦР-анализа ген М1БЕЬЬ1-2 в клубеньках мутанта ipd3 практически не индуцируется, по сравнению с диким типом, мы можем предположить, что наблюдаемый фенотип мутанта ipd3-1 может хотя бы отчасти объясняться отсутствием индукции гена М1БЕЬЬ1-2 в таких клубеньках.

Рисунок 39 — Увеличение инфекционной зоны ^П) в клубеньках М. 1гипеаШ1а со сниженным уровнем экспрессии гена М1БЕЬЬ1-2.

Конфокальная лазерная микроскопия срезов 2-недельных клубеньков М. 1гипсаШ1а, сформировавшихся на трангсенных корнях с подавлением

экспрессии гена MtBELL1-2 (А) и трансформированных контрольной конструкцией (GUS OE), полученных при инокуляции бактерией E. meliloti 2011, несущей метку GFP (A) и mRFP (Б). Шкала масштаба 200 мкм. На рисунке В представлены результаты подсчета соотношения площадей ZII, содержащей колонизированные клетки и ZIII (зоны азотфиксации). Для оценки статистической значимости использовали критерий Уилкоксона. На рисунке Г продемонстрировано снижение уровня экспрессии MtBELL1-2 в клубеньке, полученного при РНК-интерференции гена. Для оценки статистической значимости был использован t-критерий Cтьюдента (t-тест).

Логично предположить, что в таком случае сверхэкспрессия MtBELL1-2 в таких мутантных клубеньках могла бы приводить к восстановлению нормального фенотипа. Для проверки этой гипотезы нами была осуществлена сверхэкспрессия гена MtBELL1-2 под контролем конститутивного промотора p35S. Однако, изучив морфологию таких клубеньков мы пришли к выводу, что клубеньки мутанта со сверхэкспрессией гена MtBELL1-2 не отличались от клубеньков контрольных растений, трансформированных конструкцией для сверхэкспрессии гена uidA (GUS-OE). Полученный результат может объясняться тем, что промотор p35S не обеспечивает необходимого специфического пространственно-временного паттерна экспрессии, который нужен для обеспечения функциональной активности гена MtBELL1-2. Использование же родного промотора гена MtBELL1-2 в данном случае также не представляется возможным, поскольку в мутантных корнях индукция данного гена снижена, а значит, экспрессия гена, скорее всего, не будет активирована.

Поскольку известно, что гены семейства BELL способны прямо или опосредовано регулировать экспрессию генов, ассоциированных с биосинтезом гиббереллинов, нами была проведена оценка экспрессии гена GA20ox1, ответственного за синтез активных форм гиббереллинов в клубеньках гороха и M. truncatula с подавлением уровня экспрессии PsBELL1-

2/М1БЕЬЬ1-2. Действительно, в обоих случаях нами было детектировано статистически значимое снижение уровня экспрессии Р80Л20ох1 и М10Л20ох1, соответственно (Рис. 40).

Рисунок 40 — Оценка уровня экспрессии генов PsGA20ox1 и MtGA20ox1 при РНК-интерференции гена PsBELL1-2 в клубеньках гороха (А) и гена MtBELL1-2 в клубеньках M. truncatula (Б). Для каждой группы в анализ вошли данные 7-8 образцов из 3-х независимых биологических повторностей. Для оценки статистической значимости при парных сравнениях использовали ^критерий Стьюдента (^тест) или критерий Уилкоксона как его непараметрический аналог. Для оценки нормальности распределения данных использовали критерий Шапиро-Уилка.

Таким образом, одной из возможных причин увеличения зоны инфекции в клубеньках с РНК-интерференцией гена М1БЕЬЬ1-2 может быть снижение содержания активных форм гиббереллинов, поскольку ряд исследований показывает, что у мутантов, характеризующихся нарушениями в генах, кодирующих ферменты биосинтеза данного фитогормона, наблюдается такой фенотипический эффект как избыточное количество возникающих инфекционных нитей и их ветвление (McAdam et al., 2018; Velandia et al., 2022). Как было отмечено ранее, в клубеньках мутанта SGEFix--2 (зуш33-3) уровень экспрессии гена Р80Л20ох1, контролирующего биосинтез

гиббереллинов, оказывается значительно снижен, поэтому мы можем предположить, что этот эффект хотя бы отчасти может быть объяснен нарушением индукции гена PsBELL1-2 у мутанта.

Проведенные нами эксперименты по обработке мутанта SGEFix--2 (sym33-3) гиббереллиновой кислотой показали сохранение его способности к гиббереллин-индуцируемому снижению количества формирующихся клубеньков. Таким образом, мы можем предположить, что или IPD3/CYCLOPS не участвует в регуляции данного процесса снижения, либо у укороченной версии этого транскрипционного фактора сохраняется способность взаимодействовать с регуляторами гиббереллинового ответа (белком DELLA), что необходимо для контроля количества формирующихся клубеньков. По-видимому, может быть важна его роль в клубенькообразовании не как транскрипционного фактора, активирующего гены-мишени, а как белкового ко-регулятора, что и приводит к Fix- фенотипу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Транскрипционный фактор IPD3/CYCLOPS играет одну из ключевых ролей в контроле формирования бобово-ризобиального симбиоза. Однако точные механизмы, посредством которых данный регулятор влияет на органогенез формирующегося клубенька, а также на рост инфекционных нитей и высвобождение из них бактерий в цитоплазму растительной клетки, остаются неясными.

Предметом нашего изучения стала доменная структура IPD3/CYCLOPS у двух видов бобовых растений, сходным образом формирующих клубеньки недетерминированного типа, и оценка того, как нарушения в этой структуре могут влиять на способность данного регулятора взаимодействовать с другими белками, а также влиять на активацию генов-мишеней. В частности, нами было продемонстрировано, что для обеспечения функциональной активности IPD3/CYCLOPS важны не только его активирующий (AD) и ДНК-связывающий домены (DBD), расположенные на Оконце белка, но и N концевой домен (N0), функция которого до сих пор оставалась плохо изученной. В проведенных нами экспериментах по комплементации мутантов $ОЕЕ1х--2 (sym33-3) гороха и ТЯ3 (ipd3-1) M. truncatula лишь трансформация растений конструкцией с полной кодирующей последовательностью гена PsIPD3/CYCLOPS приводила к восстановлению нормального фенотипа клубенька, тогда как последовательностей активирующего (АО) и ДНК-связывающего (ОВО) доменов было недостаточно. Таким образом, нами была продемонстрирована важная роль К-концевого домена в обеспечении функциональности данного транскрипционного фактора. Вероятно, это может объясняться влиянием данного домена либо на пространственную структуру этого транскрипционного фактора, либо на его взаимодействие с новыми ко-регуляторами, работающими с IPD3/CYCLOPS в комплексе. Проверке этих предположений и детальному изучению и была посвящена часть наших исследований.

Нам удалось показать, что для обеспечения индукции экспрессии гена PsIPD3/CYCLOPS важным может быть участие разных регуляторных мотивов в его промоторе. Мы продемонстрировали, что экспрессия кодирующей последовательности гена PsIPD3/CYCLOPS под контролем конститутивного промотора p35S не приводила к восстановлению фенотипа, тогда как использование нативного промотора гена PsIPD3/CYCLOPS размером 1,5 т.п.о. до старт-кодона позволило комплементировать мутацию. Помимо этого, при трансформации данной конструкцией pIPD3::PsIPD3/CYCLOPS гомологичного мутанта M. truncatula TR3 (ipd3-1) мы также увидели восстановление нормального фенотипа клубеньков. Таким образом, регуляторные последовательности, содержащиеся в промоторе гена PsIPD3/CYCLOPS, по-видимому, являются универсальными, по крайней мере, для Бобовых с недетерминированным типом клубенькообразования.

Важную роль в контроле развития бобово-ризобиального симбиоза играют фитогормоны гиббереллины и в предыдущих исследованиях продемонстрировано, что у мутантов гороха SGEFix--5 ^ш33-2) и SGEFix--2 ^уш33-3) биосинтез гиббереллинов в клубеньках существенно снижен. Однако не было изучено, остаются ли эти мутанты гороха чувствительны к гиббереллину. В настоящей работе нами было показано, что у мутанта SGEFix--2 ^уш33-3) действительно сохраняется способность к гиббереллин-зависимому снижению количества формирующихся клубеньков.

Известно, что ко-регуляторами транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS являются белки DELLA — важнейшие участники гиббереллинового ответа у растений. Транскрипционный фактор IPD3/CYCLOPS способен формировать комплекс с белком DELLA1 у гороха, что было показано с помощью дрожжевой двугибридной системы. Проведенные нами эксперименты по оценке возможности взаимодействия мутантного белка IPD3/CYCLOPS, соответствующего укороченной его версии у мутанта sym33-3 (размер белка - 453 аминокислоты), и белка PsDELLA1 также показали возможность формирования между ними комплекса. Таким

образом, сохранение у мутантного белка возможности взаимодействия с DELLA может быть объяснением сохранения чувствительности к воздействию гиббереллинов у мутанта, что может быть важным для формирования клубеньков (Fix- фенотип).

Следующая часть работы была посвящена изучению потенциальных мишеней транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS, в частности, транскрипционного фактора BELL1-2. Нам удалось показать, что снижение экспрессии гена GA20ox1, контролирующего биосинтез гиббереллина у мутантов гороха sym33-2, sym33-3 и M. truncatula ipd3-1, может быть опосредовано транскрипционным фактором BELL1-2, который является потенциальной мишенью IPD3/CYCLOPS. Ранние работы показывают, что существенное снижение экспрессии PsBELL1-2 в клубеньках мутанта sym33-3, а также проведенные нами исследования по влиянию сверхэкспрессии и подавлению активности BELL1-2 посредством РНК-интерференции демонстрируют наличие связи между изменением уровня экспрессии данного гена и уровня экспрессии гена GA20ox1.

Самой большой загадкой является участие IPD3/CYCLOPS в контроле органогенеза клубенька. Открытие гена MtIPD3-like, являющегося паралогом MtIPD3 в геноме M. truncatula и наблюдаемый у двойного мутанта ipd3/ipd3-like по данным генам Коё--фенотип, предполагают необходимость IPD3-like гена для органогенеза. Однако проведенные нами в настоящей работе исследования по поиску гомолога гена IPD3-like в геномах других Бобовых показали, что у большинства из них ген IPD3/CYCLOPS уникален. В частности, у гороха не обнаружено гомолога IPD3-like ни в опубликованном геноме гороха сорта Cameor, ни у сорта ZW6.

Возможным объяснением данного феномена является наличие ко-регуляторов, взаимодействие которых с IPD3/CYCLOPS необходимо для контроля морфогенеза клубенька. В этом случае наличие мутации только по гену ipd3/cyclops, но не генам ко-регуляторов, может быть причиной сохраннения способности формирования клубеньков у таких мутантов. В ходе

поиска новых ко-регуляторов IPD3/CYCLOPS при скрининге белоксинтезирующей библиотеки с помощью дрожжевой двугибридной системы, нами были выявлены возможные ко-регуляторы, способные взаимодействовать с белками PsGASA1 (Psat4g056040) и белком PsN14 (Psat2g003800). Анализируя уровень экспрессии гомологов этих генов у M. truncatula, мы пришли к выводу, что оба этих регулятора активируются уже на самых ранних этапах развития клубеньков, а значит могут принимать участие в контроле морфогенеза этого органа. Изучение роли данных ко-регуляторов представляет особый интерес для дальнейшей работы.

Таким образом, проведенные нами исследования позволили детально изучить механизмы регуляции развития симбиоза с участием транскрипционного фактора IPD3/CYCLOPS, особенности регуляции экспрессии этого гена и важности регуляторных мотивов в промоторе, изучить функциональную роль доменов этого белка, а также найти новые ко-регуляторы, взаимодействие с которыми и может приводить к сохранению способности к клубенькообразованию у мутантов. Продолжение исследований в этой области могут привести к развитию новых подходов для регуляции процессов морфогенеза клубенька у культур, имеющих важное сельскохозяйственное значение, а также оптимизации условий использования ресурсов, таких как удобрения, что является особенно актуальным в условиях изменения климата и роста населения.

149 ВЫВОДЫ

1. Поиск в геномных базах данных показал отсутствие гомолога гена MtIPD3-like в геномах разных сортов гороха и большинства других бобовых растений.

2. Было выявлено наличие специфичных регуляторных сайтов в промоторе гена PsIPD3/CYCLOPS, необходимых для комплементации мутантов SGEFix--2 (sym33-3) гороха и ТЯ3 (ipd3-1) M. truncatula с использованием полной кодирующей последовательности данного гена, что свидетельствует об универсальности данного промотора для двух видов бобовых растений.

3. Исследована роль К-концевого (ND), активирующего (AD) и ДНК-связывающего (DBD) доменов транскрипционного фактора PsIPD3/CYCLOPS в контроле развития инфекции и органогенеза у клубеньков у гороха. Было показана функциональная значимость КЭ домена для восстановления нормального развития инфекции и формирования розовых клубеньков у мутантов SGEFix--2 (sym33-3) гороха и ТЯ3 (ipd3-1) M. truncatula.

4. При скрининге библиотеки кДНК с помощью дрожжевого двугибридного анализа обнаружены новые ко-регуляторы транскрипционого фактора PsIPD3/CYCLOPS - регулируемый гиббереллином белок PsGASA1 ^а14§056040) и белок PsN14 ^а12§003800). Показано взаимодействие данных белков с укороченным мутантным белком PsIPD3/CYCLOPS, синтезируемым у мутанта линии SGEFix--2 (sym33-3).

5. Показано сохранение способности к взаимодействию укороченного мутантного белка PsIPD3/CYCLOPS, синтезируемого у мутанта линии SGEFix--2 (sym33-3), с регулятором гиббереллиного ответа PsDELLA1. У этого мутанта гороха сохранялась чувствительность к гиббереллин-зависимому снижению количества формирующихся клубеньков.

6. Среди мишеней PsIPD3/CYCLOPS выявлен транскрипционный фактор PsBELL1-2, который оказался необходим для инфицирования клубенька и контроля биосинтеза гиббереллинов в этом процессе.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Du R., Niu S., Liu Y., Sun X., Porth I., El-Kassaby Y. A., Li W. The gibberellin GID1-DELLA signalling module exists in evolutionarily ancient conifers // Scientific Reports. 2017. № 1 (7). C. 16637. D01:10.1038/s41598-017-11859-w.

2. Abel S., Theologis A. Early genes and auxin action // Plant Physiology. 1996. № 1 (111). C. 9-17. D01:10.1104/pp.111.1.9.

3. Achard P., Genschik P. Releasing the brakes of plant growth: how GAs shutdown DELLA proteins // Journal of Experimental Botany. 2009. № 4 (60). C. 1085-1092. D0I:10.1093/jxb/ern301.

4. Adema K., Kohlen W. The symbiosome—a transient organelle in evolution // Journal of Experimental Botany. 2024. № 11 (75). C. 3209-3213. DOI: 10.1093/jxb/erae152.

5. Akamatsu A., Nagae M., Nishimura Y., Romero Montero D., Ninomiya S., Kojima M., Takebayashi Y., Sakakibara H., Kawaguchi M., Takeda N. Endogenous gibberellins affect root nodule symbiosis via transcriptional regulation of NODULE INCEPTION in Lotus japonicus // The Plant Journal. 2021. № 6 (105). C. 15071520. DOI: 10.1111/tpj.15128.

6. Ane J.-M., Kiss G. B., Riely B. K., Penmetsa R. V., Oldroyd G. E. D., Ayax C., Levy J., Debelle F., Baek J.-M., Kalo P., Rosenberg C., Roe B. A., Long S. R., Denarie J., Cook D. R. Medicago truncatula DMI1 required for bacterial and fungal symbioses in legumes // Science (New York, N.Y.). 2004. № 5662 (303). C. 13641367. DOI: 10.1126/science.1092986.

7. Ane J.-M., Levy J., Thoquet P., Kulikova O., Billy F. de, Penmetsa V., Kim D.-J., Debelle F., Rosenberg C., Cook D. R., Bisseling T., Huguet T., Denarie J. Genetic and cytogenetic mapping of DMI1, DMI2 , and DMI3 genes of Medicago truncatula involved in Nod factor transduction, nodulation, and mycorrhization // Molecular Plant-Microbe Interactions®. 2002. № 11 (15). C. 1108-1118. DOI: 10.1094/MPMI.2002.15.11.1108.

8. Ariel F., Brault-Hernandez M., Laffont C., Huault E., Brault M., Plet J., Moison M., Blanchet S., Ichante J. L., Chabaud M., Carrere S., Crespi M., Chan R. L., Frugier F. Two Direct Targets of Cytokinin Signaling Regulate Symbiotic Nodulation in Medicago truncatula // The Plant Cell. 2012. №№ 9 (24). C. 3838-3852. DOI: 10.1105/tpc. 112.103267.

9. Arrighi J.-F., Barre A., Amor B. Ben, Bersoult A., Soriano L. C., Mirabella R., Carvalho-Niebel F. De, Journet E.-P., Gherardi M., Huguet T., Geurts R., Denarie J., Rouge P., Gough C. The Medicago truncatula Lysine Motif-Receptor-Like Kinase Gene Family Includes NFP and New Nodule-Expressed Genes // Plant Physiology. 2006. № 1 (142). C. 265-279. D01:10.1104/pp.106.084657.

10. Arrighi J.-F., Godfroy O., Billy F. De, Saurat O., Jauneau A., Gough C. The RPG gene of Medicago truncatula controls Rhizobium -directed polar growth during infection // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2008. № 28 (105). C. 9817-9822. D0I:10.1073/pnas.0710273105.

11. Aubert D., Chevillard M., Dorne A.-M., Arlaud G., Herzog M. Expression patterns of GASA genes in Arabidopsis thaliana: the GASA4 gene is up-regulated by gibberellins in meristematic regions // Plant Molecular Biology. 1998. № 6 (36). C. 871-883. DOI: 10.1023/A: 1005938624418.

12. Azarakhsh M., Kirienko A. N., Zhukov V. A., Lebedeva M. A., Dolgikh E. A., Lutova L. A. KNOTTED 1 -LIKE HOMEOBOX 3: a new regulator of symbiotic nodule development // Journal of Experimental Botany. 2015. № 22 (66). C. 71817195. DOI:10.1093/jxb/erv414.

13. Azarakhsh M., Rumjantsev A., Lebedeva M., Lutova L. Cytokinin biosynthesis genes expressed during nodule organogenesis are directly regulated by the KNOX3 protein in Medicago truncatula // PLOS ONE. 2020. (15). C. e0232352. DOI: 10.1371/journal.pone.0232352.

14. Battaglia M., Ripodas C., Clua J., Baudin M., Aguilar O. M., Niebel A., Zanetti M. E., Blanco F. A. A Nuclear Factor Y Interacting Protein of the GRAS Family Is Required for Nodule Organogenesis, Infection Thread Progression, and Lateral Root

Growth // Plant Physiology. 2014. № 3 (164). C. 1430-1442. DOI:10.1104/pp.113.230896.

15. Bek A. S., Sauer J., Thygesen M. B., Duus J. 0., Petersen B. O., Thirup S., James E., Jensen K. J., Stougaard J., Radutoiu S. Improved Characterization of Nod Factors and Genetically Based Variation in LysM Receptor Domains Identify Amino Acids Expendable for Nod Factor Recognition in Lotus spp. // Molecular Plant-Microbe Interactions®. 2010. № 1 (23). C. 58-66. DOI:10.1094/MPMI-23-1-0058.

16. Benjamins R., Scheres B. Auxin: The Looping Star in Plant Development // Annual Review of Plant Biology. 2008. № 1 (59). C. 443-465. DOI: 10.1146/annurev.arplant.58.032806.103805.

17. Berg C. Van Den, Willemsen V., Hendriks G., Weisbeek P., Scheres B. Short-range control of cell differentiation in the Arabidopsis root meristem // Nature. 1997. № 6657 (390). C. 287-289. DOI:10.1038/36856.

18. Boogerd F. C., Rossum D. van Nodulation of groundnut by Bradyrhizobium : a simple infection process by crack entry // FEMS Microbiology Reviews. 1997. № 1 (21). C. 5-27. DOI: 10.1111/j.1574-6976.1997.tb00342.x.

19. Boonpa K., Tantong S., Weerawanich K., Panpetch P., Pringsulaka O., Yingchutrakul Y., Roytrakul S., Sirikantaramas S. Heterologous expression and antimicrobial activity of OsGASR3 from rice (Oryza sativa L.) // Journal of Plant Physiology. 2018. (224-225). C. 95-102. DOI:10.1016/j.jplph.2018.03.013.

20. Bouteraa M. T., Romdhane W. Ben, Hsouna A. Ben, Amor F., Ebel C., Saad R. Ben Genome-wide characterization and expression profiling of GASA gene family in Triticum turgidum ssp. durum (desf.) husn. (Durum wheat) unveils its involvement in environmental stress responses // Phytochemistry. 2023. (206). C. 113544. DOI: 10.1016/j .phytochem.2022.113544.

21. Breakspear A., Liu C., Roy S., Stacey N., Rogers C., Trick M., Morieri G., Mysore K. S., Wen J., Oldroyd G. E. D. D., Downie J. A., Murray J. D. The Root Hair "Infectome" of Medicago truncatula Uncovers Changes in Cell Cycle Genes

and Reveals a Requirement for Auxin Signaling in Rhizobial Infection // The Plant Cell. 2014. № 12 (26). C. 4680-4701. D01:10.1105/tpc.114.133496.

22. Brewin N. J. Development of the legume root nodule. // Annual review of cell biology. 1991. (7). C. 191-226. D0I:10.1146/annurev.cb.07.110191.001203.

23. Bruneau A., Doyle J. J., Herendeen P., Hughes C., Kenicer G., Lewis G., Mackinder B., Pennington R. T., Sanderson M. J., Wojciechowski M. F., Boatwright S., Brown G., Cardoso D., Crisp M., Egan A., Fortunato R. H., Hawkins J., Kajita T., Klitgaard B., Koenen E., Lavin M., Luckow M., Marazzi B., McMahon M. M., Miller J. T., Murphy D. J., Ohashi H., Queiroz L. P. de, Rico L., Särkinen T., Schrire B., Simon M. F., Souza E. R., Steele K., Torke B. M., Wieringa J. J., Wyk B.-E. van Legume phylogeny and classification in the 21st century: Progress, prospects and lessons for other species-rich clades // TAXON. 2013. № 2 (62). C. 217-248. DOI: 10.12705/622.8.

24. Bullock W. O., Fernandez J. M., Short J.M. XL1-Blue—a high-efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli strain with ß-galactosidase selection // Biotechniques. 1987. № 3 (5). C. 376-379.

25. Bürglin T. R., Affolter M. Homeodomain proteins: an update // Chromosoma. 2016. № 3 (125). C. 497-521. D0I:10.1007/s00412-015-0543-8.

26. Camps C., Jardinaud M. F., Rengel D., Carrère S., Hervé C., Debellé F., Gamas P., Bensmihen S., Gough C. Combined genetic and transcriptomic analysis reveals three major signalling pathways activated by Myc-LCOs in Medicago truncatula // New Phytologist. 2015. № 1 (208). C. 224-240. DOI:10.1111/nph.13427.

27. Capoen W., Sun J., Wysham D., Otegui M. S., Venkateshwaran M., Hirsch S., Miwa H., Downie J. A., Morris R. J., Ané J.-M., Oldroyd G. E. D. Nuclear membranes control symbiotic calcium signaling of legumes // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2011. № 34 (108). C. 14348-14353. DOI: 10.1073/pnas.1107912108.

28. Cardoso D., Queiroz L. P. De, Pennington R. T., Lima H. C. De, Fonty É.,

Wojciechowski M. F., Lavin M. Revisiting the phylogeny of papilionoid legumes: New insights from comprehensively sampled early-branching lineages // American Journal of Botany. 2012. № 12 (99). C. 1991-2013. DOI:10.3732/ajb. 1200380.

29. Casse F., Boucher C., Julliot J. S., Michel M., Denarie J. Identification and Characterization of Large Plasmids in Rhizobium meliloti using Agarose Gel Electrophoresis // Journal of General Microbiology. 1979. № 2 (113). C. 229-242. DOI: 10.1099/00221287-113-2-229.

30. Catoira R., Timmers A. C. J., Maillet F., Galera C., Penmetsa R. V., Cook O., Denarie J., Gough C. The HCL gene of Medicago truncatula controls Rhizobium -induced root hair curling // Development. 2001. № 9 (128). C. 1507-1518. DOI: 10.1242/dev. 128.9.1507.

31. Cenci A., Rouard M. Evolutionary Analyses of GRAS Transcription Factors in Angiosperms // Frontiers in Plant Science. 2017. (8). DOI:10.3389/fpls.2017.00273.

32. Cerri M. R., Wang Q., Stolz P., Folgmann J., Frances L., Katzer K., Li X., Heckmann A. B., Wang T. L., Downie J. A., Klingl A., Carvalho-Niebel F. De, Xie F., Parniske M. The ERN1 transcription factor gene is a target of the CC a MK / CYCLOPS complex and controls rhizobial infection in Lotus japonicus // New Phytologist. 2017. № 1 (215). C. 323-337. DOI:10.1111/nph.14547.

33. Charpentier M., Sun J., Vaz Martins T., Radhakrishnan G. V, Findlay K., Soumpourou E., Thouin J., Very A.-A., Sanders D., Morris R. J., Oldroyd G. E. D. Nuclear-localized cyclic nucleotide-gated channels mediate symbiotic calcium oscillations // Science (New York, N.Y.). 2016. № 6289 (352). C. 1102-1105. DOI: 10.1126/science.aae0109.

34. Chen H., Banerjee A. K., Hannapel D. J. The tandem complex of BEL and KNOX partners is required for transcriptional repression of ga20ox1 // The Plant Journal. 2004. № 2 (38). C. 276-284. DOI:10.1111/j.1365-313X.2004.02048.x.

35. Choi I.-S., Cardoso D., Queiroz L. P. De, Lima H. C. De, Lee C., Ruhlman T. A., Jansen R. K., Wojciechowski M. F. Highly Resolved Papilionoid Legume

Phylogeny Based on Plastid Phylogenomics // Frontiers in Plant Science. 2022. (13). C. 823190. D01:10.3389/fpls.2022.823190.

36. Clarke V. C., Loughlin P. C., Day D. A., Smith P. M. C. Transport processes of the legume symbiosome membrane // Frontiers in Plant Science. 2014. (5). DOI: 10.3389/fpls.2014.00699.

37. Coba de la Peña T., Fedorova E., Pueyo J. J., Lucas M. M. The Symbiosome: Legume and Rhizobia Co-evolution toward a Nitrogen-Fixing Organelle? // Frontiers in Plant Science. 2018. (8). D0I:10.3389/fpls.2017.02229.

38. Cook N. M., Gobbato G., Jacott C. N., Marchal C., Hsieh C. Y., Lam A. H. C., Simmonds J., Cerro P. Del, Gomez P. N., Rodney C., Cruz-Mireles N., Uauy C., Haerty W., Lawson D. M., Charpentier M. Autoactive CNGC15 enhances root endosymbiosis in legume and wheat // Nature. 2025. № 8051 (638). C. 752-759. DOI: 10.1038/s41586-024-08424-7.

39. Crespi M., Frugier F. De Novo Organ Formation from Differentiated Cells: Root Nodule Organogenesis // Science Signaling. 2008. № 49 (1). C. re11-re11. DOI: 10.1126/scisignal.149re11.

40. Crespi M., Gálvez S. Molecular Mechanisms in Root Nodule Development // Journal of Plant Growth Regulation. 2000. № 2 (19). C. 155-166. DOI: 10.1007/s003440000023.

41. D'Agostino I. B., Deruere J., Kieber J. J. Characterization of the Response of the Arabidopsis Response Regulator Gene Family to Cytokinin // Plant Physiology. 2000. № 4 (124). C. 1706-1717. DOI:10.1104/pp.124.4.1706.

42. D'Haeze W., Holsters M. Nod factor structures, responses, and perception during initiation of nodule development // Glycobiology. 2002. № 6 (12). C. 79R-105R. DOI: 10.1093/glycob/12.6.79R.

43. Das D. R., Horváth B., Kundu A., Kaló P., DasGupta M. Functional conservation of CYCLOPS in crack entry legume Arachis hypogaea // Plant Science. 2019. (281). C. 232-241. DOI:10.1016/j.plantsci.2018.12.003.

44. Daviere J.-M., Achard P. Gibberellin signaling in plants // Development (Cambridge, England). 2013. № 6 (140). C. 1147-1151. D01:10.1242/dev.087650.

45. Delay C., Imin N., Djordjevic M. A. CEP genes regulate root and shoot development in response to environmental cues and are specific to seed plants // Journal of Experimental Botany. 2013. № 17 (64). C. 5383-5394. DOI: 10.1093/jxb/ert332.

46. Dharmasiri N., Dharmasiri S., Estelle M. The F-box protein TIR1 is an auxin receptor // Nature. 2005. № 7041 (435). C. 441-445. D0I:10.1038/nature03543.

47. Dietrich P., Moeder W., Yoshioka K. Plant Cyclic Nucleotide-Gated Channels: New Insights on Their Functions and Regulation // Plant Physiology. 2020. № 1 (184). C. 27-38. DOI: 10.1104/pp.20.00425.

48. Dill A., Jung H. S., Sun T. P. The DELLA motif is essential for gibberellin-induced degradation of RGA // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2001. № 24 (98). C. 14162-14167. D0I:10.1073/pnas.251534098.

49. Dill A., Sun T. Synergistic derepression of gibberellin signaling by removing RGA and GAI function in Arabidopsis thaliana // Genetics. 2001. № 2 (159). C. 777-785. DOI: 10.1093/genetics/159.2.777.

50. Dolan L., Janmaat K., Willemsen V., Linstead P., Poethig S., Roberts K., Scheres B. Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root // Development. 1993. № 1 (119). C. 71-84. D0I:10.1242/dev.119.1.71.

51. Dolgikh A. V, Kirienko A. N., Tikhonovich I. A., Foo E., Dolgikh E. A. The DELLA Proteins Influence the Expression of Cytokinin Biosynthesis and Response Genes During Nodulation // Frontiers in Plant Science. 2019. (10). DOI: 10.3389/fpls.2019.00432.

52. Dolgikh E. A., Kusakin P. G., Kitaeva A. B., Tsyganova A. V, Kirienko A. N., Leppyanen I. V, Dolgikh A. V, Ilina E. L., Demchenko K. N., Tikhonovich I. A., Tsyganov V. E. Mutational analysis indicates that abnormalities in rhizobial

infection and subsequent plant cell and bacteroid differentiation in pea (Pisum sativum) nodules coincide with abnormal cytokinin responses and localization // Annals of Botany. 2020. № 6 (125). C. 905-923. DOI:10.1093/aob/mcaa022.

53. Ferguson B. J., Foo E., Ross J. J., Reid J. B. Relationship between gibberellin, ethylene and nodulation in Pisum sativum // New Phytologist. 2011. № 3 (189). C. 829-842. DOI: 10.1111/j.1469-8137.2010.03542.x.

54. Ferguson B. J., Mens C., Hastwell A. H., Zhang M., Su H., Jones C. H., Chu X., Gresshoff P. M. Legume nodulation: The host controls the party // Plant, Cell & Environment. 2019. № 1 (42). C. 41-51. DOI:10.1111/pce.13348.

55. Ferguson B. J., Ross J. J., Reid J. B. Nodulation Phenotypes of Gibberellin and Brassinosteroid Mutants of Pea // Plant Physiology. 2005. №№ 4 (138). C. 2396-2405. DOI: 10.1104/pp.105.062414.

56. Floss D. S., Levy J. G., Levesque-Tremblay V., Pumplin N., Harrison M. J. DELLA proteins regulate arbuscule formation in arbuscular mycorrhizal symbiosis 2013. № 51 (110). C. E5025-5034. DOI:10.1073/pnas.1308973110.

57. Fonouni-Farde C., Tan S., Baudin M., Brault M., Wen J., Mysore K. S., Niebel A., Frugier F., Diet A. DELLA-mediated gibberellin signalling regulates Nod factor signalling and rhizobial infection // Nature Communications. 2016. № 1 (7). C. 12636. DOI:10.1038/ncomms12636.

58. Fonouni-Farde C., Frugier F. NODULE INCEPTION: a direct regulator of gibberellin biosynthesis during symbiotic nodulation // New Phytologist. 2023. № 2 (239). C. 449-451. DOI:10.1111/nph.18948.

59. Foo E., Ross J. J., Jones W. T., Reid J. B. Plant hormones in arbuscular mycorrhizal symbioses: an emerging role for gibberellins // Annals of Botany. 2013. № 5 (111). C. 769-779. DOI:10.1093/aob/mct041.

60. Forzani C., Aichinger E., Sornay E., Willemsen V., Laux T., Dewitte W., Murray J. A. H. WOX5 Suppresses CYCLIN D Activity to Establish Quiescence at the Center of the Root Stem Cell Niche // Current Biology. 2014. № 16 (24). C. 1939-

1944. DOI:10.1016/j.cub.2014.07.019.

61. Fournier J., Teillet A., Chabaud M., Ivanov S., Genre A., Limpens E., Carvalho-Niebel F. de, Barker D. G. Remodeling of the infection chamber before infection thread formation reveals a two-step mechanism for rhizobial entry into the host legume root hair. // Plant physiology. 2015. № 4 (167). C. 1233-42. DOI: 10.1104/pp.114.253302.

62. Franssen H. J., Kulikova O., Willemsen V., Heidstra R. Cis -regulatory PLETHORA promoter elements directing root and nodule expression are conserved between Arabidopsis thaliana and Medicago truncatula // Plant Signaling & Behavior. 2017. № 2 (12). C. e1278102. D0I:10.1080/15592324.2016.1278102.

63. Franssen H. J., Xiao T. T., Kulikova O., Wan X., Bisseling T., Scheres B., Heidstra R. Root developmental programs shape the Medicago truncatula nodule meristem // Development. 2015. C. dev.120774. DOI:10.1242/dev.120774.

64. Gage D. J., Margolin W. Hanging by a thread: invasion of legume plants by rhizobia // Current Opinion in Microbiology. 2000. № 6 (3). C. 613-617. DOI:10.1016/S1369-5274(00)00149-1.

65. Gamas P. Use of a Subtractive Hybridization Approach to Identify New Medicago truncatula Genes Induced During Root Nodule Development // Molecular Plant-Microbe Interactions. 1996. № 4 (9). C. 233. D0I:10.1094/MPMI-9-0233.

66. Gao C., Li Z., Zhang H., Li C., Sun H., Li S., Ma N., Qi X., Cui Y., Yang P., Hu T. Genome-Wide Identification and Characterization of the GASA Gene Family in Medicago truncatula, and Expression Patterns under Abiotic Stress and Hormone Treatments // Plants. 2024. № 17 (13). C. 2364. D0I:10.3390/plants13172364.

67. Gao J.-P., Liang W., Liu C.-W., Xie F., Murray J. D. Unraveling the rhizobial infection thread // Journal of Experimental Botany. 2024. № 8 (75). C. 2235-2245. DOI: 10.1093/jxb/erae017.

68. Garcia A. N., Ayub N. D., Fox A. R., Gomez M. C., Dieguez M. J., Pagano E. M., Berini C. A., Muschietti J. P., Soto G. Alfalfa snakin-1 prevents fungal

colonization and probably coevolved with rhizobia // BMC Plant Biology. 2014. № 1 (14). C. 248. DOI: 10.1186/s12870-014-0248-9.

69. Gauthier-Coles C., White R. G., Mathesius U. Nodulating Legumes Are Distinguished by a Sensitivity to Cytokinin in the Root Cortex Leading to Pseudonodule Development // Frontiers in Plant Science. 2019. (9). C. 1901. D0I:10.3389/fpls.2018.01901.

70. Giacomo E. Di, Iannelli M. A., Frugis G. Tale and shape: How to make a leaf different // Plants. 2013. № 2 (2). C. 317-342. D0I:10.3390/plants2020317.

71. Giacomo E. Di, Laffont C., Sciarra F., Iannelli M. A., Frugier F., Frugis G. KNAT3/4/5-like class 2 KNOX transcription factors are involved in Medicago truncatula symbiotic nodule organ development // New Phytologist. 2017. № 2 (213). C. 822-837. D0I:10.1111/nph.14146.

72. Gourion B., Berrabah F., Ratet P., Stacey G. Rhizobium-legume symbioses: The crucial role of plant immunity // Trends in Plant Science. 2015. № 3 (20). C. 186194. DOI: 10.1016/j.tplants.2014.11.008.

73. Goyal R. K., Mattoo A. K., Schmidt M. A. Rhizobial-Host Interactions and Symbiotic Nitrogen Fixation in Legume Crops Toward Agriculture Sustainability // Frontiers in Microbiology. 2021. (12). C. 669404. D0I:10.3389/fmicb.2021.669404.

74. Griesmann M., Chang Y., Liu X., Song Y., Haberer G., Crook M. B., Billault-Penneteau B., Lauressergues D., Keller J., Imanishi L., Roswanjaya Y. P., Kohlen W., Pujic P., Battenberg K., Alloisio N., Liang Y., Hilhorst H., Salgado M. G., Hocher V., Gherbi H., Svistoonoff S., Doyle J. J., He S., Xu Y., Xu S., Qu J., Gao Q., Fang X., Fu Y., Normand P., Berry A. M., Wall L. G., Ané J.-M., Pawlowski K., Xu X., Yang H., Spannagl M., Mayer K. F. X., Wong G. K.-S., Parniske M., Delaux P.-M., Cheng S. Phylogenomics reveals multiple losses of nitrogen-fixing root nodule symbiosis // Science. 2018. № 6398 (361). C. eaat1743. DOI: 10.1126/science.aat1743.

75. Grosjean C., Huguet T. A persistent meristem is formed in nodular structures elicited by Nod factor or by a Rhizobium meliloti exopolysaccharide mutant in alfalfa plants which nodulate spontaneously // Plant Science. 1997. №2 2 (127). C. 215-225. DOI:10.1016/S0168-9452(97)00133-7.

76. Gu Y., Li G., Wang P., Guo Y., Li J. A simple and precise method (Y2H-in-frame-seq) improves yeast two-hybrid screening with cDNA libraries // Journal of Genetics and Genomics. 2022. № 6 (49). C. 595-598. DOI:10.1016/j.jgg.2021.11.008.

77. Guhl K., Holmer R., Xiao T. T., Shen D., Wardhani T. A. K., Geurts R., Zeijl A. van, Kohlen W. The Effect of Exogenous Nitrate on LCO Signalling, Cytokinin Accumulation, and Nodule Initiation in Medicago truncatula // Genes. 2021. № 7 (12). C. 988. DOI:10.3390/genes12070988.

78. Guinel F. C. Ethylene, a Hormone at the Center-Stage of Nodulation // Frontiers in Plant Science. 2015. (6). DOI:10.3389/fpls.2015.01121.

79. Haag A. F., Arnold M. F. F., Myka K. K., Kerscher B., Dall'Angelo S., Zanda M., Mergaert P., Ferguson G. P. Molecular insights into bacteroid development during Rhizobium- legume symbiosis // FEMS Microbiology Reviews. 2013. № 3 (37). C. 364-383. DOI: 10.1111/1574-6976.12003.

80. Hamant O., Pautot V. Plant development: A TALE story // Comptes Rendus Biologies. 2010. № 4 (333). C. 371-381. DOI:10.1016/j.crvi.2010.01.015.

81. Hayashi T., Banba M., Shimoda Y., Kouchi H., Hayashi M., Imaizumi-Anraku H. A dominant function of CCaMK in intracellular accommodation of bacterial and fungal endosymbionts 2010. № 1 (63). D0I:10.1111/j.1365-313X.2010.04228.x.

82. Hedden P., Thomas S. G. Gibberellin biosynthesis and its regulation // The Biochemical Journal. 2012. № 1 (444). C. 11-25. DOI:10.1042/BJ20120245.

83. Held M., Hou H., Miri M., Huynh C., Ross L., Hossain M. S., Sato S., Tabata S., Perry J., Wang T. L., Szczyglowski K. Lotus japonicus cytokinin receptors work partially redundantly to mediate nodule formation // Plant Cell. 2014. № 2 (26). C.

678-694. DOI: 10.1105/tpc. 113.119362.

84. Herzog M., Dorne A.-M., Grellet F. GASA, a gibberellin-regulated gene family from Arabidopsis thaliana related to the tomato GAST1 gene // Plant Molecular Biology. 1995. № 4 (27). C. 743-752. D01:10.1007/BF00020227.

85. Hirano K., Asano K., Tsuji H., Kawamura M., Mori H., Kitano H., Ueguchi-Tanaka M., Matsuoka M. Characterization of the molecular mechanism underlying gibberellin perception complex formation in rice // The Plant Cell. 2010. № 8 (22).

C. 2680-2696. DOI: 10.1105/tpc. 110.075549.

86. Hirsch A. M. Developmental biology of legume nodulation // New Phytologist. 1992. № 2 (122). C. 211-237. DOI: 10.1111/j.1469-8137.1992.tb04227.x.

87. Hirsch S., Kim J., Muñoz A., Heckmann A. B., Downie J. A., Oldroyd G. E. D. GRAS Proteins Form a DNA Binding Complex to Induce Gene Expression during Nodulation Signaling in Medicago truncatula // The Plant Cell. 2009. № 2 (21). C. 545-557. DOI: 10.1105/tpc.108.064501.

88. Horváth B., Domonkos Á., Kereszt A., Szücs A., Ábrahám E., Ayaydin F., Bóka K., Chen Y., Chen R., Murray J. D., Udvardi M. K., Kondorosi É., Kaló P. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2015. № 49 (112). C. 15232-15237. DOI: 10.1073/pnas.1500777112.

89. Horváth B., Yeun L. H., Domonkos Á., Halász G., Gobbato E., Ayaydin F., Miró K., Hirsch S., Sun J., Tadege M., Ratet P., Mysore K. S., Ané J.-M., Oldroyd G. E.

D., Kaló P. Medicago truncatula IPD3 Is a Member of the Common Symbiotic Signaling Pathway Required for Rhizobial and Mycorrhizal Symbioses // Molecular Plant-Microbe Interactions®. 2011. № 11 (24). C. 1345-1358. DOI: 10.1094/MPMI-01-11-0015.

90. Hutchison C. E., Li J., Argueso C., Gonzalez M., Lee E., Lewis M. W., Maxwell B. B., Perdue T. D., Schaller G. E., Alonso J. M., Ecker J. R., Kieber J. J. The

Arabidopsis Histidine Phosphotransfer Proteins Are Redundant Positive Regulators of Cytokinin Signaling // The Plant Cell. 2006. № 11 (18). C. 3073-3087. DOI: 10.1105/tpc.106.045674.

91. Imaizumi-Anraku H., Takeda N., Charpentier M., Perry J., Miwa H., Umehara Y., Kouchi H., Murakami Y., Mulder L., Vickers K., Pike J., Allan Downie J., Wang T., Sato S., Asamizu E., Tabata S., Yoshikawa M., Murooka Y., Wu G.-J., Kawaguchi M., Kawasaki S., Parniske M., Hayashi M., Downie J. A., Wang T., Sato S., Asamizu E., Tabata S., Yoshikawa M., Murooka Y., Wu G.-J., Kawaguchi M., Kawasaki S., Parniske M., Hayashi M. Plastid proteins crucial for symbiotic fungal and bacterial entry into plant roots // Nature. 2005. № 7025 (433). C. 527-531. DOI: 10.1038/nature03237.

92. Inoue T., Higuchi M., Hashimoto Y., Seki M., Kobayashi M., Kato T., Tabata S., Shinozaki K., Kakimoto T. Identification of CRE1 as a cytokinin receptor from Arabidopsis // Nature. 2001. №№ 6823 (409). C. 1060-1063. DOI:10.1038/35059117.

93. Ishida K., Yamashino T., Yokoyama A., Mizuno T. Three Type-B Response Regulators, ARR1, ARR10 and ARR12, Play Essential but Redundant Roles in Cytokinin Signal Transduction Throughout the Life Cycle of Arabidopsis thaliana // Plant and Cell Physiology. 2008. № 1 (49). C. 47-57. DOI:10.1093/pcp/pcm165.

94. Itoh H., Ueguchi-Tanaka M., Matsuoka M. Chapter 6 Molecular Biology of Gibberellins Signaling in Higher Plants Elsevier, 2008.C. 191-221.

95. Jacobi L. M., Petrova O. S., Tsyganov V. E., Borisov A. Y., Tikhonovich I. A. Effect of mutations in the pea genes Sym33 and Sym40 // Mycorrhiza. 2003. № 1 (13). C. 3-7. DOI: 10.1007/s00572-002-0188-3.

96. Jacott C. N., Cerro P. del CNGC15 and DMI1 ion channel gating in nuclear calcium signaling: opening new questions and closing controversies // Journal of Experimental Botany. 2024. № 22 (75). C. 6998-7005. DOI:10.1093/jxb/erae352.

97. James P., Halladay J., Craig E. A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast // Genetics. 1996. № 4 (144). C.

1425-1436.

98. Jasinski S., Piazza P., Craft J., Hay A., Woolley L., Rieu I., Phillips A., Hedden P., Tsiantis M. KNOX Action in Arabidopsis Is Mediated by Coordinate Regulation of Cytokinin and Gibberellin Activities // Current biology : CB. 2005. № 17 (15). C. 1560-1565. DOI:10.1016/j.cub.2005.07.023.

99. Jhu M.-Y., Oldroyd G. E. D. Dancing to a different tune, can we switch from chemical to biological nitrogen fixation for sustainable food security? // PLOS Biology. 2023. № 3 (21). C. e3001982. DOI:10.1371/journal.pbio.3001982.

100. Jin Y., Chen Z., Yang J., Mysore K. S., Wen J., Huang J., Yu N., Wang E. IPD3 and IPD3L Function Redundantly in Rhizobial and Mycorrhizal Symbioses // Frontiers in Plant Science. 2018. (9). C. 267. DOI:10.3389/fpls.2018.00267.

101. Jin Y., Liu H., Luo D., Yu N., Dong W., Wang C., Zhang X., Dai H., Yang J., Wang E. DELLA proteins are common components of symbiotic rhizobial and mycorrhizal signalling pathways // Nature Communications. 2016. № 1 (7). C. 12433. DOI: 10.1038/ncomms 12433.

102. Kalo P., Gleason C., Edwards A., Marsh J., Mitra R. M., Hirsch S., Jakab J., Sims S., Long S. R., Rogers J., Kiss G. B., Downie J. A., Oldroyd G. E. D. Nodulation Signaling in Legumes Requires NSP2, a Member of the GRAS Family of Transcriptional Regulators // Science. 2005. № 5729 (308). C. 1786-1789. DOI: 10.1126/science.1110951.

103. Kang H., Chu X., Wang C., Xiao A., Zhu H., Yuan S., Yang Z., Ke D., Xiao S., Hong Z., Zhang Z. A MYB coiled-coil transcription factor interacts with NSP 2 and is involved in nodulation in Lotus japonicus // New Phytologist. 2014. № 3 (201). C. 837-849. DOI:10.1111/nph.12593.

104. Kantsurova Rudaya E. S., Ivanova A. N., Kozyulina P. Y., Dolgikh E. A. Exogenously Applied Cytokinin Altered the Bacterial Release and Subsequent Stages of Nodule Development in Pea Ipd3/Cyclops Mutant // Plants (Basel, Switzerland). 2023. № 3 (12). C. 657. D0I:10.3390/plants12030657.

105. Kereszt A., Mergaert P., Kondorosi E. Bacteroid Development in Legume Nodules: Evolution of Mutual Benefit or of Sacrificial Victims? // Molecular Plant-Microbe Interactions®. 2011. № 11 (24). C. 1300-1309. DOI:10.1094/MPMI-06-11-0152.

106. Kieber J. J., Schaller G. E. Cytokinin signaling in plant development // Development. 2018. № 4 (145). C. dev149344. DOI:10.1242/dev.149344.

107. Kirienko A. N., Porozov Y. B., Malkov N. V., Akhtemova G. A., Signor C. Le, Thompson R., Saffray C., Dalmais M., Bendahmane A., Tikhonovich I. A., Dolgikh E. A. Role of a receptor-like kinase K1 in pea Rhizobium symbiosis development // Planta. 2018. № 5 (248). C. 1101-1120. DOI:10.1007/s00425-018-2944-4.

108. Kohlen W., Ng J. L. P., Deinum E. E., Mathesius U. Auxin transport, metabolism, and signalling during nodule initiation: indeterminate and determinate nodules // Journal of Experimental Botany. 2018. № 2 (69). C. 229-244. DOI: 10.1093/jxb/erx308.

109. Kreplak J., Madoui M. A., Capal P., Novak P., Labadie K., Aubert G., Bayer P. E., Gali K. K., Syme R. A., Main D., Klein A., Berard A., Vrbova I., Fournier C., d'Agata L., Belser C., Berrabah W., Toegelova H., Milec Z., Vrana J., Lee H. T., Kougbeadjo A., Terezol M., Huneau C., Turo C. J., Mohellibi N., Neumann P., Falque M., Gallardo K., McGee R., Tar'an B., Bendahmane A., Aury J. M., Batley J., Paslier M. C. Le, Ellis N., Warkentin T. D., Coyne C. J., Salse J., Edwards D., Lichtenzveig J., Macas J., Dolezel J., Wincker P., Burstin J. A reference genome for pea provides insight into legume genome evolution // Nature Genetics. 2019. № 9 (51). C. 1411-1422. DOI: 10.1038/s41588-019-0480-1.

110. Krusell L., Madsen L. H., Sato S., Aubert G., Genua A., Szczyglowski K., Duc G., Kaneko T., Tabata S., Bruijn F. de, Pajuelo E., Sandal N., Stougaard J. Shoot control of root development and nodulation is mediated by a receptor-like kinase // Nature. 2002. № 6914 (420). C. 422-426. DOI:10.1038/nature01207.

111. Kuppusamy K. T., Endre G., Prabhu R., Penmetsa R. V., Veereshlingam H., Cook D. R., Dickstein R., VandenBosch K. A. LIN , a Medicago truncatula Gene

Required for Nodule Differentiation and Persistence of Rhizobial Infections // Plant Physiology. 2004. № 3 (136). C. 3682-3691. DOI:10.1104/pp.104.045575.

112. Kuroha T., Tokunaga H., Kojima M., Ueda N., Ishida T., Nagawa S., Fukuda H., Sugimoto K., Sakakibara H. Functional Analyses of LONELY GUY Cytokinin-Activating Enzymes Reveal the Importance of the Direct Activation Pathway in Arabidopsis // The Plant Cell. 2009. № 10 (21). C. 3152-3169. DOI: 10.1105/tpc.109.068676.

113. Laffont C., Ivanovici A., Gautrat P., Brault M., Djordjevic M. A., Frugier F. The NIN transcription factor coordinates CEP and CLE signaling peptides that regulate nodulation antagonistically // Nature Communications. 2020. № 1 (11). C. 3167. DOI: 10.103 8/s41467-020-16968-1.

114. Laloum T., Mita S. De, Gamas P., Baudin M., Niebel A. CCAAT-box binding transcription factors in plants: Y so many? // Trends in Plant Science. 2013. № 3 (18). C. 157-166. DOI: 10.1016/j.tplants.2012.07.004.

115. Lavin M., Doyle J. J., Palmer J. D. Evolutionary Significance of the Loss of the Chloroplast-DNA Inverted Repeat in the Leguminosae Subfamily Papilionoideae // Evolution. 1990. № 2 (44). C. 390. D0I:10.2307/2409416.

116. Lebedeva M. A., Dobychkina D. A., Bashtovenko K. A., Petrenko V. A., Rubtsova D. N., Kochetkova L. A., Azarakhsh M., Romanyuk D. A., Lutova L. A. MtCLE35 Mediates Inhibition of Rhizobia-Induced Signaling Pathway and Upregulation of Defense-Related Genes in Rhizobia-Inoculated Medicago truncatula Roots // Journal of Plant Growth Regulation. 2024. № 12 (43). C. 49414956. DOI: 10.1007/s00344-024-11448-y.

117. Lebedeva M. A., Gancheva M. S., Kulaeva O. A., Zorin E. A., Dobychkina D. A., Romanyuk D. A., Sulima A. S., Zhukov V. A., Lutova L. A. Identification and Expression Analysis of the C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDE Family in Pisum sativum L. // International Journal of Molecular Sciences. 2022. № 23 (23). C. 14875. DOI:10.3390/ijms232314875.

118. Lee H. W., Kim N. Y., Lee D. J., Kim J. LBD18/ASL20 Regulates Lateral Root Formation in Combination with LBD16/ASL18 Downstream of ARF7 and ARF19 in Arabidopsis // Plant Physiology. 2009. № 3 (151). C. 1377-1389. DOI: 10.1104/pp.109.143685.

119. Lee S., Cheng H., King K. E., Wang W., He Y., Hussain A., Lo J., Harberd N. P., Peng J. Gibberellin regulates Arabidopsis seed germination via RGL2, a GAI/RGA-like gene whose expression is up-regulated following imbibition // Genes & Development. 2002. № 5 (16). C. 646-658. D01:10.1101/gad.969002.

120. Lefebvre B., Timmers T., Mbengue M., Moreau S., Hervé C., Toth K., Bittencourt-Silvestre J., Klaus D., Deslandes L., Godiard L., Murray J. D., Udvardi M. K., Raffaele S., Mongrand S., Cullimore J., Gamas P., Niebel A., Ott T. A remorin protein interacts with symbiotic receptors and regulates bacterial infection // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010. № 5 (107). C. 2343-2348. D0I:10.1073/pnas.0913320107.

121. Lévy J., Bres C., Geurts R., Chalhoub B., Kulikova O., Duc G., Journet E.-P., Ané J.-M., Lauber E., Bisseling T., Dénarié J., Rosenberg C., Debellé F. A putative Ca2+ and calmodulin-dependent protein kinase required for bacterial and fungal symbioses // Science. 2004. № 5662 (303). C. 1361-1364. DOI: 10.1126/science.1093038.

122. Li C., Zong Y., Wang Y., Jin S., Zhang D., Song Q., Zhang R., Gao C. Expanded base editing in rice and wheat using a Cas9-adenosine deaminase fusion // Genome Biology. 2018. № 1 (19). C. 59. D0I:10.1186/s13059-018-1443-z.

123. Li Y., Zhao Y., Yan Z., Dong R., Yu H., Zhu H., Cao Y. NODULATION TRIO in Medicago truncatula : Unveiling the redundant roles of MtLYK2, MtLYK3, and MtLYK2bis // Journal of Integrative Plant Biology. 2024. № 8 (66). C. 1553-1556. DOI: 10.1111/jipb.13718.

124. Libbenga K. R., Harkes P. A. A. Initial proliferation of cortical cells in the formation of root nodules in Pisum sativum L. // Planta. 1973. № 1 (114). C. 17-28. DOI: 10.1007/BF00390281.

125. Limpens E., Franken C., Smit P., Willemse J., Bisseling T., Geurts R. LysM domain receptor kinases regulating rhizobial Nod factor-induced infection. // Science (New York, N.Y.). 2003. № 5645 (302). C. 630-633. DOI: 10.1126/science.1090074.

126. Lin J., Frank M., Reid D. No Home without Hormones: How Plant Hormones Control Legume Nodule Organogenesis // Plant Communications. 2020. № 5 (1). C. 100104. DOI: 10.1016/j .xplc.2020.100104.

127. Lin J., Roswanjaya Y. P., Kohlen W., Stougaard J., Reid D. Nitrate restricts nodule organogenesis through inhibition of cytokinin biosynthesis in Lotus japonicus // Nature Communications. 2021. № 1 (12). C. 6544. DOI: 10.1038/s41467-021-26820-9.

128. Lindsay P. L., Williams B. N., MacLean A., Harrison M. J. A Phosphate-Dependent Requirement for Transcription Factors IPD3 and IPD3L During Arbuscular Mycorrhizal Symbiosis in Medicago truncatula // Molecular Plant-Microbe Interactions®. 2019. № 10 (32). C. 1277-1290. DOI:10.1094/MPMI-01-19-0006-R.

129. Liu C.-W., Breakspear A., Stacey N., Findlay K., Nakashima J., Ramakrishnan K., Liu M., Xie F., Endre G., Carvalho-Niebel F. de, Oldroyd G. E. D., Udvardi M. K., Fournier J., Murray J. D. A protein complex required for polar growth of rhizobial infection threads // Nature Communications. 2019. № 1 (10). C. 2848. DOI:10.1038/s41467-019-10029-y.

130. Liu J., Rutten L., Limpens E., Molen T. van der, Velzen R. van, Chen R., Chen Y., Geurts R., Kohlen W., Kulikova O., Bisseling T. A Remote cis -Regulatory Region Is Required for NIN Expression in the Pericycle to Initiate Nodule Primordium Formation in Medicago truncatula // The Plant Cell. 2019. № 1 (31). C. 68-83. DOI: 10.1105/tpc.18.00478.

131. Liu M., Kameoka H., Oda A., Maeda T., Goto T., Yano K., Soyano T., Kawaguchi M. The effects of ERN1 on gene expression during early rhizobial infection in Lotus japonicus // Frontiers in Plant Science. 2023. (13). C. 995589.

DOI: 10.3389/fpls.2022.995589.

132. Liu W., Kohlen W., Lillo A., Op Den Camp R., Ivanov S., Hartog M., Limpens E., Jamil M., Smaczniak C., Kaufmann K., Yang W.-C., Hooiveld G. J. E. J., Charnikhova T., Bouwmeester H. J., Bisseling T., Geurts R. Strigolactone Biosynthesis in Medicago truncatula and Rice Requires the Symbiotic GRAS-Type Transcription Factors NSP1 and NSP2 // The Plant Cell. 2011. № 10 (23). C. 38533865. DOI: 10.1105/tpc.111.089771.

133. Ljung K. Auxin metabolism and homeostasis during plant development // Development. 2013. № 5 (140). C. 943-950. D0I:10.1242/dev.086363.

134. Ljunggren H., Fahraeus G. Effect of Rhizobium Polysaccharide on the Formation of Polygalacturonase in Lucerne and Clover // Nature. 1959. № 4698 (184). C. 1578-1579. D0I:10.1038/1841578a0.

135. Lomin S. N., Krivosheev D. M., Steklov M. Y., Arkhipov D. V, Osolodkin D. I., Schmülling T., Romanov G. A. Plant membrane assays with cytokinin receptors underpin the unique role of free cytokinin bases as biologically active ligands // Journal of Experimental Botany. 2015. № 7 (66). C. 1851-1863. DOI: 10.1093/jxb/eru522.

136. Lorteau M., Ferguson B. J., Guinel F. C. Effects of cytokinin on ethylene production and nodulation in pea ( Pisum sativum ) cv. Sparkle // Physiologia Plantarum. 2001. № 3 (112). C. 421-428. DOI:10.1034/j.1399-3054.2001.1120316.x.

137. Lotocka B., Kopcinska J., Skalniak M. Review article: The meristem in indeterminate root nodules of Faboideae // Symbiosis. 2012. № 1-3 (58). C. 63-72. DOI:10.1007/s13199-013-0225-3.

138. Luo J., Zhou J.-J., Zhang J.-Z. Aux/IAA Gene Family in Plants: Molecular Structure, Regulation, and Function // International Journal of Molecular Sciences. 2018. № 1 (19). C. 259. D0I:10.3390/ijms19010259.

139. Luu T.-B., Carles N., Bouzou L., Gibelin-Viala C., Rembliere C., Gasciolli V.,

Bono J.-J., Lefebvre B., Pauly N., Cullimore J. Analysis of the structure and function of the LYK cluster of Medicago truncatula A17 and R108 // Plant Science. 2023. (332). C. 111696. DOI: 10.1016/j.plantsci.2023.111696.

140. Ma Y., Xiao C., Liu J., Ren G. Nutrient-dependent regulation of symbiotic nitrogen fixation in legumes // Horticulture Research. 2025. № 3 (12). DOI: 10.1093/hr/uhae321.

141. Madsen E. B., Madsen L. H., Radutoiu S., Olbryt M., Rakwalska M., Szczyglowski K., Sato S., Kaneko T., Tabata S., Sandal N., Stougaard J. A receptor kinase gene of the LysM type is involved in legumeperception of rhizobial signals // Nature. 2003. № 6958 (425). C. 637-640. DOI:10.1038/nature02045.

142. Madsen L. H., Tirichine L., Jurkiewicz A., Sullivan J. T., Heckmann A. B., Bek A. S., Ronson C. W., James E. K., Stougaard J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus // Nature Communications. 2010. № 1 (1). C. 10. D0I:10.1038/ncomms1009.

143. Maekawa T., Maekawa-Yoshikawa M., Takeda N., Imaizumi-Anraku H., Murooka Y., Hayashi M. Gibberellin controls the nodulation signaling pathway in Lotus japonicus // The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 2009. № 2 (58). C. 183-194. DOI: 10.1111/j.1365-313X.2008.03774.x.

144. Magne K., Couzigou J.-M., Schiessl K., Liu S., George J., Zhukov V., Sahl L., Boyer F., Iantcheva A., Mysore K. S., Wen J., Citerne S., Oldroyd G. E. D., Ratet P. MtNODULE ROOT1 and MtNODULE ROOT2 Are Essential for Indeterminate Nodule Identity // Plant Physiology. 2018. № 1 (178). C. 295-316. DOI:10.1104/pp.18.00610.

145. Mâhônen A. P., Tusscher K. Ten, Siligato R., Smetana O., Diaz-Trivino S., Salojârvi J., Wachsman G., Prasad K., Heidstra R., Scheres B. PLETHORA gradient formation mechanism separates auxin responses // Nature. 2014. № 7525 (515). C. 125-129. DOI: 10.1038/nature13663.

146. Mangeon A., Lin W., Springer P. S. Functional divergence in the Arabidopsis

LOB-domain gene family // Plant Signaling & Behavior. 2012. № 12 (7). C. 15441547. DOI:10.4161/psb.22320.

147. Mao Z., Zheng J., Wang Y., Chen G., Yang Y., Feng D., Xie B. The new CaSn gene belonging to the snakin family induces resistance against root-knot nematode infection in pepper // Phytoparasitica. 2011. № 2 (39). C. 151-164. DOI: 10.1007/s12600-011-0149-5.

148. McAdam E. L., Reid J. B., Foo E. Gibberellins promote nodule organogenesis but inhibit the infection stages of nodulation // Journal of Experimental Botany. 2018. № 8 (69). C. 2117-2130. DOI:10.1093/jxb/ery046.

149. Mergaert P., Montagu M. Van, Holsters M. Molecular mechanisms of Nod factor diversity // Molecular Microbiology. 1997. № 5 (25). C. 811-817. DOI: 10.1111/j.1365-2958.1997.mmi526.x.

150. Messinese E., Mun J.-H., Yeun L. H., Jayaraman D., Rouge P., Barre A., Lougnon G., Schornack S., Bono J.-J., Cook D. R., Ane J.-M. A novel nuclear protein interacts with the symbiotic DMI3 calcium- and calmodulin-dependent protein kinase of Medicago truncatula // Molecular Plant-Microbe Interactions®. 2007. № 8 (20). C. 912-921. DOI:10.1094/MPMI-20-8-0912.

151. Miller J. B., Pratap A., Miyahara A., Zhou L., Bornemann S., Morris R. J., Oldroyd G. E. D. Calcium/Calmodulin-Dependent Protein Kinase Is Negatively and Positively Regulated by Calcium, Providing a Mechanism for Decoding Calcium Responses during Symbiosis Signaling // The Plant Cell. 2014. №2 12 (25). C. 50535066. DOI: 10.1105/tpc.113.116921.

152. Miri M., Janakirama P., Held M., Ross L., Szczyglowski K. Into the Root: How Cytokinin Controls Rhizobial Infection // Trends in Plant Science. 2016. № 3 (21). C. 178-186. DOI:10.1016/j.tplants.2015.09.003.

153. Mitra R. M., Shaw S. L., Long S. R. Six nonnodulating plant mutants defective for Nod factor-induced transcriptional changes associated with the legume-rhizobia symbiosis // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2004. № 27 (101).

C. 10217-10222. D01:10.1073/pnas.0402186101.

154. Mohd-Radzman N. A., Binos S., Truong T. T., Imin N., Mariani M., Djordjevic M. A. Novel MtCEP1 peptides produced in vivo differentially regulate root development in Medicago truncatula // Journal of Experimental Botany. 2015. № 17 (66). C. 5289-5300. D0I:10.1093/jxb/erv008.

155. Montiel J., Downie J. A., Farkas A., Bihari P., Herczeg R., Balint B., Mergaert P., Kereszt A., Kondorosi E. Morphotype of bacteroids in different legumes correlates with the number and type of symbiotic NCR peptides // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2017. № 19 (114). C. 5041-5046. DOI: 10.1073/pnas.1704217114.

156. Mortier V., Wasson A., Jaworek P., Keyser A. De, Decroos M., Holsters M., Tarkowski P., Mathesius U., Goormachtig S. Role of LONELY GUY genes in indeterminate nodulation on Medicago truncatula // New Phytologist. 2014. № 2 (202). C. 582-593. D0I:10.1111/nph.12681.

157. Mu T., Luo S., Li L., Zhang R., Wang P., Zhang G. A review of the interaction mechanisms between jasmonic acid (JA) and various plant hormones, as well as the core regulatory role of MYC2 // Plant Science. 2025. (353). C. 112407. D0I:10.1016/j.plantsci.2025.112407.

158. Murray J. D. Invasion by Invitation: Rhizobial Infection in Legumes // Molecular Plant-Microbe Interactions®. 2011. № 6 (24). C. 631-639. D0I:10.1094/MPMI-08-10-0181.

159. Murray J. D., Karas B. J., Sato S., Tabata S., Amyot L., Szczyglowski K. A Cytokinin Perception Mutant Colonized by Rhizobium in the Absence of Nodule 0rganogenesis // Science. 2007. № 5808 (315). C. 101-104. D01:10.1126/science.1132514.

160. Nahirnak V., Almasia N. I., Fernandez P. V., Hopp H. E., Estevez J. M., Carrari F., Vazquez-Rovere C. Potato Snakin-1 Gene Silencing Affects Cell Division, Primary Metabolism, and Cell Wall Composition // Plant Physiology. 2012. № 1

(158). C. 252-263. DOI:10.1104/pp.111.186544.

161. Nelson D. R., Schuler M. A., Paquette S. M., Werck-Reichhart D., Bak S. Comparative genomics of rice and Arabidopsis. Analysis of 727 cytochrome P450 genes and pseudogenes from a monocot and a dicot // Plant Physiology. 2004. № 2 (135). C. 756-772. DOI:10.1104/pp.104.039826.

162. Nishimura C., Ohashi Y., Sato S., Kato T., Tabata S., Ueguchi C. Histidine Kinase Homologs That Act as Cytokinin Receptors Possess Overlapping Functions in the Regulation of Shoot and Root Growth in Arabidopsis // The Plant Cell. 2004. № 6 (16). C. 1365-1377. DOI:10.1105/tpc.021477.

163. Noorden G. E. van, Ross J. J., Reid J. B., Rolfe B. G., Mathesius U. Defective long-distance auxin transport regulation in the Medicago truncatula super numeric nodules mutant // Plant Physiology. 2006. № 4 (140). C. 1494-1506. DOI: 10.1104/pp.105.075879.

164. Okamoto S., Ohnishi E., Sato S., Takahashi H., Nakazono M., Tabata S., Kawaguchi M. Nod Factor/Nitrate-Induced CLE Genes that Drive HAR1-Mediated Systemic Regulation of Nodulation // Plant and Cell Physiology. 2009. № 1 (50). C. 67-77. DOI: 10.1093/pcp/pcn194.

165. Okazaki S., Kaneko T., Sato S., Saeki K. Hijacking of leguminous nodulation signaling by the rhizobial type III secretion system // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2013. № 42 (110). C. 17131-17136. DOI: 10.1073/pnas.1302360110.

166. Okazaki S., Tittabutr P., Teulet A., Thouin J., Fardoux J., Chaintreuil C., Gully D., Arrighi J. F., Furuta N., Miwa H., Yasuda M., Nouwen N., Teaumroong N., Giraud E. Rhizobium-legume symbiosis in the absence of Nod factors: two possible scenarios with or without the T3SS // The ISME Journal. 2016. № 1 (10). C. 64-74. DOI:10.1038/ismej.2015.103.

167. Okuma N., Kawaguchi M. Systemic Optimization of Legume Nodulation: A Shoot-Derived Regulator, miR2111 // Frontiers in Plant Science. 2021. (12).

D01:10.3389/fpls.2021.682486.

168. 0ldroyd G. E. D., Downie J. A. Coordinating nodule morphogenesis with rhizobial infection in legumes // Annual Review of Plant Biology. 2008. (59). C. 519-546. D01:10.1146/annurev.arplant.59.032607.092839.

169. 0ldroyd G. E. D., Engstrom E. M., Long S. R. Ethylene Inhibits the Nod Factor Signal Transduction Pathway of Medicago truncatula // The Plant Cell. 2001. № 8 (13). C. 1835-1849. D0I:10.1105/TPC.010193.

170. Oldroyd G. E. D., Leyser O. A plant's diet, surviving in a variable nutrient environment // Science. 2020. № 6486 (368). C. eaba0196. D0I:10.1126/science.aba0196.

171. 0ldroyd G. E. D., Murray J. D., Poole P. S., Downie J. A. The rules of engagement in the legume-rhizobial symbiosis // Annual Review of Genetics. 2011. (45). C. 119-144. D01:10.1146/annurev-genet-110410-132549.

172. 0sipova M. A., Dolgikh E. A., Lutova L. A. Peculiarities of meristem-specific WOX5 gene expression during nodule organogenesis in legumes // Russian Journal of Developmental Biology. 2011. № 4 (42). C. 226-237. D01:10.1134/S1062360411010085.

173. 0sipova M. A., Mortier V., Demchenko K. N., Tsyganov V. E., Tikhonovich I. A., Lutova L. A., Dolgikh E. A., Goormachtig S. WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX5 Gene Expression and Interaction of CLE Peptides with Components of the Systemic Control Add Two Pieces to the Puzzle of Autoregulation of Nodulation // Plant Physiology. 2012. № 3 (158). C. 1329-1341. D01:10.1104/pp.111.188078.

174. 0vchinnikova E., Journet E.-P., Chabaud M., Cosson V., Ratet P., Duc G., Fedorova E., Liu W., Camp R. 0. den, Zhukov V., Tikhonovich I., Borisov A., Bisseling T., Limpens E. IPD3 Controls the Formation of Nitrogen-Fixing Symbiosomes in Pea and Medicago Spp. // Molecular Plant-Microbe Interactions®. 2011. № 11 (24). C. 1333-1344. D0I:10.1094/MPMI-01-11-0013.

175. Peck M. C., Fisher R. F., Long S. R. Diverse Flavonoids Stimulate NodD1 Binding to nod Gene Promoters in Sinorhizobium meliloti // Journal of Bacteriology. 2006. № 15 (188). C. 5417-5427. DOI:10.1128/JB.00376-06.

176. Peng J., Harberd N. P. Derivative Alleles of the Arabidopsis Gibberellin-Insensitive (gai) Mutation Confer a Wild-Type Phenotype // The Plant Cell. 1993. № 3 (5). C. 351-360. DOI: 10.1105/tpc.5.3.351.

177. Penmetsa R. V., Cook D. R. A Legume Ethylene-Insensitive Mutant Hyperinfected by Its Rhizobial Symbiont // Science. 1997. № 5299 (275). C. 527530. DOI: 10.1126/science.275.5299.527.

178. Peoples M. B., Brockwell J., Herridge D. F., Rochester I. J., Alves B. J. R., Urquiaga S., Boddey R. M., Dakora F. D., Bhattarai S., Maskey S. L., Sampet C., Rerkasem B., Khan D. F., Hauggaard-Nielsen H., Jensen E. S. The contributions of nitrogen-fixing crop legumes to the productivity of agricultural systems // Symbiosis. 2009. № 1-3 (48). C. 1-17. DOI:10.1007/BF03179980.

179. Prayitno J., Rolfe B. G., Mathesius U. The Ethylene-Insensitive sickle Mutant of Medicago truncatula Shows Altered Auxin Transport Regulation during Nodulation // Plant Physiology. 2006. № 1 (142). C. 168-180. DOI: 10.1104/pp.106.080093.

180. Pysh L. D., Wysocka-Diller J. W., Camilleri C., Bouchez D., Benfey P. N. The GRAS gene family in Arabidopsis: sequence characterization and basic expression analysis of the SCARECROW-LIKE genes // The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 1999. № 1 (18). C. 111-119. DOI:10.1046/j.1365-313x.1999.00431.x.

181. Qiu B., Zhang Y., Wang Q., Wang Z., Chen H., Cui X., Liu D. Panax notoginseng snakin gene increases resistance to Fusarium solani in transgenic tobacco // Industrial Crops and Products. 2020. (157). C. 112902. DOI: 10.1016/j. indcrop.2020. 112902.

182. Radutoiu S., Madsen L. H., Madsen E. B., Felle H. H., Umehara Y., Granlund

M., Sato S., Nakamura Y., Tabata S., Sandal N., Stougaard J. Plant recognition of symbiotic bacteria requires two LysM receptor-like kinases // Nature. 2003. № 6958 (425). C. 585-592. D0I:10.1038/nature02039.

183. Radutoiu S., Madsen L. H., Madsen E. B., Jurkiewicz A., Fukai E., Quistgaard E. M. H., Albrektsen A. S., James E. K., Thirup S., Stougaard J. LysM domains mediate lipochitin-oligosaccharide recognition and Nfr genes extend the symbiotic host range // The EMBO Journal. 2007. № 17 (26). C. 3923-3935. D0I:10.1038/sj .emboj .7601826.

184. Reid D., Liu H., Kelly S., Kawaharada Y., Mun T., Andersen S. U., Desbrosses G., Stougaard J. Dynamics of Ethylene Production in Response to Compatible Nod Factor // Plant Physiology. 2018. № 2 (176). C. 1764-1772. D0I:10.1104/pp.17.01371.

185. Reid J. B., Murfet I. C., Potts W. C. Internode Length in Pisum . II. Additional Information on the Relationship and Action of Loci Le, La, Cry, Na and Lm // Journal of Experimental Botany. 1983. № 3 (34). C. 349-364. D0I:10.1093/jxb/34.3.349.

186. Rightmyer A. P., Long S. R. Pseudonodule Formation by Wild-Type and Symbiotic Mutant Medicago truncatula in Response to Auxin Transport Inhibitors // Molecular Plant-Microbe Interactions®. 2011. № 11 (24). C. 1372-1384. D01:10.1094/MPMI-04-11-0103.

187. Roudier F., Fedorova E., Lebris M., Lecomte P., Gyorgyey J., Vaubert D., Horvath G., Abad P., Kondorosi A., Kondorosi E. The Medicago species A2-type cyclin is auxin regulated and involved in meristem formation but dispensable for endoreduplication-associated developmental programs // Plant Physiology. 2003. № 3 (131). C. 1091-1103. D01:10.1104/pp.102.011122.

188. Roux B., Rodde N., Jardinaud M., Timmers T., Sauviac L., Cottret L., Carrere S., Sallet E., Courcelle E., Moreau S., Debelle F., Capela D., Carvalho-Niebel F. de, Gouzy J., Bruand C., Gamas P. An integrated analysis of plant and bacterial gene expression in symbiotic root nodules using laser-capture microdissection coupled to RNA sequencing // The Plant Journal. 2014. № 6 (77). C. 817-837.

DOI: 10.1111/tpj.12442.

189. Roux M. M. le, Miller J. T., Waller J., Döring M., Bruneau A. An expert curated global legume checklist improves the accuracy of occurrence, biodiversity and taxonomic data // Scientific Data. 2022. № 1 (9). C. 708. D0I:10.1038/s41597-022-01812-6.

190. Roy S., Liu W., Nandety R. S., Crook A., Mysore K. S., Pislariu C. I., Frugoli J., Dickstein R., Udvardi M. K. Celebrating 20 years of genetic discoveries in legume nodulation and symbiotic nitrogen fixation // The Plant Cell. 2020. №2 1 (32). C. 15-41. DOI:10.1105/tpc. 19.00279.

191. Sabatini S., Heidstra R., Wildwater M., Scheres B. SCARECROW is involved in positioning the stem cell niche in the Arabidopsis root meristem // Genes & Development. 2003. № 3 (17). C. 354-358. DOI:10.1101/gad.252503.

192. Sagan M., deLarambergue H., Morandi D. Genetic Analysis of Symbiosis Mutants in Medicago truncatula 1998.C. 317-318. DOI:10.1007/978-94-011-5159-7_178.

193. Sakakibara H. CYTOKININS: Activity, Biosynthesis, and Translocation // Annual Review of Plant Biology. 2006. № 1 (57). C. 431-449. DOI: 10.1146/annurev.arplant.57.032905.105231.

194. Sasaki T., Suzaki T., Soyano T., Kojima M., Sakakibara H., Kawaguchi M. Shoot-derived cytokinins systemically regulate root nodulation // Nature Communications. 2014. № 1 (5). C. 4983. D0I:10.1038/ncomms5983.

195. Schiessl K., Lilley J. L. S., Lee T., Tamvakis I., Kohlen W., Bailey P. C., Thomas A., Luptak J., Ramakrishnan K., Carpenter M. D., Mysore K. S., Wen J., Ahnert S., Grieneisen V. A., Oldroyd G. E. D. NODULE INCEPTION Recruits the Lateral Root Developmental Program for Symbiotic Nodule Organogenesis in Medicago truncatula // Current Biology. 2019. № 21 (29). C. 3657-3668.e5. DOI:10.1016/j.cub.2019.09.005.

196. Schnabel E., Journet E.-P., Carvalho-Niebel F. de, Duc G., Frugoli J. The

Medicago truncatula SUNN Gene Encodes a CLV1-like Leucine-rich Repeat Receptor Kinase that Regulates Nodule Number and Root Length // Plant Molecular Biology. 2005. № 6 (58). C. 809-822. D0I:10.1007/s11103-005-8102-y.

197. Schnabel E. L., Frugoli J. The PIN and LAX families of auxin transport genes in Medicago truncatula // Molecular Genetics and Genomics. 2004. № 4 (272). C. 420-432. D01:10.1007/s00438-004-1057-x.

198. Searle I. R., Men A. E., Laniya T. S., Buzas D. M., Iturbe-0rmaetxe I., Carroll B. J., Gresshoff P. M. Long-Distance Signaling in Nodulation Directed by a CLAVATA1 -Like Receptor Kinase // Science. 2003. № 5603 (299). C. 109-112. D01:10.1126/science.1077937.

199. Serova T. A., Tsyganova A. V., Tikhonovich I. A., Tsyganov V. E. Gibberellins Inhibit Nodule Senescence and Stimulate Nodule Meristem Bifurcation in Pea (Pisum sativum L.) // Frontiers in Plant Science. 2019. № March (10). C. 1-19. D01:10.3389/fpls.2019.00285.

200. Sharma V., Bhattacharyya S., Kumar R., Kumar A., Ibanez F., Wang J., Guo B., Sudini H. K., Gopalakrishnan S., DasGupta M., Varshney R. K., Pandey M. K. Molecular Basis of Root Nodule Symbiosis between Bradyrhizobium and 'Crack-Entry' Legume Groundnut (Arachis hypogaea L.) // Plants. 2020. № 2 (9). C. 276. D01:10.3390/plants9020276.

201. Shaw S. L., Long S. R. Nod Factor Elicits Two Separable Calcium Responses in Medicago truncatula Root Hair Cells // Plant Physiology. 2003. № 3 (131). C. 976-984. D01:10.1104/pp.005546.

202. Sieberer B. J., Chabaud M., Fournier J., Timmers A. C. J., Barker D. G. A switch in Ca2+ spiking signature is concomitant with endosymbiotic microbe entry into cortical root cells of Medicago truncatula // The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 2012. № 5 (69). C. 822-830. D0I:10.1111/j.1365-313X.2011.04834.x.

203. Singh S., Katzer K., Lambert J., Cerri M., Parniske M. CYCL0PS, A DNA-

Binding Transcriptional Activator, Orchestrates Symbiotic Root Nodule Development // Cell Host & Microbe. 2014. № 2 (15). C. 139-152. DOI:10.1016/j.chom.2014.01.011.

204. Singh S., Parniske M. Activation of calcium- and calmodulin-dependent protein kinase (CCaMK), the central regulator of plant root endosymbiosis // Current Opinion in Plant Biology. 2012. № 4 (15). C. 444-453. DOI:10.1016/j.pbi.2012.04.002.

205. Songwattana P., Chaintreuil C., Wongdee J., Teulet A., Mbaye M., Piromyou P., Gully D., Fardoux J., Zoumman A. M. A., Camuel A., Tittabutr P., Teaumroong N., Giraud E. Identification of type III effectors modulating the symbiotic properties of Bradyrhizobium vignae strain ORS3257 with various Vigna species // Scientific Reports. 2021. № 1 (11). C. 4874. D0I:10.1038/s41598-021-84205-w.

206. Soyano T., Akamatsu A., Takeda N., Watahiki M. K., Goh T., Okuma N., Suganuma N., Kojima M., Takebayashi Y., Sakakibara H., Nakajima K., Kawaguchi M. Periodic cytokinin responses in Lotus japonicus rhizobium infection and nodule development // Science. 2024. № 6706 (385). C. 288-294. DOI: 10.1126/science.adk5589.

207. Soyano T., Hirakawa H., Sato S., Hayashi M., Kawaguchi M. NODULE INCEPTION creates a long-distance negative feedback loop involved in homeostatic regulation of nodule organ production // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2014. № 40 (111). C. 14607-14612. DOI: 10.1073/pnas.1412716111.

208. Soyano T., Kouchi H., Hirota A., Hayashi M. NODULE INCEPTION directly targets NF-Y subunit genes to regulate essential processes of root nodule development in Lotus japonicus // PLoS Genetics. 2013. № 3 (9). C. e1003352. DOI:10.1371/journal.pgen.1003352.

209. Soyano T., Liu M., Kawaguchi M., Hayashi M. Leguminous nodule symbiosis involves recruitment of factors contributing to lateral root development // Current Opinion in Plant Biology. 2021. (59). C. 102000. DOI:10.1016/j.pbi.2020.102000.

210. Soyano T., Shimoda Y., Kawaguchi M., Hayashi M. A shared gene drives lateral root development and root nodule symbiosis pathways in Lotus // Science. 2019. № 6468 (366). C. 1021-1023. D01:10.1126/science.aax2153.

211. Sprent J. I., Ardley J., James E. K. Biogeography of nodulated legumes and their nitrogen-fixing symbionts // New Phytologist. 2017. № 1 (215). C. 40-56. DOI: 10.1111/nph.14474.

212. Stepanova A. N., Yun J., Robles L. M., Novak O., He W., Guo H., Ljung K., Alonso J. M. The Arabidopsis YUCCA1 Flavin Monooxygenase Functions in the Indole-3-Pyruvic Acid Branch of Auxin Biosynthesis // The Plant Cell. 2011. № 11 (23). C. 3961-3973. DOI: 10.1105/tpc. 111.088047.

213. Strack D., Fester T., Hause B., Schliemann W., Walter M. H. Review Paper: Arbuscular Mycorrhiza: Biological, Chemical, and Molecular Aspects // Journal of Chemical Ecology. 2003. № 9 (29). C. 1955-1979. DOI: 10.1023/A:1025695032113.

214. Su C. Pectin modifications at the symbiotic interface // New Phytologist. 2023. № 1 (238). C. 25-32. DOI:10.1111/nph.18705.

215. Su D., Liu K., Yu Z., Li Y., Zhang Y., Zhu Y., Wu Y., He H., Zeng X., Chen H., Grierson D., Deng H., Liu M. Genome-wide characterization of the tomato GASA family identifies SlGASA1 as a repressor of fruit ripening // Horticulture Research. 2023. № 1 (10). D0I:10.1093/hr/uhac222.

216. Subramanian S., Stacey G., Yu O. Endogenous isoflavones are essential for the establishment of symbiosis between soybean and Bradyrhizobium japonicum // The Plant Journal. 2006. № 2 (48). C. 261-273. DOI:10.1111/j.1365-313X.2006.02874.x.

217. Sujkowska M., Gorska-Czekaj M., Bederska M., Borucki W. Vacuolar organization in the nodule parenchyma is important for the functioning of pea root nodules // Symbiosis. 2011. № 1 (54). C. 1-16. DOI:10.1007/s13199-011-0126-2.

218. Sun S., Wang H., Yu H., Zhong C., Zhang X., Peng J., Wang X. GASA14

regulates leaf expansion and abiotic stress resistance by modulating reactive oxygen species accumulation // Journal of Experimental Botany. 2013. № 6 (64). C. 16371647. DOI: 10.1093/jxb/ert021.

219. Sun T.-P., Gubler F. Molecular mechanism of gibberellin signaling in plants // Annual Review of Plant Biology. 2004. (55). C. 197-223. DOI: 10.1146/annurev.arplant.55.031903.141753.

220. Suzaki T., Takeda N., Nishida H., Hoshino M., Ito M., Misawa F., Handa Y., Miura K., Kawaguchi M. LACK OF SYMBIONT ACCOMMODATION controls intracellular symbiont accommodation in root nodule and arbuscular mycorrhizal symbiosis in Lotus japonicus // PLOS Genetics. 2019. № 1 (15). C. e1007865. DOI:10.1371/journal.pgen.1007865.

221. Takei K., Yamaya T., Sakakibara H. Arabidopsis CYP735A1 and CYP735A2 Encode Cytokinin Hydroxylases That Catalyze the Biosynthesis of trans-Zeatin // Journal of Biological Chemistry. 2004. № 40 (279). C. 41866-41872. DOI: 10.1074/jbc.M406337200.

222. Taylor B. H., Scheuring C. F. A molecular marker for lateral root initiation: The RSI-1 gene of tomato (Lycopersicon esculentum Mill) is activated in early lateral root primordia // Molecular and General Genetics MGG. 1994. № 2 (243). C. 148157. DOI: 10.1007/BF00280311.

223. Timmers A. C. J. J., Auriac M.-C. C., Truchet G. Refined analysis of early symbiotic steps of the Rhizobium-Medicago interaction in relationship with microtubular cytoskeleton rearrangements // Development. 1999. № 16 (126). C. 3617-3628. DOI: 10.1242/dev.126.16.3617.

224. Tirichine L. L., Sandal N., Madsen L. H., Radutoiu S., Albrektsen A. S., Sato S., Asamizu E., Tabata S., Stougaard J. A Gain-of-Function Mutation in a Cytokinin Receptor Triggers Spontaneous Root Nodule Organogenesis // Science. 2007. № 5808 (315). C. 104-107. DOI:10.1126/science.1132397.

225. To J. P. C., Deruère J., Maxwell B. B., Morris V. F., Hutchison C. E., Ferreira

F. J., Schaller G. E., Kieber J. J. Cytokinin Regulates Type-A Arabidopsis Response Regulator Activity and Protein Stability via Two-Component Phosphorelay // The Plant Cell. 2008. № 12 (19). C. 3901-3914. D01:10.1105/tpc.107.052662.

226. Tsyganov V. E., Morzhina E. V., Stefanov S. Y., Borisov A. Y., Lebsky V. K., Tikhonovich I. A. The pea (Pisum sativum L.) genes sym33 and sym40 control infection thread formation and root nodule function // Molecular and General Genetics MGG. 1998. № 5 (259). C. 491-503. D0I:10.1007/s004380050840.

227. Tsyganova A. V., Brewin N. J., Tsyganov V. E. Structure and Development of the Legume-Rhizobial Symbiotic Interface in Infection Threads // Cells. 2021. № 5 (10). C. 1050. DOI: 10.3390/cells10051050.

228. Tsyganova A. V., Ivanova K. A., Tsyganov V. E. Histological and ultrastructural nodule organization of the pea (Pisum sativum) mutant SGEFix--5 in the Sym33 gene encoding the transcription factor PsCYCL0PS/PsIPD3 // Ecological genetics. 2019. № 1 (17). C. 65-70. D0I:10.17816/ecogen17165-70.

229. Tu T., Gao Z., Li L., Chen J., Ye K., Xu T., Mai S., Han Q., Chen C., Wu S., Dong Y., Chen J., Huang L., Guan Y., Xie F., Chen X. Soybean symbiotic-nodule zonation and cell differentiation are defined by NIN2 signaling and GH3-dependent auxin homeostasis // Developmental Cell. 2024. № 16 (59). C. 2254-2269.e6. D0I:10.1016/j.devcel.2024.07.001.

230. Tyler L., Thomas S. G., Hu J., Dill A., Alonso J. M., Ecker J. R., Sun T.-P. Della proteins and gibberellin-regulated seed germination and floral development in Arabidopsis // Plant Physiology. 2004. № 2 (135). C. 1008-1019. D01:10.1104/pp.104.039578.

231. Udvardi M., Poole P. S. Transport and Metabolism in Legume-Rhizobia Symbioses // Annual Review of Plant Biology. 2013. № 1 (64). C. 781-805. D0I:10.1146/annurev-arplant-050312-120235.

232. Ulmasov T., Murfett J., Hagen G., Guilfoyle T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin

response elements // The Plant Cell. 1997. № 11 (9). C. 1963-1971. DOI: 10.1105/tpc.9.11.1963.

233. Velandia K., Reid J. B., Foo E. Right time, right place: The dynamic role of hormones in rhizobial infection and nodulation of legumes // Plant Communications. 2022. № 5 (3). C. 100327. D0I:10.1016/j.xplc.2022.100327.

234. Velde K. Van De, Ruelens P., Geuten K., Rohde A., Straeten D. Van Der Exploiting DELLA Signaling in Cereals // Trends in Plant Science. 2017. №2 10 (22). C. 880-893. DOI:10.1016/j.tplants.2017.07.010.