Селекция древесных растений с использованием комплексного анализа в условиях урбанизированной среды Центрального Черноземья тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Вострикова Татьяна Валентиновна
Вострикова Татьяна Валентиновна
доктор наук
2025
- Специальность ВАК РФ00.00.00
- Количество страниц 391
Оглавление диссертации доктор наук Вострикова Татьяна Валентиновна
ВВЕДЕНИЕ
1. ОЦЕНКА АДАПТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА И ОТБОР ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К АНТРОПОГЕННОМУ ЗАГРЯЗНЕНИЮ (ОБЗОР)
1.1. Способы и методы отбора
1.2. Стресс. Устойчивость растений к стрессорам. Оценка устойчивости растений к антропогенному загрязнению
1.3. Адаптивная селекция. Адаптивный потенциал. Методики оценки
1.4. Эколого-биологическая характеристика объектов исследований
1.4.1. Биология и экология березы повислой
1.4.2. Эколого-биологическая характеристика ели колючей
1.4.3. Биоэкология, систематика, химический состав и полезные свойства видов рода Rhododendron
1.5. Молекулярные маркеры для анализа полиморфизма ДНК растений и маркерная селекция
2. МАТЕРИАЛ, МЕТОДЫ И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Эколого-географическая характеристика исследуемых областей Центрального Черноземья
2.2. Погодные условия в годы проведения исследований
2.3. Характеристика экологической ситуации в районах проведения исследований
2.4. Характеристика почвенного покрова исследуемых областей Центрального Черноземья
2.5. Объекты исследований
2.6. Методы исследований
2.6.1. Цитогенетический анализ
2.6.2. Анализ морфометрических параметров
2.6.3. Обработка органическими соединениями
2.6.4. Биохимические параметры
2.6.5. Антиоксидантная активность (АОА)
2.6.6. Молекулярно-генетический анализ
2.6.7. Фенологические наблюдения
2.6.8. Статистическая обработка экспериментальных данных
3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ BETULA PENDULA В СЕЛЕКЦИИ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К АНТРОПОГЕННОМУ ЗАГРЯЗНЕНИЮ
3.1. Выявление пределов изменчивости цитогенетических признаков Betula pendula под влиянием комплекса внешних факторов
3.2. Цитогенетический полиморфизм Betula pendula для отбора устойчивых материнских растений и потомства
3.3. Индивидуальный отбор материнских растений и потомства Betula pendula по цитогенетическим признакам, содержанию общего белка (в семенах и проростках) и всхожести семян
3.4. Индивидуальный и групповой отбор маточников Betula pendula по морфометрическим, биохимическим и цитогенетическим параметрам в условиях различной антропогенной нагрузки
4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ, ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ В СЕЛЕКЦИИ ВИДОВ РОДА RHODODENDRON
4.1. Выявление генетической дивергенции видов рода Rhododendron на основе анализа ITS1-ITS2 последовательностей
4.2. Изменчивость фенологических признаков видов рода Rhododendron
4.3. Связь цитогенетических признаков с молекулярно-генетическими различиями у видов рода Rhododendron при интродукции для оценки их генетического родства, стабильности генома и отбора наиболее устойчивых генотипов
4.4. Разработка основ размножения и групповой отбор семенного потомства Rhododendron ledebourii на основании цитогенетического полиморфизма и морфометрических параметров сеянцев
4.5. Отбор форм Rhododendron по антиоксидантной активности в листьях для урбанизированных территорий
5. СЕЛЕКЦИЯ И ОТБОР PICEA PUNGENS F. GLAUCA ДЛЯ УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ
5.1. Групповой отбор устойчивого к антропогенному загрязнению селекционного материала хвойных
5.2. Индивидуальный отбор цитогенетически устойчивых материнских растений Picea pungens и потомства с лучшими морфометрическими показателями
6. КОМПЛЕКСНАЯ СЕЛЕКЦИОННАЯ ОЦЕНКА АДАПТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ В СЕЛЕКЦИИ
6.1. Сравнительная оценка селекционного материала аборигенных и интродуцированных видов древесных растений в связи с устойчивостью к антропогенному загрязнению
6.2. Использование комплексной селекционной оценки адаптивного потенциала
7. ЭФФЕКТИВНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДИК ОТБОРА В СЕЛЕКЦИОННО-СЕМЕНОВОДЧЕСКОМ ПРОЦЕССЕ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ И НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА
7.1. Использование методики отбора цитогенетически устойчивых материнских растений и семенного потомства
7.2. Использование методики оценки по цитогенетическим показателям качества семян для получения быстрорастущих сеянцев (с последующей оценкой их морфометрических характеристик)
7.3 Экономическая эффективность отбора цитогенетически устойчивых материнских растений Picea pungens и потомства с лучшими морфометрическими параметрами
7.4. Разработка способов выращивания посадочного материала видов рода Rhododendron в защищенном грунте
7.5. Реализация адаптивного потенциала интродуцентов при выращивании в открытом грунте: отбор маточников и семенного потомств
7.6. Синтезированные органические гетероциклические соединения -регуляторы роста посадочного материала
7.6.1. Цитогенетические эффекты соединения хинолинового ряда 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2-дигидрохинолина
7.6.2. Влияние соединений 6-гидрокси-2,2,4-триметил-1,2-дигидрохинолина, его производных и их гидрированных аналогов на всхожесть семян и морфометрические показатели сеянцев Rhododendron
7.6.3. Влияние соединений ряда пиримидинкарбоновых кислот на всхожесть семян и морфометрические показатели сеянцев Rhododendron
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ И ПРОИЗВОДСТВА
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ
Приложение А. Цитологические фотографии и дендрограммы
Приложение Б. Таблицы
Приложение В. Фотографии объектов исследования и графики
Приложение Г. Схемы отбора
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Биотическая изменчивость и селекция дуба черешчатого в Центральной лесостепи2022 год, доктор наук Попова Анна Александровна
Цитогенетические реакции лиственных древесных растений на стрессовые условия и перспективы их использования для оценки генотоксичности окружающей среды2009 год, доктор биологических наук Калаев, Владислав Николаевич
Цитоэкология березы повислой: Betula pendula Roth.2002 год, кандидат биологических наук Вострикова, Татьяна Валентиновна
Цитогенетический и морфологический полиморфизм семенного потомства деревьев дуба черешчатого (Quercus robus L.) в условиях антропогенного загрязнения: на примере г. Воронеж2014 год, кандидат наук Попова, Анна Александровна
Влияние антропогенного загрязнения на цитогенетический полиморфизм семенного потомства берёзы повислой (Betula pendula Roth) в естественных и искусственных древостоях2011 год, кандидат биологических наук Карпова, Светлана Сергеевна
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Селекция древесных растений с использованием комплексного анализа в условиях урбанизированной среды Центрального Черноземья»
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы исследований. В настоящее время в связи с глобальными изменениями климата, возрастающим техногенным прессингом, уничтожением лесных массивов вследствие пожаров возникает проблема получения быстрорастущего и устойчивого к антропогенному загрязнению посадочного материала древесных растений. Поэтому важна разработка методологических принципов экспресс-оценки, селекции древесных видов с учетом адаптивного потенциала - способности растений приспосабливаться к условиям окружающей среды за счет модификационной и генотипической изменчивости [Жученко, 2001; Дорошенко и др., 2010; Ерофеева, 2015, 2016; Lubimov, Larionov, 2016; Рахмангулов, 2017; Юшков, 2017; Бессчетнов, Бессчетнова, 2018; Легощина, 2018; Кулькова и др., 2020; Ларионов, Володькин, 2021]. Ранее подобные исследования были проведены для цветочно-декоративных культур [Кузичев, 2022; Ханбабаева, 2022].
В связи с более частым использованием в насаждениях городской и пригородной зоны высокодекоративных интродуцентов - ели колючей (Picea pungens Engelm.), видов рода Rhododendron L. - представляет интерес выявление их реакций на антропогенное загрязнение, оценка качества семян и отбор материнских растений, продуцирующих фенотипически стабильные быстрорастущие сеянцы. В настоящее время не решена проблема сокращения длительности селекционного процесса древесных растений, занимающего десятки лет, и отбора устойчивого к стрессорам посадочного материала. Комплексный подход к отбору материнских экземпляров и цитогенетически стабильного семенного потомства позволил бы оптимизировать селекционный процесс древесных растений.
Состояние изученности проблемы. Проводятся исследования адаптивного потенциала на основании морфологических, физиолого-биохимических [Кулагин, 2006, 2009; Юшков, 2017; Рахмангулов, 2017; Легощина, 2018], анатомических
[Легощина, 2018] признаков древесных растений. Селекцию по признаку адаптивности к абиотическим факторам осуществляли у зерновых [Корзун, Бруйло, 2011], плодовых [Дорошенко и др., 2010; Юшков, 2017], овощных культур [Солдатенко, 2016]. Критерии отбора по признаку устойчивости к техногенному загрязнению с использованием понятия «адаптивный потенциал» предложены для овощных культур [Солдатенко, 2016]. Проведены работы над сокращением продолжительности селекционного процесса [Соколова и др., 2019; Кузичев, 2022; Ханбабаева, 2022] и оптимизацией получения выровненного, устойчивого к неблагоприятным факторам среды посадочного материала декоративных растений [Кузичев, 2020; Ханбабаева, 2022]. Селекцию древесных видов осуществляли на основе морфологических [Царев и др., 2002; Ширнин, 2010; Бессчетнова, 2013; Бессчетнова, Бессчетнов, 2017], физиологических [Высоцкий, Шеверножук, 2010; Бессчетнов, Бессчетнова, 2012; Бессчетнова и др., 2015] или генотипических маркерных признаков [Schulman, 2007; Боронникова и др., 2007, 2009; Mizuta et al., 2008; Lanying et al., 2008; Ковалевич, Каган, 2010], которые являются технически сложными и ресурсозатратными. Разработка методик отбора посадочного материала и оценки адаптивного потенциала древесных растений на клеточном и организменном уровнях позволяет интегрировано исследовать виды хвойных и лиственных, создать универсальные алгоритмы для селекции и снизить затраты на их проведение.
Цель исследований - разработка метода комплексного анализа древесных растений на основе изучения цитогенетических, биохимических и морфометрических признаков для ускорения селекционного процесса и получения быстрорастущего, устойчивого к антропогенному загрязнению посадочного материала.
Задачи исследований:
- провести сравнительный анализ цитогенетических признаков семенного потомства древесных растений (Betula pendula, Picea pungens, видов рода
Rhododendron) в условиях городских ландшафтов с различным уровнем антропогенного загрязнения;
- установить цитогенетические признаки видов рода Rhododendron серии Dauricum (подсекции Rhodorastrum (Maxim.) Cullen секции Rhododendron подрода Rhododendron), провести анализ ITS1-ITS2 последовательностей видов рода Rhododendron, выявить связь между молекулярно-генетическими и цитогенетическими признаками у видов рода Rhododendron серии Dauricum для оценки их генетического родства и отбора наиболее устойчивых генотипов;
- обосновать использование цитогенетического метода в селекционно-семеноводческом процессе древесных растений для оценки качества семян и отбора цитогенетически стабильного, быстрорастущего, устойчивого к антропогенному загрязнению потомства на примере Picea pungens и видов рода Rhododendron;
- оценить адаптивный потенциал древесных растений на примерах Betula pendula, Picea pungens, видов рода Rhododendron и разработать комплексные методики отбора устойчивых материнских экземпляров и цитогенетически стабильного потомства для ускоренного выращивания посадочного материала;
- разработать схему ускоренного селекционного процесса древесных растений и отбора устойчивого к антропогенному загрязнению быстрорастущего посадочного материала на основе комплексного анализа биохимических и морфометрических признаков.
Научная новизна работы. Впервые в условиях Центрального Черноземья проведен отбор по биохимическим и морфометрическим признакам материнских растений Betula pendula, от которых получено цитогенетически стабильное семенное потомство. Разработаны принципы размножения и отбора быстрорастущего, устойчивого к антропогенному загрязнению посадочного материала древесных растений (Picea pungens, видов рода Rhododendron). Выявлено, что цитогенетические параметры адекватно отражают ростовые способности семенного потомства. Установлены пределы изменчивости
цитогенетических признаков рододендрона даурского (Rhododendron dauricum L.), Ледебура (Rh. ledebourii Pojark.), сихотинского (Rh. sichotense Pojark.), остроконечного (Rh. mucronulatum Turcz.) в условиях интродукции и урбанизированной среды. Проведен анализ ITS1-ITS2 последовательностей у видов рода Rhododendron L. серии Dauricum (у Rh. dauricum L., Rh. ledebourii Pojark., Rh. sichotense Pojark., Rh. mucronulatum Turcz.), произрастающих в Центральном Черноземье. Установлены различия в 1-3 нуклеотида между видами и их генетическое родство, обусловливающее сходство цитогенетических признаков. Выявлена высокая антиоксидантная активность тканей листьев видов рода Rhododendron. Межвидовая, возрастная, экологическая изменчивость признака, связанная с цитогенетическими особенностями, позволяет использовать этот параметр в качестве критерия для отбора. На основе комплексного анализа цитогенетических, биохимических и морфометрических признаков разработана схема ускоренного селекционного процесса древесных растений и отбора устойчивого к антропогенному загрязнению быстрорастущего посадочного материала.
Теоретическая и практическая значимость работы. Проведена комплексная селекционная оценка адаптивного потенциала (цитогенетических, физиолого-биохимических признаков и величины флуктуирующей асимметрии), отобраны материнские деревья Betula pendula, устойчивые к антропогенному загрязнению, от которых получено цитогенетически стабильное потомство. Доказано, что использование цитогенетического метода обеспечивает возможность адекватной оценки экологических условий в местах сбора семян и качества семян, подбора материала для серийного производства быстрорастущих сеянцев на урбанизированных территориях, поиска фенотипически изменчивых экземпляров материнских растений для селекции, выявления цитотоксичности регуляторов роста, значительного сокращения времени селекционного процесса. Установлена связь между цитогенетическими и морфометрическими признаками видов рода Rhododendron серии Dauricum, Picea pungens, выявлены группы
семенного потомства с различной ростовой активностью, получены быстрорастущие, устойчивые к антропогенному загрязнению сеянцы. Разработаны способы отбора материнских растений, оценки качества семян и ранней диагностики быстрорастущих сеянцев, позволяющие сократить селекционно-семеноводческий процесс у древесных видов. Рекомендованы источники для селекции Rhododendron ledebourii, Picea pungens - маточники, продуцирующие цитогенетически стабильное потомство, обладающее высокой ростовой активностью в условиях урбанизированных территорий Центрального Черноземья. Установлена экономическая эффективность способа отбора материнских растений Picea pungens и цитогенетически стабильного быстрорастущего потомства для ускорения селекционного процесса до 4 лет. Результаты исследований используются в научно-образовательном процессе в курсе «Экологическая генетика».
Методология и методы исследований. Методология исследований включает определение объектов, предмета, формулировку цели, задач, основных положений и программы, организацию эксперимента, анализ и апробацию результатов. В работе использован системный подход и методы: сравнительный, теоретико-экспериментальный в области цитогенетики, молекулярно-генетического анализа, морфологии, биохимии, физиологии растений (наблюдение, сравнительно-экологический, структурно-функциональный), моделирования, статистический. Проведен анализ фенотипической изменчивости количественных признаков. Для комплексной селекционной оценки использованы цитогенетические признаки (митотическая и ядрышковая активность, уровень патологий митоза), физиолого-биохимические (антиоксидантная активность, активность пероксидазы в листьях материнских растений, содержание общего белка в семенах и проростках, всхожесть семян), морфометрические (величина флуктуирующей асимметрии листьев, высота растения, длина корня, число листьев сеянцев, годичный текущий прирост растений).
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- цитогенетическая стабильность является принципом отбора материнских растений, продуцирующих семенное потомство с лучшими морфометрическими признаками;
- использование количественных признаков (величины флуктуирующей асимметрии листьев, активности пероксидазы в листьях материнских растений, содержания общего белка в семенах и проростках, митотической и ядрышковой активности, изменчивости патологий митоза семенного потомства) как основы селекционно-семеноводческого процесса древесных растений;
- комплексная селекционная оценка, включающая выявление морфометрических, биохимических и цитогенетических признаков, позволяет определять адаптивный потенциал материнских растений, качество их семенного потомства и ускорять селекционно-семеноводческий процесс древесных видов.
Степень достоверности. Достоверность исследований достигнута в результате 4-6-летних экспериментов, обеспечивающих репрезентативные выборки, учета изучаемых признаков на опытных площадях и в лаборатории. По результатам проведена компьютерная статистическая обработка данных с помощью пакета программ "Stadia" 7.0. Оценку распределения признаков в выборке осуществляли с использованием критерия %2. Для сравнения показателей, подчиняющихся нормальному распределению, использовали /-критерий Стьюдента. Признаки, не подчиняющиеся нормальному распределению, сравнивали с использованием Х-критерия рангов Ван-дер-Вардена. Кластерный анализ проводили с использованием метрики нормированного Эвклидова расстояния, стратегия группировки - группового соседа. Всхожесть семян в контрольном и опытных вариантах сравнивали с использованием Z-аппроксимации для критерия равенства частот. Производили однофакторный непараметрический дисперсионный анализ Крускалла-Уоллиса, двухфакторный и однофакторный параметрический дисперсионный анализ. Силу влияния фактора определяли по Снедекору (%). Для выявления корреляционной зависимости
использовали коэффициент корреляции рангов Спирмена (rs). Достоверность статистических характеристик соответствует 95-процентному уровню значимости.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на региональных, всероссийских, международных научных конференциях: 9-ой Международной научно-методической конференции «Фармобразование-2023» (Воронеж, 28-29 сентября 2023 г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика Г.И. Тараканова (Москва, 31 октября 2023 г.); II-ой Международной научно-практической конференции «Проблемы экологии и сельское хозяйство в XXI веке», посвященной 135-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (Москва, 3-6 октября 2022 г.) и др. Части исследования включены в аналитическую вневедомственную целевую программу МНО РФ «Развитие научного потенциала высшей школы» по проекту № 2245, государственные контракты № 02.518.11.7176, № 16.518.11.7099, проект № 4.903.2011; работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований в рамках грантов № 09-04-97503-р-центр-а, № 14-34-50505 мол_нр, № 15-34-50857 мол_нр.
Полнота изложения материалов диссертации в работах, опубликованных соискателем. По теме диссертации опубликовано 43 работы, в том числе 1 монография, 1 учебное пособие, 13 статей в изданиях, индексируемых в международных базах Scopus и Web of Sciences, 9 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ (из них 6, входящих в перечень ВАК РФ квартили К1, К2 по специальности) и 9 патентов на изобретение.
Личный вклад соискателя. В основу диссертационной работы положены результаты многолетних экспериментальных исследований, проведенных лично автором на кафедре генетики, цитологии и биоинженерии и в ботаническом саду Воронежского госуниверситета. Анализ ITS1-ITS2 последовательностей видов рода Rhododendron проведен совместно с лабораторией института Биотехнологии Хельсинского университета. Автором собраны оригинальные материалы,
разработаны теоретические положения, обоснованы цели и задачи исследования, статистически обработаны, проанализированы и обобщены результаты. Статьи подготовлены самостоятельно и в соавторстве, в которых личное участие автора составляет выше 80%.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов, предложений производству, списка литературы и приложений. Работа содержит 391 страницу текста, 92 таблицы, 13 рисунков, 4 приложения. Список литературы включает 548 источников, в том числе 82 иностранных.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному консультанту, доктору биологических наук, профессору Калаеву Владиславу Николаевичу, доктору сельскохозяйственных наук, профессору Сорокопудову Владимиру Николаевичу, за консультации, ценные замечания и обсуждение результатов работы, кандидату биологических наук, доценту Календарь Роману Николаевичу, кандидату биологических наук Землянухиной Ольге Александровне за консультации и помощь в выполнении отдельных этапов научных исследований.
1. ОЦЕНКА АДАПТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА И ОТБОР ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА НА УСТОЙЧИВОСТЬ К АНТРОПОГЕННОМУ ЗАГРЯЗНЕНИЮ (ОБЗОР)
1.1. Способы и методы отбора
Одним из основных типов изменчивости лесных популяций считается структурная [Яблоков, 1963; Мамаев, 1973] и связанная с ней функциональная, биохимическая и этологическая (поведенческая) изменчивость [Ширнин, 2010]. А.Я. Любавская приводит данные о количественных признаках структуры у форм березы, различной по декоративности древесины [Любавская, 1978]. Отбор лучших (плюсовых) насаждений часто называют «групповым» [Любавская, 1982; Котов, 1997]. Однако лучшие качества деревьев могут не проявляться из-за неблагоприятных условий произрастания [Царев и др., 2002; Бессчетнова, 2013; Бессчетнова, Бессчетнов, 2017]. При отборе лучших (плюсовых) деревьев повышение продуктивности насаждений не всегда присутствует, особенно в селекции на продуктивность по массе [Царев и др., 2002]. Недостаток -отсутствие предварительной оценки наследственных качеств материнских растений, что может быть устранено при использовании цитогенетического метода [Патент № 2662650]. В последнее время в цитогенетических исследованиях часто используются семена популяционной выборки [Дорошев, 2004; Сенькевич, 2007; Калаев, 2009; Артюхов и др., 2009; Калаев, Попова, 2014 б; Патент № 2662650]. Это достаточно удобно, поскольку уменьшает объем исследований, дает возможность проводить адекватную оценку качества семян и отбор устойчивых форм на ранних стадиях развития растений, что устраняет основные недостатки группового и массового методов.
Массовый отбор не выделяет конкретный ценный индивид для получения от него быстрорастущего потомства [Патент № 2654605], а также этот метод
односторонен (отбор генотипов только по материнской линии), не позволяет оценивать генотип потомства [Царев и др., 2002]. Однако в случае гетерогенности исходной популяции можно получить положительный эффект массового отбора на увеличение прироста [Царев и др., 2002; Бессчетнов, Бессчетнова, 2012; Бессчетнова, 2013, Бессчетнова и др., 2015, Бессчетнова, Бессчетнов, 2017]. Индивидуальный отбор и смешанные методы (индивидуально семейного и семейно-группового) для древесных достаточно длительны (из-за поэтапной оценки потомства требуются десятки лет), ограничены в количестве отбираемых индивидов и генетически не оценивают качество семян [Патент № 2654605].
Часто ограничиваются оценкой морфометрических показателей [Патент № 2681105], например, массой 1000 семян [Корзун, Бруйло, 2011], величиной и массой семян [Любавская, 1982; Царев и др., 2002; Патент № 2681105]. Но нельзя преувеличивать значение сортировки семян [Вересин, 1946; Добринов, 1983; Царев и др., 2002], а также сортировки растений по величине в направлении более быстрого роста в молодом возрасте [Гуляев, 1971; Царев и др., 2002; Патент № 2654605].
В настоящее время традиционные методы оценки качества семян (по «крупности» и дающий более полную информацию - по удельному весу [Овчаров, Кизилова, 1966]) уступают более совершенным, использующим биохимические, генетические технологии. Сортировка и отбор семян по абсолютной массе не позволяют исследовать генетические особенности потомства и прогнозировать ростовые способности получаемых из них сеянцев [Патент № 2654605]. А.Я. Любавская считает, что анатомические исследования имеют большое значение при отборе исходного материала для практической селекции [Любавская, 1978]. Цитогенетическая оценка качества семян позволяет производить отбор и одновременно проверку потомства на ранних стадиях развития на основании клеточных и субклеточных характеристик [Патент № 2654605]. Но до сих пор проблема разнокачественности семян остается малоисследованной. Сейчас актуальной задачей является разработка
рациональных приемов диагностики и отбора высококачественных семян с применением современных методик, в том числе и цитогенетического метода. Перспективно использование этого метода для оценки качества мелких семян, например, видов Betula, Rhododendron, являющихся объектами настоящего исследования. Решению проблемы разнокачественности семян может помочь выделение различных по стабильности групп семенного потомства и их оценка по цитогенетическим показателям. Озеленение загрязненных территорий, которыми являются многие города и зоны промышленных предприятий, предполагает использование устойчивых экземпляров. Такие особи можно выявить при изучении полиморфизма с использованием цитогенетического метода и разделения проростков на группы по уровню стабильности. В последние годы проводятся физиолого-биохимические исследования [Кулагин, 2006; Юшков, 2017; Алиева, 2017; Бессчетнов, Бессчетнова, 2012; Бессчетнова и др., 2015] и предпринимаются попытки отбора генотипов с помощью морфологических [Царев и др., 2002; Ширнин, 2010; Бессчетнова, 2013], физиологических [Высоцкий, Шеверножук, 2010; Бессчетнов, Бессчетнова, 2012; Бессчетнова и др., 2015], функциональных признаков [Высоцкий, Шеверножук, 2010; Шеверножук, 2010].
Для озеленения урбанизированных территорий требуются виды и формы, устойчивые к техногенной нагрузке, аномалиям погодных условий, которые часто отмечаются в последние годы. Важной задачей является разработка рациональных приемов диагностики и отбора маточных растений, высококачественного семенного потомства с использованием современных методов, в том числе и цитогенетического.
1.2. Стресс. Устойчивость растений к стрессорам. Оценка устойчивости растений к антропогенному загрязнению
Защитные реакции организма Г. Селье назвал «стрессом» или «адаптационным синдромом», а вызывающие их факторы - «стрессорами» [Селье, 1960, 1972]. Состояние, в котором находится растение под действием того или иного стрессора называется стрессом [Физиология растений, 2005]. Суть стресса - поддержание жизнедеятельности организма в экстремальных условиях и приспособление к ним. По мнению некоторых авторов, в реакции организма на экстремальные условия есть элементы патологии, поэтому их правомерно рассматривать как «адаптационную болезнь» [Шкутко, 1991]. Согласно концепции Г. Селье, любой живой организм отвечает на воздействие факторов среды, если они незначительны по силе и непродолжительны по времени, локальными реакциями, специфичными для данного фактора или раздражителя [Селье, 1960, 1972]. К этому утверждению в литературе приводится пример о влиянии полуденной депрессии на растение: при кратковременном недостатке влаги в полуденные часы клетки листьев и молодых побегов теряют тургор и завядают, при этом устьица закрываются, а рост прекращается, вечером тургор восстанавливается и рост возобновляется [Шкутко, 1991]. Однако значительные по силе и продолжительности действия раздражители вызывают, кроме специфических локальных, еще и общие, стереотипные реакции всего организма, имеющие явно защитный характер [Шкутко, 1991]. Любой стресс нарушает гомеостаз в организме, однако следует подчеркнуть неспецифичность ответной реакции на него, чему существует множество примеров. Угнетение физиологических процессов вследствие антропогенного воздействия отмечается на организменном и на клеточном уровне травянистых и древесных растений. Например, техногенное пылевое загрязнение места произрастания родительских растений приводило к снижению физиологических показателей (всхожесть, длина корешка) семенного потомства лебеды раскидистой [Прокопьев и др., 2012]. К
снижению биомассы и замедлению роста корневой системы сеянцев сосны обыкновенной приводят повышенные концентрации ионов свинца [Иванов и др., 2013]. Подобную реакцию у растений вызывает недостаток влаги. На клеточном уровне угнетение процессов проявляется общими неспецифическими реакциями. Так, независимо от этиологии сильное стрессовое воздействие вызывает снижение числа митотических делений соматических клеток и мейотических делений генеративных клеток [Богданова, 2004; Калашник, 2008], увеличение времени прохождения стадий митоза, повышение уровня цитогенетических нарушений [Калаев, 2009]. Введено понятие "неспецифическая метаболическая реакция" клеток на экстремальные условия [Инжеваткин, Савченко, 2016]. Обнаружено, что в экстремальных условиях в клетках развиваются метаболические изменения, неспецифические по отношению к типу клеток и природе действующего экстремального фактора, что эти изменения характеризуют метаболические механизмы клеточной адаптации и дезадаптации [Инжеваткин, Савченко, 2016].
Итак, разработанная для животных концепция стресса как совокупности неспецифических реакций вполне применима и к растениям, которые вследствие прикрепленного образа жизни находятся в особенно тесной зависимости от окружающей среды [Чиркова, 2002]. Но наряду с общими (неспецифическими) реакциями у растений существуют и специфические реакции на стресс. В современной литературе встречаются работы сравнительного характера по исследованию физиологических реакций и экологических свойств, например, на действие низкой температуры и тяжелых металлов. Так, были выявлены определенные различия в реакциях растений на воздействие низкой температуры и кадмия, связанные с негативным влиянием последнего на рост и фотосинтетическую активность [Венжик и др., 2015]. Попытки построить модели поведения разных видов растений, в частности, щучки дернистой и горицвета обыкновенного на воздействие медьсодержащих растворов в лабораторных условиях с помощью корневого теста позволили выявить разные типы
трансформации зависимости доза-эффект, основанные на различной металлоустойчивости: высокой изменчивости по признаку у щучки дернистой и низкой - у горицвета обыкновенного, что подразумевает соответственно высокую и низкую фенотипическую пластичность видов в отношении токсического фактора [Дуля и др., 2013]. Стратегии адаптации к различным экологическим условиям большей частью исследовались на примере многолетних травянистых растений с использованием морфометрических критериев [Жуйкова и др., 2002; Позолотина и др., 2006]. Новые подходы к проблеме адаптации подразумевают выделение «стратегии поведения» защитных систем по биохимическим показателям [Ерофеева, 2016]. Мы говорим о стратегии адаптации к различным экологическим условиям древесных растений на клеточном, а также на организменном уровне.
Под устойчивостью понимают способность растений сохранять постоянство внутренней среды (поддерживать гомеостаз) и осуществлять жизненный цикл в условиях действия стрессоров [Физиология растений, 2005]. Однако далеко не ко всем воздействиям возможно развитие устойчивости у растений. Так, например, по результатам многолетних исследований, отмечалась высокая индивидуальная изменчивость жизнеспособности, мутабильности, радиочувствительности у древесных растений, в частности, у сосны обыкновенной [Гераськин и др., 2016], травянистых: одуванчика лекарственного [Жуйкова и др., 2002; Позолотина и др., 2006], подорожника большого [Позолотина и др., 2005], звездчатки злаковой [Ро7о1о1та е1 а1., 2010 а]. Показано наличие эффекта преадаптации растений из зоны с повышенным содержанием тяжелых металлов, выраженном в устойчивости к дополнительному облучению, и его отсутствие у популяций подорожника большого [Позолотина и др., 2016] и у сосны обыкновенной [Гераськин и др., 2016] с радиактивно загрязненных территорий (при дополнительном облучении) по показателю жизнеспособности.
Похожие диссертационные работы по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Сравнительная цитоэкология сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) и ели белой (Picea glauca (Moench) Voss) в условиях антропогенного загрязнения2022 год, кандидат наук Игнатова Ирина Викторовна
Дендроиндикация эмиссий автотранспорта и мебельных комбинатов2004 год, кандидат биологических наук Заложных, Наталья Викторовна
Биоразнообразие сосны обыкновенной (Pinus sylvestris L.) в контрастных экотопах юга Сибири2016 год, доктор наук Пименов Александр Владимирович
Отбор высокопродуктивных деревьев на плантациях сосны кедровой сибирской разного географического происхождения по фенотипу и семенному потомству: зеленая зона г. Красноярска2009 год, кандидат сельскохозяйственных наук Орешенко, Сергей Александрович
Селекционно-генетическая оценка сосны обыкновенной (Pinus sylvestris l.) на лесосеменных плантациях в Республике Башкортостан2025 год, кандидат наук Рафикова Дина Анваровна
Список литературы диссертационного исследования доктор наук Вострикова Татьяна Валентиновна, 2025 год
ПМ - - -
ОЯ * *** -
П - *** -
М - *** -
А - * -
Т - ** **
Примечание: МИ - митотический индекс, подсчитанный с учетом стадии профазы; МИ без П -митотический индекс без учета клеток, подсчитанных в стадии профазы; ПМ - уровень патологий митоза; ОЯ - уровень клеток с остаточными ядрышками; П - число клеток в стадии профазы; М - число клеток в стадии метафазы; А - число клеток в стадии анафазы; Т - число клеток в стадии телофазы; * - влияние достоверно (Р<0,05); ** - влияние достоверно (Р<0,01); *** - влияние достоверно (Р<0,001).
Наибольшие эффекты отмечаются в районе со слабым уровнем загрязнения среды поллютантами, полученные результаты объясняются различиями индивидуальных реакций семенного потомства отдельных деревьев, что может свидетельствовать о существовании альтернативных цитогенетических механизмов, обусловливающих стабильность прохождения митотического цикла. Причем наиболее ярко проявляется разнообразие таких путей при слабом уровне загрязнения. Это означает различие индивидуальных реакций семенного потомства отдельных деревьев, что указывает на существование неустойчивых и резистентных групп, а также на возможность их выявления с помощью предлагаемого комплексного метода.
Возможно, увеличение параметра «уровень клеток с остаточными ядрышками» (Приложение А, Рисунок 1), как адаптивный механизм, обеспечивает дополнительный биосинтез белка и обуславливает повышение содержания общего растворимого белка у семенного потомства березы, которое в слабозагрязненном районе значительно превышает контрольный показатель. Ранее другими авторами было выявлено, что у растений умеренные дозы поллютантов, в частности, свинца и других тяжелых металлов, увеличивают общее содержание белка, активируя синтез защитных белков (стрессовых белков, ферментов антиоксидантной системы) [8пуав1ауа е1 а1., 2005], а высокие дозы, напротив, снижают количество белка из-за повышенной продукции активных форм кислорода, окисляющих белки [Агутё, Ргагаё, 2005; Е1-КИа1:1Ь е1 а1., 2014; Ерофеева, 2016]. Мы связываем увеличение уровня клеток с остаточными ядрышками с дополнительными резервами (на клеточном уровне) для поддержания эффективного биосинтеза белка при прорастании семени, сформировавшегося в условиях антропогенного загрязнения.
Наше предположение подтверждается существованием высоких положительных корреляций между признаками «количество общего растворимого белка» и «уровень клеток с остаточными ядрышками», «количество общего растворимого белка» и «митотический индекс», при которых г8=0,9
(Р<0,05). Несмотря на более высокий уровень патологий митоза в клетках корневой меристемы проростков березы повислой из слабозагрязненного района по сравнению с контролем (Таблица 24; Р<0,01), семена сохраняют высокую способность к прорастанию и имеют даже большую всхожесть, чем таковые с контрольной территории (Таблица 19; Р<0,01). Уровень патологий митоза в клетках корневой меристемы проростков сильнозагрязненного района существенно превосходит контрольный (Р<0,01) и этот параметр у семенного потомства из слабозагрязненного района (Таблица 24; Р<0,01), хотя всхожесть не различается с контролем (Таблица 19). Однако, как было замечено, митотический индекс в опыте был ниже контрольного (Таблица 24). Недостаточная ростовая активность, показателем которой является МИ, на наш взгляд, компенсируется адаптивными реакциями, например, усиленным синтезом белковых соединений, возможно, в том числе стрессовых белков, характеризующимся параметром «содержание белка». Наши результаты согласуются с литературными данными об увеличении количества белка в стрессовых условиях, в частности при повышенной техногенной нагрузке [Сидорович, Гетко, 1992; Чиркова, 2002; Татаринова и др., 2017]. Сходный механизм был обнаружен при влиянии высокой температуры на живые организмы, действующей как стресс и вызывающей синтез стрессовых белков [Кулаева и др., 1991], белков «теплового шока» [Чиркова, 2002]. Превышение уровня клеток с остаточными ядрышками на опытных территориях по сравнению с контролем на стадиях мета-, ана-, телофазы митоза в клетках корневой меристемы проростков березы повислой, отмеченное нами и у других объектов исследования, по-видимому, связано с влиянием антропогенного загрязнения. Увеличение уровня клеток с остаточными ядрышками свидетельствует об усилении ядрышковой активности, что происходит за счет дополнительной синтетической деятельности рибосомальных генов, похожей на синтез белков «теплового шока», который может быть индуцирован не только тепловым шоком, но и рядом других неблагоприятных воздействий, в том числе тяжелыми металлами [Чиркова, 2002]. Антропогенное воздействие на
материнские растения и их семенное потомство является стрессовым воздействием, следовательно, прорастающее семя, как живой организм, изыскивает резервные возможности роста, т.е. включаются адаптивные механизмы к воздействию окружающей среды. Отмечалось, что потомство подорожника большого из зоны с повышенным содержанием тяжелых металлов обладало низкой жизнеспособностью и было устойчиво к дополнительному воздействию нового (гамма-облучение) и привычного (тяжелые металлы) для него фактора, в то время как семена подорожника с радиактивно загрязненных территорий храктеризовались высокой жизнеспособностью и низкой металло- и радиоустойчивостью, что позволило авторам предполагать неспецифичность адаптивных механизмов [Позолотина и др., 2016].
Таким образом, можно охарактеризовать исходный селекционный материал: материнские растения и их семенное потомство по цитогенетическим (уровню патологий митоза, митотической и ядрышковой активности) и биохимическим (содержание белка) признакам потомства, определить качество семян и выделить маточники по анализируемым параметрам их потомства. Качество семенного материала, собранного в слабозагрязненной зоне ниже, чем в контроле, но выше, чем у такового в сильнозагрязненном районе. Отобраны формы Betula pendula, произрастающие на экологически чистой (ботанический сад ВГУ): Б-ВБс-1, Б-ВБс-2, Б-ВБс-3, Б-ВБс-4, Б-ВБс-5 и слабозагрязненной территории (ул. Платонова): Б-Пл-3, Б-Пл-4, Б-Пл-5, потомство которых обладает более высокой митотической и ядрышковой активностью и меньшим уровнем патологий митоза, в качестве источников на устойчивость к антропогенному загрязнению. В связи с этим рекомендуется сбор семян с анализируемых деревьев в целях получения посадочного материала для урбанизированных территорий. Вследствие высокого уровня хромосомных аберраций в клетках корневой меристемы проростков березы повислой из загрязненного района, можно сделать заключение о цитогенетической нестабильности материнских растений. В связи с этим не рекомендуется сбор семян с проанализированных деревьев для выращивания
посадочного материала. Однако их возможно использовать в селекционных целях в качестве источника получения новых форм (как наиболее отзывчивых экземпляров).
3.4. Индивидуальный и групповой отбор маточников Betula pendula по морфометрическим, биохимическим и цитогенетическим параметрам в условиях различной антропогенной нагрузки
В литературе встречаются многочисленные сведения о влиянии химического загрязнения природных сред на количественные и качественные характеристики ферментов, в том числе растительных пероксидаз [Кретович, 1971; Сергеева, 1971; Андреева, 1988; Гордей и др., 1988; Неверова, 2004; Ветчинникова, 2004, 2005; Физиология растений, 2005, 2017; Полесская, 2007; Стаценко и др., 2008; Фазлиева и др., 2012]. Исследовали изменение показателей состояния защитных систем (пероксидазной активности, содержания общего белка и суммарного количества сульфгидрильных групп защитных пептидов) в листе у березы повислой и липы сердцевидной (Tilia cordata Mill.) при действии автотранспортного загрязнения [Ерофеева, 2016; Патент № 2716112]. Анализировали изменение активности антиоксидантных ферментов у некоторых однолетних и многолетних травянистых растений [Особенности окислительного стресса., 2006; Воскресенская, 2009], интродуцированных хвойных (Picea pungens Engelm., Thuja occidentals L., Juniperus sabina L. и др.), произрастающих в условиях городской среды [Неверова, 2004; Стаценко и др., 2008; Воскресенская и др., 2015]. Предлагали использовать активность пероксидазы Betula pendula как индикатор качества городской среды [Симонова, Чемаркин, 2013; Патент № 2716112]. Указывали, что новообразования в изозимном спектре пероксидазы
хвои сосны и ели могут служить объективными показателями уровня химического загрязнения природных сред [Стаценко и др., 2008].
Исследования физиологических характеристик растений, в основном, ограничены морфо-физиологическими параметрами [Оскорбина и др., 2010; Венжик и др., 2011, 2015; Казнина и др., 2012; Бухарина, Поварницина, 2013] или анатомо-физиологическими особенностями [Глянько, Ищенко, 2013; Инжеваткин, Савченко, 2016]. Показана корреляция морфологических признаков листовой пластинки (длины, ширины, площади) на примере видов тополя (Populus L.) [Бессчетнов, Бессчетнова, 2018]. Немногие работы, касающиеся изучения биохимических показателей, носят комплексный характер, включая морфо-физиологические, фенологические особенности растений [Ветчинникова, 2004, 2005]. Обнаружена связь содержания тритерпеновых спиртов в листьях Betula pendula с климатическими параметрами [Махнев и др., 2012]. Связывают морфометрические и физиологические параметры [Иванов и др., 2011, 2012, 2013], в том числе, интенсивность липопероксидации и величину флуктуирующей асимметрии листа у Betula pendula [Ерофеева, 2015, 2016] или площадь листа, асимметрию листовой поверхности, сопротивление устьиц, содержание хлорофилла у Quercus robur [Wuytack et al., 2013]. В литературе упоминается о существовании связи между флуктуирующей асимметрией и цитологическими показателями [Калаев, 2011, 2012; Калаев, Попова, 2014 а], хотя чаще изучение цитогенетических характеристик семенного потомства сопряжено с физиологическими параметрами, в частности, всхожестью семян [Филиппова и др., 2015], фенологическими [Седельникова, Пименов, 2015] или морфометрическими, например, длиной корней или проростков [Дмитриева и др., 2006; Лазарева и др., 2017]. Сведения о связи цитогенетических и биохимических параметров растений в литературе фрагментарны. Встречаются исследования окислительного стресса на стыке биохимии и цитологии [Инжеваткин, Савченко, 2016; Лапшина и др., 2016]. Изучено влияние нитрата свинца на цитогенетические и некоторые биохимические показатели семенного потомства сосны
обыкновенной [Белоусов, Землянухина, 2011; Патент № 2716112]. Немногие работы, касающиеся изучения стабильности генетического материала [Артюхов и др., 2009; Машкина и др., 2009; Калаев, Попова, 2014 б, в], показывают возможность использования цитогенетических признаков в селекции, хотя направление является достаточно перспективным, поскольку позволяет выявлять не только устойчивые фенотипы, но и генотипы. Цитологические и морфометрические исследования направлены на выявление параметров морфогенетического гомеостаза, с которым связывают определение флуктуирующей асимметрии [Иванов и др., 2014].
Понятие флуктуирующей асимметрии, количественным выражением которой является коэффициент флуктуирующей асимметрии, часто сопряжено с понятием стабильность развития, которую исследуют в разных условиях у растений [Чистякова, Кряжева, 2001; Гелашвилли и др., 2004; Захаров и др., 2011; Устюжанина и др., 2012; Ерофеева, 2015; Рахмангулов, 2017] и животных [Захаров, 1987; Захаров и др., 2000; Чубинишвили, 2001]. В литературных источниках не было отражено использования исследований флуктуирующей асимметрии для отбора материнских древесных растений. Не производили комплексного исследования морфометрических, цитогенетических и биохимических показателей, например, активности пероксидазы. Такая работа позволит, с одной стороны, пролить свет на механизмы адаптации материнских растений и их семенного потомства на клеточном и организменном уровне к антропогенному загрязнению. С другой стороны, с помощью комплексного исследования морфометрических (коэффициент флуктуирующей асимметрии), биохимических (активность пероксидазы) параметров возможна оценка экологической обстановки на территории произрастания и отбор наиболее устойчивых материнских экземпляров, затем проверка семенного потомства по цитогенетическим признакам.
В контрольных точках (Воронежский БС, Белгородский БС, пос. Тюнино) коэффициент флуктуирующей асимметрии в среднем колебался в пределах
условной нормы (Таблицы 26-27). Наименьшие величины отмечались в Воронежском БС (в среднем 0,020), а у отдельных деревьев из Белгородского БС (Б-Бс-4 - 0,042) и пос. Тюнино (Б-Т-2 - 0,042; Б-Т-3 - 0,043; Б-Т-4 - 0,041) выявлены начальные (незначительные) отклонения от нормы по уровню флуктуирующей асимметрии согласно шкале В.М. Захарова [Захаров и др., 2000]. Следовательно, эти деревья Betula pendula наиболее чувствительны по морфометрическим признакам к колебаниям окружающей среды.
Были проведены исследования стабильности развития березы повислой более 15 лет назад по уровню флуктуирующей ассиметрии по методологии «Биотеста» в разных районах г. Воронежа, в том числе на территории Ботанического сада ВГУ, где интегральный показатель соответствовал условной норме (0,035), на территории санатория им. Горького (Центральный район г. Воронежа - 0,036) и вблизи завода синтетического каучука (СК) (Левобережный район г. Воронежа - 0,042), где отмечались незначительные изменения в ходе развития [Кругляк, 2000]. Можно отметить, что в настоящее время величина флуктуирующей асимметрии в Воронежском БС снизилась, а в загрязненном Левобережном районе повысилась по сравнению с предыдущими исследованиями.
Величина флуктуирующей асимметрии у березы повислой в экологически загрязненных районах варьировала от 0,058 (г. Задонск) до 0,065 (г. Воронеж, Завод СК), что соответствует критическому состоянию [Захаров и др., 2000] (таблицы 26-27). Однако некоторые деревья отличались наиболее высоким уровнем флуктуирующей асимметрии в точках: г. Воронеж, Завод СК (Б-СК-4 -0,073); Белгородский автовокзал (Б-Ба-4 - 0,086); г. Задонск (Б-Зд-1 - 0,076; Б-Зд-3 - 0,072) (различия достоверны, Р<0,01).
В целом, выявлены различия по величине флуктуирующей асимметрии между деревьями в выборках, что свидетельствует об индивидуальных особенностях отдельных экземпляров и, возможно, разной устойчивости к вариациям окружающей среды, в частности, к загрязнению по морфометрическим
признакам (различия достоверны, Р<0,01) (Таблицы 26-27). Было замечено, что к условиям урбанизированной среды приспосабливаются виды, которые имеют широкую норму реакции (адаптивный резерв) [Алтухов, 1989; Рахимов, Рахимов, 2011]. Одним из таких видов растений является береза повислая [Попов, 2003].
Отмечалось повышение коэффициента флуктуирующей асимметрии и, соответственно, снижение стабильности развития у растений [Чистякова, Кряжева, 2001; Гелашвили и др., 2004; Захаров и др., 2011; Ерофеева, 2015; Рахмангулов, 2017] и животных [Захаров, 1987; Захаров и др., 2000; Чубинишвили, 2001] в неблагоприятных для организма условиях. Е.А. Ерофеевой установлено, что колебания погодных условий оказывали значительное влияние на величину флуктуирующей асимметрии у деревьев Betula pendula контрольного участка при умеренном уровне загрязнения, а при высоком - основополагающее действие принадлежало антропогенному фактору [Ерофеева, 2015].
Таблица 26 - Величина флуктуирующей асимметрии (х ±S х) у отобранных форм березы повислой (Betula pendula) в различных экологических условиях
Наименование отобранной формы
№ Б-ВБс Б-Пл Б-СК Б-ББс Б-Ба
1 0,020+0,005* 0,067+0,006* 0,066+0,004* 0,028+0,005* 0,051+0,005
2 0,014+0,004 0,059+0,005* 0,060+0,004 0,020+0,005 0,050+0,004
3 0,015+0,003 0,052+0,004 0,059+0,003 0,020+0,005 0,060+0,005*
4 0,026+0,006* 0,069+0,005* 0,073+0,003* 0,042+0,004* 0,086+0,005*
5 0,025+0,005* 0,053+0,005 0,066+0,005* 0,029+0,004* 0,059+0,004*
ср 0,020+0,005 0,060+0,005 b 0,065+0,004 b 0,028+0,003 0,061+0,004 b
Примечание: № - № формы; ср - среднее значение показателя по району исследования; * -различия между деревьями одной выборки достоверны (Р<0,01); ь - различия с контролем достоверны (Р<0,001)
Следует обратить особое внимание, что активность пероксидазы в распускающихся листьях у отмеченных деревьев: Б-СК-4 (г. Воронеж, Завод СК) - 1,34 мкмоль/мин/мг; Б-Ба-4 (Белгородский автовокзал) - 1,39 мкмоль/мин/мг; Б-Зд-1 (г. Задонск) - 1,54 мкмоль/мин/мг; Б-Зд-З - 1,37 мкмоль/мин/мг также, как и величина флуктуирующей асимметрии, была наиболее высока (различия достоверны, Р<0,05) (Таблицы 26-28).
Таблица 27 - Активность пероксидазы и величина флуктуирующей асимметрии
(х ±Sл;) у отобранных форм березы повислой (Betula pendula) в различных экологических условиях
Район Тюнино (Б-Т) Задонск (Б-Зд)
№ формы УА, мкмоль/мин/мг КФА УА, мкмоль/мин/мг КФА
1 0,50+0,02 0,036+0,004 1,54+0,03* 0,076+0,007**
2 0,62+0,03 0,042+0,006** 1,19+0,04* 0,050+0,005**
3 0,69+0,05* 0,043+0,005** 1,37+0,06* 0,072+0,007**
4 0,58+0,04 0,041+0,005** 1,03+0,04 0,049+0,005**
5 0,51+0,03 0,040+0,004** 0,98+0,04 0,045+0,005
среднее 0,58+0,03 0,040+0,004 1,22+0,04 c 0,058+0,005 b
Примечание: УА, мкмоль/мин/мг - Удельная активность пероксидазы, мкмоль/мин/мг; КФА -коэффициент флуктуирующей асимметрии; * - различия между деревьями одной выборки достоверны (Р<0,05); ** - различия между деревьями одной выборки достоверны (Р<0,01); ь -различия с контролем достоверны (Р<0,01); с - различия с контролем достоверны (Р<0,001)
Удельная активность пероксидазы в двух контрольных точках (Воронежский БС, Белгородский БС) составила 0,27 мкмоль/мин/мг, а в третьей (пос. Тюнино) - 0,58 мкмоль/мин/мг, значительно выше (различия достоверны, Р<0,05), возможно указывая на стрессовое состояние деревьев в этом районе. Необходимо отметить, что отдельные экземпляры, характеризующиеся
наибольшей флуктуирующей асимметрией, например, Б-Т-3 (пос. Тюнино) -0,043, Б-Бс-4 (Белгородского БС) - 0,042 отличались от других в выборке более высокой пероксидазной активностью (различия достоверны, Р<0,05) (Таблицы 2728). Это утверждение справедливо как в отношении выборок из контрольных точек, так и из экологически загрязненных районов (Таблицы 27-28), подтверждаясь высокой положительной корреляцией между признаками «величина флуктуирующей асимметрии» и «активность пероксидазы» для всех исследованных районов г8=1 (Р<0,05), кроме варианта пос. Тюнино, где г8=0,975 (Р<0,05).
Таблица 28 - Удельная активность пероксидазы (мкмоль/мин/мг) (X±SX) у отобранных форм березы повислой (Betula pendula) в различных экологических условиях
Наименование отобранной формы
№ Б-ВБс Б-Пл Б-СК Б-ББс Б-Ба
1 0,28+0,02 0,72+0,05 1,21+0,06* 0,27+0,03 0,75+0,06
2 0,22+0,02 0,69+0,05 1,06+0,05 0,21+0,02 0,73+0,05
3 0,24+0,01 0,65+0,04 0,98+0,05 0,22+0,02 0,99+0,07*
4 0,33+0,03 0,77+0,05 1,34+0,07* 0,37+0,03* 1,39+0,08*
5 0,30+0,03 0,66+0,04 1,23+0,06* 0,28+0,03 0,86+0,06
ср 0,27+0,02 0,70+0,05 b 1,16+0,05 c а 0,27+0,03 0,94+0,05 c
Примечание: № - № формы; ср - среднее значение показателя по району исследования; * -различия между деревьями одной выборки достоверны (Р<0,05); ь - различия с контролем достоверны (Р<0,01); с - различия с контролем достоверны (Р<0,001); а - различия со слабозагрязненным районом достоверны (Р<0,001).
Наибольшее (среднее) значение активности пероксидазы выявлено у березы повислой в точках: г. Задонск (1,22 мкмоль/мин/мг), где проходит автомагистраль
M-4, и г. Воронеж, Завод СК (1,16 мкмоль/мин/мг). Левобережный район г. Воронежа, где расположено предприятие ООО «Воронежсинтезкаучук» или Завод СК определен как сильнозагрязненный, отличающийся повышенными концентрациями поллютантов на фоне высокого содержания в почве ионов тяжелых металлов [Медико-экологический атлас., 2010; Куролап и др., 2012]. Наиболее токсичными являются ионы кадмия, цинка, меди, железа, алюминия, никеля [Полесская, 2007], которыми изобилуют отработанные газы автотранспорта, поэтому придорожные полосы являются территориями с сильной техногенной нагрузкой, характеризуясь высоким содержанием в почве ионов тяжелых металлов.
В связи с выше изложенным, можно предполагать, что в исследуемом районе г. Задонска средняя степень антропогенного загрязнения. В отличие от этой территории, у деревьев в слабозагрязненном Центральном районе г. Воронежа на ул. Платонова активность пероксидазы составила 0,70 мкмоль/мин/мг, что значительно ниже, чем в сильнозагрязненном Левобережном районе (различия со слабозагрязненным районом достоверны, P<0,001). Это согласуется с ранее полученными результатами с применением геоинформационных технологий о ранжировании территорий г. Воронежа [Епринцев и др., 2008; Куролап и др., 2012]. Достаточно высокая активность пероксидазы в районе Белгородского автовокзала с прилегающей автомагистралью (0,94 мкмоль/мин/мг), что может характеризовать данную территорию как среднезагрязненную. Результаты наших исследований согласуются с ранее проведенными, например, было показано, что в листьях в листьях горчицы сарептской активность пероксидазы возрастала при избытке железа, меди и цинка [Полесская, 2007].
В экологически загрязненных районах у материнских растений B. pendula наиболее велик разброс между показателями отдельных экземпляров, как по параметру «величина флуктуирующей асимметрии», так и по «активности пероксидазы» (различия достоверны, Р<0,01, Р<0,05) (Таблицы 26-28).
Двухфакторный дисперсионный анализ влияние фактора «дерева» и «места произрастания материнских растений» на параметры: «величина флуктуирующей асимметрии» (Р<0,05) и «активность пероксидазы» (Р<0,05).
Учитывая этот факт, можно утверждать, что одни из исследуемых деревьев, имеющие более низкие величины флуктуирующей асимметрии и активности пероксидазы, более устойчивы и лучше адаптируются, а другие, которые имеют более высокие параметры (флуктуирующей асимметрии и активности пероксидазы), менее резистентны и менее приспособлены к антропогенной нагрузке. На загрязненных территориях отмечаются количественные изменения пероксидаз, чаще наблюдается активация пероксидазы [Неверова, 2004; Стаценко и др., 2008; Воскресенская, 2009; Воскресенская и др., 2015; Ерофеева, 2016]. Ранее были показаны изменения компонентного состава фермента, возрастание гетерогенности изозимного спектра пероксидазы, что свидетельствует об адаптивной перестройке окислительно-восстановительных систем, связанной с приспособлением растения к условиям техногенного стресса [Сергеева, 1971; Андреева, 1988; Неверова, 2004; Полесская, 2007; Стаценко и др., 2008]. Усиление антропогенной нагрузки на среду повышает активность пероксидазы, что рассматривается как естественный механизм защиты от загрязнения для сохранения чувствительных внутриклеточных компонентов [Воскресенская, 2009] или как защитно-приспособительный механизм, направленный на выживание растений в экстремальных условиях [Неверова, 2004].
Однако наиболее значимые различия с контролем (Р<0,001) у материнских деревьев березы повислой на загрязненных территориях возникают по величине флуктуирующей асимметрии, поэтому мы полагаем, что морфометрические параметры более чувствительны к техногенной нагрузке. Наши предположения согласуются с результатами исследований других авторов. На примере ромашки аптечной (Matricaria chamomila L.) было показано, что при действии техногенного загрязнения наиболее чувствительны морфометрические и репродуктивные характеристики [Prokop'ev et al., 2014]. Ответные реакции
растений выражались в увеличении вариабельности морфологических признаков, мобилизации компенсаторных биохимических механизмов защиты и формировании более жизнеспособного семенного потомства [Prokop'ev et al., 2014].
Таким образом, учитывая морфометрические (величина флуктуирующей асимметрии) и биохимические (активность пероксидазы, содержание общего белка в семенах и проростках) признаки, можно отобрать перспективные формы, наиболее устойчивые к антропогенному загрязнению, произрастающие в условиях техногенной нагрузки. Например, Б-Пл-3, Б-Пл-5 (Центральный район г. Воронежа, ул. Платонова), Б-Зд-2, Б-Зд-4, Б-Зд-5 (г. Задонск), Б-Ба-1, Б-Ба-2 (г. Белгород, автовокзал).
Реакции семенного потомства на антропогенное загрязнение (на клеточном уровне) выражаются также в форме изменения их цитогенетических параметров, представленных в таблице 29. Из таблицы видно снижение митотического индекса у B. pendula по сравнению с контролем (различия достоверны, Р<0,05; P<0,01), но одновременное повышение уровня патологий митоза (различия достоверны, P<0,01) и числа клеток на стадии профазы (различия достоверны, P<0,001) в опыте. В сильнозагрязненном районе г. Воронежа доля патологий митоза (различия достоверны, Р<0,01) и число клеток на стадии профазы (различия достоверны, P<0,001) значительно превышали таковые в слабозагрязненном. Уровень патологий митоза напрямую зависит от степени загрязнения территории, что неоднократно отмечалось и другими авторами [Буторина и др., 2000; Вострикова, 2007; Kalaev et al., 2010].
Замечено перераспределение клеток по стадиям митоза в опыте за счет значительного повышения числа клеток на стадии профазы (P<0,001) (Таблица 29). Это свидетельствует о задержке клеток в профазе в связи с нарушениями митотического аппарата и работой системы checkpoint-контроля генетического материала [Лебедева и др., 2004].
Таблица 29 - Цитогенетические параметры семенного потомства у отобранных форм Betulapendula (х ±SX) из районов с различной экологической обстановкой
Наименование отобранных форм
Параметры Б-ВБс Б-Пл Б-СК Б-ББс Б-Ба Б-Т Б-Зд
МИ, % 4,0+0,1 3,3+0,06 * 3,5+0,05 * 3,9+0,1 3,4+0,07* 3,3+0,1 2,8+0,1*
МИ без П, % 2,9+0,1 2,1+0,04 * 1,7+0,03 ** 2,9+0,1 2,2+0,05* 2,3+0,1 1,6+0,1*
П, % 28,1+0,4 35,5+0,6 ** 50,0+0,4 * * *в 27,8+0,5 37,5+0,8* * 28,7+0,9 45,3+1,1 ***
М, % 31,0+1,2 36,2+1,2 * 24,0+0,8 **б 38,9+1,4 34,2+1,1* 30,6+1,1 23,2+1,1 **
А, % 11,5+0,4 9,0+0,6 7,7+0,4* 13,8+1,0 10,0+0,8* 13,9+1,0 11,7+0,9
Т, % 25,8+0,9 19,1+1,0 * 18,8+0,7 * 18,9+1,0 18,3+1,0 26,7+1,2 19,8+1,3 **
ПМ, % 3,6+0,5 13,1+0,7 ** 22,6+0,7 ***б 2,9+0,5 13,5+0,6* ** 3,1+0,8 12,2+0,6 ***
ОЯ, % 13,8+1,0 24,2+1,0 ** 17,0+0,6 *а 26,0+0,8 25,4+1,0 13,8+1,1 21,5+1,4 **
Вакуол., % 10,7±0,9 15,4±1,0 * 25,8±1,1 *** б 20,4±1,2 25,5±1,1* 9,3±0,8 23,3±1,2 ***
Примечание: Б-ВБс - ботанический сад ВГУ, Б-Пл - Центральный р-н (Воронеж), Б-СК -Левобережный р-н (Воронеж), Б-ББс - ботанический сад БелГУ, Б-Ба - Белгород (автовокзал), Б-Т - пос. Тюнино, Б-Зд - г. Задонск; МИ, % - митотический индекс, подсчитанный с учетом стадии профазы; МИ без П, % - митотический индекс без учета клеток, подсчитанных в стадии профазы; П, % - число клеток в стадии профазы; М, % - число клеток в стадии метафазы; А, % - число клеток в стадии анафазы; Т, % - число клеток в стадии телофазы; ПМ, % - уровень патологий митоза; ОЯ, % - уровень клеток с остаточными ядрышками; Вакуол., % - уровень вакуолизированных клеток.
* - различия с контролем достоверны (Р<0,05); ** - различия с контролем достоверны (Р<0,01); *** - различия с контролем достоверны (Р<0,001);
а - различия со слабозагрязненным районом достоверны (P<0,05); б - различия со слабозагрязненным районом достоверны (P<0,01); в - различия со слабозагрязненным районом достоверны (P<0,001)
Задержку клеток в профазе показывают такие признаки, как «митотический индекс, подсчитанный с учетом стадии профазы» и «митотический индекс без учета клеток, подсчитанных в стадии профазы» [Бурменко и др., 2018], связанные между собой положительной корреляцией (rs=0,9 (Р<0,05)). Отмечается одновременное снижение числа клеток в метафазе, анафазе и телофазе в опыте по сравнению с контролем (различия достоверны, Р<0,05, P<0,01, P<0,001), характеризуемое признаком «митотический индекс без учета клеток, подсчитанных в стадии профазы». При этом значительные изменения митотического цикла и уровня патологий митоза при сильном антропогенном загрязнении свидетельствует о более существенных повреждениях генетического материала у материнских растений березы и их семенного потомства (проростков), чем у таковых в слабозагрязненном районе.
В условиях окислительного стресса, когда нарушается клеточный гомеостаз, происходит накопление Н2О2 в клеточных компартментах [Полесская, 2007; Лапшина и др., 2016]. При этом Н2О2 действует как сигнализирующая молекула, участвуя в сигнальных каскадах и индуцируя экспрессию защитных генов [Gechev, Hille, 2005; Nyathi, Baker, 2006; Лапшина и др., 2016]. С другой стороны, в ответ на раздражение в клетке образуются относительно небольшие молекулы или ионы (вторичные мессенджеры), участвующие в передаче сигнала, концентрация которых в цитоплазме резко возрастает, например, Са2+ [Физиология растений, 2017], что тормозит разборку микротрубочек, влияя на вязкость и движение цитоплазмы, митотическую и секреторную активность клеток [Лазарева и др., 2017]. В связи с выше изложенным становится ясна
причина задержки цитотомии в клетках проростков (из-за повышения вязкости цитоплазмы) с увеличением степени загрязнения в местах произрастания материнских деревьев. Другими авторами было отмечено, что концентрации ^ и Cd, не превышающие официально установленные нормативы проявляют активность на клеточном уровне, повреждая нити веретена деления [Евсеева и др., 2003; Евсеева, 2005]. Кроме того, предполагают, что клетки, подвергнутые Н2О2-опосредованной гибели являются источниками сигнальных молекул, индуцирующих защитные механизмы против окислительного стресса в клетках, не обнаруживающих программированной гибели [Лапшина и др., 2016].
Скорость пролиферации клеток весьма чувствительна к различным воздействиям [Иванов и др., 2011]. В норме пролиферация зависит от уровня синтетических процессов, и эти параметры изменяются пропорционально, обеспечивая постоянный клеточный гомеостаз. Нами выявлены высокие корреляции между признаками: «митотический индекс без учета клеток, подсчитанных в стадии профазы», и «уровень патологий митоза», г8=-0,67...-0,85 (Р<0,05); «митотический индекс без учета клеток, подсчитанных в стадии профазы», и «уровень клеток с остаточными ядрышками», г8=0,6-0,9 (Р<0,05) [Патент № 2716112]. При этом первое соотношение справедливо для всех исследованных точек, а второе характерно для загрязненных районов. В меристематических клетках проростков с чистых территорий «митотический индекс без учета клеток, подсчитанных в стадии профазы», и «уровень клеток с остаточными ядрышками» связаны отрицательной корреляцией, г8=-0,7...-0,8 (Р<0,05). Остаточное ядрышко считалось не нормой, а функциональным нарушением [Ви1:огта е! а1., 1997; Бурменко и др., 2018]. Оно, на наш взгляд, является ответной реакцией на воздействие окружающей среды. Под воздействием стрессоров (загрязнителей) возникает дисбаланс между образованием АФК, возможностью их ликвидации и скоростью репарационных процессов (системы репарации не успевают устранять повреждения клеточных структур) [Полесская, 2007]. Для поддержания постоянного гомеостаза
необходимы другие соотношения цитогенетических параметров, приводящие к их активации, депрессии или компенсации, т. е. включению адаптивных механизмов.
Адаптивным механизмом к воздействию неблагоприятных условий среды считается остаточное ядрышко [Буторина, Исаков, 1989], появление которого в митозе можно назвать частным случаем усиления ядрышковой активности за счет дополнительной синтетической деятельности рибосомальных генов [Татаринова Бурменко и др., 2018], похожей на синтез белков «теплового шока» [Шалыго и др., 2012]. Ядрышко является наиболее лабильной клеточной органеллой, отражающей уровень метаболизма клетки в целом, количественные и качественные характеристики которой могут использоваться как высокочувствительный тест для определения действия внешних факторов на клетку [Соболь, 2001; Вострикова, 2002]. Уровень клеток с остаточными ядрышками повышался в опыте и был выше контрольного (различия достоверны, Р<0,05, P<0,01). Однако в Белгородском БС данный параметр был достаточно высок (26,0 %) по сравнению с остальными контрольными точками (различия достоверны, Р<0,05, P<0,01), как при умеренном загрязнении (таблица 29), что в совокупности с повышенной величиной флуктуирующей асимметрии характеризует материнские растения березы и их семенное потомство как адаптирующиеся к стрессу (сохраняется гомеостаз развития). Возможно, увеличение параметра «уровень клеток с остаточными ядрышками», как адаптивный механизм, обеспечивает дополнительный биосинтез белка и обуславливает приспособительную реакцию на комплексное воздействие внешних факторов [Бурменко и др., 2018]. В сильнозагрязненном районе г. Воронежа у B. pendula данный параметр превышал контрольный, но был значительно ниже такового при слабом загрязнении (различия достоверны, P<0,01). Характер изменений показателя «уровень клеток с остаточными ядрышками» укладывается в рамки понятия о немонотонных эффектах [Ерофеева, 2016] и определяется как гормезис, при этом слабый стресс вызывает стимуляцию, а сильный - угнетение параметра.
На микропрепаратах корней проростков B. pendula всех исследуемых точек отмечены вакуолизированные клетки (Приложение А, Рисунок 1), число которых увеличивалось пропорционально степени загрязнения (Таблица 29). Причиной появления вакуолизированных клеток можно назвать антропогенное воздействие на материнские растения березы (повышенную карбонатность почвы [Dumacheva, Cherniavskih, 2013; Думачева, Чернявских, 2012, 2014 а, б], известную в качестве мощного стрессора), вызывающее, с одной стороны, процессы деградации и даже гибель некоторых клеток в прорастающих семенах. С другой стороны, причиной возникновения и увеличения числа таких клеток можно предположить активизацию защитной роли вакуоли в клетке в результате карбонатного стресса, как на B. pendula и ее семенное потомство в Белгородском БС, у которого число вакуолизированных клеток было значительно выше, чем в остальных контрольных точках (20,4 %, различия достоверны, Р<0,01), сходно с воздействием на долю клеток с остаточными ядрышками. В клетках проростков семян из района Белгородского автовокзала (25,5 %) и г. Задонска (23,3 %) присутствовало число вакуолизированных клеток на уровне сильнозагрязненного района г. Воронежа. В наших экспериментах повышение числа вакуолизированных клеток в апикальной корневой меристеме (при увеличении загрязнения территории) коррелировало с уровнем клеток с остаточными ядрышками (rs=0,8 (Р<0,05)) и уровнем патологий митоза (rs=0,73 (Р<0,05)) [Патент № 2715644], следовательно, эти параметры могут являться критериями степени загрязнения территории.
Наличие вакуолизированных клеток в меристематической ткани говорит о возможном разрушении их структур, поскольку в норме вакуоли отсутствуют в делящихся клетках, появляясь при прохождении ими дифференцировки [Морфология и анатомия..., 1988]. В результате процессов, вызванных повреждением клеток, происходит деградация липидов и белков [Мальхотра, Хан, 1988]. В сильнозагрязненном районе г. Воронежа у B. pendula параметр составил 25,8 %, превышая таковой в контроле (10,7 %, различия достоверны, Р<0,001) и
слабозагрязненном (15,4 %, различия достоверны, Р<0,01). Другие авторы в лабораторных экспериментах по воздействию растворов нитрата свинца на семена сосны обыкновенной замечали, что в опытных образцах клеток корневой меристемы цитоплазма имела зернистую вакуолизированную структуру, что может быть связано со связыванием свинца с белками цитоплазмы и их денатурацией [Белоусов и д., 2011]. В условиях окислительного стресса в клетках происходит интенсивное образование аутолитических вакуолей, содержащих участки цитоплазмы, митохондрии и другие органеллы, что объясняется необходимостью удаления структур, поврежденных активными формами кислорода, а также окисленных макромолекул [Дмитриева, 2008]. При окислительном стрессе клетки обладают повышенной протеолитической активностью [Лапшина и др., 2016], а деградация окисленных белков в клетках растений может осуществляться автофагией [Морфология и анатомия..., 1988; Xiong et а1., 2007]. Установлено, что растения имеют две вакуолярные системы: одну для хранения запасных веществ, а другую для выполнения литических функций [Физиология растений, 2005, 2017]. Под воздействием стресса в клетке образуются вторичные (стрессовые) метаболиты [Мальхотра, Хан, 1988; Рощина, Рощина, 1989], в том числе терпеноиды, фитогормоны (гиббереловая и абсцизовая кислоты), фенольные соединения (образуются из одного предшественника - фенилаланина), которые превращаются в активно действующие вещества и находятся в вакуолях [Фуксман, 2003]. Возможно, появление вакуолизированных клеток в корневой меристеме проростков вызвано включением биохимического механизма антиоксидантной защиты от повреждения (как адаптивная реакция семенного потомства на стресс).
Береза повислая в условиях урбанизированной среды была отмечена как вид, характеризующийся высокой водоудерживающей способностью и содержанием вторичных метаболитов. Кроме того, установлены высокие корреляции между концентрацией танинов и содержанием в воздухе диоксида
азота у березы повислой (г=0,52) [Бухарина и др., 2007]. Из литературы известно, что эффективное функционирование супероксиддисмутазы в клетках растений, особенно тех молекулярных форм фермента, которые ингибируются перекисью водорода, зависит от пероксид-утилизирующих ферментов, из которых в вакуолях выявлена фенол-зависимая пероксидаза. Наличие супероксиддисмутазы и пероксидазы в вакуолярном соке может указывать на функционирование в вакуолях клеток растений системы антиоксидантной защиты, которая способна предохранять ее молекулярные структуры от супероксид-радикалов и избыточных количеств перекиси водорода [Прадедова и др., 2011]. Исходя из выше сказанного, вакуоль является адаптивным органоидом, участником системы антиоксидантной защиты. Поэтому появление вакуолизированных клеток в меристематических тканях - одна из цитогенетических реакций на стрессовое воздействие [Бурменко и др., 2018].
В литературе рассматриваются конкретные механизмы участия вакуоли растительных клеток в поддержании их редокс-гомеостаза в условиях абиотических стрессов различной природы, обуславливающих генерацию в них активных форм кислорода (АФК), а проявление антиоксидантной роли вакуоли в растительных клетках является ясным примером тесной интеграции функционирования этой органеллы с остальной частью клетки [Андреев, 2012]. Другие авторы отмечали, что при сравнительно низких концентрациях Н2О2 (слабом стрессе) генерация АФК вызывает адаптацию растений к стрессу, а при более высоких ведет к окислительному повреждению белков и других клеточных компонентов (липидов, углеводов, ДНК), что завершается гибелью клеток [Nyathi, Baker, 2006; Xiong et al., 2007; Лапшина и др., 2016]. Замечено, что клетка может вернуться к нормальному функционированию после репарации своих структур, справляясь со сверхпродукцией АФК с помощью различных физиологических процессов [Дмитриева, 2008].
Для определения возможности проведения отбора устойчивых к антропогенной нагрузке растений (и выделения источников на устойчивость к антропогенному загрязнению) следует оценить экологическую обстановку в месте произрастания, выявить приоритетные зоны, возможно провести ранжирование территорий по степени загрязнения. С этой целью необходимо рассмотреть морфометрические, биохимические и цитогенетические признаки в совокупности. Высокие положительные корреляции отмечались между активностью пероксидазы и цитогенетическими параметрами: уровнем патологий митоза (rs=0,98 (Р<0,05)), уровнем клеток с остаточными ядрышками (rs=0,98 (Р<0,05)), числом профаз (rs=0,98 (Р<0,05)), числом метафаз (rs=0,88 (Р<0,05)) [Патент № 2716112]. Величина флуктуирующей асимметрии коррелировала с уровнем клеток с остаточными ядрышками (rs=0,87 (Р<0,05)) и уровнем патологий митоза (rs=0,98 (Р<0,05)). Таким образом, проростки семян Воронежского БС, пос. Тюнино характеризуются высоким МИ, низким уровнем патологий митоза и вакуолизированных клеток, средним числом профаз и уровнем клеток с остаточными ядрышками (Таблицы 29-30).
В клетках проростков Белгородского БС высоко число вакуолизированных клеток и уровень клеток с остаточными ядрышками, что свидетельствует об адаптации материнских растений и их семенного потомства к слабым стрессовым воздействиям. Однако высокий МИ, среднее число профаз и низкий уровень патологий митоза в клетках корневой меристемы указывают на нормальное протекание пролиферации и на достаточно благоприятную экологическую ситуацию в месте произрастания. С учетом величины флуктуирующей асимметрии листьев материнских деревьев, соответствующей условной норме, и активности пероксидазы можно назвать исследуемые территории экологически чистыми.
Таблица 30 - Критерии отбора материнских растений и семенного потомства Betula pendula на устойчивость к антропогенному загрязнению
Территории МИ, % П, % ПМ, % ОЯ, % В. к., % УА, мкмоль/мин/ мг КФА
1 Воронеж БС, пос. Тюнино, Белгород БС выше 3 27-30 ниже 5 ниже 20 ниже 20 0,20-0,60 ниже 0,040
2 Центральн. р-н (Воронеж), г. Задонск, Белгород (автовокзал) 2,5-3,5 35-50 5-15 20-30 15-25 0,60-1,20 0,0450,060
3 Левобереж. р-н (Воронеж) выше 3 выше 50 выше 15 15-20 Выше 25 выше 1,0 выше 0,060
Примечание: МИ, % - митотический индекс; П, % - число клеток в стадии профазы; ПМ, % -уровень патологий митоза; ОЯ, % - уровень клеток с остаточными ядрышками; В. к., % -уровень вакуолизированных клеток; УА, мкмоль/мин/мг - Удельная активность пероксидазы; КФА - коэффициент флуктуирующей асимметрии; 1 - экологически чистая территория; 2 -умеренно загрязненная территория; 3 - сильно загрязненная территория.
В апикальной корневой меристеме проростков семян Центрального района г. Воронежа снижен МИ, повышены число профаз и вакуолизированных клеток, уровень патологий митоза и клеток с остаточными ядрышками (Таблицы 29-30). Данные цитогенетические признаки характеризуют материнские растения B. pendula и их семенное потомство как находящиеся в состоянии адаптации к стрессу средней силы. Активность пероксидазы повышена, а величина флуктуирующей асимметрии листьев материнских деревьев соответствует критическому состоянию. Морфометрический параметр «величина флуктуирующей асимметрии» более чувствителен к техногенной нагрузке, чем биохимический «активность пероксидазы». Однако по совокупности всех исследуемых показателей можно определить эту территорию как умеренно загрязненную и использовать материнские растения B. pendula и их семенное потомство в качестве источников устойчивого селекционного материала.
Величины цитогенетических характеристик семенного потомства B. pendula из района Белгородского автовокзала и г. Задонска приближались к таковым в проростках из Центрального района г. Воронежа, отличаясь большим числом профаз и вакуолизированных клеток (Таблицы 29-30). В совокупности с высокими значениями активности пероксидазы и величины флуктуирующей асимметрии листьев материнских деревьев, соответствующей критическому состоянию, мы определяем эти территории как умеренно загрязненнные, где возможен отбор источников устойчивого селекционного материала (Приложение В, Рисунок 1-4). Высокими значениями числа профаз и вакуолизированных клеток, уровнем патологий митоза и низким МИ отличалось семенное потомство B. pendula из Левобережного района г. Воронежа (Таблицы 29-30). С учетом высокой активности пероксидазы и величины флуктуирующей асимметрии можно утверждать, что территория сильно загрязнена. Материнские деревья B. pendula и их семенное потомство характеризуются цитогенетической нестабильностью. Такие экземпляры можно использовать в селекции в качестве источников мутаций.
Возможно выстроить ряд исследуемых территорий по приоритету использования для сбора материала (по возрастанию степени загрязнения): Воронежский БС, Белгородский БС > пос. Тюнино > Центральный район г. Воронежа > г. Задонск, Белгородский автовокзал > Левобережный район г. Воронежа. Определив возможность использования территории для сбора материала, необходимо установить критерии отбора растений для участия в селекционно-семеноводческом процессе (Таблица 30). Отбор материнских растений производится по величине флуктуирующей асимметрии, активности пероксидазы в листьях, а проверка по потомству - по цитогенетическим признакам.
Для селекционного процесса необходимо сначала отобрать материнские растения с определенными признаками, а затем осуществлять проверку по потомству [Царев и др., 2002]. Для ускорения селекции древесных растений,
которая иногда занимает десятки лет, возможно проводить исследования в более краткие временные сроки, для чего необходимо установить корреляционные связи между определенными параметрами материнских растений и их семенного потомства. Например, на основе выявленных биохимических признаков (активность пероксидазы, содержание белка) мы отбираем устойчивые к антропогенному загрязнению материнские деревья и осуществляем проверку потомства по цитогенетическим параметрам. Для отбора материнских деревьев Betula pendula и их семенного потомства по биохимическим параметрам (содержание общего белка в семенах и проростках, активность пероксидазы), необходимо вычисление активности пероксидазы материнского растения и сравнение ее со значением 0,28 мкмоль/мин/мг (Приложение Г, Рисунок 1). Если активность пероксидазы материнского растения выше, то его семенное потомство будет характеризоваться низкой митотической и ядрышковой активностью, высоким уровнем патологий митоза (нестабильное). Если активность пероксидазы материнского растения ниже, то его семенное потомство будет с высокой митотической и ядрышковой активностью, низким уровнем патологий митоза (стабильное) [Патент № 2716112]. Вычисленное содержание общего белка в семенах сравнивают со значением 0,180 мг/мл, а в проростках со значением 0,160 мг/мл, ниже которых семенное потомство характеризуется низкой всхожестью и ростовой способностью (нестабильное), выше которых - высокими показателями (стабильное) (Приложение Г, Рисунки 3-4).
Возможен более простой и дешевый способ отбора устойчивых к загрязнению древесных растений с высоким качеством семян. Разработанная нами методика ускоренного получения результатов отбора устойчивых к антропогенному загрязнению материнских экземпляров по уровню флуктуирующей асимметрии листовой пластинки включает проверку по потомству и оценку качества семян на основании биохимических (содержание общего белка) или цитогенетических признаков. Оценка флуктуирующей асимметрии - более простая, доступная и дешевая методика по сравнению с
оценкой активности пероксидазы. Кроме того, устойчивость к антропогенному загрязнению материнских экземпляров и стабильность их семенного потомства возможно проверить по цитогенетическим признакам, что позволяет сэкономить десятки лет, необходимые для селекционно-семеноводческого процесса древесных растений. Для отбора материнских экземпляров Betula pendula и их семенного потомства по уровню флуктуирующей асимметрии листовой пластинки, вычисляют величину флуктуирующей асимметрии листа материнского растения и сравнивают ее со значением 0,020 (Приложение Г, Рисунок 2). Если параметр материнского экземпляра выше этого значения, то от него будет получено нестабильное семенное потомство, в противном случае - стабильное [Патент № 2715644]. Разработанные нами методики позволяют отбирать устойчивые к антропогенному загрязнению материнские растения по биохимическим (активность пероксидазы, содержание белка) и/или морфометрическим (флуктуирующая асимметрия) признакам, производить взаимозаменяемость параметров при отборе.
Полностью соответствуют приведенным критериям (Таблица 30) растения Воронежского БС, Белгородского БС, а также пос. Тюнино на основании невысокого уровня пероксидазы и коэффициента флуктуирующей асимметрии в пределах нормы [Захаров и др., 2000]. Учитывая величину флуктуирующей асимметрии и биохимические признаки (активность пероксидазы, содержание белка), можно отобрать перспективные формы с наиболее устойчивым к антропогенному загрязнению семенным потомством (проверенным по соответствующим цитогенетическим признакам), например, Б-Пл-3, Б-Пл-5 (Центральный район г. Воронежа, ул. Платонова). Таким образом, произведен отбор перспективных цитогенетически стабильных форм как источников на устойчивость к антропогенному загрязнению на территории Воронежского БС (Б-ВБс-1, Б-ВБс-2, Б-ВБс-3, Б-ВБс-4, Б-ВБс-5), Белгородского БС (Б-ББс-1, Б-ББс-2, Б-ББс-3, Б-ББс-4, Б-ББс-5) и пос. Тюнино Липецкой области (Б-Т-1, Б-Т-2, Б-Т-3, Б-Т-4, Б-Т-5). Выделены устойчивые к антропогенному загрязнению источники на
территории Центрального района г. Воронежа (Б-Пл-3, Б-Пл-5), Белгородского автовокзала (Б-Ба-1, Б-Ба-2), г. Задонска (Б-Зд-2, Б-Зд-4, Б-Зд-5) для селекции и выращивания в урбанизированных зонах.
В контрольных районах г. Воронежа и Белгорода отмечен низкий уровень флуктуирующей асимметрии, соответствующий условно нормальному состоянию или I баллу оценки качества среды по шкале В.М. Захарова [Захаров и др., 2000]. Более высокий уровень флуктуирующей асимметрии замечен в контроле Липецкой области. Выявляются начальные (незначительные) отклонения от нормы или II балл оценки качества среды по шкале В.М. Захарова по причине эмиссии вредных веществ от Новолипецкого металлургического комбината, который вносит основной вклад в загрязнение природной среды г. Липецка, области и ЦЧР в целом [Девятова и др., 2015]. Уровень флуктуирующей асимметрии в опыте по шкале В.М. Захарова [Захаров и др., 2000] соответствует критическому состоянию или V баллу оценки качества среды. Содержание общего растворимого белка в семенах Betula pendula в контрольном районе г. Воронежа было наибольшее по сравнению с другими (контрольными зонами) (различия достоверны, Р<0,05), что свидетельствует о хорошем качестве семян.
Результаты нашего исследования показывают повышение уровня флуктуирующей асимметрии листовой пластинки и содержания общего растворимого белка в семенах Betula pendula на экологически загрязненных территориях по сравнению с чистыми (Таблица 31). Особенно увеличилось содержание общего белка у семенного потомства из Воронежа и Липецкой области (более, чем в 2 раза), что указывает на влияние загрязнителей среды, вызывающее стимулирующий эффект.
Анализ содержания общего белка в семенах показал связь с морфометрическим параметром «уровень флуктуирующей асимметрии» у материнских растений березы повислой. Нами были обнаружены высокие положительные корреляции между параметрами «уровень флуктуирующей асимметрии» и «содержание общего растворимого белка» для исследованных
районов г8=0,9 (Р<0,05). Увеличение содержания общего растворимого белка, показывающее усиление метаболической активности, возможно, является адаптивным механизмом в условиях антропогенной нагрузки. При исследовании физиолого-биохимических параметров, частности, биоэлектрического потенциала покоя сосны обыкновенной показано, что слабый стресс вызывает стимулирующий эффект [Шеверножук, 2010].
Таблица 31 - Содержание общего белка в семенах и уровень флуктуирующей асимметрии у отобранных форм березы повислой (Betula pendula)
Об/с, мг/мл КФА Об/с, мг/мл КФА
Б-Т-1, 2, 3, 4, 5 Б-Зд-1, 2, 3, 4, 5
0,17+0,02 0,040+0,004 0,37+0,02** 0,059+0,005**
Б-ББс-1, 2, 3, 4, 5 Б-Ба-1, 2, 3, 4, 5
0,18+0,02 0,028+0,003 0,29+0,03* 0,061+0,004***
Б-ВБс-1, 2, 3, 4, 5 Б-Пл-1, 2, 3, 4, 5
0,31+0,03 0,020+0,005 0,73+0,04*** 0,060+0,005 ***
Примечание: Об/с, мг/мл - Общий белок/семя, мг/мл; КФА - коэффициент флуктуирующей асимметрии; * - различия с контролем достоверны (Р<0,05); ** - различия с контролем достоверны (Р<0,01); *** - различия с контролем достоверны (Р<0,001)
На примере биоиндикационных параметров (интенсивность перекисного окисления липидов, содержание пигментов, флуктуирующая асимметрия листа, показатели фенологических ритмов и семенного размножения) у B. pendula, Tilia cordata в Нижнем Новгороде выявлены немонотонные: гормезис, парадоксальный эффект и монотонный ответ в зависимости от интенсивности автотранспортного загрязнения [Ерофеева, 2016]. Горметический эффект обнаружен и в наших исследованиях по цитогенетическим и физиолого-биохимическим признакам (содержание общего растворимого белка в семенах и проростках, всхожесть
семян) у B. pendula. У семенного потомства березы повислой, собранного в слабозагрязненном районе, возможно, происходит стимуляция синтеза белка, имеющая адаптивное значение на клеточном уровне к воздействию техногенной нагрузки, обусловленной повышенным содержанием вредных соединений в атмосфере и почве.
Схема ускорения селекционного процесса древесных растений на основе комплексного анализа представлена на рисунке 6.
Разделение материнских растений на группы стабильности 1-й г.
Рисунок 6 - Схема ускорения селекционного процесса древесных растений и отбора устойчивого к антропогенному загрязнению быстрорастущего посадочного материала на основе комплексного анализа
экологической обстановки в месте произрастания 1-й г.
Разделение семенного потомства
на группы стабильности 1 -й г.
Отобранные материнские деревья и их потомство возможно использовать для сбора растительного материала и для урбанизированных территорий как устойчивых форм.
Таким образом, по уровню флуктуирующей асимметрии возможна не только экспресс-оценка экологической обстановки в месте произрастания деревьев и качества насаждений, а также групповой и индивидуальный отбор материнских экземпляров. Последующую проверку по потомству можно осуществлять по цитогенетическим и физиолого-биохимическим признакам.
Цитогенетические показатели, содержание общего белка позволяют прогнозировать возможность всхожести и прорастания семян не только березы повислой, но и других древесных растений. Сочетание исследования морфометрических и биохимических признаков мы предлагаем использовать в селекции для группового и индивидуального отбора древесных видов. Основными этапами экспресс-оценки и отбора древесных растений в условиях урбанизированной среды Центрального Черноземья являются: 1. Выявление изменчивости биохимических, морфометрических параметров материнских растений, а также физиолого-биохимических, цитогенетических признаков семенного потомства. 2. Оценка экологической обстановки в месте произрастания на основании исследованных характеристик. 3. Групповой и индивидуальный отбор материнских растений и их семенного потомства на экологически чистых, слабозагрязненных или умеренно загрязненных территориях. 4. Отбор материнских растений и цитогенетически стабильного (устойчивого к антропогенному загрязнению) семенного потомства.
4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ, ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ В СЕЛЕКЦИИ ВИДОВ РОДА RHODODENDRON
4.1. Выявление генетической дивергенции видов рода Rhododendron на основе анализа ITS1-ITS2 последовательностей
Для выявления скрытой генетической изменчивости необходимо иметь информацию о генетическом сходстве (или различии) видов, что осуществимо при использовании молекулярно-генетического анализа, например, ITS1-ITS2 последовательностей [Баранова и др., 2014]. Последовательность нуклеотидов внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS, Internal Transcribed Spacer, между 18S и 25S рибосомальными генами, включающий 5.8S ген) уникальна для каждого вида, поэтому нетранслируемый спейсер используется для идентификации видов [White et al., 1990; Баранова и др., 2014]. Проведенные ранее исследования [Gao et al., 2002; Zhang et al., 2007; Mizuta et al., 2008; Lanying et al., 2008; Zha et al., 2008; Li et al., 2011; Huang et al., 2011] показали возможность использования результатов RAPD-анализа и анализа ITS последовательности для выявления скрытой генетической изменчивости, сходства (или различия) видов.
Для разработки научных основ культивирования и отбора селекционного материала высокодекоративных видов рода Rhododendron (Приложение В, Рисунки 5-8) возрастает необходимость исследования их цитогенетических признаков, сравнения реакций интродуцентов с таковыми у аборигенов. Анализ ITS1-ITS2 последовательностей позволяет выявить генетическую дивергенцию видов рода Rhododendron L. (Приложение Б, Таблица 1). Кроме того, метод дает возможность идентифицировать близкие виды, научно обосновать подбор видов для успешной межвидовой гибридизации и прогнозировать ее результат.
По результатам кластерного анализа выделены наиболее близкие или идентичные по последовательности нуклеотидов ITS1-ITS2 виды (Рисунок 7). Отличия в один, два или несколько нуклеотидов малы и наиболее характерны для разных экземпляров большинства видов [Баранова и др., 2014]. Анализируемые виды представлены в таблице 2 (Приложение Б), по группам (представители каждой группы характеризуются одинаковой Г^1-ГГ82).
Рисунок 7 - Генетическая дивергенция видов рода Rhododendron L.
Тест Таджимы [Tajima, 1989] на нейтральность также выявил невысокую дивергенцию между всеми исследуемыми видами рода Rhododendron
(Приложение Б, Таблица 3). В таблице 4 (Приложение Б) приводится оценка нуклеотидных замен методом максимального правдоподобия. Среди основных замен имеют место, главным образом, транзиции для пиримидинов (C<->T), реже для пуринов (A<->G), трансверсии редки и имеют наименьшую частоту [Баранова и др., 2014].
Проведенный анализ последовательностей спейсеров ITS1-ITS2 выявил их идентичность у Rh. mucronulatum, Rh. dauricum. Наиболее близок к ним Rh. ledebourii (отличие составляет 1 нуклеотид) по сравнению с Rh. sichotense (отличие в 2 нуклеотида), кластерное расстояние до которого также незначительно (Рисунок 7). Различие видов Rh. ledebourii и Rh. sichotense для спейсеров ITS1-ITS2 составляет 3 нуклеотида [Баранова и др., 2014] (Приложение В, Рисунок 15).
Несмотря на то, что в результате исследования морфологических и анатомических признаков видов рода Rhododendron L. некоторые авторы пришли к выводу об их видовой самостоятельности [Вологдина, 2007; Белоусов и др., 2000], часть видов рода Rhododendron L. с идентичной последовательностью ITS1-ITS2 (Приложение Б, Таблица 2) достаточно сходны по морфологии [Баранова и др., 2014], например, рододендрон даурский (Rhododendron dauricum), рододендрон остроконечный (Rh. mucronulatum), рододендрон сихотинский (Rh. sichotense) [Кондратович, 1981; Александрова, 2003; Вологдина, 2007; Баранова и др., 2014]. Эти виды рододендрона высоко полиморфны, возможна их гибридизация, а ксеромезофитной линией развития является рододендрон даурский [Врищ и др., 2010].
Таким образом, на основе анализа ITS1-ITS2 последовательности была выявлена низкая вариабельность между видами рода Rhododendron серии Dauricum, в частности, у Rh. mucronulatum, Rh. dauricum (1-3 нуклеотида). Эти виды различаются друг от друга на несколько нуклеотидов, что дает возможность предполагать их успешную межвидовую гибридизацию, которая происходит в
природных популяциях между видами рода Rhododendron серии Dauricum [Прокопенко, 2011]. Полученные результаты возможно использовать для разработки системы вспомогательных молекулярных маркеров для селекционного процесса сходных по морфологии видов рода Rhododendron. По результатам анализа ITS1-ITS2 последовательностей выделено 16 групп видов со сходной последовательностью ITS1-ITS2. При сравнении морфологических описаний некоторых видов рода Rhododendron L. со сходной последовательностью ITS1-ITS2 отмечаются их небольшие различия [Баранова и др., 2014]. Но для перехода на клеточный и далее на организменный уровень организации, а также выявления скрытой генетической изменчивости необходимо установить связь между молекулярно-генетическими и цитогенетическими показателями.
4.2. Изменчивость фенологических признаков видов рода Rhododendron
С помощью фенонаблюдений оценивают возможности культивирования интродуцентов [Бейдеман, 1954; Базилевская, 1964; Базилевская, Мауринь, 1986; Доронина, 2000; Коропачинский, 2002; Васильева, 2009; Худоногова, Третьякова, 2011; Баранова, 2013 б]. Подробное изучение древесных растений, особенно их фенологии, проводится в Санкт-Петербурге, где имеется многолетняя база фенонаблюдений с начала прошлого века [Булыгин, Ярмишко, 2003; Фирсов и др., 2010; Фадеева, Фирсов, 2010]. На современном этапе в Белгородском университете подробно исследуют плодовые [Тохтарь, 2011] и декоративные растения [Кольцов, 2011]. Сибирские ученые, кроме изучения фенологии растений, их биологии и использования в озеленении [Тафинцев, 1978], связывают климатические условия, физиологические и биохимические параметры [Оскорбина и др., 2010; Сунцова и др., 2010; Запрометов, 1993]. Подробное изучение видов рода Rhododendron ведутся в Москве, Санкт-Петербурге, Йошкар-
Оле, на Украине, в Сибири и на Дальнем Востоке [Александрова, 1975, 1989, 2003; Костина, 2009; Бабро, 2007; Зарубенко, 1991; Доронина, 2000; Белоусов и др., 2000; Врищ и др., 2010; Мирович, 2010; Вологдина, 2007, 2008; Жаворонкова, 2012], в Центральном Черноземье [Моисеева, Николаев, 2011; Баранова и др., 2012 в; Моисеева и др., 2012; Баранова, 2013 б].
В Ботаническом саду им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета большинство представителей рода Rhododendron зацветает в апреле-мае, но отдельные виды - в июне-июле (видоспецифично), при этом разная сумма эффективных температур (Таблица 7) особенно влияет на время начала, а количество осадков - на продолжительность цветения растений в различные годы [Баранова, 2013 б]. По результатам фенологических наблюдений за 5 лет, отмечается сокращение сроков зацветания (Приложение Б, Таблица 5), варьирование даты начала цветения на 1-3 недели [Баранова, 2013 б]. Самое длительное цветение наблюдалось у Rh. schlippenbachii, Rh. dauricum, Rh. mucronulatum, Rh. sichotense, но сроки цветения видов Rhododendron видоспецифичны [Баранова, 2013 б]. Выявлена высокая вариабельность по продолжительности цветения изучаемых видов (Приложение Б, Таблица 6). Поскольку наследственная фотопериодическая реакция цветения в онтогенезе [Аксенова и др., 1976] видоспецифична, ее приспособительное значение проявляется в регуляции сроков цветения и в способности растений противостоять неблагоприятным условиям внешней среды, обеспечивая выживание [Жученко и др., 2012]. Однако короткий период бутонизации у Rh. canadense свидетельствует о его устойчивости. Неоднократно отмечалось обмерзание цветковых почек у Rhododendron dauricum, что совпадает с результатами исследований Р.Я. Кондратовича и других авторов [Кондратович, 1981; Фирсов и др., 2010]. В засушливых условиях второй половины лета 2011 г. у Rh. viscosum, Rh. dauricum, видимо, не сформировались цветочные почки. Цветение этих видов не отмечалось в 2012 г. (Приложение Б, Таблица 6), а у остальных исследуемых видов значительно снизилось его обилие [Баранова, 2013
б]. Поскольку онтогенез в роде Rhododendron обязательно захватывает предшествующий (стадия мейоза при образовании тетрад микроспор - сентябрь) и текущий (стадия поздней вакуолизации - апрель и формирования двуклеточных пыльцевых зерен - середина мая) вегетационные сезоны при развитии цветка и семени [Миргородская, Мирославов, 2012], на процессы влияют погодные условия двух вегетационных сезонов (как и у березы повислой).
Ранние сроки зацветания указывают на холодостойкость Rh. ledebourii, поскольку начало его бутонизации и цветения не требует значительной суммы эффективных температур (достаточно 300-400 0С). По данным Ботанического сада УрО РАН (Средний Урал) у рододендронов подрода Rhodoastrum отмечено регулярное обильное цветение, интенсивность которого снижается лишь после суровых зим, что свойственно Rh. dauricum, Rh. ledebourii, а также лучшим гибридным формам [Бакланова, 2003]. Подмерзающие Rh. mucronulatum и Rh. sichotense обильно цветут только в благоприятные годы [Бакланова, 2003], когда отмечается и плодоношение, которое у данных видов после суровых зим может быть слабым или отсутствовать.
По литературным данным, на северо-востоке Карельского перешейка (Ленинградская область) без укрытия могут зимовать Rh. sichotense, Rh. ledebourii, Rh. dauricum, Rh. ferrugineum, Rh. hirsutum, Rh. canadense, частично Rh. japonicum, Rh. caucasicum [Связева и др., 2011]. Таким образом, они являются зимостойкими видами. Это справедливо для видов в условиях Центрального Черноземья, а также для зимующих без укрытия Rh. japonicum, Rh. caucasicum, Rh. mucronulatum и Rh. luteum. В Ботаническом саду УрО РАН среди рододендронов подрода Rhodoastrum к низким температурам устойчивы только Rh. dauricum, Rh. ledebourii (I—II балла), часть гибридов из семян местной репродукции от свободного и принудительного опыления. У Rh. mucronulatum, Rh. sichotense (I-IV балла) в суровые зимы вымерзают цветковые почки [Бакланова, 2003], что характерно в большей степени для Rh. dauricum в Центральном Черноземье.
Выявленная вариабельность по срокам и продолжительности цветения видов рода Rhododendron в разные годы зависит от погодных условий (температуры и количества осадков). Сроки и продолжительность цветения характеризуются видоспецифичностью. У видов Rhododendron с идентичной ITS1-ITS2 последовательностью (Rh. dauricum, Rh. mucronulatum или Rh. molle, Rh. japonicum) средняя продолжительность цветения практически совпадала. Они проявляют высокую устойчивость к климатическим вариациям.
4.3. Связь цитогенетических признаков с молекулярно-генетическими различиями у видов рода Rhododendron L. при интродукции для оценки их генетического родства, стабильности генома и отбора наиболее устойчивых
генотипов
На колебания цитогенетических показателей оказывают влияние радиационное загрязнение [Butorina, Evstratov, 1996; The effects of., 1997; Артюхов, Калаев, 2005, 2006], химические поллютанты [Буторина и др., 2002; Вострикова, Буторина, 2006; Машкина и др., 2009], тяжелые металлы [Вострикова, 2007; Белоусов, 2011], причем цитогенетические эффекты семенного потомства многих древесных растений сходны, что вызывает вопросы об их видоспецифичности [Баранова и др., 2018]. В связи с этим актуальны вопросы выявления аналогии и различия цитогенетических реакций у видов Rhododendron серии Dauricum, сходных по молекулярно-генетическим признакам. Виды Rhododendron серии Dauricum изучали с точки зрения молекулярной систематики [Тихонова и др., 2012; Mizuta et al., 2008; Куцев, Каракулов, 2010; Huang et al., 2011] и хемосистематики [Белоусов и др., 2000; Карпова, Каракулов, 2011], но в настоящее время в литературе отрывочны сведений об их цитогенетических признаках. Проблема сокращения численности и уменьшения генетического разнообразия этих лесообразующих видов в природных местообитаниях [Врищ и
др., 2010] ведет за собой и другие, в том числе, снижение адаптивного потенциала растений. Решение этой проблемы состоит в выявлении адаптивных механизмов растений к среде обитания на разных уровнях организации (в том числе на молекулярно-клеточном). Для оценки генетического родства, стабильности генома и отбора наиболее устойчивых генотипов видов Rhododendron серии Dauricum следует определить, насколько молекулярно-генетическое сходство обуславливает специфичность реакций в условиях интродукции.
Результаты молекулярно-генетического анализа ITS1-ITS2 последовательностей представлены на дендрограмме (Рисунок 8). Цитогенетические показатели изученных видов рода Rhododendron представлены в таблицах 7-8 (Приложение Б), микрофотографии - на рисунках 6-13 (Приложение А).
Рисунок 8 - Различия по ITS1-ITS2 последовательности видов рода Rhododendron
серии Dauricum (по Барановой с соавт., 2018)
Несмотря на различие цитогенетических показателей у семенного потомства изученных видов кластерный анализ совокупности цитогенетических признаков позволил выделить две группы: 1) Rh. mucronulatum и Rh. dauricum; 2) Rh. ledebourii и Rh. sichotense [Баранова и др., 2018] (Рисунок 9). Наибольшее кластерное расстояние отмечается между совокупностью цитогенетических признаков Rh. mucronulatum и Rh. sichotense, наименьшее - между видами Rh. mucronulatum и Rh. dauricum, что совпадает с результатами молекулярно-генетических исследований, которые отражают сходную группировку этих видов. При интродукции в Центральное Черноземье (в Ботаническом саду им. проф. Б.М.
Козо-Полянского Воронежского государственного университета) материнские растения изучаемых видов находились в одинаковых условиях, поэтому показывают видоспецифичность цитогенетических признаков семенного потомства.
Полученные результаты наших исследований о сходстве цитогенетических параметров видов рода Rhododendron согласуются с данными М.В. Белоусова с соавторами [Белоусов и др., 2000], которые выявили наибольшее вторичное сходство видов по морфологии и объяснили его идентичными экологическими условиями в местах произрастания в естественных ареалах. Заслуживает внимания сходство между молекулярно-генетическим и цитогенетическим группированием видов. Кластерное расстояние, вычисленное на основании исследования цитогенетических признаков, между видами Rh. mucronulatum и Rh. dauricum наименьшее. Эти виды имеют одинаковую ITS1-ITS2 последовательность, Rh. ledebourii отличается от них по 1 нуклеотиду, Rh. sichotense (отличается от них) - по 2 нуклеотидам, что соответствует большему кластерному расстоянию между цитогенетическими показателями. Сходство нуклеотидной последовательности видов рода Rhododendron обуславливает их большую близость по совокупности цитогенетических признаков.
5 г 4; Зг 2 -
1:
(>|_
12 3 4
Рисунок 9 - Дендрограмма кластерных расстояний по цитогенетическим признакам между видами рода Rhododendron L. Обозначения: 1 -Rhododendron dauricum; 2 - Rh. mucronulatum; 3 - Rh. sichotense; 4 - Rh. ledebourii (по Барановой
с соавт., 2018)
ш s
I
ос О I-и о го о.
ш
0
1
о. ш
I-
и го
Таким образом, идентичность нуклеотидной последовательности спейсера ITS1-ITS2 у видов рода Rhododendron серии Dauricum приводит к их большему сходству по совокупности цитогенетических показателей, но полного совпадения цитогенетических характеристик у изученных видов, имеющих идентичную ITS1-ITS2 последовательность, не отмечается [Баранова и др., 2018]. На основании сравнения можно предположить, что у представителей рода Rhododendron серии Dauricum генетическая однородность обуславливает сходство цитогенетических показателей. Наиболее устойчивы в условиях ЦЧР Rh. ledebourii и Rh. sichotense.
4.4. Разработка основ размножения и групповой отбор семенного потомства Rhododendron ledebourii на основании цитогенетического полиморфизма и морфометрических параметров сеянцев
Скорость роста растений обусловлена генетически [Шкутко, 1991], поэтому ранний отбор перспективных растений позволяет сократить время селекционного процесса и выделения быстрорастущего потомства [Патент № 2681105]. В связи с этим актуальна оценка цитогенетического полиморфизма семенного потомства высокодекоративных растений-интродуцентов рода Rhododendron, произрастающих в условиях Центрального Черноземья. Ранее генетический полиморфизм рода Rhododendron изучали методами AFLP, RAPD-анализа и анализа ITS последовательности [Тихонова и др., 2012; Gao et al., 2002; Mizuta et al., 2008; Куцев, Каракулов, 2010; Li et al., 2011; Huang et al., 2011; Баранова и др., 2014; Бурменко и др., 2018].
Цитогенетические признаки исследованы у семенного потомства группового сбора материнских растений на чистой (Ботанический сад ВГУ) и загрязненной территории (Коминтерновский район г. Воронежа) (Приложение Б, Таблица 9).
Все анализируемые проростки были разделены на группы по генетической стабильности. На чистой территории было выделено 6 групп проростков: стабильная, нестабильная и 4 промежуточные (Приложение А, Рисунок 14).
В экологически чистом районе нестабильная группа отличалась от стабильной высоким уровнем патологий митоза и клеток с остаточными ядрышками (Приложение А, Рисунки 5-7), большей площадью поверхности одиночных ядрышек, ядрышек типа «кора-сердцевина» (активные) и «кора-сердцевина вакуолизированные» (умеренно активные), т.е. сильной ядрышковой активностью, но низким митотическим индексом, наибольшим числом клеток на стадии профазы (Приложение Б, Таблица 10); в спектре патологий митоза преобладали отставания хромосом в анафазе и метакинезе (92,8 %), встречалась агглютинация хроматина (5,5 %), мосты единичны [Бурменко и др., 2018]. Спектр патологий митоза в клетках стабильной группы был представлен преимущественно мостами (71,3 %), что говорит о более активной работе системы репарации [Акопян, 1967; Симаков, 1983; Ка1аеу е! а1., 2010]), отмечены отставания хромосом в анафазе и метакинезе (28,7 %) [Бурменко и др., 2018].
Доля особей нестабильной группы в экологически чистом районе составила 20 % (аналогично таковой в экологически загрязненном районе), к стабильной относилось 17,5 % проанализированных проростков, что на 10 % меньше, чем в экологически загрязненном районе (27,5 %).
В экологически чистом районе преобладали особи промежуточных групп (62,5 % от всех проанализированных проростков), которых насчитывалось четыре: две из них по цитогенетическим признакам (уровню патологий митоза, митотическому индексу, ядрышковым характеристикам) приближались к нестабильной, две - к стабильной группе (Приложение Б, Таблица 10). В клетках апикальной меристемы корня проростков Rh. ledebourii установлено увеличение площади поверхности одиночных ядрышек в нестабильной группе, что указывает на усиление ядрышковой активности [Архипчук, 1995; Бурменко и др., 2018]. Повышение уровня патологий митоза и площадей поверхности одиночных
ядрышек в нестабильной группе отмечено в ранее выполненных исследованиях цитогенетического полиморфизма семенного потомства березы повислой (Betula pendula) [Kalaev et al., 2010], дуба черешчатого (Quercus robur) [Калаев, Попова, 2014 б] и сосны обыкновенной (Pinus sylvestris) [Машкина и др., 2009; Бурменко и
др., 2018].
О большей адаптированности к условиям среды лесных древесных растений, семенное потомство которых в цитогенетических исследованиях показало более низкий уровень хромосомных аберраций, указывала А.К. Буторина с соавторами [Буторина и др., 2008], а также свидетельствовали проведенные позднее эксперименты по изучению ростовых показателей проростков и сеянцев дуба черешчатого [Калаев, Попова, 2014 б в], которые проявляли лучшую ростовую активность [Калаев, Попова, 2014 в; Бурменко и др., 2018].
Анализируя результаты исследования цитогенетических признаков семенного потомства Rh. ledebourii из загрязненного района, нами установлено, что коэффициент вариации практически всех параметров снижался по сравнению с таковым в экологически чистом (Приложение 2, таблица 9). Это свидетельствует о низкой степени изменчивости, меньшем варьировании параметров семенного потомства Rh. ledebourii в условиях антропогенного загрязнения. Видимо, происходит стабилизация признаков и развитие устойчивости у потомства Rh. ledebourii. По результатам других исследований, было обнаружено сохранение гомозигот, наиболее приспособленных к неблагоприятным условиям, у пуляций Quercus robur [Чохели и др., 2018].
В целом, у проростков Rh. ledebourii из загрязненного района отмечено уменьшение митотического индекса (подсчитанного с учетом и без учета профазы) и числа клеток в анафазе-телофазе, повышение уровня патологий митоза, уровня клеток с остаточными ядрышками, увеличение числа клеток в профазе, площади поверхности одиночных ядрышек, площади поверхности ядрышек типа «кора-сердцевина» и «кора-сердцевина вакуолизированные» по
сравнению с таковыми в чистом районе (Приложение Б, Таблица 9). Перечисленные изменения цитогенетических показателей говорят о снижении интенсивности ростовых процессов и возможной компенсации недостаточной биосинтетической активности путем увеличения площади поверхности одиночных ядрышек. Увеличение числа клеток в профазе свидетельствует о задержке клеток на этой стадии, обусловленной повреждением генетического материала либо нарушением синтеза белков веретена деления [Алов, 1972; Казанцева, 1981], приводящей к ингибированию ростовых процессов у семенного потомства данной группы, что отмечалось нами ранее у других древесных объектов в условиях антропогенного загрязнения: березы повислой, дуба черешчатого [Буторина и др., 2000; Бурменко и др., 2018].
В загрязненном районе процентное соотношение несколько изменилось, хотя по-прежнему большая часть особей принадлежала промежуточным группам (52,5 %), количество которых сократилось до двух (Приложение А, Рисунок 15). При этом изменился их качественный состав: по сниженному митотическому индексу семенное потомство промежуточных групп приближалось к нестабильной группе, а по невысокому уровню патологий митоза, но повышенной ядрышковой активности (выраженной в увеличении площади поверхности одиночных ядрышек, ядрышек активного типа «кора-сердцевина» и умеренно активного «кора-сердцевина вакуолизированные») - к стабильной. Нестабильная группа в загрязненном районе, как и в чистом, включала 20 % от общего числа проанализированных особей, характеризуясь повышенным уровнем патологий митоза и сниженным митотическим индексом, кроме того, низкой площадью поверхности одиночных ядрышек, ядрышек типа «кора-сердцевина» и «кора-сердцевина вакуолизированные» (Таблица 32). Это свидетельствует об активных ростовых и синтетических процессах в меристематических клетках семенного потомства Rh. ledebourii из загрязненного района и цитогенетической стабильности индивидов, их резистентности в условиях антропогенной нагрузки.
Таблица 32 - Цитогенетические признаки разных по стабильности групп
семенного потомства у отобранных форм Rh. ledebourii (Рл-К-1, 2, 3, 4)
Показатели / Группы 1 2 3 4
МИ, подсчитанный с учетом стадии профазы, % 6,9+0,3 6,8+0,1 7,1+0,3 7,8+0,2*й
МИ, подсчитанный без учета стадии профазы, % 3,1+0,1 3,2+0,1 3,1+0,3 3,7+0,1 **й
% клеток в профазе 54,2+1,8 53,2+1,0 59,0+1,9* 52,5+0,8й
% клеток в метафазе 15,6+2,4 11,0+0,5 10,9+0,8 11,4+1,4
% клеток в анафазе-телофазе 29,5+1,1 34,0+1,1* 30,4+1,4 35,7+1,5*
Уровень патологий митоза, % 6,2+0,5а 4,8+0,4* 4,4+0,2** 4,6+0,1 *й
Уровень клеток с остаточными ядрышками, % 12,2+1,1 10,4+0,4 12,0+0,8 10,9+1,5°
Площадь поверхности ядрышек «кора-сердцевина», мкм2 77,2+2,5 81,5+1,3 78,5+2,5 85,1+1,2*
Площадь поверхности ядрышек «кора-сердцевина вакуолиз.», мкм2 85,0+1,5а 92,7+1,4** 97,6+3,5* 97,4+2,1*
Площадь поверхности компактных ядрышек, мкм2 46,0+1,6 41,5+3,8 61,2+3,3* 55,1+2,8* *ь
Площадь поверхности вакуолизированных ядрышек, мкм2 41,9+0,7а 45,3+2,2 50,6+3,0 48,2+3,6* **
Площадь поверхности одиночных ядрышек, мкм2 74,6+1,2а 80,0+1,0** 81,0+2,4* 81,9+1,6*
% ядрышек «кора-сердцевина» 58,3+0,8б 51,5+0,7** * 44,8+1,7* ** 55,0+0,8*ь
% ядрышек «кора-сердцевина вакуолизованные» 27,4+1,1а 34,3+0,6** 35,1+0,4* * 26,4+1,0й
% компактных ядрышек 9,1+1,1 8,8+0,5 13,4+1,2* 12,6+1,0*ь
% вакуолизированных ядрышек 5,3+0,3 5,4+0,3 6,7+0,5 6,1+0,8
Примечание: 1 - нестабильная группа, 2 - промежуточная группа, 3 - промежуточная группа, 4 - стабильная группа. Различия с группой №1 (нестабильной) достоверны: * Р<0,05; ** Р<0,01; *** Р<0,001. Различия с нестабильной группой из экологически чистого района достоверны: а Р<0,05; б Р<0,01; различия со стабильной группой из экологически чистого района достоверны: ь Р<0,05; с Р<0,01; й Р<0,01
В экологически загрязненном районе в стабильной группе отмечается увеличение площади поверхности одиночных ядрышек и высокая частота встречаемости клеток с остаточными ядрышками в митозе (6,3-20,2 %), что свидетельствует о повышении ядрышковой активности (Таблица 32), об увеличении транскрипции, усилении синтетических процессов, в частности, биосинтеза белка (по типу стрессовых белков [Чиркова, 2002]), об адаптации проростков к стрессовым условиям (Таблица 33). Такая цитогенетическая реакция на антропогенное загрязнение неоднократно отмечалась другими авторами на примере животных и растений [Архипчук, 1995; Соболь, 2001]. На увеличение площади поверхности одиночных ядрышек в слабомутабильной группе в условиях антропогенной нагрузки указывалось в ранее выполненных исследованиях цитогенетического полиморфизма у древесных растений, в частности, березы повислой [Артюхов и др., 2009], дуба черешчатого [Калаев, Попова, 2014 б].
Нами установлено снижение площади поверхности высокоактивных ядрышек типа «кора-сердцевина» и умеренноактивных типа «кора-сердцевина вакуолизированные» в нестабильной группе Rh. ledebourii (Таблица 32), как у дуба черешчатого при невысокой степени загрязнения [Калаев, Попова, 2014 б]. Однако у березы повислой в экологически неблагополучном районе отмечались две противоположные тенденции [Артюхов и др., 2009]. В меристематических клетках семенного потомства Rh. ledebourii нами выявлено возрастание доли
высокоактивных ядрышек типа «кора-сердцевина» в нестабильной группе и доли умеренноактивных ядрышек в стабильной группе (Таблица 32), как было отмечено у березы повислой [Артюхов и др., 2009], у дуба черешчатого [Калаев, Попова, 2014 б] при загрязнении.
Таблица 33 - Характеристика цитогенетических признаков «нестабильной» и
«стабильной» групп проростков Rhododendron ledebourii
Показатели «нестабильная» группа «стабильная»
Уровень патологических митозов В экологически чистом районе: сравнительно низкие и средние значения (1,9-6,3 %) В экологически загрязненном районе: средние значения (4,5-8,3 %) В экологически чистом районе: низкие значения (0,5-2,1 %) В экологически загрязненном районе: средние значения (4,3-5,1 %)
Спектр патологических митозов Расширение спектра патологий с преобладанием нарушений, связанных с повреждением хромосом (в экологически чистом районе-85,8 %; в загрязненном районе-81,5 %), что свидетельствует о низкой интенсивности репаративных процессов Преобладание мостов (в экологически чистом районе-71,3 %; в загрязненном районе-68,7 %), что свидетельствует об активной работе систем репарации
Митотическая активность В экологически чистом районе: митотический индекс, подсчитанный с учетом профазы 6-7,8 % митотический индекс, подсчитанный без учета профазы 2,1-3,9 % В экологически загрязненном районе: 6-7,9 % и 2,7-3,4 % соответственно В экологически чистом районе: митотический индекс, подсчитанный с учетом профазы 8,4-9,6 % митотический индекс, подсчитанный без учета профазы 5,2-5,9 % В экологически загрязненном районе: 6,5-8,8 % и 2,8-4,2 % соответственно
Ядрышковые характеристики В экологически чистом районе: высокая частота встречаемости клеток с остаточными ядрышками в митозе (8,3-20,2 %). Увеличение площадей поверхности всех типов ядрышек В экологически загрязненном районе: высокая частота встречаемости клеток с остаточными ядрышками в митозе (8,9-16,7 %). Уменьшение площадей поверхности всех типов ядрышек, возрастание доли высокоактивных ядрышек В экологически чистом районе: сравнительно низкая частота встречаемости клеток с остаточными ядрышками в митозе (5,1-7,0 %). В экологически загрязненном районе: высокая частота встречаемости клеток с остаточными ядрышками в митозе (7,1-20,2 %). Увеличение площадей поверхности всех типов ядрышек
Таким образом, под воздействием антропогенного загрязнения происходит сокращение числа промежуточных групп и увеличение доли резистентных проростков в семенном потомстве Rh. ledebourii. Малые значения хромосомных аберраций и преобладание мостов в спектре патологий митоза, свидетельствующее об активной работе систем репарации, указывают на низкий уровень наследственной изменчивости. Можно предположить, что процесс адаптации на клеточном уровне к стрессовым условиям приводит к стабилизации цитогенетических параметров. Для более точного определения направления
развития проростков, необходимо оценить адаптивный потенциал сеянцев (на организменном уровне). Это удобно произвести с помощью оценки их морфометрических признаков.
По результатам анализа морфометрических параметров Rhododendron ledebourii (длина корня, высота растения, число листьев) можно сравнить динамику роста и в опытном (семена собраны в экологически загрязненном, Коминтерновском районе г. Воронежа) и в контрольном варианте (семена собраны на территории Воронежского БС). Сеянцы, выращенные из семян, собранных в экологически загрязненном районе, имели большую длину корня (различия достоверны, P<0,01) и число листьев (различия достоверны, P<0,05), чем в контроле на ранних стадиях развития (через 2 месяца после посева). Высота побега не различалась с контрольной (Таблица 34, Рисунок 10).
а) быстрорастущая медленнорастущая б) загрязненный чистый район
Рисунок 10 - Сеянцы Rh. ledebourii, выращенные из семян, собранных в экологически чистом районе по группам: быстрорастущая, медленнорастущая (а);
в чистом и загрязненном районе (б) В опыте через полгода после посева корни были длиннее, чем в контроле (различия достоверны, Р<0,01). Через полтора года после посева опытные сеянцы отличались от контрольных меньшей высотой и числом листьев (различия достоверны, Р<0,01) (Таблица 34).
Известно, что в условиях техногенной нагрузки происходит усиленное развитие корневой системы растений [Зайцев и др., 2001; Шунелько, Федорова, 2002; Ярмишко, 1997; Васильев, 2009]. Другими авторами, наоборот, этот процесс обозначается как замедление роста корневой системы растений, проявляющееся в
сокращении длины главного и зоны образования боковых корней, что отмечалось, например, у сеянцев сосны обыкновенной при воздействии повышенных концентраций ионов свинца [Иванов и др., 2013]. Известна высокая экологическая пластичность сосны обыкновенной [Малинина и др., 2011]. Например, происходят изменения подземной части растения: прекращение развития стержневой корневой системы (замена центрального корня - прекращение роста вертикального и развитие боковых) в 20-30-летнем возрасте [Малинина и др., 2011]. Как видно из литературных источников и результатов наших исследований, под воздействием антропогенного стресса механизм защиты растения от повреждения на организменном уровне - сильное ветвление корней. Таблица 34 - Морфометрические признаки сеянцев Rhododendron ledebourii из семян, собранных в экологически чистом (Рл-ВБс-1, 2, 3, 4, 5) и загрязненном (Рл-К-1, 2, 3, 4) районе
Признаки Значения показателей в опыте Значения показателей в контроле
2 мес. 6 мес. 18 мес. 2 мес. 6 мес. 18 мес.
Длина корня, 1,6+0,02* 3,6+0,03* 6,4+0,04 1,4+0,02 3,4+0,03 6,4+0,04
см * *
Высота 1,1+0,02 2,7+0,05* 16,5+0,09* 1,1+0,02 3,1+0,03 17,1+0,16
растения, см * *
Число листьев, 3,4+0,07* 7,6+0,08* 16,6+0,08* 3,2+0,06 8,4+0,08 17,4+0,14
шт. * *
Примечание: опыт - семена собраны в экологически загрязненном районе; контроль - семена собраны в экологически чистом районе. Различия показателей между опытом и контролем достоверны: * Р<0,05; ** Р<0,01.
Морфометрический признак сеянцев «длина корня» (1 замер, через 2 месяца после посева) был связан высокой положительной корреляцией с цитогенетическим «уровнем клеток с остаточными ядрышками» у проростков из экологически чистого (г8=0,9 (Р<0,05)) и загрязненного района (г8=0,95 (Р<0,05)), а также с «площадью поверхности одиночных ядрышек» на чистой (г8=0,88 (Р<0,05)) и загрязненной (г8=0,9 (Р<0,05)) территории. Увеличение ядрышковой активности, которое как раз выражается в увеличении перечисленных параметров,
показывает усиление синтетических процессов, характерных при адаптации растений к стрессовым факторам, в частности, к техногенной нагрузке (у проростков семян, собранных в экологически загрязненном районе). На примере семенного потомства из экологически загрязненного района проиллюстрированы корреляционные связи между параметрами клеточного (субклеточного) и организменного уровней организации, вскрывающие механизмы приспособления растений к стрессу и общие закономерности развития. Таким образом, слабое или средней силы стрессовое воздействие приводит к усилению синтетических процессов на клеточном (субклеточном) и увеличению ростовой активности на организменном уровне. Если анализировать процесс развития сеянцев на ранних этапах, происходит активация морфометрических признаков (длина корня, число листьев) (Таблицы 35-36).
Таблица 35 - Морфометрические признаки сеянцев отобранных форм Rhododendron ledebourii (Рл-ВБс-1, 2, 3, 4, 5) по группам
Признаки Значения в быстрорастущей группе Значения в медленнорастущей
группе
2 мес. 6 мес. 18 мес. 2 мес. 6 мес. 18 мес.
Длина корня, 1,5+0,04 3,4+0,04 6,6+0,02 1,4+0,04* 3,4+0,03 6,2+0,04*
см **
Высота 1,3+0,03 3,3+0,02 18,1+0,13 1,2+0,01* 3,0+0,02* 16,4+0,1*
растения, см * **
Число листьев, 4,1+0,01 9,0+0,04 18,3+0,11 3,0+0,04* 8,1+0,06* 16,7+0,1*
шт. * * **
Различия между группами достоверны: * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001. Таблица 36 - Морфометрические признаки сеянцев отобранных форм Rhododendron ledebourii из семян (Рл-К-1, 2, 3, 4) по группам
Признаки Значения в быстрорастущей группе Значения в медленнорастущей
группе
2 мес. 6 мес. 18 мес. 2 мес. 6 мес. 18 мес.
Длина корня, 1,8+0,02 3,7+0,01 6,5+0,03 1,5+0,01* 3,4+0,07* 6,1+0,04*
см * * *
Высота 1,3+0,02 2,9+0,02 16,9+0,04 1,1+0,02* 2,3+0,03* 15,8+0,1*
растения, см * * *
Число листьев, 4,2+0,04 8,1+0,02 17,0+0,04 3,1+0,03* 7,0+0,03* 16,1+0,1*
шт. * * *
Различия показателей между группами достоверны: * P<0,05; ** P<0,01.
На более поздних этапах развития сеянцы из экологически чистого района незначительно отличаются от таковых из загрязненного по высоте растения и числу листьев (Таблицы 35-36). Установлены корреляционные связи между морфометрическими признаками сеянцев (через 6-18 месяцев после посева) и цитогенетическими параметрами проростков не зависимо от степени загрязнения территории, выявляющие общие закономерности развития растений.
Высокой положительной корреляцией связаны признаки «митотический индекс» (подсчитанный с учетом и без учета стадии профазы) и «высота растения», где г8=0,9-0,98 (Р<0,05); «митотический индекс» и «число листьев», где г8=0,9-0,95 (Р<0,05). Отрицательной корреляцией характеризовались параметры: «уровень патологий митоза» и «высота растения», где г8=-0,9...-0,95 (Р<0,05); «уровень патологий митоза» и «число листьев», где г8=-0,88...-0,92 (Р<0,05). Это означает, что при увеличении уровня ПМ, ухудшаются ростовые процессы и наоборот. Таким образом, усиление ростовых процессов на клеточном (субклеточном) уровне, выраженное в увеличении митотической и ядрышковой активности (при низком уровне нарушений деления) приводит к повышению ростовой деятельности на организменном уровне организации.
С помощью кластерного анализа (по совокупности морфометрических показателей) сеянцы были разделены на две группы: быстрорастущие и медленнорастущие. Дендрограммы кластерных расстояний по морфометрическим признакам сеянцев представлены на рисунках 16-18, 35-37 (Приложение А). В контрольной выборке группа быстрорастущих сеянцев через 2 месяца после прорастания семян составила 22,5 %, медленнорастущих - 77,5 % от общего числа сеянцев. В опытной выборке так же, как и в контрольной, преобладали медленнорастущие сеянцы, число которых составляло - 62,5 %, быстрорастущих насчитывалось 37,5 % (различия достоверны, Р<0,05). Через полгода после посева в контрольной выборке было 42,5 % быстрорастущих и 57,5 % медленнорастущих; через полтора года после посева соотношение сеянцев в данной выборке практически не изменилось, т.е. отмечалось незначительное
преобладание медленнорастущих. В опытной выборке по мере развития сеянцев был замечен все больший перевес в сторону быстрорастущих: через полгода после посева - 55 %, через полтора года после посева - 60%, число медленнорастущих сеянцев составляло 45 % и 40 % соответственно. Значения морфометрических признаков сеянцев (длина корня, высота растения, число листьев) в группе быстрорастущих были выше, чем в группе медленнорастущих во всех вариантах (различия достоверны, P<0,01) из экологически загрязненного района (Таблица 36, Рисунок 9). Группы сеянцев из экологически чистого района не различались только в одном случае: по длине корня через полгода после посева. Значения остальных показателей в быстрорастущей группе были выше, чем в медленнорастущей (различия достоверны, P<0,05; P<0,01; P<0,001) (Таблица 36). Однако морфометрические признаки сеянцев быстрорастущей группы из загрязненного района были выше, чем таковые у медленнорастущей из экологически чистого (P<0,05), что может являться основанием к заключению об их адаптивной способности к антропогенному загрязнению.
Увеличение количества резистентных особей и числа индивидов по своим цитогенетическим характеристикам приближающимся к таковым (и меньшая доля нестабильных проростков в анализируемой выборке) может указывать на прохождение процесса адаптации к условиям антропогенного загрязнения у исследуемого интродуцента (Rhododendron ledebourii) и стабилизацию показателей на клеточном уровне. На организменном уровне увеличивается число быстрорастущих особей в выборке из экологически загрязненного района по мере развития сеянцев. Наибольшего преобладания достигает процент быстрорастущих особей в данной выборке через полтора года после посева. Отмечается повышение ростовых показателей у сеянцев, выращенных из семян, собранных в экологически загрязненном районе по сравнению с таковыми из чистого района, что может свидетельствовать об активном процессе адаптации к внешним факторам, в частности, к повышенным концентрациям тяжелых металлов (особенно цинка) в почве [Доклад «О состоянии., 2016] и стимуляции
морфометрических параметров. Цинк входит в состав ряда ферментов (в том числе ДНК-, РНК-полимераз, супероксиддисмутазы,
триозофосфатдегидрогеназы, пероксидазы, каталазы, оксидазы,
полифенолоксидазы) и принимает участие в биохимических процессах, в частности, в образовании аминокислоты (триптофана), которая является исходным материаллом для формирования ауксинов
[https://www.chem21.info/info/100006/ Справочник химика 21; Физиология растений, 2005]. Влияние антропогенных факторов вызывает стимуляцию цитогенетических и морфометрических признаков в зоне невысоких доз загрязнителей на ранних этапах развития сеянцев.
Таким образом, на основании анализа перечисленных признаков выделены источники для селекции на устойчивость к антропогенному загрязнению Rhododendron ledebourii - маточники, произрастающие в ботаническом саду ВГУ (Рл-ВБс-1, Рл-ВБс-2, Рл-ВБс-3, Рл-ВБс-4), а также в Коминтерновском районе г. Воронежа (Рл-К-1, Рл-К-2, Рл-К-3, Рл-К-4), продуцирующие цитогенетически стабильное семенное потомство и быстрорастущие сеянцы, устойчивые к антропогенному загрязнению, пригодные к выращиванию на урбанизированных территориях.
4.5. Отбор форм Rhododendron по антиоксидантной активности в листьях для урбанизированных территорий
Среди биохимических признаков находят маркерные, которые можно использовать в селекции [Ковалевич, Каган, 2010]. Для разработки научных основ и методик отбора древесных растений для озеленения урбанизированных территорий также возможно применение некоторых биохимических параметров, а выявление корреляций последних с цитогенетическими позволит производить взаимозаменяемость показателей. Выявлены изменения содержания некоторых
фенольных соединений рода Rhododendron L. в динамике в зависимости от этапа развития органа [Васильева, 2009; Горюнова, 2009; Дзюба, 2001; Мирович, 2010], вида растения [Костина, 2009]. На основании изучения динамики накопления биологически активных веществ у рододендрона Адамса, мелколистного и даурского в качестве сырья предлагается использовать побеги текущего года, а у рододендрона золотистого - листья 2-го и 3-го года жизни [Мирович, 2010]. В связи с выше изложенным актуальны исследования антиоксидантной активности (АОА) видов рода Rhododendron как источников биологически активных соединений, а также наличие ее взаимосвязи с цитогенетическими признаками в целях отбора устойчивого к антропогенному загрязнению селекционного материала.
АОА в листьях кустарников рода Rhododendron варьировала в зависимости от вида, возраста растений, индивида (таблица 37). Показатель изменялся в пределах 0,3-0,5 у.е. у разных видов и практически не различался у одновозрастных представителей Rh. luteum и Rh. calendulaceum. Однако у 5-летних экземпляров Rh. luteum АОА была практически на 1 у.е. выше, чем у 30-летних особей того же вида, что свидетельствует о снижении АОА по мере приспособления растений к условиям окружающей среды [Чупахина и др., 2011] или в связи с процессами старения [Дзюба, 2001; Баранова и др., 2012 а].
Изучаемый признак полувечнозеленого Rh. ledebourii был выше, чем у листопадного Rh. luteum такого же возраста (30 лет), что указывает на более сильную способность вида синтезировать (в стрессовых условиях) вторичные соединения, обуславливающие АОА. Тенденция снижения способности к синтезу фенольных соединений отмечена В.М. Костиной (2009) при исследовании их содержания в ряду: вечнозеленый Rh. smirnowii, полувечнозеленый Rh. ledebourii, листопадный Rh. japonicum (сходный по морфологии с Rh. luteum). [Костина, 2009].
Таблица 37 - Антиоксидантная активность (АОА) в условных (у.е.) единицах у представителей рода Rhododendron L.
Название вида АОА, у.е.
Rh. dauricum Рд-ВБс-1, 2, 3, 4 5,63+0,02
Rh. luteum (5 лет) 6,45+0,03
Rh. luteum (30 лет) 5,55+0,02
Rh. ledebourii Рл-ВБс-1 6,02+0,03
Rh. ledebourii Рл-ВБс-2 5,82+0,03
Rh. ledebourii Рл-ВБс-3 5,94+0,02
Rh. calendulaceum 6,36+0,03
Rh.mucronulatum Ро-ВБс-1, 2, 3, 4 5,68+0,02
Rh. sichotense Рс-ВБс-1, 2, 3, 4 5,75+0,03
Примечание: 1 у.е. соответствует активности, эквивалетной антиоксидантной активности стандарта - 1 мг аскорбиновой кислоты.
У разных экземпляров одного вида (Rh. ledebourii) АОА незначительно различалась. Rh. dauricum характеризовался меньшей величиной параметра, хотя сходные с ними по морфологии виды: Rh.mucronulatum и Rh. sichotense проявили более высокую АОА по сравнению с последним (таблица 37). Пятилетний Rh. calendulaceum показал активность, аналогичную одновозрастному и близкому по морфологии Rh. luteum, у которого отмечен самый высокий параметр. На наш взгляд, морфологическое и биохимическое сходство может быть обусловлено генетически [Баранова и др., 2014].
Таким образом, из одновозрастных рододендронов наибольшую АОА имел Rh. ledebourii, наименьшую - Rh. dauricum, минимальная величина АОА определялась у Rh. luteum в возрасте 30 лет, что свидетельствует о ее снижении, как и метаболической активности, по мере старения растения [Баранова и др., 2012 а]. Установлено, что при старении дерева биоэлектрическая активность
значительно уменьшается с возрастом, отражая снижение метаболических и ростовых процессов [Шеверножук, 2010]. Выявлено, что доминирующими компонентами фенольного комплекса листьев однолетних побегов рододендронов являются флавоноиды: флавонол-гликозиды, а также моно-, ди- и тримеры проантоцианидинов [Костина, 2009; Васильева, 2009]. По нашему мнению, фенольные соединения обусловливают антиоксидантную активность видов Rhododendron.
При сравнении АОА у представителей рода Rhododendron с таковой у других растений-антиоксидантов (род Amaranthus) было выявлено превышение показателя на порядок у видов рода Amaranthus [Баранова и др., 2012а], обладающего сильными антиоксидантными свойствами [Гинс, Кононков, 2002; Зобкова, 2006].
Антиоксидантные характеристики растений предлагают использовать как тестовые для мониторинга. Например, показано снижение антиоксидантного статуса при антропогенном загрязнении [Чупахина и др., 2011]. По литературным данным, выявлена высокая отрицательная корреляция между содержанием Cd в растениях и их антиоксидантным статусом [Чупахина и др., 2011]. Нами установлено повышение АОА (6,32+0,03) в листьях Rh. ledebourii, произрастающего в загрязненном районе по сравнению с контролем (Таблица 38).
Многие авторы полагают, что наличие фенольных соединений в разных частях растений рода Rhododendron обуславливает их биологическую активность [Жаворонкова, 2012; Васильева, 2009; Костина, 2009; Карпова, Каракулов, 2011]. Факт локализации фенольных соединений в вакуолях [Фуксман, 2003] и обнаруженное в наших исследованиях наличие вакуолизированных клеток в корневой меристеме проростков (более высокое их число у семенного потомства из экологически загрязненного района) приводят к заключению о том, что появление вакуолизированнных клеток - неспецифическая цитогенетическая реакция древесных растений, отмечаемая нами у березы повислой, рододедронов,
ели колючей, а также другими авторами у сосны обыкновенной [Белоусов и др., 2011] на антропогенные и природно-климатические факторы.
В наших экспериментах число вакуолизированных клеток в апикальной корневой меристеме коррелировало с уровнем патологий митоза (г8=0,78 (Р<0,05)), следовательно, этот параметр, как и уровень патологий митоза, может быть критерием степени загрязнения территории. АОА коррелировала с числом вакуолизированных клеток в апикальной корневой меристеме (г8=0,75 (Р<0,05)), а также с уровнем патологий митоза (г8=0,83 (Р<0,05)), что позволяет использовать эти показатели в биоиндикации (Таблица 38).
Таблица 38 - Антиоксидантная активность и цитогенетические параметры (х ±S х ) отобранных форм рода Rhododendron L.
Название вида АОА МИ, % МИ без П, % П, % ПМ, % В кл, %
Rh. dauricum Рд-ВБс-1, 2, 3, 4 5.63+0.02 7.6+0,3 3.9+0.2 48.9+2.0 1.6+0.4 2.5+0.3
Rh. ledebourii Рл-К-1, 2, 3, 4 6.32+0.03 * 7.5+0.4* 3.6+0.5 52.2±1.4** 5.5±1.0* 8.1+0.7*
Rh. ledebourii Рл-ВБс-1, 2, 3, 4 5.82+0.03 6.1+0.6 3.8+0.4 37.9+1.9 4.2+1.1 4.6+0.7
Rh.mucronulatum Ро-ВБс-1, 2, 3, 4 5.68+0.02 7.7+0.7 4.9+0.7 37.5+1.9 3.4+0.3 3.2+0.5
Rh. sichotense Рс-ВБс-1, 2, 3, 4 5.75+0.03 5.6+0,7 3.5+0.4 37.5+1.1 3.5+0.5 3.6+0.4
Примечание: АОА - антиоксидантная активность в условных единицах (у.е.); 1 у.е. соответствует активности, эквивалетной антиоксидантной активности стандарта - 1 мг аскорбиновой кислоты; МИ, % - митотический индекс, подсчитанный с учетом стадии профазы; МИ без П - митотический индекс без учета клеток, подсчитанных в стадии профазы, %; ПМ, % - уровень патологий митоза; ОЯ, % - уровень клеток с остаточными ядрышками; П, % - число клеток в стадии профазы; М, % - число клеток в стадии метафазы; А, % - число клеток в стадии анафазы; Т, % - число клеток в стадии телофазы; В кл, % - уровень вакуолизированных клеток; * - различия с контролем достоверны (Р<0,05); ** - различия с контролем достоверны (Р<0,01).
Отмечено, что адаптация растений к действию стрессоров зависит от функционирования антиоксидантных ферментов (каталазы, пероксидазы) и от накопления в клетках низкомолекулярных антиоксидантов (пролина, аскорбиновой кислоты, фенолов, пектинов) [Зобкова, 2006; Фаустова, 2009; Пермякова, 2010; Бухарина и др., 2012]. Н.Г. Чупахиной и П.В. Масленниковым выявлено накопление аскорбиновой кислоты, антоциановых пигментов в травянистых растениях, усиление эффективности антиоксидантной системы клетки и повышение устойчивости растений к действию загрязнителей [Чупахина, Масленников, 2004]. Показано, что повышение содержания фенольных соединений и токоферолов, активности антиоксидантных ферментов может существенно увеличить устойчивость растений к токсическому действию ионов тяжелых металлов [Прокопьев и др., 2012]. Была установлена высокая положительная корреляционная зависимость между содержанием Cd в почве и накоплением антоцианов в вакуолях некоторых древесных растений, используемых в озеленении городской зоны (г=0,86-0,98), что позволяет отнести биосинтез антоцианов к неспецифическим механизмам адаптации растений к высоким концентрациям поллютанта, а их содержание использовать в качестве теста, характеризующего реакцию растений на уровень загрязнения территорий ионами кадмия [Масленников и др., 2013]. Эти современные данные еще раз подтверждают защитную роль вакуоли в ответ на техногенное загрязнение.
Таким образом, выявлена видоспецифичность антиоксидантной активности у представителей рода Rhododendron серии Dauricum. Исследованные виды Rhododendron различаются по содержанию антиоксидантных веществ в листьях. У разных видов и индивидов различного возраста, а также одного и того же вида (Rh. ledebourii), произрастающего на экологически чистой и загрязненной территории, величина антиоксидантной активности варьирует в пределах 1 условной единицы. Выявленные прямые корреляции антиоксидантной активности с числом вакуолизированных клеток в апикальной корневой меристеме, а также с
уровнем патологий митоза на примере Rh. ledebourii позволяют предполагать наличие таковых у других видов Rhododendron и производить взаимозаменяемость признаков при отборе перспективных форм. Значения антиоксидантной активности для одного и того же вида в известных экологических условиях возможно использовать в качестве критерия для отбора устойчивых к загрязнению форм. В чистой зоне уровень антиоксидантной активности у материнских растений, уровень патологий митоза, число вакуолизированных клеток в апикальной корневой меристеме проростков менее, чем у таковых в загрязненной, поэтому предпочтение следует отдавать материнским экземплярам и их семенному потомству с меньшими значениями признаков. На основании проведенных исследований выделены перспективные формы Rh. ledebourii (Рл-ВБс-1, Рл-ВБс-2, Рл-ВБс-3, Рл-ВБс-4, Рл-К-1, Рл-К-2, Рл-К-3, Рл-К-4), Rh. dauricum (Рд-ВБс-1, Рд-ВБс-2, Рд-ВБс-3, Рд-ВБс-4), Rh. mucronulatum (Ро-ВБс-1, Ро-ВБс-2, Ро-ВБс-3, Ро-ВБс-4), Rh. sichotense (Рс-ВБс-1, Рс-ВБс-2, Рс-ВБс-3, Рс-ВБс-4), произрастающие в ботаническом саду ВГУ.
5. СЕЛЕКЦИЯ И ОТБОР PICEA PUNGENS F. GLAUCA ДЛЯ УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ
5.1. Групповой отбор устойчивого к антропогенному загрязнению селекционного материала хвойных
Одним из перспективных растений является ель колючая (Picea pungens Engelm.), обладающая высокой декоративностью, устойчивостью к техногенному загрязнению и отмеченная как перспективный вид для озеленения промышленных центров [Бухарина, Поварницина, 2008, 2013]. Этим обусловлен выбор в качестве объекта исследований Picea pungens. Были исследованы морфометрические, физиологические и биохимические показатели Picea pungens [Бухарина, Поварницина, 2008, 2013; Воскресенская и др., 2015], жизненное состояние Picea pungens на урбанизированной территории Центрально-Черноземного региона [Бухарина и др., 2012]. Цитогенетические реакции хвойных в условиях антропогенного загрязнения, в том числе ели колючей изучали в Сибири [Горячкина, Сизых, 2012]. Однако не проводилось подробного изучения цитогенетических признаков хвойных в условиях Центрального Черноземья с целью массового отбора устойчивого к антропогенному загрязнению селекционного материала. Сведения о цитогенетических признаках такого ценного интродуцента для территории Центрального Черноземья, как Picea pungens отрывочны, фрагментарны, поэтому представляет интерес выявление и сравнение особенностей семенного потомства от материнских деревьев, произрастающих в экологически чистых и загрязненных районах. В настоящее время не было получено прямых доказательств связи цитогенетических показателей с ростовыми характеристиками у растений-интродуцентов. Однако у дуба черешчатого (аборигена для территории Центрального Черноземья) такие связи были найдены [Калаев, Попова, 2014 в]. В связи с выше изложенным нами
предпринята попытка установления такой связи для семенного потомства Picea pungens.
Цитогенетические признаки в клетках корневой меристемы проростков семян потомства материнских растений Picea pungens f. glauca, произрастающих в экологически чистом районе, представлены в таблице 39, изученные в условиях антропогенного загрязнения - в таблице 40. Из таблиц 39-40 следует, что МИ, доля профаз, уровень ПМ в 2015 г. существенно возросли по сравнению с 2005 г. как в опыте (Таблицы 39-40), так и в контроле (различия достоверны, P<0,01, P<0,01) 2005 г.
Таблица 39 - Цитогенетические признаки в клетках корневой меристемы семенного потомства Picea pungens f. glauca (Е-ВБс-1, Е-ВБс-2, Е-ВБс-3, Е-ВБс-4, Е-ВБс-5)
Признаки 2005 г. Cv, % 2015 г. Cv, %
Митотический индекс, подсчитанный с учетом стадии профазы, % 9,3+0,1 3,5 11,8+0,3*** 15,4
Митотический индекс, подсчитанный без учета стадии профазы, % 6,9+0,1 7,4 7,1+0,2 14,8
% клеток в профазе 25,6+0,7 16,9 38,5+1,2*** 20,1
% клеток в метафазе 15,1+0,4 16,6 24,9+0,5*** 13,4
% клеток в анафазе 21,4+0,7 20,4 13,3+0,5*** 26,7
% клеток в телофазе 38,0+0,8 12,8 22,7+1,2*** 34,3
Уровень патологий митоза, % 3,8+0,1 14,9 5,0+0,2** 12,9
Примечание: * - различия с признаками 2005 г. достоверны P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001; Cv - коэффициент вариации
Таблица 40 - Цитогенетические признаки в клетках корневой меристемы семенного потомства Picea pungens f. glauca в условиях антропогенного загрязнения
Признаки 2005 г. Cv, % 2015 г. Cv, %
Митотический индекс, подсчитанный с учетом стадии профазы, % 13,4+0,2в 8,7 14,5±0,2***в 9,4
Митотический индекс, подсчитанный без учета стадии профазы, % 7,2+0,2а 14,4 7,0+0,1 11,3
% клеток в профазе 46,3+1,0в 14,3 51,2±0,9***в 11,9
% клеток в метафазе 27,4+0,7в 15,7 27,2+0,9а 20,9
% клеток в анафазе 14,2+0,6в 27,7 12,0±0,4**а 22,4
% клеток в телофазе 12,4+0,7в 35,5 10,4±0,4*в 27,9
Уровень патологий митоза, % 6,5+0,2в 18,3 9,1±0,6**в 42,6
Примечание: * - различия с признаками 2005 г. достоверны Р<0,05; ** Р<0,01; а - различия с контролем достоверны (Р<0,05); в - Р<0,001
Ранее для сосны обыкновенной было установлено, что за норму можно принимать такой уровень ПМ (одного из наиболее четких показателей нестабильности генома), в котором насчитывается до 5 % повреждений генетического аппарата [Ви1:огта е1 а1., 2000], поскольку в таких пределах репаративные системы клетки справляются с исправлениями повреждений, поддерживается гомеостаз развития, а далее наступают необратимые процессы [Вострикова, 2002]. Возможно для ели колючей, как для хвойного растения, диапазон нормы реакции сходен с таковым для сосны обыкновенной или несколько шире. В неблагоприятных условиях происходит развитие окислительного стресса и увеличивается содержание пролина, что было показано в модельных экспериментах с солями цинка на сосне обыкновенной [Иванов и
др., 2012] и в зоне химического загрязнения [Городничев и др., 2010]. При сравнительных исследованиях выявлено значительное увеличение содержания в хвое свободного пролина у сосны обыкновенной, в то время как ель обыкновенная, ель колючая, туя западная реагировали менее активно [Городничев и др., 2010]. Это указывает на большую устойчивость ели колючей по сравнению с сосной обыкновенной. Другими авторами было выявлено, что максимальная активация пероксидазы и инактивация каталазы в условиях городской среды наблюдалась в хвое Juniperus sabina L., что позволило сделать вывод о более высокой чувствительности этого интродуцированного вида к атмосферным загрязнителям по сравнению с Picea pungens, Thuja occidentals L. [Воскресенская и др., 2015], соответственно, более устойчивыми к антропогенному загрязненнию. В контроле у Picea pungens ПМ не превышали 5 % (Таблица 39), а в опыте параметр был увеличен (Таблица 40) (различия достоверны, P<0,01, P<0,01).
Коэффициент вариации (Cv) цитогенетических признаков семенного потомства показал разную степень изменчивости. Низкая степень варьирования отмечалась у такого признака как митотический индекс, кроме варианта «контроль 2015 г.», где Cv был средним. Высокой и средней степенью варьирования характеризовались доли клеток по стадиям митоза. Высокий Cv был присущ уровню патологий митоза в 2015 г. в условиях техногенной нагрузки, в остальных вариантах Cv был средним. Высокий коэффициент вариации по признаку «уровень патологий митоза» уже отмечался у рододендрона, что указывало на генетическую гетерогенность семенного потомства и наличие материнских экземпляров, продуцирующих потомство с разным уровнем цитогенетической стабильности [Бурменко др., 2018].
Таким образом, контрольный материал цитогенетически устойчив. На основании проведенных исследований можно предположить, что от родительских особей из ботанического сада ВГУ будут получены наиболее резистентные и быстрорастущие сеянцы. Селекционный материал в опыте проявляет разную степень устойчивости к антропогенному загрязнению. Для проведения
индивидуального отбора, выявления неустойчивых и резистентных индивидов, необходимо проанализировать потомство от каждого в отдельности материнского растения по совокупности цитогенетических признаков проростков семян.
Цитогенетические признаки были исследованы у семенного потомства группового сбора материнских растений на чистой территории (ботанический сад ВГУ, контроль). В семенном потомстве Picea pungens f. glauca из экологически чистого района проростки четко разделялись на четыре группы в оба периода исследования: нестабильная, стабильная и две промежуточных. При этом в 2005 г. нестабильная группа была самая малочисленная, составляя 14,3 % проростков, стабильная - 35,7 %, остальные 50 % приходились на промежуточные группы, которые по своим характеристикам приближались к стабильной. В 2015 г. нестабильная группа составляла 38,1 %, а стабильная - 14,3 %. Однако выделенные две промежуточные группы (47,6 %) по своим характеристикам приближались к стабильной, как и в 2005 г., что указывает на сохранение цитогенетической стабильности у семенного потомства и материнских растений в ботаническом саду ВГУ в 2015 г. (Таблицы 41-42).
Дендрограммы кластерных расстояний между проростками семенного потомства деревьев Picea pungens f. glauca из экологически чистого района, построенные на основании их цитогенетических показателей представлены на рисунках 19-20 (Приложение А).
Таблица 41 - Цитогенетические признаки групп семенного потомства Picea pungens f. glauca (Е-ВБс-1, Е-ВБс-2, Е-ВБс-3, Е-ВБс-4, Е-ВБс-5) из экологически чистого района (2005 г.)
Признаки / группы 1 2 3 4
МИ, подсчитанный с учетом стадии профазы, % 9,1+0,1 9,4+0,1* 9,2+0,1 9,4+0,2*
МИ, подсчитанный без учета стадии профазы, % 6,2+0,1 7,4+0,1** 6,8+0,1* 7,2+0,2**
Продолжение таблицы 41
% клеток в профазе 31,2+0,8 22,0+0,3*** 26,0+1,0** 23,7+0,9**
% клеток в метафазе 14,5+0,8 16,5+0,6* 13,8+0,4 15,4+0,7
% клеток в анафазе 17,4+0,9 23,4+0,6** 21,5+0,5* 23,4+0,8**
% клеток в телофазе 37,0+1,5 38,3+0,7 38,8+0,9 37,6+1,2
Уровень патологий митоза, % 4,5+0,1 3,5+0,1* 3,6+0,1** 3,6+0,2*
Примечание: 1 - нестабильная группа, 2 - стабильная группа, 3 - промежуточная группа,
4 - промежуточная группа. Различия с группой №1 (нестабильной) достоверны: * P<0,05; ** P<0,01
Таблица 42 - Цитогенетические признаки групп семенного потомства Picea pungens f. glauca (Е-ВБс-1, Е-ВБс-2, Е-ВБс-3, Е-ВБс-4, Е-ВБс-5) из экологически чистого района (2015 г.)
Признаки / группы 1 2 3 4
МИ, подсчитанный с учетом стадии профазы, % 13,5+0,3 9,5+0,5*** 10,3+0,2** 11,8+0,1*
МИ, подсчитанный без учета стадии профазы, % 7,3+0,3 6,5+0,5* 6,4+0,1* 7,7+0,1
% клеток в профазе 45,9+1,3 30,7+1,5*** 35,8+1,3** 34,2+0,4**
% клеток в метафазе 28,3+0,6 22,8+0,5** 23,0+0,6** 22,6+0,5**
% клеток в анафазе 10,8+0,9 15,7+1,1** 12,3+0,5 16,3+0,5**
% клеток в телофазе 14,9+0,8 29,1+1,5*** 27,8+1,3** * 26,6+0,8***
Уровень патологий митоза, % 5,6+0,1 4,3+0,2** 4,6+0,1* 4,8+0,1*
Примечание: 1 - нестабильная группа, 2 - стабильная группа, 3 - промежуточная группа,
4 - промежуточная группа. Различия с группой №1 (нестабильной) достоверны: * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001.
Анализ морфометрических признаков проводили у семенного потомства группового сбора материнских растений на чистой территории. Морфометрические параметры сеянцев из семян Picea pungens f. glauca, собранных в экологически чистом районе, по группам представлены в таблице 43. На основании результатов кластерного анализа (по совокупности морфометрических характеристик) анализируемые сеянцы группового сбора были разделены на группы: быстрорастущие и медленнорастущие (промежуточные не выделены). В последних морфометрические параметры были ниже (Р<0,05; Р<0,01; P<0,001), чем в быстрорастущих (Таблица 43). Дендрограммы кластерных расстояний по морфометрическим параметрам между сеянцами P. pungens через 6 и 18 месяцев после посева изображены на рисунках 25-26 (Приложение А). Таблица 43 - Морфометрические параметры сеянцев из семян Picea pungens f. glauca (Е-ВБс-1, Е-ВБс-2, Е-ВБс-3, Е-ВБс-4, Е-ВБс-5) по группам
Параметры Значения в быстрорастущей группе Значения в медленнорастущей группе
6 мес. 18 мес. 6 мес. 18 мес.
Длина корня, см 1,6+0,01 4,5+0,01 1,5+0,01* 4,5+0,01
Высота растения, см 2,2+0,01 8,2+0,04 2,1+0,02* 7,9+0,04**
Число хвоинок, шт. 7,9+0,05 21,2+0,1 7,7+0,08** 20,1+0,1***
Примечание: 6 мес. - возраст сеянцев 6 месяцев, 18 мес. - возраст сеянцев 18 месяцев. Различия показателей между группами достоверны: * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001.
На основании проведенных исследований выделены маточники Picea pungens f. glauca, произрастающие на территории ботанического сада ВГУ (Е-ВБс-1, Е-ВБс-2, Е-ВБс-3, Е-ВБс-4, Е-ВБс-5), от которых получены наиболее цитогенетически стабильные проростки и быстрорастущие сеянцы.
5.2. Индивидуальный отбор цитогенетически устойчивых материнских растений Picea pungens и потомства с лучшими морфометрическими
показателями
Цитогенетические признаки можно использовать для отбора более устойчивых к антропогенному загрязнению растений-маточников [Артюхов и др., 2009; Машкина и др., 2009; Калаев, Попова, 2014 б], что наиболее актуально для интродуцентов, которые часто используются в озеленении города и зоны промышленных предприятий. Дальнейшие исследования морфометрических показателей сеянцев и сопоставление их с цитогенетическими параметрами позволит установить корреляционные зависимости и выявлять резистентные экземпляры среди материнских растений и их семенного потомства. Изучение морфометрических признаков семенного потомства и разделение его на группы (быстрорастущее, медленнорастущее) на основе не только фенотипических критериев, а с привлечением цитогенетических характеристик, способствует более точной дифференциации и отбору особей для урбанизированных территорий.
Цитогенетические признаки были исследованы у семенного потомства каждого из 4-х деревьев в отдельности в загрязненной зоне (Левобережный район г. Воронежа). Цитогенетические показатели нестабильных и стабильных групп семенного потомства Picea pungens f. glauca представлены в таблице 11 (Приложение Б). С помощью кластерного анализа (по совокупности цитогенетических характеристик) проростки каждого дерева из экологически загрязненного района (2015 г.) были разделены на группы: нестабильные и стабильные. Промежуточных групп проростков не было выделено. В целом, процентные соотношения нестабильных и стабильных групп составляли около 3050 % и 50-70 % соответственно. Дендрограммы кластерных расстояний между проростками семенного потомства деревьев Picea pungens f. glauca из
экологически загрязненного района (по цитогенетическим показателям) показаны на рисунках 21-24 (Приложение А).
Митотический индекс, подсчитанный с учетом клеток на стадии профазы, был выше в нестабильной группе у дерева Е-СК-1 (различия достоверны, Р<0,01) за счет увеличения числа профаз. Число клеток на стадии профазы в нестабильной группе было увеличено по сравнению со стабильной у всех деревьев (Приложение Б, Таблица 11). Митотический индекс, подсчитанный без учета клеток на стадии профазы, в стабильной группе превышал таковой в нестабильной у дерева Е-СК-3 (различия достоверны, Р<0,05). В стабильных группах отмечалось повышение доли анафаз и телофаз, что замечалось другими авторами у березы повислой [Калаев и др., 2006] и сосны обыкновенной [Машкина и др., 2009].
При анализе цитогенетических признаков в клетках апикальной корневой меристемы семенного потомства материнских растений ели колючей выявлено, что митотический индекс у проростков семян дерева Е-СК-4 выше, чем у остальных, что связано с увеличением числа профаз (различия достоверны, Р<0,05) из-за многочисленных повреждений ДНК, отмеченного и у других объектов исследования в условиях антропогенной нагрузки.
Подтверждением предположения о нарушениях ДНК является высокий уровень патологий митоза и значительное превышение показателя у семенного потомства материнского растения Е-СК-4 (различия достоверны, Р<0,01) по сравнению с остальными. При анализе совокупности цитогенетических характеристик очевидна негативная реакция проростков данного дерева, по нашему мнению, обусловленная их меньшей резистентностью. В данном случае проявляется разная индивидуальная чувствительность материнских растений к антропогенному стрессу и неоднозначность цитогенетических реакций их семенного потомства. Между нестабильными и стабильными группами проростков замечены различия по уровню патологий митоза, спектр нарушений был сходен.
Таким образом, результаты наших исследовний свидетельствуют о различных по стабильности группах проростков в семенном потомстве Picea pungens, произрастающей в условиях интродукции. По цитогенетическим признакам семенного потомства можно отобрать материнские растения из экологически чистого (Е-ВБс-1, Е-ВБс-2, Е-ВБс-3, Е-ВБс-4, Е-ВБс-5), а также экземпляры Е-СК-1, Е-СК-2, Е-СК-3 из загрязненного района, от которых получено наиболее активно растущее потомство, с более высокой ростовой способностью (с более высоким МИ), и прогнозировать, что из них будут получены быстрорастущие сеянцы (Приложение В, Рисунки 16-19). От дерева Е-СК-4 получены менее резистентные проростки (с высокими ПМ) и, возможно, с меньшей ростовой способностью, медленнорастущие сеянцы. Для проверки данного предположения следует рассмотреть морфометрические признаки семенного потомства.
В загрязненной зоне потомство по морфометрическим признакам характеризовали у каждого дерева в отдельности. С помощью кластерного анализа (по совокупности морфометрических параметров) сеянцы каждого опытного дерева были разделены на группы: быстрорастущие и медленнорастущие, в которых морфометрические параметры были ниже (Р<0,05; Р<0,01; P<0,001) (Таблицы 44-47). Все параметры в опыте были ниже контрольных (Р<0,05; Р<0,01). У сеянцев от материнского растения Е-СЕК-4 морфометрические характеристики были ниже (Р<0,05; Р<0,01), а у таковых от дерева Е-СК-3 - выше (Р<0,05), чем у потомства остальных деревьев, как и МИ. Это указывает на существование связи между морфометрическими и цитогенетическими признаками и позволяет прогнозировать ростовую способность проростков и сеянцев на ранних стадиях развития растения. Дендрограммы кластерных расстояний по морфометрическим параметрам между сеянцами Picea pungens f. glauca материнских деревьев Е-СК-1, Е-СК-2, Е-СК-3, Е-СК-4 (по группам) через 6 и 18 месяцев после посева изображены на рисунках 27-34 (Приложение А).
Таблица 44 - Морфометрические параметры сеянцев из семян Picea pungens f. glauca (Е-СК-1) по группам
Параметры Значения в быстрорастущей группе Значения в медленнорастущей группе
6 мес. 18 мес. 6 мес. 18 мес.
Длина корня, см 1,5+0,01 4,1+0,04 1,4+0,01* 3,9+0,03
Высота растения, см 2,0+0,01 7,5+0,04 1,8+0,02* 7,3+0,03*
Число хвоинок, шт. 7,3+0,07 17,6+0,09 6,9+0,1* 17,2+0,09**
Примечание для таблиц 44-47: 6 мес. - возраст сеянцев 6 месяцев, 18 мес. - возраст сеянцев 18 месяцев. Различия показателей между группами достоверны: * P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001.
Таблица 45 - Морфометрические параметры сеянцев из семян Picea pungens f. glauca (Е-СК-2) по группам
Параметры Значения в быстрорастущей группе Значения в медленнорастущей группе
6 мес. 18 мес. 6 мес. 18 мес.
Длина корня, см 1,5+0,01 4,2+0,03 1,4+0,01* 4,0+0,02*
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.