Синтез РНК в семядолях гороха на ранних стадиях прорастания тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Ахматова, Айгуль Токтосуновна

• Ахматова, Айгуль Токтосуновна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ахматова, Айгуль Токтосуновна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ МЕТАБОЛИЗМА РНК В ПРОРАСТАЮЩИХ СЕМЕНАХ

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Материал.

2. Условия прорастания.

3. Определение поглощения воды.

4. Постановка опытов с мечеными предшественниками

5. Обработка меченых семядолей

6. Определение радиоактивности в ТХУ-осаждаемом и ТХУрастворимом материале.

7. Дифференциальное центрифугирование гомогената и выделение рибосом

8. Седиментационный анализ рибосом в сахарозном градиенте

9. Определение кислотонерастворимой радиоактивности во фракциях сахарозного градиента.

10. Анализ рибосом в градиенте плотности CsCI

11. ДСН-диск-электрофорез в полиакриламидном геле и радиоавтография

12. Определение содержания белка

13. Определение содержания РНК.

14. Выделение рибосомных белков

15. Фракционирование РНК рибосомной фракции методом сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Исследование условий и времени возобновления синтеза

РНК в семядолях набухающих зародышей гороха

I.I. Выбор экспериментального материала для исследования синтеза РНК на начальных стадиях набухания

1.2. Использование меченого уридина для регистрации синтеза РНК.

1.3. Условия и время обнаружения синтеза РЖ.

2-т Г" U С» характеристика цитоплазматическои высокомолекулярной РЖ, синтезированной на ранних стадиях прорастания

2.1. Локализация вновь синтезированной РЖ в цитоплазме.

2.2. Характеристика полисомосвязанной новообразованной РЖ.

2.2.1. Идентификация новообразованной мРЖ в рибосомнок фракции семядолей

2.2.2. Идентификация новообразованной рРЖ в рибосомной фракции семядолей

2.2.3. Корреляция синтеза рРЖ и рибосомных белков

3. Связь транскрипции и трансляции в клетках семядолей на ранних стадиях прорастания

3.1. Зависимость транскрипции от трансляции

3.2. Роль транскрипции в раннем синтезе белка в семядолях.III

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез РНК в семядолях гороха на ранних стадиях прорастания»

Прорастание семян - сложный биологический процесс, в результате которого зародыш превращается в активно растущий и развивающийся организм.Совокупность и последовательность всех молекулярных событий, делающих возможным прорастание семени, все еще остаются неизвестными. Фундаментальная перестройка метаболизма, происходящая при прорастании, подразумевает изменения в соотношении активированных и репрессированных генов, изменения в качестве и количестве транслируемых мРНК и синтезируемых белков. Происходят ли эти изменения в активности генов во время самого набухания зародыша или же совершаются в период эмбрионального развития, а новая информация, предназначенная для перестройки метаболизма, сохраняется нереализованной в сухих семенах и затем используется при прорастании - пока не вполне ясно. Неизвестно также, различаются ли в этом отношении растущие и запасающие ткани зародыша. Все современные данные, полученные, главным образом, на растущих частях зародыша, говорят о том, что транскрипция при прорастании возобновляется очень рано и что на начальных этапах в зародыше наряду с преформированными мРНК функционируют и новообразованные мРНК. Характер их взаимоотношений и роль в синтезе белка и в прорастании все еще остаются неясными. Для решения этих актуальных задач необходимо детальное и всестороннее исследование белково-нуклеинового метаболизма на ранних этапах прорастания. С другой стороны, прорастание представляет собой критическую стадию в жизненном цикле растения, и такие показатели качества семян, как их жизнеспособность и сила, коррелируют со скоростью синтеза белка и РНК в начальный период прорастания. Очевидно, что для понимания молекулярных механизмов ухудшения качества семян необходимы сведения о закономерностях развития трансляционной и транскрипционной активностей при прорастании. Таким образом, необходимость детальной биохимической характеристики процесса прорастания определяется теоретическими задачами, связанными с проблемой дифференцированной экспрессии генов, и практическими задачами, связанными с проблемами семеноводства - основы продуктивного земледелия. В связи с этим, в настоящее время интенсивно исследуются молекулярные события, происходящие в растущих частях зародыша в период, предшествующий началу видимого прорастания. События, происходящие в этот же период в запасающих органах зародыша, таких как семядоля, предназначенных для поддержания роста проростка на более поздних стадиях развития и непосредственно не связанных с самим прорастанием, пока остаются в тени.

Семядоли в семенах бобовых растений представляют собой специализированную запасающую ткань зародыша, где в период формирования семени синтезируются и накапливаются в большом количестве запасные вещества, главным образом, белки. Этот процесс сопровождается значительным увеличением содержания РНК и ДНК в клетках семядолей. Характерной особенностью развития семядолей при прорастании является отсутствие в них клеточных делений и формирование в старых клетках новых метаболических систем, обеспечивающих растущие части зародыша питательными веществами за счет деградации запасных отложений. Хорошо известно, что функционирование семядолей как органов запаса при прорастании зависит от синтеза новых белков и требует развития не только деградативных, но и синтетических путей метаболизма. Однако синтез РНК и роль транскрипции в метаболизме семядолей при прорастании исследованы очень мало, особенно на ранних стадиях прорастания, при переходе зародыша от состояния вынужденного покоя, вызванного обезвоживанием, к активному метаболизму при гидратации.

Ко времени начала нашей работы имелись лишь единичные данные о состоянии аппарата транскрипции в клетках семядолей на начальных стадиях прорастаниями практически полностью отсутствовали сведения о локализации в цитоплазме и функции продуктов ранней транскрипции, а также о характере взаимоотношений транскрипции и трансляции в этот период.

В связи с этим представляло интерес исследовать характер развития РНК-синтезирующей активности в запасающих тканях семян бобовых на ранних стадиях прорастания, то есть в период, предшествующий видимому прорастанию.

Целью нашей работы явилось изучение in vivo синтеза РНК и его связи с синтезом белка в клетках запасающей паренхимы семядолей гороха на начальных стадиях прорастания. В работе были поставлены следующие задачи: I) выбрать экспериментальный материал и способ регистрации синтеза РНК в семядолях на начальных стадиях набухания; 2) определить условия и оценить время возобновления транскрипции в клетках семядолей; 3) проследить за судьбой новообразованной РЖ и определить время ее появления и локализацию в цитоплазме; 4) охарактеризовать виды новообразованной цитоплазмати-ческой РНК и их отношение к трансляционному аппарату; 5) определить характер зависимости ранней транскрипции от синтеза белка; 6) с помощью ингибиторного анализа оценить роль новообразованных РНК в ранней трансляции.

В обзоре литературы мы рассмотрим в общих чертах современное состояние исследований по биосинтезу РНК в прорастающих семенах и роли преформированных и новообразованных мРНК в синтезе белка при прорастании.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ СИНТЕЗА РНК В СЕМЕНАХ РАСТЕНИЙ ПРИ ПРОРАСТАНИИ

I. Что такое прорастание?

Семена представляют собой уникальное образование. С одной стороны, они являются частью или органом растения, с другой - носителем или вместилищем новой генерации. Покидая материнское растение, семена функционируют как самостоятельные единицы и служат распространению и сохранению видового разнообразия растений.

В общем виде структура семени несложна. Оно состоит из зародыша, эндосперма и семенной кожуры. Степень развития и строение каждой из этих частей у семян разных видов растений варьирует очень сильно. Растущую часть зародыша однодольных и двудольных растений составляет зародышевая ось, разделяющаяся на почечку, зародышевой стебелек и корешок. Запасные вещества в семенах однодольных растений накапливаются в эндосперме, у двудольных - в специализированной части самого зародыша, в семядолях. В последнем случае эндосперм в зрелом семени остается в виде тонкой пленки или полностью редуцируется.

Развитие зародыша начинается после оплодотворения и протекает одновременно с формированием семени достаточно сложным образом (Эзау, 1980; Dure, 1975, 1977). В общих чертах это выглядит так. Период эмбрионального роста с интенсивным клеточным делением, синтезом белка и нуклеиновых кислот завершается образованием многоклеточного дифференцированного зародыша и прекращается задолго до завершения созревания семени. Следующий период, во время которого семя увеличивается в размерах только за счет растяжения клеток эндосперма или семядолей, включает синтез запасных отложений. Затем следует постепенная дегидратация семени, при которой синтез макромолекул постепенно прекращается, зародыш вступает в фазу минимальной метаболической активности, а семя - в фазу полной зрелости. Одна из самых удивительных особенностей семян состоит в том, что они могут длительное время сохраняться живыми в глубоко обезвоженном состоянии и способны прорасти и образовать новое растение при благоприятных условиях.

Что такое прорастание и как оно протекает во времени? Определить, что такое прорастание, достаточно сложно, поскольку существует несколько аспектов проблемы прорастания: морфологический, физиологический и биохимический. Считается, что прорастание - это,в первую очередь, возобновление ростовой активности зародыша, возобновление растяжения и деления клеток. Прорастание означает инициацию новой (или новых) генетических программ, реализация которых превращает зародыш в проросток и затем в самостоятельное новое растение (Джен^Амен, 1982).

Попадая в воду, сухие семена поглощают ее^ и в ответ на это при благоприятной температуре в них быстро активируются различные метаболические процессы. Для семян большинства видов культурных растений этого бывает достаточно, чтобы возобновились временно приостановленные или подавленные ростовые процессы в зародыше. Для прорастания других видов семян требуется воздействие дополнительных факторов внешней среды, которые каким-то, пока не известным образом, прерывают покой и делают возможным рост зародыша. Б последующем изложении литературных данных мы будем касаться прорастания семян первой группы, то есть семян, не имеющих глубокого покоя.

Известно, что поглощение воды зрелыми семенами проходит в 3 фазы. Начальная фаза, именуемая набуханием, продолжается от нескольких минут до нескольких часов в зависимости от типа семян, семенной кожуры и проницаемости тканей. После завершения набухания имеет место "лаг-фаза" длительностью от 4-5 до 18 и более часов. Затем следует фаза роста, когда начинается удлинение зародышевого корешка и рост проростка (Bewley, Blaok, 1978).

Быоли полагает, что прорастанием следует считать период от начала набухания до начала удлинения зародышевого корешка, которое происходит благодаря растяжению клеток зародышевой оси и приводит к "проклевыванию", то есть пробиванию зародышевым корнем семенных покровов, окружающих зародыш, Все последующие события следует рассматривать как рост проростка (Bewley, Black, 1978J Bewley, 1982)• Тем не менее в литературе часто термин "прорастание" относят к периоду раннего роста первичного корня и проростка, при этом выделяют более ранние и более поздние стадии прорастания, а начало роста зародышевого корня рассматривают как видимое или собственно прорастание. Во всех случаях ясно, что рост зародыша при прорастании начинается не сразу с момента набухания семени и активации в нем метаболических процессов, а лишь спустя некоторое время, в течение которого никакие морфологические изменения в зародыше не происходят. До сих пофет четкого представления о том, какие молекулярные события и в какой последовательности должны произойти в ответ на поступление воды, чтобы стал возможным переход зародыша от состояния относительного покоя к активному росту, чтобы запустить процесс прорастания и обеспечить его завершение. Для понимания механизмов, регулирующих прорастание и обепечивающих успешное развитие растения, требуется детальное исследование процессов репликации, транскрипции и трансляции в различные периоды прорастания, так как взаимодействие и скоординированность этих процессов обеспечивают последовательную реализацию генетической информации.

2. Синтез ДНК и прорастание

Многочисленные данные, полученные при исследовании зародышей пшеницы ( Могу et al., 1972, 19751 Datta et al., 1983)» лука ( Payne, Bal, 1973)» зародышевых осей конских бобов ( Jacob,

Ботву, 1969; Fukuei et al., 1977 ) и гороха (Robinson, Bryant,

• 1975а^в) свидетельствуют о том, что синтез ДНК возобновляется много .позже синтеза белка и, по всей видимости, не требуется для начала роста зародышевого корешка. Репликация ДНК предшествует митозам, которые начинаются значительно позже видимого прорастания и являются обязательным условием последующего роста зародышевой оси. Репликация ДНК в значительной мере зависит от предшествующего синтеза белка и мРНК. Это обусловлено тем, что синтез ДНК-полимеразы, тимидинкиназы и гистонов, а также транскрипция гистоновых мРНК предшествуют началу синтеза ДНК ( Могу et al., 1975; Fukuei et al., 1977, 1978; Kato et al., 1982 ).

Таким образом, возобновление синтеза ДНК не является тем событием, которое необходимо для начала растяжения клеток зародышевой оси, то есть для начала прорастания.

Синтез белка и прорастание

В отличие от синтеза ДНК, синтез белка происходит на всех стадиях прорастания и подавление его полностью блокирует возобновление роста зародышевой ОСИ (Fujasawa, 1966; Marcus, Feeley, 1964, 1965J Walton, 1966*, Walton, Soofi, 1969', Klein et al., 1971', Marcus, 19695 Brooker et al., 1977J Datta et al., 1983)*

Многочисленные данные указывают на то, что синтез белка возобновляется очень рано, как только ткани зародыша начинают поглощать воду. Так, изолированные зародыши пшеницы ( Marcus, reeiey, 1964, 1965; Marcus et al., 1966 ), риса ( Bhat, Padayatty, 1975)» ржи (Sen et al., 1975 ), ячменя ( Abdul-Baki, 19695 Sopory et al., 1980), овса (Bewley, 1982 ), изолированные зародышевые оси гороха (Bray, Dasgupta, 1976 ), фасоли лима (Klein et al., 1971 ), фасоли обыкновенной ( Walton, Soofi, 1969; Gillars, Walton, 1973 ), зародыши куколя (Hecker et ai., 1977 ) начинают синтезировать белки в «первые 30-60 минут набухания. Более позднее время обнаружения синтеза белка в некоторых работах, очевидно, является следствием недостаточного поглощения радиоактивных предшественников, поскольку техника регистрации синтеза белка in vivo основана на включении экзогенно подаваемых меченых аминокислот.

Таким образом, быстрое возобновление синтеза белка в клетках набухающего зародыша, совершенно бесспорно является тем молекулярным событием, которое абсолютно необходимо для начала растяжения зародышевого корешка, то есть для начала прорастания и последующего развития проростка.

Из этого вытекает вопрос, который представляет наибольший интерес: обладают ли сухие семена всем необходимым, чтобы инициировать ситез белка при набухании, и достаточно ли этих запасенных компонентов белок-синтезирующей системы, чтобы обеспечить синтез белков, необходимых для завершения прорастания?

В настоящее время считается твердо установленным, что в сухих зрелых семенах присутствуют структурно и функционально полноценные рибосомы, имеются в достаточном количестве транспортные РНК, активные аминоацил-тРНК-синтетазы и различные факторы трансляции, а также аминокислоты, АТФ и ГТФ, но отсутствуют полисомы - комплексы рибосом с мРНК, осуществляющие синтез полипептидов в клетке. Это показано на семенах различных видов растений: зародышах пшеницы ( Marcus, Feeley, 1964; Marcus et al., 1966, 1973 ), зародышах ржи (earlier, Peumans, 197б), зародышевых осях арахиса (Marcus, Fee-ley, 1964), гороха (Bray, Chow, 1976; Peumans et al., 1980<£;' зародышах "клещевины (Bewley, Larsen,-1979) и других (см. также обзоры: 1^умилевская, 1975; Payne, I976J Bewley, Black, 1978).

Как показали первые работы Маркуса, набухание зародыша сопровоздается активацией синтеза белка и это хорошо коррелирует с появлением полисом и ростом их активности в клетках зародыша С Marcus, Feeley, 1965» Marcus et al., 1966, 1973 ). Из ЭТОГО следовало, что центральным событием, благодаря которому становится возможным возобновление синтеза белка в набухающих зародышах, является появление в цитоплазме доступных для трансляции мРНК. Естественно, что это могло произойти как путем активации уже имевшихся! в сухом зародыше мРНК, так и путем синтеза мРНК de ndvo . Первая возможность означала бы, что синтез белка при прорастании направляте-ся матрицами, транскрибированными в период эмбриогенеза, сохраняющимися в сухих семенах и способными активироваться и транслироваться лишь при набухании, чтобы обеспечить развитие зародыша без предварительной активации генома. Вторая возможность означала бы, что активация генома должна предшествовать началу митотической активности клеток зародыша. Вопрос, который вызвал наибольшее число который дискуссий, противоречивых данных иvдоминировал в литературе последние 10 лет,заключался в следующем: может ли синтез белка начаться в набухающих зародышах без предварительного синтеза РНК :: достаточно ли мРНК, запасенных в сухом зародыше, чтобы обеспечить синтез белка, необходимый для завершения прорастания, или же РНК должна синтезироваться de novo в процессе набухания. Для решения этих вопросов были использованы следующие подходы: с одной стороны, предпринимались попытки выяснить, присутствуют ли мРНК в сухих зародышах, каковы ее свойства и роль в синтезе белка при прорастании; с другой стороны,исследовалось время возобновления транскрипционных событий и их роль в синтезе белка при прорастании. Далее будут рассмотрены основные сведения, накопленные к настоящему времени в этой области исследования.

4. Предюрмированные (или запасенные) мРНК в зародышах сухих семян и их роль в синтезе белка при прорастании

Обнаружение. Первоначальные утверждения о том, что синтез белка при прорастании направляется мРНК, присутствующими в сухих зародышах, базировались на ряде косвенных данных. Так, Маркусу и Фили удалось активировать рибосомы сухих зародышей in vitro и наблюдать образование полисом в безъядерных экстрактах сухих зародышей пшеницы в условиях, исключающих возможность транскрипции (Marcus, Feeiey, 1966 ). В других работах утверждалось, что включение аминокислот в белки предшествует включению предшественников в РНК (chen et ai.t 1968 ). Кроме того, сообщалось, что синтез белка не чувствителен к действию актиномицина Д ( Dure, Waters, 1965; Waters, Dure, 1966). Однако в дальнейшем были получены данные, указывающие на то, что синтез белка в зародышах ячменя ( Abdui-Baki,

1969) и зародышевых осях фасоли (Walton, Soofi, 1969 ) и их проэтого растание зависят от синтеза РНК. В результате"Увопрос о роли пре-формированной мРНК потребовал переисследования.

Надежные доказательства существования мРНК в сухих зародышах были получены в опытах по определению матричной активности различных фракций гомогената сухих зародышей в бесклеточной системе. Ви-икс и Маркус первыми показали, что в гомогенате сухих зародышей пшеницы присутствует фракция клеточных структур, обладающая матричной активностью в системе in vitro , и что при набухании зародышей содержание этой фракции уменьшается при одновременном увеличении содержания полисом ( Weeks, Marcus, 1971). Позже это было подтверждено в других работах на зародышах пшеницы ('Schultzet а1#> 1972 ), риса (Bhat, Padayatty, 1974 ), пшеницы и ржи ( Peumans, Carlier, 1977 ) И фасоли (Mori, Matsushita, 1970 ). В дальнейшем развитие техники исследования нуклеиновых кислот и обнаружение в в составе мРНК эукариотов полиадениловой последовательности дало возможность использовать метод аффинной хроматографии для выделения матричных РНК. С применением этих методов удалось выделить по-лиА-содержащие РНК, обладающие матричной активностью, из сухих зародышей пшеницы (Cuming, Lane, 1978), ячменя (Sopory et al., 1980), ржи, целых семян рапса и гороха С Gordon, Payne, 1976 ), хлопчатника (Hammett, Katterman, 1975 )» редиса (Ferrer et al., 1979 ), зародышевых осей редиса (Delseny et al., 1977c ), маша (Carleir et al., 198O ) и гороха (peumans et al., 1981 , см. также обзоры Payne, 1976; Delseny et?.al*, 1980/ 81 ). Таким образом, в пользу наличия мРНК в сухих зародышах имеется много надежных данных, и в настоящее время этот вопрос не вызывает никаких сомнений.

Свойства. Многие данные говорят о том, что мРНК в сухих зародышах высокомолекулярны и полидисперсны и имеют размеры от 7 до 36s (Delseny et al., 1977c; Peumans et al., 197Ъ\ Каримов и др.,1982) Как отмечалось выше, преформированные мРНК, очевидно, полиаденили-рованы, поскольку полиА-содержащие фракции РНК выделены из сухих семян многих видов растений. Неясным остается вопрос о том, вся ли популяция мРНК в сухих зародышах полиаденилирована, или же наряду с аденилированными мРНК имеется и популяция мРНК, не прошедших пол-ного^роцессинга в период созревания семени или же уже деаденили-рованных. Дюр предполагает, что аденилирование некоторых видов запасенных мРНК может быть средством их активации для вовлечения в трансляцию при набухании (Dure, 1977 ) .и что мРНК в сухих зародышах могут находиться в двух формах (Galan, Dure, 1980/81 ). Наряду с этим известно, что в сухих зародышах пшеницы преформированные мРНК аденилированы и не требуют никакой активации при набуха-своеи нии для трансляции (Spiegel, Marcus, 1975 ). Кроме того, в ряде работ показано, что мРНК, не содержащие полиА-последовательности, могут образовывать с рибосомами активные полисомы (Delseny et al., 1977а; sieiiwanowicz, 198O ). Таким образом, роль аденилирования и деаденилирования в регуляции фущсции прсформированных мРНК остается неясной.

Помимо аденилированных мРНК, в сухих зародышах пшеницы обнаружена фракция РНК, имеющая у 3*-конца полиуридиловую последовательность величиной до 150 нуклеотидов ( Dobrzanska et al., 1980). Функция этой фракции РНК пока неясна.

Использование аналогов нуклеозидов 7-метилгуанозинмонофосфата и 7-метилгуанозинтрифосфата приводило к ингибированию инициации синтеза белка в бесклеточной системе в присутствии преформированной мРНК ( Peumans et al., 1978). На основании этого было предположено, что преформированные мРНК семян растений, подобно мРНК животных и вирусов (Гайцхоки, 1980, см. обзор Hall, 1980), имеют на 5*-конце "кеп"-структуру: 7-метилгуанозин, связанный через б'-углерод рибозы трифосфатным мостиком с 5*-углеродом рибозы второго нуклео-тида. "Кеп"-структура обнаружена в составе мРНК, выделенных из зародышей пшеницы (Haffner et al., 1978 ) и семян нута ( Matilla et al., 1980).

Предполагается, что "кеп" является структурной детерминантом мРНК, облегчающей и обеспечивающей адекватную и эффективную инициацию ее трансляции.

Локализация и форма запасания мРНК. Весьма интересным и важным является вопрос о том, как и где хранятся запасенные мРНК в клетках сухого зародыша. Имеются данные о том, что в зародышах семян хлопчатника (Hammett, Katterman, 1975 ) и семенах рапса ( Payne et al., 1977а» ь ) полиА^НК в сухом семени локализованы в ядре. В сухих зародышах пшеницы . матричная активность была обнаружена как в тяжелых, так и в легких фракциях гомогената ( Marcus, 1969; Weeks, Marcus, 1971» Brooker et al., 1978J Schultz et al.,

1972; Ajtkhozhin et al., 197б). По мнению ряда авторов, мРНК в сухих зародышах пшеницы и ржи находятся в комплексе с белком и присутствуют в цитоплазме в форме РНП-частиц - информосом, имеющих размеры ОТ 25S до I04S (Peumans et al., 1979? Peumans, Carliear, 1977; Айтхожин, Искаков, 1982). Распределение мРНП-частиц по размерам может варьировать в зависимости от состава гомогенизирующей среды, вызывающего агрегацию или солюбилизацию частиц (Peumans et al., 1978 ). Присутствие матричной активности в тяжелых фракциях гомогената может объясняться тем, что исходно малые мРНП-частицы связываются с большими мембранными структурами (Peumans et al., 1978). На основании приведенных данных можно сказать, что пока нет полной ясности относительно места сохранения мРНК в клетках сухих зародышей.

Трансляция in vitro . Кодирующая способность запасенных мРНК была исследована в системе in vitro у различных видов семян. Анализ продуктов трансляции мРНК, выделенных из сухих непроросших зародышей ржи, целых семян рапса, гороха (Gordon, Payne, 1976 ), зародышей ржи и пшеницы ( Peumans, Cariiee, 1977), зародышевых корешков семян гороха (Peumans et al., 1981 ), зародышей пшенищ (Cuming, Lane 1978; Thompson, Lane, 1980 ) показал, ЧТО в сухих семенах присутствует запас интактных молекул мРНК, способных кодировать синтез большого числа полипептидов с молекулярной массой от 10-12 до 100-130 тыс. В некоторых случаях обнаружено большое сходство между белками, синтезируемыми in vitro при трансляции мРНК сухих зародышей пшеницы,и белками, синтезируемыми in vivo в первые часы набухания в условиях, когда транскрипция новых мРНК подавлена ( Thom pson, Lane, 198O). Но тем не менее пока нет никаких данных относительно того, все ли присутствующие в сухом зародыше мРНК будут транслироваться in vivo» или же часть из них будет быстро разрушаться при набухании. Неизвестно также, в какой мере необходимы для прорастания белки, кодируемые этими мРНК. По мнению Дюра Ч Dure, 1977, 1979) мРНК сухих зародышей следует дифференцировать на популяцию "остаточных" мРНК и популяцию "запасенных" мРНК. "Остаточные" - это те мРНК, которые кодировали синтез белков, специфически связанных с периодом созревания семян и которые не требуются при прорастании. Очевидно, что матрицы таких белков разрушаются на поздних стадиях эмбриогенеза. Молекулы мРНК, не успевшие разрушиться до наступления метаболического покоя, могут сохраниться в сухих семенах. Очевидно, что их трансляция при набухании не возобновится или будет очень кратковременной из-за быстрого разрушения. Такого типа мРНК и кодируемый ею белок обнаружены в зародышевых осях маша (earlier et al., 1980;Manickam, Carlier, 1980). ОчевидноК этой же группе мРНК можно отнести матрицы для запасных белков. "Запасенными" мРНК следует считать такие мРНК, которые транскрибировались в период эмбриогенеза, но предна значают/для синтеза белков, необходимых зародышу при прорастании, и потому запасаются в зародыше и используются в трансляции лишь в период прорастания. Таким образом, Дюр подчеркивает возможную физиологическую неоднородность всей популяции мРНК в сухих зародышах. Однако этот вопрос все еще остается дискуссионным и требует экспериментального подтверждения. Пока нет никаких представлений о том, каким образом одни мРНК консервируются, то есть запасаются, в период созревания семени, а другие разрушаются, и каким образом предотвращается преждевременная трансляция запасенных мРНК после их транскрипции в период созревания семени.

Трансляция in vivo . Имеются надежные доказательства того, что преформированные мРНК участвуют в трансляции при набухании. Еще в ранних работах Виикса и Маркуса (Weeks, Marcus, 1971 ) было показано, что мРНК-содержащая фракция гомогената сухих зародышей пшеницы при набухании быстро исчезает^: одновременно с этим появляются полисомы и начинается синтез белка. На основании этого считалось, что именно преформированные мРНК становятся доступными для рибосом и обеспечивают возобновление трансляции. Однако позже было обнаружено, что синтез белка и синтез РНК являются одновременными событиями очень раннего времени, набухания (Spiegel et al., 1975 ) ,и что в зародышах пшеницы синтез полиА^РНК регистрируется в первые 15 минут набухания (Spiegel, Marcus, 1975 ). В такой ситуации трудно определить, с какими именно молекулами мРНК происходит первичное образование полисом, и функционируют ли вообще преформированные мРНК при прорастании. Однако Спигелем и Маркусом было установлено, что полное ингибирование транскрипции и полиаденилирования не отражается на образовании полисом в зародышах пшеницы в начальный период набухания, занимающий первые 40 минут. Из этого следовало, что первичное образование полисом не зависит от синтеза или процессинга мРНК и происходит при участии запасенных мРНК. Имеются данные о том, что большая часть преформированных мРНК сухого зародыша не используется при прорастании. (Peumanset al., 1979 ). Только 25-40% запасенных мРНК сухих зародышей пшеницы поступает в полисомы при инициации синтеза белка в процессе набухания (Brookeг, et al., 1978 ). Опыты по гибридизации показали, что никакой разницы между мРНК, которые связываются с полисомами при набухании, и мРНК, которые остаются неиспользованными, нет. Каким образом запасенные мРНК мобилизуются для трансляции, пока не вполне ясно.

Участие преформированных мРНК в начальном синтезе белка подтверждают' :и данные, полученные при использовании ингибиторов транскрипции. Так, синтез белка в осях редиса ( Deiseny et al., 1977с), зародышей ржи И пшеницы ( Caers et al., 19791 Peumans et al., 1979), хлопчатника (Hammett, Katterman, 1975 ) мало чувствителен к кордицепину в течение первых часов набухания. В зародышах кукурузы (Sanchez de Jemenz et al., 1981) cZ-аманитин не оказывал действия на синтез белка в первые часы, но подавлял его на более поздних стадиях. Все это указывает на то, что самый начальный синтез белка, очевидно, не требует новообразованных мРНК и протекает с участием прсформированных матриц.

5. Синтез мРНК и их роль в синтезе белка при прорастании

Как уже отмечалось выше, первоначальные представления об определяющей роли прсформированных мРНК в синтезе белка и развитии заболев родыша при прорастании отчасти поддерживались данными о^Шозднем времени возобновления синтеза РЖ по сравнению с синтезом белка. Однако развитие методов исследования нуклеиновых кислот, характерное для последних десяти лет, привело к появлению новых экспериментальных данных, которые не подтвердили результатов прежних исследований и показали, что определяемое время возобновления транскрипции в набухающих семенах зависит во многом от чувствительности метода, используемого для регистрации синтеза РНК . Поскольку вопрос о времени начала синтеза РНК имеет принципиальное значение, то он исследуется весьма интенсивно. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что транскрипция является событием самого раннего времени набухания и регистрируется в набухающих зародышах однодольных или зародышевых осях двудольных одновременно с синтезом белка.

Хорошо установлено, что изолированные зародыши пшеницы начинают синтез РНК, среди которых идентифицированы и мРНК, одновременно с поглощением ВОДЫ ( Spiegel et al., 1975; Spiegel, Marcus, 1975). Ранний синтез мРНК (или мРНК-подобных РНК) в зародышах пшеницы продемонстрирован и в других работах (Айтхожин, Искаков, 1982; Blowers et al., 1980*, Huang et al,, 198O ).и обнаружен также в зародышах ржи (Sen et al., 1975*» Payne, 1977 ), хлопчатника ( Ham-mett, Katterman, 1975 » Каримов, Донцова, 1981a), куколя (Hecker -t al., 1976, 1977 ), зародышевых осях редиса (Deiseny et ai#,1977a) рапса (Payne et al., 1978 ), гороха (TaBIfuji et al., 1969? Bray, Dasgupta, 1976; Takahaahi et al., 1977» Takaiwa, Tanifuji, 1979b), сои ( Huang et al., 1980), чечевицы ( Van de Walle et al., 1983).

Имеющиеся данные говорят о том, что новообразованные мРНК полидисперсны по величине (6S- 30S с преобладанием I8-20S материала), находятся в цитоплазме в полиаденилированной или неиполиадени-лированной форме в комплексе с белком и обнаруживаются в виде популяции свободных или полисомо^овязанных РНП-частиц. Скорость синтеза мРНК в период набухания и лаг-фазы прорастания изменяется незначительно.

Весьма важным является тот факт, что новообразованные мРНК, по-видимому, достаточно быстро вовлекаются в процесс трансляции. Об этом свидетельствует, во-первых, присутствие новообразованных мРНК в полисомах в период лаг-фазы прорастания ( Takaiwa, Tanifuji, 19796; Delserury et al., 1977a; Cheung et al., 1979» Dommes et al., 1983) и,во-вторых, значительная чувствительность синтеза белка к ингибиторам транскрипции в этот период ( Hecker et al., 1976*, Cheung et al., 1979» Casrs et al., 1979*, Abdul-Baki 1969; Walton, Soofi, 1969 ). В какой мере ранний синтез мРНК обязателен для самого прорастания^все еще не совсем понятно. По одним данным, инги-бирование начальной транскрипции о( -аманитином, кордицепином или актиномицином Д блокирует возобновление ростовой активности зародыша ( Jendriaak, 1980', Abdul-Baki, 1969*, Walton, Soofi, 1969). На этом основании считают, что возобновление транскрипции мРНК является тем:-молекулярным событием, которое тесно связано с прорастанием. По другим данным, синтез мРНК может быть снижен на 30-40% в первые 8 часов прорастания зародышей пшеницы и это не отразится на начальном росте зародыша ( Datta et al., 1983).

Таким образом, несмотря на то, что синтез белка может начаться без предварительного синтеза новых мРНК, он становится зависимым от синтеза мРНК значительно раньше, чем завершится прорастание ( Caere et al., 1979; Peumans et al., 1979» Cheung et al., 1979).

6. Взаимоотношение преформированных и новообразованных мРНК.

Из всего вышесказанного очевидно, что в период набухания и лаг-фазы в клетках зародыша присутствуют две популяции мРНК - запасенные в сухом зародыше и новообразованные при набухании.

Использование кордицепина дало возможность определить время жизни преформированных мРНК в набухающих зародышах (Delseny et al., 1975). Результаты, полученные на зародышевых осях редиса ( Delseny et al., 1977с; Aspart et al., 1979 )и зародышах пшеницы ( Caers et al., 1979 ) говорят о том, что запасенная полиА+РНК быстро исчезает в течение первых часов набухания. Одновременно с этим увеличивается содержание новообразованных мРНК и появляется зависимость синтеза белка от синтеза РЖ. К 6 часам набухания в зародышах пшеницу и осях редиса преформированные мРНК почти полностью заменяются новообразованными матрицами.

Несмотря на смену источников мРНК, белки, синтезируемые при участии преформированных мРНК или ранних новообразованных мРНК, оказались очень сходными. Такие данные были получены при электро-форетическом и радиоавтографическом анализе продуктов трансляции in vitro мРНК, выделенных из сухих зародышей ржи и пшеницы, и белков, синтезированных in vivo после 1,2,4,6 и 8 часов набухания (Caers et al., 1979» Peumans et al., 1979 ). В этих опытах было показано, что никакие новые белки не появлялись и никакие специфические матрицы не исчезали к 6 часам набухания по сравнению с белками, синтез которых кодировался преформированными мРНК сухих зародышей. Однако количественные различия, которые наблюдались в этих опытах, могут маскировать присутствие новых белков с близкими молекулярными массами. Так, при более детальном анализе белков, на общем фоне большого сходства синтезируемых полипептидов были выявлены некоторые качественные различия в белках, кодируемых пронормированными и новообразованными мРНК (Grzeiczak et al., 1982; Grzelczak,:Lane, 1983).

Анализ нуклеотидной последовательности преобладающих классов мРНК методом гибридизации также показал, что имеется полная гомология между мРНК, связанными с полисомами к 40 минутам набухания зародышей пшеницы ,'то есть прсформированными мРНК :и мРНК, связанными с полисомами к 5 часам набухания то есть преимущественно новообразованными мРНК< (Brooker et al., 1978 ). Однако следует учесть, что чувствительность используемого метода, как и в первом случае, не дает возможности выявить изменения в минорных популяциях мРНК.

Таким образом, несомненно, что в сухих зрелых семенах присутствуют мРНК. Они находятся в комплексе с белком и в виде РНП-частиц присутствуют в ядре или цитоплазме. Некоторые из этих мРНК используются в самое раннее время набухания для возобновления синтеза белка. Имеется большой избыток запасенных мРНК по сравнению с их потребностью в клетках зародыша, но неиспользуемые при набухании преформированные мРНК качественно одинаковы с теми, которые используются в трансляции. Также несомненно, что в саше первые часы набухания происходит синтез новых мРНК и продолжающийся синтез белка становится зависимым от синтеза этих мРНК. Транслируемые новообразованные мРНК, очевидно, сходны с мРНК, запасенными в сухом семени, хотя нельзя исключить возможность незаметных, но важных различий в наборе минорных классов мРНК. Пока не удалось идентифицировать какие-либо белки, которые были бы уникальными или незаменимыми для прорастания и кодировались бы только преформированными мРНК. Неизвестно также, требуется ли непрерывный синтез мРНК для таких белков во время прорастания.

Вопрос о том, какую роль играют преформированные мРНК в обеспечении успешного прорастания, пока не вполне понятен. Полагают, что этот класс мРНК не участвует в регуляции развития зародыша во времени, но функционирует при первичном образовании полисом, создавая пул быстродоступных молекул мРНК, необходимых для быстрого возобновления синтеза белка при попадании семени в воду (Бгоокег et al,, 1978; Caere et al., 1979) •

Целесообразность большого избытка запасенных матриц в сухом зародыше объясняют тем, что при прорастании в естественных условиях колебания температур. и влажности почвы будут сопровождаться повторяющимися циклами возобновления и затухания синтеза белка, то есть образования и деградации полисом. Это может привести к тому, что запасенные мРНК будут исчерпаны прежде, чем в цитоплазме появятся в достаточном количестве доступные для трансляции новообразованные мРНК. Благодаря избыточному запасу преформированных мРНК зародыш оказывается лучше приспособленным к неблагоприятным условиям прорастания и приобретает дополнительную возможность быстро прорасти. Таким образом, запасание мРНК в сухом зародыше может быть результатом эволюционной адаптации, обепечивающей успешное прорастание (Peumans et al., 1979)«

Очень мало известно о том, когда в развивающемся зародыше происходит транскрипция тех мРНК, которые будут транслироваться при прорастании , и что служит сигналом для начала их трансляции. В развивающихся зародышах ржи непрерывное образование нетранслируе-мых мРНП-частиц наблюдалось на протяжении последних 5 недель созревания, вплоть до тех пор, пока синтез макромолекул не прекращался при высыхании семени (Peumans et al., 1979 ). В зародышах пшеницы синтез и накопление свободных мРНП-частиц происходит особенно интенсивно в период молочно-восковой и восковой спелости , . накопленные свободные мРНП-частицы связываются с рибосомами при формировании полисом в период прорастания зародыша (Ajtkozhin et al.,

В опытах с семенами фасоли наблюдалось следующее явление: незрелые семена, удаленные из стручка на 32 день развития (после опыления), не способны прорасти, пока не подвергнутся высушиванию. После намачивания таких преждевременно высушенных семян в зародышевых осях не возобновлялся,, синтез белков, уникальных для периода созревания, и вместо этого начинали синтезироваться белки, сходные с теми ., которые образуются в зародышевых осях при прорастании сухих зрелых семян. Высушивание 22-дневных семян не делало их способными прорастать и не вызывало изменений в картине синтезируемых белков при последующей гидратации. Так,переключение от развития к прорастанию сопровождалось изменениями в картине синтезируемых белков. Авторы высказывают предположение, что дегидратация зародыша на определенной стадии развития играет роль супрессии синтеза белков развития и индукции синтезг|белков прорастания ( Das» gupta, Bewley, 1982)•

7. Синтез других видов РНК и их роль в синтезе белка

Рибосомные РНК. По современным представлениям синтез РНК происходит в ядрышке и начинается с образования большого предшественника. Предшественник содержит помимо 25s , 18s и 5s рРНК, последовательность, которая утрачивается в ходе образования зрелых молекул рРНК. Процессинг рибосомных РНК в растительных клетках можно представить следующей схемой ( Liever, 1980).

1976). при прорастании семян х Юр

1,3 хЮ6 (25S ) рДНК - - » 2,3 - 2,4 X10

3IS )

6.

5,4 хЮ3 (5,8s ) 0,7 х IO5 (I8S )

Синтез рРНК в зародышах злаков или зародышевых осях двудольных обнаруживается одновременно с синтезом мРНК на очень ранних стадиях прорастания. Это показано на зародышах пшеницы (Дощанов и др., 1975; Spiegel, Marcus, 1975; Spiegel et al., 1975 ), ржи ( Sen et al., 1975 ), куколя ( Hecker et al., 1977 ) , зародышевых ОСЯХ редиса ( Deiseny et al., 1977a ) путем анализа меченых РНК, выделенных из зародышей, набухавших в присутствие радиоактивных предшественников. Аналогичные результаты получены на зародышевых осях рапса ( Payne et all., 1978) и чечевицы ( Van de Walle et al., 1983) при исследовании локализации меченой РНК в клетке с помощью радиоавтографии . срезов зародышевого корешка. В отличие от мРНК, синтез которых протекает с более или менее постоянной скоростью в первые 18 часов прорастания, скорость синтеза рРНК заметно увеличивается в период набухания и лаг-фазы (Spiegel et al., 1975).

В зародышах пшеницы скорость синтеза рРНК возрастала к концу лаг-фазы (к 5,5 часам после начала набухания) в 3-3 раза, и 50$ этого увеличения достигалось к 3,5 часам. ( Cheung, Suhadoinik, 1978; Huang et el., 198O). Новые рРНК обнаруживаются в составе рибосом уже в первые 1-1,5 часа набухания, но процессинг 25 s рРНК большой субъединицы рибосом протекает, по-видимому, медленнее, чем процессинг 18 s рРНК малой субъединицы (Дощанов и др., 1975).

В зародышах ржи через 20 минут набухания появляются новообразованные гетерогенные ядерные РНК (вероятно, пре-мРНК), 4S РНК (вероятно, тРНК) и 5 S рРНК. Через 40 минут регистрируется новообразованная 31 S РНК - предшественник рибосомных РНК, который вскоре (через 20 мин) превращается в зрелые 25 s и 18 s рРНК. Между 3 и 6 часами после начала набухания процессинг полностью завершается и в зародыше появляются в большом количестве новые 25 s и 18 s рРНК ( Sen et al., 1975). Однако все еще не ясно, когда новые рРНК в зародышах пшеницы и ржи становятся связанными с рибосомами, участвующими в трансляции.

В изолированных зародышевых осях сои синтез рРНК наблюдался в первые 2 часа набухания. К концу лаг-фазы (к 10 часам после начала набухания) скорость синтеза рРНК увеличивалась в 5,5 раз и 1Ъ% этого увеличения происходило после 4 часов набухания. Процессию? рРНК, особенно 25s рРНК, протекал медленно в первые 4 часа, затем его скорость увеличивалась, но особенно возрастала после окончания лаг-фазы. К этому времени новые рРНК обнаруживались как в полисомной, так и в рибосомной фракции. Это предполагает, что они участвуют в трансляции на ранних стадиях прорастания ( Huang et al., 1980).

В зародышевых осях гороха большой предшественник рибосомных РНК (31 - 33s РНК) накапливается в ядре в первые часы набухания перед тем, как новообразованные рРНК появляются в цитоплазме (Та-nifuet al,, 1970). Через 4-7 часов определяются вновь-синтези-рованные зрелые 25S и I8S рРНК (Takaiwa, Tanifuji, 1979 а). При этом малые субчастицы появляются в цитоплазме раньше, чем большие, и быстро вовлекаются в образование 80S рибосом, тогда как половина новообразованных 60S субчастиц некоторое время присутствует в цитоплазме в свободном состоянии (Takahashi et al., 1977).

В зародышевых осях редиса синтез пре-рРНК наблюдается через 2 часа после начала набухания и процессинг зрелых 25s и I8s рРНК завершается к 5 - 6 часам набухания. К этому времени новые рРНК входят в состав рибосом, участвующих в трансляции ( Delseny et al., 1977а).

В зародышах куколя синтез предшественника рибосомных РНК обнаруживается через 60 минут после начала набухания ( Hecker et al., 1977).

В зародышевых осях фасоли адзуки (v/atanabe et al., 1973 ) и фасоли обыкновенной (Сытник и др., 1982) синтез всех видов РНК начинается сразу на ранних стадиях набухания.

В связи с тем, что в семенах в ходе их формирования, созревания и прорастания происходят глубокие метаболические изменения, можно было оцидать, что в них, как и в животных тканях, на некоторых стадиях развития будет иметь место амплификация рибосомных генов. Однако ряд данных говорит о том, что в развивающихся, прорастающих и растущих зародышах пшеницы (ingle, Sinclair, 1972 ) или al*, зародышевых осях бобовых (Fukuei et 1975 ) процент ДНК, способных гибридизоваться с 25s и 18s рРНК?остается постоянным. Это свидетельствует о том, что развитие и прорастание зародыша не сопряжено с амплификацией или делевдей генов рРНК.

Таким образом, несомненно, что в сухих зрелых зародышах присутствуют рибосомы, активные в системе in vitro и способные поддерживать синтез белка in vivo при наличии: доступных мРНК. Ясно также, что возобновление синтеза рРНК является таким же ранним событием, как и возобновление синтеза мРНК>и происходит задолго до начала роста клеток зародыша, и что рибосомы, содержащие новосинте-зированные рРНК, могут участвовать в трансляции на ранних этапах прорастания.

Неизвестным остается вопрос о том, насколько существенен синтез новых рибосом для синтеза белка при прорастании. Есть основание полагать, что синтез новых рибосом более существенен для периода интенсивного роста проростка, чем для самого прорастания. А для прорастания более важным является наличие в сухих зародышах запаса неповрежденных рибосом. В пользу этого говорят низкая скорость процессинга рРНК в начальный период набухания (следовательно, новосинтезированные рибосомы не могут самостоятельно обеспечить быстрое возобновление синтеза белка, необходимое^для быстрого прорастания зародыша) и наличие тесной корреляции между скоростью прорастания и степенью целостности рРНК в сухих зародышах ( Brock-lenhurst, Fraser, 1980).

Транспортные РНК. тРНК и их аминоацилирующие ферменты присутствуют в сухих семенах и способны поддерживать синтез белка. Это было продемонстрировано при получении активной бесклеточной системы из сухих зародышей пшеницы (Marcus, 1969), зародышей ржи (earlier, Peumans, 1976 ) и зародышевых осей гороха (Peumans et al., 1980 в). Не более 10% тРНК, присутствующих в сухом семени, могут аминоацилироваться, и около 40% тРНК имеют повреждения у ССА-кон-ца. Однако при набухании процент способных к аминоацилированию тРНК быстро возрастает и дефекты в тРНК исчезают. Показано, что необходимые для этого ферменты присутствуют в сухих семенах и их активность при набухании увеличивается. Тем не менее синтез тРНК имеет место при прорастании и начинается через 20 минут после начала набухания в зародышах ржи ( Sen et al., 1975 ) и через I час в зародышевых осях фасоли (Walbot, 19?2 ). Однако остается неизвестным, участвуют ли новообразованные тРНК в трансляции. Никаких существенных изменений в размерах популяции тРНК и уровне синтетаз при набухании не происходит. Исследование активности аминоацил-тРНК-синтетаз для 20 видов тРНК в зародышевой почечке, корне и семядолях фасоли показало, что удельная активность ферментов не меняется до начала роста зародышевой оси и заметно возрастает в почечке и корне лишь через несколько дней (Anderson, Fowden, 1969)• Вполне вероятно, что запаса аминоацил-тРНК-синтетаз, присутствующего .в сухих семенах, достаточно дяя аминоацилирования тРНК на всех стадиях прорастания, а увеличение активности ферментов необходимо только в период интенсивного роста прорастания. Таким образом, содержание тРНК, по всей вероятности, не лимитирует синтеза'белка при прорастании и возобновление транскрипции тРНК не является фактором, регулирующим развитие зародыша при прорастании.

8. Последовательность транскрипционных событий при прорастании

В настоящее время считается хорошо установленным, что зародыши способны синтезировать все виды РЖ во время прорастания и что во многих случаях эти синтезы начинаются очень рано. Предполагавшаяся ранее последовательная активация транскрипции различных видов РНК в набухающих зародышах (Dobrzanska et al., 1973 ) в настоящее время не подтверждается экспериментальными данными и считается маловероятной. Так, в зародышах пшеницы мРНК, рРНК и белки начинают синтезироваться одновременно вскоре после начала набухания (Spiegel et al., 1975? Huang et al., 1980).

В зародышах ржи синтез 4-5 S РНК, рРНК и полиА^НК происходит более или менее одновременно в ранний период набухания и все виды РНК оказываются синтезированными в течение первого часа набухания (Sen et al., 1975; Payne, 1977 ). В зародышевых осях редиса синтез рРНК и полиА+РНК происходит в течение первых 2-х часов набухания (Delseny et al., 1977а). В зародышевых осях семян рапса синтез пре-рРНК, 25S и I8S рРНК и полиА^ТНК был определен к концу периода гидратации (4-6 часов от начала набухания). Радиоавтографическое исследование, проведенное на тех же семенах, выявило еще более раннее(через 2 часа после начала набухания) время активации синтеза всех видов РНК (Payne et al., 1978 ). При радиоавтографическом исследовании срезов зародышевых осей семян чечевицы, набухавших в течение первых 3-х часов в присутствии меченого уридина, метка была обнаружена в трех областях клетки: ядрышке, хроматине и цитоплазме. При этом наибольшая плотность зерен серебра наблюдалась над ядрышком, но более 80% суммарной радиоактивности было найдено над хроматином и цитоплазмой (Yan de walle, 1983)*

Все это доказывает, что синтез всех видов РНК возобновляется, по-видимому, одновременно, иногда задолго до того.времени, когда меченые молекулы РНК обнаруживаются в изолированных препаратах, поскольку происходит их разведение немечеными молекулами, присутствующими в ткани. Показано, что синтез РНК первоначально возобновляется в тех клетках, которые расположены по периферии зародыша или оси, так как в них в первую очередь поступает вода, а, следовательно, и меченые предшественники, дающие возможность зарегистрировать этот синтез. Несмотря на одновременное возобновление транскрипции всех видов РНК в тканях зародыша, синтез того или иного типа РНК может оказаться преобладающим. Соотношение видов новообразованных РНК будет зависеть от скорости их транскрипции или процессинга и времени жизни и может быть различным на разных стадиях прорастания у разного типа клеток. Так, на зародышах многих видов однодольных и зародышевых осях двудольных растений было показано, что большая доля новообразованных РНК на самых ранних стадиях набухания приходится на мРНК.

9. Регуляция синтеза РНК в прорастающих семенах

Несмотря на то, что быстрое возобновление синтеза РНК в набухающих зародышах хорошо установлено, а рост транскрипционной активности при прорастании достоверно измерен, до сих пор остаются неясными механизмы, ругулирующие этот процесс при прорастании.

Как известно, синтез РНК представляет собой сложный многоэтапный процесс, включающий инициацию транскрипции, элонгацию растущей цепи полирибонуклеотида, терминацию транскрипции и освобождение транскрипта от матрицы ДНК, процессинг первичного транскрипта и транспорт зрелых молекул в цитоплазму. В соответствии с этими этапами имеется столько же возможных уровней регуляции синтеза РНК в клетке.

Для быстрого возобновления синтеза всех типов РНК Набухающих зародышах требуется присутствие трех классов ДНК-зависимых РНК-полимераз: РНК-полимеразы I, локализованной в ядрышке и ответственной за транскрипцию предшественника рибосомных РНК; РНК-полимеразы II, локализованной в нуклеоплазме и ответственной за транскрипцию предшественников мРНК,и РНК-полимеразы III, также локализованной в нуклеоплазме и транскрибирующей гены тРНК и 5S рРНК. Очевидно, что синтез каждого из типов РНК в набухающем зародыше может регулироваться самостоятельно на уровне транскрипции путем изменения содержания и активности соответствующих полимераз.

Все три класса полимераз выделены из сухих зародышей пшеницы (Jendrisak, 1980а,Ъ ) и ржи ( Fabisz-Kijowska et al., 1975 ). Предполагается, что они находятся в достаточном количестве, чтобы катализировать синтез РНК, как только это становится необходимым при набухании. По всей видимости, полимеразы не являются фактором, лимитирующим скорость- транскрипции в начальный период прорастания.

Все полимеразы имеют сложную структуру и состоят из 2-3 высокомолекулярных и большого числа низкомолекулярных субъединиц. Свойства и функции этих ферментов в сухих и прорастающих семенах изучены все еще недостаточно.

Наиболее изученным ферментом является РНК-полимераза II. Исследование субъединичной структуры РНК-полимеразы II в сухих и прорастающих зародышах пшеницы и зародышевых осях сои показало, что прорастание сопровождается модификацией фермента. Его большая(220кс/) субъединица по мере прорастания превращается в субъединицу меньшей молекулярной массы (180 ко/ ) путем ограниченного протеолиза^и это коррелирует с активацией синтеза мРНК при прорастании ( Jendrisak,

1980 b)} Выдвинуто предположение, что ^модифицированный фермент, присутствующий в сухих зародышах, является запасаемой формой или предшественником, который активируется для транскрипции путем модификации его большой субъединица. Остается неизвестным, необходима ли эта модификация для возобновления синтеза мРНК в период,набухания или же в сухом зародыше присутствует достаточное количество активного фермента, а дальнейшая модификация происходит после завершения прорастания и связана с увеличением скорости транскрипции мРНК в тканях проростка.

Очень мало известно о факторах, отвественных за увеличение скорости синтеза рРНК в период лаг-фазы прорастания. Ничего неизвестно о факторах, регулирующих скорость процессинга рРНК и обеспечивающих/Заметный рост в ходе прорастания С Delseny et al», 1980/81).

Инициация и продолжение синтеза РНК в набухающих зародышах зависят от быстрой подачи 4 рибонуклеозид-трифосфатов. Поскольку их содержание в сухих зародышах пшеницы незначительно и быстро возрастает при набухании, было высказано предположение (Cheung, Suhadolnik, 1978 ), что начальное увеличение скорости синтеза РНК (в первые 40 минут набухания) зависит от роста концентрации всех четырех нуклеотидов. В последующий лаг-период содержание АТФ и ГТФ увеличивалось незначительно (на 60$ и 3($ соответственно), в то время как синтез РНК возрастал в 3 раза. Однако оказалось, что содержание УТФ увеличивалось в этот же период на 400%. Авторы полагают, что в период лаг-фазы скорость синтеза РНК контролируется только уровнем пиримидиновых нуклеозид-трифосфатов. Результаты другой работы (Huang et al., 1980 ) не подтвердили предположения о регуляторной роли пиримидиновых нуклеотидов в синтезе РНК в начальный период прорастания.

Все это свидетельствует о том, что природа контрольных механизмов синтеза РНК при прорастании остается неизвестной и требует детального исследования.

10. Особенности метаболизма белка и РНК в запасающих тканях зародыша в период прорастания

Рассмотренная выше литература касалась исследования основных черт метаболизма РНК в растущих частях зародыша, т.е. в таких тканях, где при прорастании должна возобновиться ростовая активность, должно начаться растяжение и деление клеток.

Помимо таких тканей, в зародышах семян двудольных растений имеются хорошо развитые специализированные запасающие органы - семядоли, в которых деление, клеток не происходит при прорастании. У некоторых видов растений семядоли при развитии проростка выносятся на поверхность почвы и кратковременно функционируют как фотосинте-зирующие органы.

У других видов, : ^например, у гороха, семядоли остаются в почве, не подвергаются морфологическим изменениям и вскоре погибают. В таких тканях, в отличие от растущих частей зародыша, развитие метаболической активности при прорастании происходит при отсутствии растяжения, деления и дифференцировки клеток. Семядоли, несущие органам зародышевой оси запас питательных веществ, необходимы?не для самого прорастания, как такового, т.е. начала их роста, а для последующего развития проростка пока он не выйдет на поверхность почвы и не приобретет способность к автотрофному питанию. Запасы питательных веществ в семядолях находятся в форме, недоступной для использования растущими клетками осевых органов, и требуют превращения в метаболиты, способные усваиваться клетками проростка. По современным представлениям, клетки семядолей сухих зародышей не обладают всем ферментативным аппаратом, необходимым для превращения запаса питательных веществ в форму доступных метаболитов, и должны синтезировать de novo большой набор ферментов, чтобы обеспечить тем самым успешное развитие нового растения. Из этого следует, что появление в семядолях активного белок-синтезирующего аппарата в период прорастания и роста проростка является событием жизненно важным для развития нового растения. В связи с этим проблема регуляции синтеза белка в семядолях прорастающих семян представляет большой интерес и требует всестороннего исследования. Наиболее важным является вопрос о происхождении всех типов РНК в составе белок-синтезирую-щего комплекса, функционирующего в клетках семядолей при прорастании.

Хорошо известно, что клетки в семядолях прекращают делиться на ранних этапах эмбриогенеза,задолго до полного созревания семени. После этого наступает период синтеза и накопления запасных отложений. В семенах бобовых растений главным видом запасных питательных веществ являются специфические белки - запасные глобулины. В этот период клетки семядолей значительно увеличиваются в размерах за счет роста растяжением. В них происходит интенсивный синтез нуклеиновых кислот, приводящий к многократному увеличению содержания РНК и ДНК, развивается обширная сеть эндоплазматического рети-кулума, формируются белковые тела, где накапливаются запасные белки. Можно сказать, что весь метаболизм и структура клеток семядолей в период эмбриогенеза определяются главным молекулярным событием этого времени - синтезом запасных белков.(см. обзоры Milierd, 1975; Dure, 1975; Гумилевская, 1975).

При постепенном высыхании созревающих семян метаболическая акв семядолях, тивностьТ"как и в зародышевой оси, затухает, синтез макромолекул прекращается. В этот период происходят глубокие изменения в состоянии белок-синтезирующего аппарата и мембранных систем ( Bain,

Mercer, 1966 а,' обзор Bewley, Black, 1978).

По данным ультраструктурных исследований рибосомы в цитоплазме сухих семядолей гороха концентрируются вблизи митохондрий, образуя области, исключительно плотно заполненные РНП-частицами, полисомы не наблюдаются, элементы ретикулума очень редки, митохондрии лишены внутренней структуры ( Bain, Mercer, 1966 a,b; Chapman, Rieber, 1967).

Из результатов биохимического анализа следует, что рибосомы в семядолях сухих зрелых семян гороха находятся в форме структурно-полноценных 80s -частиц, свободных от мембран ретикулума, не связанных с мРНК (1^шлевская и др., 1971, 1972, 1975; Чумикина, 1974; Чумикина, Кретович, 1975), и способных осущестЕлятфинтез полипептида В присутствии матрицы (Barker, Rieber, 19675 Beevers, Poul-son, 1972). Растворимые компоненты белок-синтезирующей системы все еще достаточно активны (wells, Beevers, 1974)^ : присутствуют также все необходимые тРНК и соответствующие аминоацил-тРНК-син-тетазы (Anderson, rowdejfi 1969)»

Вопрос о наличии в сухих семядолях преформированных мРНК, способных обеспечить синтез белка при прорастании, весьма сложен. Как известно, преобладающим видом матричных РНК в семядолях созревающих семян являются мРНК, кодирующие синтез запасных белков. Предполагается, что транскрипция этой популяции матриц должна прекращаться на поздних стадиях эмбриогенеза, а имеющиеся матрицы подвергаться деструкции (Dure, 1977). Действительно, попытки обнаружить синтез запасных глобулинов in vivo на ранних стадиях прорастания оказались безуспешными ( Gumilevskaya, et ai.,1982; Ска-женник И др., I98I6; Скаженник, 1982; Payne et al., 1977b; Gordon, Payne, 1977 ). Но,тем не менее, из семядолей сухих семян сои были выделены полиА-содержащие РНК, кодировавшие в бесклеточной системе синтез полипептидов, иммунологически сходных с запасными белками сои (Mori et al., 1978 )• Можно предположить, что эта фракция мРНК не транслируется in vivo > так как подвергается быстрой деструкции при гидратации зародышами представляет собой "остаточные" мРНК, неуспевшие разрушиться при завершении созревания семени.

В семядолях сухих семян присутствуют и другие популяции мРНК, способные кодировать синтез разнообразных полипептидов при трансляции в бесклеточной системе. Такие фракции полиА-содержащих мРНК были выделены из целых семян гороха (Gordon, Payne, 1976), семядолей нута (Matilia et al., 1980 ) И семян рапса (Gordon, Payne, 1976, 1977). Транслируются ли эти мРНК in vivo при прорастании, в какой мере,) какие именно,.; какова их роль в метаболизме семядолей, пока абсолютно неясно.

Опыты с ингибиторами транскрипции, проведенные в нашей лаборатории, свидетельствуют о том, что в период набухания зародышей гороха мРНК, присутствующие в сухих семядолях, способны поддерживать некоторый синтез белка (Gumilevskaya et al., 1982», Gumilevskaya et al., 1981 ; Скаженник, 1982).

Таким образом, можно сказать, что в сухих зрелых зародышах преформированные мРНК присутствуют не только в клетках зародышевой оси, но и в клетках запасающих органов зародыша. Однако роль этих мРНК в формировании активного метаболизма в семядолях при прорастании остается неизвестной.

Как уже отмечалось, одним из наиболее удивительных свойств семян является их способность сохраняться живыми при очень глубоком обезвоживании и возобновлять метаболическую активность и рост при благоприятных условиях. Другое не менее удивительное свойство семян состоит в их способности коренным образом менять ход метаболических процессов при переходе от эмбриогенеза к прорастанию. Эта отличительная черта особенно ярко проявляется в метаболизме семядолей.

С момента набухания семян начинается реализация новой программы (или программ) развития зародыша, предусматривающей возобновление ростовой активности и превращение зародыша в проросток.

В семядолях число клеток, а часто и их размеры не меняются в процессе прорастания; новая программа развития выражается в данной ткани в том, что в ней формируется новый тип обмена, в котором преобладающими становятся катаболические процессы, обепечивающие мобилизацию запасных отложений и снабжение растущих клеток оси соответствующими метаболитами. Таким образом, процессы синтеза и накопления белков и науклеиновых кислот, характерные для периода эмбриогенеза, сменяются при прорастании на противоположные, и в семядолях происходит деградация этих соединений.

В тоже время хорошо установлено, что с момента набухания семядолей в них начинается синтез белка. Так, активные полисомы обнаруживаются в семядолях изолированных зародышей гороха через 30 минут после начала набухания (Скаженник, 1982). Способность семядолей включать меченые предшественники в белки зарегистрирована и на более ПОЗДНИХ стадиях прорастания (Beevers, Splittstoesser, 1968; Chin et al., 1972 обзоры !Цумилевская, 1975; Bewley, Black, 1978). Установлено, что возобновление синтеза белка в семядолях набухающих зародышей происходит при участии старых рибосом, синтезированных В период эмбриогенеза (Walbot, 1972; Gumilevskaya et al., 1982). 1982). Как долго способны функционировать старые рибосомы и происходит ли их замена новыми рибосомами в неделящихся клетках семядолей в период прорастания? Сообщалось, что в семядолях конских бобов новые рибосомы, содержащие в своем составе новообразованные рРНК, появлялись через несколько дней после прорастания (Payne, Boulter, 1969).

Полагают, что трансляция играет'важную роль в метаболизме семядолей на всех стадиях прорастания. В ранний период, предшествующий началу потребления запасных отложений,новообразованные белки, повидимому, необходимы для восстановления структурной организации очных клетки, ликвидации внутриклет'повреждений, вызванных глубоким обезвоживанием цитоплазмы и для обновления мембранных систем ( Bain, Mercer, 1966 в,С; opik, 1966 ; Осборн, 1980). Так,в первые сутки в семядолях гороха наблюдается восстановление структуры и активности митохондрий и синтез в цитоплазме митохондриальных белков ( Nawa, Aeahi, 1971, 1973 )• В семядолях фасоли происходит пролифера ция ретикулума и синтез его компонентов - белков и липидов ( Harris, Chrispeels, 1980J Chrispeels, Jones, 1980/-81 ).

На более поздних стадиях происходит синтез многих гидролитических ферментов, участвующих в метаболизме запасных веществ: кислых фосфатаз , И РНКазЫ ( Barker et al., 197V, Barker, Bray, 1973J Bryant et al., 1976 ), фитазы (Куваева, Кретович, 1978, 1979), проте-а?ы эндопептидазного типа ( Chrispeels, Jones, 1980/81).

Наиболее сложным ; и в тоже время наиболее важным является вопрос о роли транскрипции в синтезе белка на ранних и поздних стадиях прорастания.

Синтез РНК в запасающих органах зародыша в период прорастания изучен очень мало. Имеющиеся данные малочислены и противоречивы, однако . свидетельствуют , о том, что синтез РНК можно зарегистрировать в указанной ткани во время развития проростка. Такие результаты были получены на семядолях хлопчатника ( Dure, Waters,

1965; waters, Dure, 1965', Каримов, Донцова, 1981 а,б), арахиса

Cherry, Cherry, 1963', Chroboczek,Tf965), гороха ( Chakravorty, 1969*, Ross et al., 1971; Hewish et al., 1971'» Chin et al., 1972*, Barker, Bray, 1973', Куваева и др., 1973; Watanabe et al., 1973) при исследовании спо.собндсти интактных или отделенных от оси семядолей или же их срезов включать меченые предшественники в РНК, а также прг анализе препаратов меченых РНК.

БЗдиничные данные самого последнего времени, полученные на семядолях рапса ( Payne et al., 1978 ) И нута ( Mat ilia et al., 1982) свидетельствуют о том, что синтез всех типов РНК происходит на очень ранних стадиях прорастания.

Вопросы, касающиеся времени начала синтеза РНК в семядолях, последовательности траскрипционных соб&тий и их зависимости от синтеза белка, качественной характеристики новосинтезированных и преформированных мРНК^их соотношения в клетке и роливсинтеае белка в начальный период прорастания, пока не имеют ответа.

Можно надеяться, что успех в исследовании этих вопросов будет способствовать раскрытию молекулярных механизмов , позволяющих высокодифференцированным клеткам запасающей паренхимы семядолей изменять коренным образом ход метаболических процессов при прорастании.

В настоящей работе предпринято исследование некоторых аспектов биосинтеза РНК в семядолях гороха в наименее изученных период от покоя прорастания семян, в период перехода сухих зародышей'т активному метаболизму :при* набухании.

МЕТОДЫ. ИССЛЕДОВАНИЯ I. Материал

Работу проводили на семенах гороха ( Pisum sativum L. ) сорта "Победитель". В ходе исследования были использованы три партии семян, хранившихся при комнатных условиях в течение 0,5-2 лет после сбора урожая и имевших хорошую (более 90%) всхожесть в момент постановки опыта.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Ахматова, Айгуль Токтосуновна

ВЫВОДЫ

1. В клетках запасающей паренхимы семядолей гороха, не подверженных делению или росту растяжением в период прорастания семени, активация генома происходит сразу с момента достаточной гидратации без какой-либо задержки. Возобновление транскрипции в семядолях, по-видимому, не зависит от присутствия осевых органов, чувствительно к температурным условиям набухания и не нуждается в новообразованных белках.

2. Преобладающим типом новообразованной РНК в цитоплазме в первые 0-6 часов набухания зародышей является мРНК-подобная РНК (высокополимерная полидисперсная РНК нерибосомного типа, чувствительная к РНКазе и способная связываться с нитроцеллюлозными фильтрами). Начальный синтез мРНК не зависит от синтеза белка и подавляется полностью актиномицином Д, с^-аманитином и кордицепином.

3. После полного завершения гидратации на фоне продолжающегося синтеза мРНК наблюдается ускорение синтеза рРНК и рибосомных белков, в клетках семядолей накапливаются свободные несвязанные с мембранами новообразованные рибосомы. Начальный синтез рРНК зависит от синтеза белка и полностью подавляется актиномицином Д. Длительное подавление синтеза мРНК с/-аманитином также приводит к снижению скорости синтеза рРНК.

4. Новообразованные мРНК и новообразованные рибосомы (или по t> о \ крайней мере их часть) присутствуют в полисомах и участвуют в процессе трансляции на самых ранних стадиях прорастания.

5. Подавление начальной транскрипции приводит к существенному (50-60%) снижению начальной скорости синтеза белка. После завершения гидратации зародыша трансляция в основном зависит от новообразованных РНК.

6. Некоторый синтез белка в первые часы набухания возможен при полном подавлении транскрипции, что указывает на способность запасенных мРНК и запасенных рибосом, синтезированных в период эмбриогенеза и сохраняющихся в сухих семенах, возобновить трансляцию при поступлении в клетки воды.

7. Транскрипция в клетках семядолей на ранних стадиях прорастания регулирует скорость синтеза белка и в свою очередь находится под контролем трансляции.

В заключение считаю своим приятным долгом выразить глубокую искреннюю благодарность моим научным руководителям члену-корреспонденту АН СССР профессору Вацлаву Леоновичу Кре-товичу и кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику Наталии Александровне ^умилевской за предоставленную тему научного исследования и постоянное внимание и помощь при выполнении данной работы.

- 131

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа является одной из первых попыток осветить с различных сторон события ранней транскрипции в клетках запасающей паренхимы семядолей зрелых семян гороха на начальных стадиях прорастания, а именно - в период возобновления в зародыше активного метаболизма при гидратации.

Всякое исследование у растений связи синтеза РНК с ростом и развитием требует определенной осторожности при постановке эксперимента. Поскольку обычно синтез РНК регистрируют по включению меченых предшественников в соответствующие соединения, то, естественно, при этом возникает необходимость инкубировать материал в присутствии метки, чтобы предоставить анализируемым тканям в определенный период развития меченые соединения. Сложность заключается в том, что в растительных тканях в ответ на изменения внешних условий (температура, аэрация, раневые и радиационные повреждения) происходят быстрые изменения в биосинтезе белка и нуклеиновых кислот. Поэтому очень важно, чтобы условия, при которых анализируемую ткань инкубируют с меткой, были максимально приближены к условиям, при которых in vivo происходит исследуемый процесс роста или развития. В противном случае регистрируемая картина событий в метаболизме РНК будет отражать не реально происходящие на данной стадии развития, а индуцированные ходом эксперимента ( Jackson, Ingle, 1973).

Проведенная нами предварительная работа по выбору экспериментального материала и условий для регистрации синтеза РНК по включению меченого уридина в ТХУ-осаждаемый материал позволила установить, что семена без семенной кожуры, то есть изолированные зародыши, представляют собой удобную систему для решения поставленных задач - исследования синтеза РНК на начальных стадиях прорастания, так как зародыши отлично прорастают и в тех же условиях способны поглощать меченые предшественники и включать их в соответствующие соединения. Таким образом, возможность возникновения артефактов при постановке опыта исключалась.

Исследование времени возобновления синтеза РНК в семядолях прорастающих семян гороха, проведенное на изолированных зародышах с помощью биохимических методов, показало, что транскрипционная активность в клетках семядолей регистрируется с первого часа набухания. Это хорошо дополняет цитологические данные Пейна с соавторами, полученные на семядолях рапса ( Payne et al., 1978) и в свою очередь подтверждается результатами, полученными на семядолях нута ( Matliia et al., 1982). По-видимому, существенных различий между растущими и запасающими тканями зародыша двудольных в этом отношении не существует и транскрипция, подобно трансляции, возобновляется в различных тканях зародыша, независимо от пути их дальнейшего развития при прорастании, с момента достаточного оводне-ния клеток и выхода протоплазмы из обезвоженного состояния. Все ли клетки семядоли равноценны в этом отношении и возобновляют транскрипцию с одинаковой скоростью при поступлении воды или же существуют специфические различия между отдельными клетками или участками семядоли, пока не вполне ясно.

Хорошо известно, что охлаждение в начальный период набухания отрицательно действует на последующее прорастание бобовых. Нами было обнаружено, что короткое воздействие холодом в начале набухания тормозит развитие РНК-синтезирующей и белок-синтезирующей активностей в семядолях* Можно допустить, что задержка развития или недоразвитие этих активностей в семядоле понизит способность зародыша использовать запасные отложения, а это в свою очередь отразится на качестве проростков.

Возобновление транскрипции в семядолях гороха, очевидно, происходит автономно и не требует присутствия осевых органов, так как удаление последних до начала набухания не влияло на скорость синтеза РНК в семядолях в период гидратации (перше 6 часов). Трансляция оказалась более чувствительной, и скорость синтеза белка снижалась в этих же условиях на 37$. Однако, удаление зародышевой оси после начала её роста (после 20 часов набухания) приводило к снижению скорости синтеза РНК и белка в последующие 4 часа на 34$ и 44$ соответственно. Возможно, что с началом роста осевых органов их физиологическое воздействие на метаболизм в семядолях возрастает, но тем не менее нельзя исключить и возможность раневого эффекта.

Исследование времени появления новообразованных РНК в цитоплазме, их свойств и отношения к трансляционному аппарату, впервые проведенное в данной работе на запасающих тканях зародышей бобовых в начальный период прорастания, позволило выявить ряд новых фактов. Работа показала, что преобладающим типом новообразованной РНК в первые часы набухания является мРНК-подобная РНК, которая первой обнаруживается в цитоплазме, быстро связывается с полисомами и вовлекается в процесс трансляции. Непрерывное поступление новообразованной мРНК в полисомы отчетливо регистрируется в течение первых 24 часов прорастания. Одновременно с этим, в клетках семядолей гороха, несмотря на высокое содержание активных рибосом, происходит синтез рРНК и рибосомальных белков, новообразованные рибосомы обнаруживаются в полисомах и, следовательно, участвуют в процессе трансляции. Синтез рРНК заметно ускоряется после завершения гидратации зародыша.

Сравнение полученных нами данных с результатами исследования растущих частей зародыша показывает, что в отношении типа синтезируемой РНК в момент возобновления активного метаболизма между этими тканями зародыша также нет глубоких различий и несмотря на то, что клетки семядоли не подвергаются делению, в них, как и в клетках зародышевой оси, происходит синтез не только функционально активных мРНК, но и рРНК. Необходимость синтеза новых рибосом в клетках зародышевой оси, которым предстоит растягиваться или делиться, вполне объяснима и, очевидно, связана с необходимостью увеличить общий объем цитоплазмы. Причины же, побуждающие нерастущие клетки семядолей гороха активировать транскрипцию рибосомных генов при набухании зародыша еще предстоит выяснить. Интересно также узнать, обладают ли новые рибосомы какими-либо преимуществами перед старыми, и обязателен ли их синтез для развития метаболической активности в семядолях при прорастании. По всей видимости, программа для быстрого создания элементов аппарата трансляции заложена во всех тканях зародыша. Можно предположить, что синтез новых рибосом в семядолях есть проявление дополнительной адаптации зародыша, повышающей надежность возобновления активного метаболизма, необходимого для прорастания.

Исследование роли новообразованных мРНК в синтезе белка в семядолях на начальных этапах прорастания выявило значительную и все возрастающую по мере набухания зародыша зависимость трансляции от транскрипции. Аналогичная картина наблюдалась ранее в зародышах пшеницу (Cheung et al., 1979*, Caiers et al., 1979 ), редиса ( Delseny et al.,1977c ), куколя (Hecker et al., 1976; Hecker, Bernhardt, 1976 ), кукурузы (Sanchez de Yemenez et al.,1981), зародышевой оси фасоли (Walton, Soofi, 1969 ), эндосперма клещевины (Hoberts, Lord, 1979a,b ), семядолей нута (Matilla et al., 1982), Связан ли этот эффект со снижением субстратного уровня мРНК в клетке при набухании зародыша в присутствии ингибиторов транскрипции, или же со снижением содержания белковых факторов, кодируемых новообразованной мРНК и необходимых для трансляции, пока остается неизвестным. Некоторые данные, полученные на зародышах пшеницы, указывают на то, что субстратный уровень мРНК в клетках при набухании в присутствии об-аманитина не является лимитирующим фактором синтеза белков, и что в этих условиях наблюдается сокращение эффективности инициации трансляции, возможно,из-за дефицита специфического белкового фактора, необходимого для образования первой пептидной связи ( Cheung et al., 1979)»

Исследование возможной зависимости начальной транскрипции от трансляции показало, что синтез мРНК и рРНК в этот период регулируется некоординированно. Трансляция не является обязательным условием возобновления транскрипции и процессинга мРНК, но необходима для синтеза рРНК.

Таким образом, в результате исследования синтеза РНК in vivo в семядолях зрелых зародышей семян гороха получены новые данные о ключевых процессах метаболизма и характере их взаимодействия в запасающих тканях зародышей бобовых на начальных стадиях прорастания .

Практическая ценность полученных результатов усматривается в том, что они вносят определенный вклад в биохимическую характеристику процесса прорастания, способствуют пониманию последовательности молекулярных событий при прорастании и выяснению биохимических механизмов ухудшения качества семян при хранении, выражающееся в потере семенами силы и жизнеспособности.

Результаты проведенного исследования в определенной мере расширяют представления о метаболизме РНК и роли синтетических процессов в запасающих органах семян бобовых в начальный период прорастания и позволяют предполагать наличие ряда общих закономерностей в белково-нуклеиновом обмене у всех тканей зародыша, независимо от их способностей возобновлять ростовую активность при прорастании.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ахматова, Айгуль Токтосуновна, 1984 год

1. Айтхожин М.А. Рибонуклеиновые кислоты и биосинтез белка врастительных клетках. В кн.: Растительные белки и их биосинтез.-М.:Наука,1975, с.245-253.

2. Айтхожин М.А.,Искаков Б.К. Информосомы растений.-Алма-Ата;1. Наука,1982,с.182.

3. Гайцхоки B.C. Информационные РНК клеток животных.- М.:Медицина, 1980, сЛ99.

4. Гумилевская Н.А. Синтез белка в созревающих и прорастающихсеменах. В кн.:Растительные белки и их биосинтез.- М.: Наука,1975,с.195-220.

5. Гумилевская Н.А. ,Куваева Е.Б. ,Чумикина Л.В. ,Кретович В.Л.

6. Рибосомы сухих семян гороха. Биохимия,197I, т. 36, №2, с. 277-289.6. 1Умилевская Н.А.,Куваева Е.Б. ,Чумикина Л.В. ,Кретович В. Л.

7. Плавучая плотность рибосом и их субъединицы,выделенные из покоящихся семян гороха. Биохимия, 1972, т.37, № 3, с. 629-636.

8. Гумилевская Н.А. ,Чумикина Л.В. ,Куваева Е.Б. ,Кретович В.Л.

9. Выделение и характеристика субъединиц 80 s рибосом сухих семян гороха. Биохимия,1975,т.40,№1,с.175-186.

10. Джен Р.К.,Амен Р.Д. Что такое прорастание? В кн.: Физиология и биохимия покоя и прорастания.- М.:Колос,1982, с.19-46.

11. Дощанов X.И.,Айтхожин М.А. ,Дарканбаев Т.В. Синтез цитоплазматических РНК на ранних этапах прорастания зародышей пшеницы. -Физиология растений,1975,т. 22, №3,с.360-365.

12. Ю.Каримов Х.Х.,Донцова С.В. Цитоплазматические рибонуклеопроте- 132 идные частицы прорастающих семян хлопчатника,- Физиология растений, 1981 а,т. 28, № 5,с.1007-1011.

13. Каримов Х.Х. Донцова С.В. Информосомы в семенах хлопчатника.

14. Докл. АН Тадж.ССР, 1981 б,т.24,№ 2,с.123-125.

15. Каримов Х.Х.Донцова С. В.,Николаева М.И. Синтез РНК и цитоплазматических РНП-частиц при созревании семян хлопчатника. Физиология и биохимия культ, растений,1982, т.14, ЯП, с. 70-73.

16. Куваева Е.Б.,Кретович В.Л. Фитаза прорастающих семян гороха.

17. Физиология растений,1978,т.25,$2,с.366-372.

18. Куваева Е.Б.,Кретович В.Л. Влияние ингибиторов белкового инуклеинового обмена на биосинтез фитазы в семядолях гороха. Докл. АН СССР, 1979, T.245,Jfc I,с.257-260.

19. Куваева Е.Б. ,1^милевская Н.А. ,Чумикина Л.В. ,Кретович В. Л.

20. Изучение синтеза белка в семядолях семян гороха при прорастании.- В сб.: Физиолого-биохимические проблемы семеноведения и семеноводства.Иркутск,Сибирское отделение АН СССР, часть 2,1973,с.46-51.

21. Осборн Д.Д. Нуклеиновые кислоты и прорастание семян. В кн.:

22. Физиология и биохимия покоя и прорастания семян.- М.:Колос, 1982,с. 357-372.

23. Скаженник М.А. Синтез белков в семядолях семян гороха при прорастании.-Дисс. канд. биол. наук. М.,1982,с.141.

24. Скаженник М.А.,£умилевская Н.А.,Куваева Е.Б.,Кретович В.Л.

25. Электрофоретический анализ компонентного состава суммарного белка семядолей семян гороха. Прикл. биохим. и микробиол.,1981а,Т.17,вып.6,с.918-926.

26. Скаженник М.А.,Куваева Е.Б.,1^милевская Н.А. Полипептиды,синтезированные in vivo в семядолях гороха на ранних стадиях прорастания. Материалы Всесоюзного Симпозиума "Механизмы усвоения азота и биосинтез белка в растениях". Алма-Ата,I98I6,с.106.

27. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарногоколичества нуклеиновых кислот.-Биохимия,1958,т. 23, вып.5, с.656-662.

28. Спирин А.С. 0 маскированной форме мРНК.- Журнал эволюц.биохим. физиол.,1966,т.2, #4,с.285-292.

29. Сытник К.М. ,Мусатенко Л.И. ,Пушкарев В.М.,Нестерова Л.И.,

30. Галкин А.П. Об изменении синтеза различных классов РНК в органах зародышевой оси на ранних этапах прорастания семян фасоли,- Докл. АН Укр.ССР,1982,,Б.,с.73-75.

31. Чумикина Л.В. Рибосомы семян гороха. Дисс.канд.биол.наук.- М.,1974,149 с.

32. Чумикина Л.В.,Кретович В.Л. Рибосомы семядолей гороха.

33. В кн.: Растительные белки и их биосинтез.-М.:Наука, 1975,с.250-257.

34. Эзау К. Анатомия семенных растений.- М.,1980,том 2,558 с.

35. Abdul-Baki,A.A. Metabolism of barley seed during earlyhours of germination.- Plant Physiol.,1969,vol.44,N 5, p.733-738.

36. Ajtkhozhin,M.A.,Akhanov,A. Release of mRHA-particles ofthe Lnformosome-like type from polyribosomes of higher v plant embryos.-FEBS Letters,1974,vol.41,N2,p.275-279.

37. Aspart,L.,Cooke,R,,Delseny,M. Stability of polyadenylicand polyadenylated RITA in radish seedlings.-Biochim.et Biophys.Acta,1979,vol.564,N1,p.43-54.

38. Aspart,L.,Cooke,R.,Delseny,M,,Guitton,J. Effect of theprotein synthesis initiation inhibitor 2-(4-methyl-2,6-dinitro anilino-7-N-(methylpropionamide) on ribonucleicsynthesis to radish seedling.-Biochem.J.,v1978, vol.171,N3,p.607-611.

39. Bain,J,M,,Mercer,F.V, Subcellular organization of the cotyledons in germinating seeds and seedlings of Pisum sativum L.- Austral,J.Biol.Sci.,1966a,vol.19,N1,p.69-84.

40. Bain,J.M.,Mercer,F.V, Subcellular organization of thedeveloping cotyledons of Pisum sativum L,-Austral,J, Biol.Sci,,1966b,vol.19, ,p.49-68.

41. Bain,J.M,,Mercer,F.V. The relationship of the axis andthe cotyledons in germinating seeds and seedlings of Pisum sativum L.-Austral.J.Biol.Sci.,1966c,vol.19,N1, p.85-96,

42. Barker,G,R,,Bray,C.M, Nucleic acid and protein synthesis- 135 in germinating seeds.-Symp.Biol.Hung,,1973,vol.13,p.75.

43. Barker,G.R.,Hollenshead,J.A. The degradation of ribonucleic acid in cotyledons of Pisum arvense.-Biochem.J., 1967,vol.103,N1,p.230-237.

44. Barker,G.R.,Rieber,M, The development of polysomes in theseed of Pisum arvense.-Biochem.J.,1967,vol.105,N3,P.1195-1201.

45. Barker,G.R.,Bray,C.M.,Detlepsen,M. An examination of theevidence for stable messenger ribonucleic acid in seed.-Biochem.J.,1971,vol.124,N2,p.5p.

46. Barker,G.R.,Bray,C.M,Walter,T.Y. The development of ribonuclease and acid phosphatase during germination of Pisum arvense.-Biochem.J.,1974,vol.142,N2,p.211-213.

47. Beevers,L. ,Splittstoesser,V/.E. Protein and nucleic acidmetabolism^ in germinating peas.-J.Exp.Bot.,1968,vol.19, N61,p.648-711.

48. Bhat,S.P.,Padayatty,J.D. Presence of conserved messenger

49. RHA in rice embryo.-Ind.J.Biochem.Biophys.,1974,vol.11, N1,p.47-50.germination

50. Bhat,S.P.,Padayatty,J.D. Transcriptional events duringof rice embryos.-Nature,1975,vol.256,N5514,p.227-228.

51. Bewley,J.D. Protein and nucleic acid synthesis duringseed germination and early seedling growth.-Encyclopedia- 136 of Plant Physiol.Hew ser.,1982,vol.14a,p.559-591.

52. Bewley,J.D.,Black,M. Physiology and biochemistry of seed in relation to germination. 1.Developmenttermination and growth.-Heidelberg-New YorksSpringer-Verlag,1978, 306 p.

53. Bewley,J.D.,Larsen,K.M. Endosperm and embryos of maturedry castor bean seeds contain active ribosomes.-Phyto-chemistry, 1979, vol. 18,1110, p. 1617-1619.

54. Blowers,L.E.,Stormouth,D.A.,Bray,C.M. Nucleic acid andprotein synthesis and loss of vigour in germinating wheat embryos.-Planta,1980,vol.150,N1,p.19-25.

55. Bramhall,S.,Noack,N.,Wu,M.,Loewenberg,J.R. A simple colorimetric method for determination of protein.-Analyt. Biochem.,1969,vol.31,N1-3,p.146-148.

56. Brawerman,G.,Mendecki,J.,Lee,S.Y. A proced re for the isolation of mammalian messenger ribonucleic acid.-Biochemistry, 1972, vol. 11,N4,p.637-641.

57. Bray,C.M.Nucleic acid and protein synthesis in the embryoof germinating cereals.-Recent advances in the biochemistry of cereals.New York-London:Academic Press,1979, p.147-173.

58. Bray,С.M.,Chow,T.-Y. Lesions in post-ribosomal supernatant fractions associated with loss of viability in pea seed (Pisum sativum).-Biochim. et Biophys.Acta, 1976,vol.442,N1,p.1-13.

59. Bray,C.M.,Dasgupta,Je Ribonucleic acid synthesis and lossof viability in pea seed.-Planta,1976,vol.132,N1,p.103-108.- 137

60. Brimlage,W.J.,Leopold,A.C.,Parrish,D.J. Chilling stressto soybean during imbibition.-Plant Physiol.,1978, vol.61,N4,p.525-529.

61. Brocklehurst,P.A.,Fraser,R.S.S. Ribosomal RNA integrityand rate of seed germination.-Planta,1980,vol.148,N5, p.417-421.

62. Brooker,J.D.,Cheung,C.P.,Marcus,A. Protein synthesis andseed germination.-Ini The physiology and biochemistry of seed dormancy and germination,1977,p.347-356.

63. Brooker,J.D.,Tomaszewski,M.,Marcus,A. Preformed messenger HNAs and early wheat embryo germination.-Plant Physiol. ,1978, vol. 61,111, p. 145-149.

64. Bryant,J.A.,Haczycki,S.J. Studies on the interactionbetween the embryonic axis and the cotyledons during germination in Pisum sativum L.:the influence of incubation condition.-New Phytol.,1976,vol.77,N3,p.757-760.

65. Bryant, J.A. ,Greenway,S.C. ,West,I.A. Development of nuclease activity in cotyledons of Pisum sativum L.-Planta,1976,vol.130,N2,p.137-140.

66. Caers,L.I.,Peumans,W.J.,Carlier,A.R. Preformed and newly synthesized messenger RNA in germinating wheat embryos.-Planta, 1979,vol.144,N5 ,p.491-496.

67. Carlier,A.R.,Manickam,A.,Peumans,W.J. Characterizationof maturation-specific mRNA in dry mung bean embryonic axis.-Planta,1980,vol.149,N3,p.227-233.

68. Carlier,A.R.,Peumans,W.J. The rye embryo system as analternative to the wheat system for protein synthesis- 138 in vitro.-Biochim.et Biophys.Acta,1976,vol.447,N4, p.436-444.

69. Chakravorty,A.K. Ribosomal RNA synthesis in the germinating black eye pea (Vigna unguiculata).-Biochim.et Biophys.Acta,1969,vol.179,N1,p.67-95.

70. Chapman, J.A. ,Rieber,M. Distribution of ribisimes indormant and imbibed seeds of Pisum arvense:electron-microscopic observations.-Biochem.J.,1967,vol.105, N3,p.1201-1202.

71. Chen,D.,Sarid,S.,Katchalski,E. Studies on nature ofmessenger RITA in germinating wheat embryos.-Proc.Nat. Acad.Sci.USA,1968,vol.60,F7,p.902-909.

72. Cherry,J.H. Nucleic acid changes in the storage tissueof seeds during germination.-Biochi,Bet Biophys.Acta, 1963,vol.68,N2,p.193-198.

73. Chin,T.Y.,Poulson,R.,Beevers,L. The influence of axis removal on the protein metabolism in cotyledons of Pisum sativum L.-Plant Physiol.,1972,vol.49,N4,p.482-489.

74. Chrispeels,M.J.,Jones,R.L. The role of the endoplas- 139 mic reticulum in the mobilization of reserve mac-romolecules during seedling growth.-Israel J. Bot.,1980-81,vol.29,n1-4,p.225-245.

75. Chroloczek,H.,Cherry,J.H. Production of mEUA duringseed germination.-Biochem.Biophys.Res.Commun.,1965, vol.20,N6,p.774-777.

76. Cuming,A.C.,Lane,B.G. Wheat embryos ribonucleates.

77. Xl.Conserved mRHA in dry wheat embryo and its relation to protein synthesis during early imbibition.-Can.J.Biochem.,1978,vol.56,N6,p.365-369.

78. Cuming,A.C,,Lane,B.G. Protein synthesis in imbibingwheat embryos.-Eur.J.Biochem.,1979,vol.99,N2,p.217-224.

79. Dasgupta,J,,Bewley,J.D. Desiccation of axes of Phaseolus vulgaris during development is, a swich from a development pattern of protein synthesis to a germination pattern.-Plant Physiol.,1982, vol.70,N4,p.1224-1227.

80. Datta,K.,Marsh,L,,Marcus,A. Early growth of wheatembryonic axes and the synthesis of RUA and DNA.-Plant Physiol.,1983,vol.72,N2,p.394-397.

81. Davies,E. , Latbkins, B.A. ,Knight ,R.H. Polyribosomes from peas.An improved method for their isolation in the absence of ribonuclease inhibitor.-Plant Physiol. ,1972,vol.50,П5,p.581-584.

82. Delseny,M.,Peralta,M.P.,Guitton,Y. Effects of cordy-cepin on RNA metabolism in germinating seedlings.-Biochem.Biophys.Res.Commun.,1975,vol.64,N4,p.1278-1285.- но

83. Delseny,M.,Aspart,L.,Got,A.,Cooke,R.,Guitton,Y. Early synthesis of polyadenylated and ribosomal nucleic acids in germinating radish embryo axes.-Physiol.Veget.,1977a,vol.15,N4, p.415-430.

84. Delseny,M.,Aspart,L.,Guitton,Y. Effect of the protein synthesis inhibitor cycloheximide on RNA synthesis in radish seedlings .-Biochemistry,1977b,vol.59,N1,p.51-57.

85. Delseny,M.,Aspart,L.,Guitton,Y. Disappearance of stored polyadenylic acid and mRNA during early germination of radish (Raphanus sativus L.) embryo axes.-Planta,1977c,vol.135, N2,p.125-128.

86. Delseny,M.,Aspart,Ь.,Cooke,R. Studies on ribonucleic acidduring radish seed germination a search for potential regulatory mechanisms.-Israel J.Bot.,1980-1981,vol.29,N1-4,p. p.246-258.

87. Dobrzanska,M.,Tomaszewski,M.,Grzelczak,Z.,Rejman,E.,Buchowicz,

88. J. Cascade activation of genome transcription in wheat.-Nature, 1973, vol. 244, N5417 , p. 507-509.

89. Dobrzanska,M.,Tomaszewski,M.,Buchowicz,J. Oligo(U) and poly(U)containing RNA of wheat embryo.-Biochim.et Biophys.Acta,1980,vol.609,N3,p.425-434.

90. Dommes,J.,Van de Walle,C.Newly synthesized mRNA is translated during the initial imbibition of germination maize embryo.-Plant Physiol,,1983,vol.72,N2,p.484-487.

91. Duke,S.H.,Kakefuda,G. Role of the testa in preventing cellular rupture during imbibition of legume seeds.-Plant Physiol.,1981,vol.67,N3,p.449-456.

92. Dure,L. Seed formation.-Ann.Rev. Plant Physiol.,1975,vol.26,p.259-278.- 141

93. Dure,b.S. III.Storage messe: lger RNA and seed germination.1.: The physiology and biochemistry of seed dormancy and germination.Amsterdam:North Holland Publish,Corp.,1977, p.321-335.

94. Dure,b,S,III. Role of stored messenger RNA in late embryodevelopment and germination,-In: The plant seeddevelopment, preservation and germination, Proc,Symp,Univer,Minnesota, Academic Press,1979,p.113-128.

95. Dure,L,S,,Waters,L, Long-lived messenger RNA:evidence fromcotton seed germ nation,-Science,1965,vol.147,N3656,p,410-412.

96. Fabisz-Kijowska,A.,Dullum,P.,Walerych,W. Isolation and purification of RNA polymerase from rye embryo.-Biochim,et Bio-phys.Acta,1975,vol.390,N1,p.105-116.

97. Ferrer,A.,Delseny,M.,Guitton,Y. Isolation and characterization of sub-ribosomal RNP-particles from radish seed and seedlings.-Plant Sci.betters,1979,vol.14,N1,p.31-42.

98. Fujasawa,H. Role nucleic acid and protein metabolism in theinitiation of growth at germination.-Plant Cell Physiol., 1966,vol.7,N2,p.185-197.

99. Fukuei,K.,Yakura,K.,Tanifuji,S. Non-coordinated histone synthesis with DNA replication and close temporal association of ribosomal protein and rRNA synthesis in germinating Vicia faba embryo.-Biochi et Biophys.Acta,1978,vol.518,N2,p.390-400.

100. Fukuei,K.,Sakamaki,T.,Takahashi,N.,Tanifuji,S. Stability ofrRNA genes during germination of Vicia faba seeds.-Plant Cell Physiol.,1975,vol.16,N3,p.387-394.- 142

101. Fukuei,K.,Sakamaki,Т.,Takahashi,N.,Takaiwa,P.,Tanifuji,S.

102. RNA synthesis required for DNA replication in Vicia faba seed embryos.-Plant Cell Physiol.,1977,vol.18,N1,p.173-180.

103. Galau,G.A.,Dure,L.S.III.RNA complexity during seed formationand germination.-Israel J. Bot.,1980-1981,vol.29,N1-4,p.281-292.

104. Gebauer,H.U.,Seitz,U.,Seitz,U. Transport and processing ofribosomal RNA on plant cells after treatment with cyclohexi-mide.-Z.Naturforsch.,1975,band 30c,h.2,s.213-215.

105. Gillard,D.F.,Walton,D.C. Germination of Phaseolus vulgaris. IV.Patterns of protein synthesis in excised axes.-Plant Physiol. ,1973,vol.51 ,N6,p.1147-1149.

106. Goldberg,I.H.,Friedman,P.A. Antibiotics and nucleic acids.-Ann.Rev.Biochem.,1971,vol.40,p.775-810.

107. Gordon,M.E.,Payne,P.J. In vitro translation of the long-lived messenger ribonucleic acid of dry seeds. Planta,1976, vol.130,N3,p.269-273.

108. Gordon,M.E.,Payne,P.I. In vitro translation of poly(A)rich RITA from dry and imbibing seeds of rape.-In:The translation of natural and synthetic polynucleotides.Poznan,1977,p.228-231.

109. Gross,K. J. ,Pogo,A.0. Control of RITA synthesis in eucaryotes.

110. The effect of protein synthesis on the activities of nuclear and total DNA-dependent RITA polymerase in yeast,-Bio-chemistry, 1976a,vol.15,N10,p.2070-2081.

111. Gross,K.J.,Pogo,A.O. Control of RNA synthesis in eucaryotes.

112. The effect of cycloheximide and edeine on RNA synthesis in yeast.-Biochemistry,1976b,vol,15,N10,p.2082-2086.- 143

113. Grzelczak,Z.F. ,Sattolo,M.Hf ,Hanley-Bowdoin,L.K. ,Kennedy,T.D., Lane,B.G. Synthesis and turnover of proteins and mRNA in germinating wheat embryos.-Can.J.Biochem.,1982,vol.60,N3»p.389-397.

114. Grzelczak,Z.F.,Lane,B.G. The growth-related 28-kilodalton protein in germinating wheat. Use of peptide mapping to identify cryptic forms in cell-free extracts and protein synthe-zing systems.-Can.J.Biochem.,1983,vol.61,N11,p.1233-1243.

115. Gumilevskaya,N.A.,Alechina,S.K.,Chumikina,L.V.,Kretovich,W.L. The early RUA and protein synthesis in pea cotyledons during germination.-Proc.Inter.Conf.:Regulation of developmental processes in plants.Halle,1978,p.115.

116. Gumilevskaya,N.A.,Skazhennic,M.A.,Akhmatova,A.T.,Chumikina, L.V.,Kuvaeva,E.B.,Kretovich,W.L. Distinctive characteristics of RHA and protein synthesis in pea cotyledons at early stages of germination,-Biol.Plantarum,1982,vol.24,N5,p.363-373.

117. Haffher,M.H.,Chin,M.B.,Lane,B.G. Wheat embryo ribonucleates. XII.Formal characterization of terminal and penultimate nucleoside residues at the 5'ends of "capped" RITA from imbibing wheat embryos.-Can.J.Biochem.,1978,vol.56,N7,p.729-733.

118. Hall,T.C. Plant messenger RUA.-In:Nucleic acid in plants, 1980,vol.1,p.217-251.- 144

119. Hamnett,J.R.,Katterman,F.R. Storage and metabolism of poly-(adenylic)-mRNA in germinating cotton seeds.-Biochemistry,1975,vol.14,N20,p.4375-4379.

120. Hardy,S.J.S.,Kurland,C.G.,Vojnow,P.,Mora,G. The ribosomal proteins of Escherichia coli. I.Purification of the 30S prot eins.-Biochemistry,1969,vol.8,N7,p.2897-2 901.

121. Harris,N.,Chrispeels,M. Endoplasmic reticulum of mung bean соtуle dons.-Plant a,1980,vo1.148,N3,p.2 92-303.

122. Hecker,Ш.,Bernhardt,D. Proteinbiosynthesen in dormanten und nachgereiften Embryonen und Samen von Agrostemma githago.-Phytochemistry,1976,vol.15,N7,p.1105-1110.

123. Hecker,M.,Wiedmann,M.,Kohler,H.K.,Serfling,E. Studies on early RNA and protein synthesis in imbibing embryos of

124. Agrostemma githago.-Biochem.Physiol.Pflanzen.,1976, vol.169,N5,p.427-436.

125. Hecker,M.,Kohler,K.H.,Wiedmann,M. Reactivation of ribonucleic acid synthesis during early germination of Agrostemma githa-go embryos.-Biochem.Physiol.Pflanzen.,1977,vol.171,N5,p.401408.

126. Hemshaw,E.C.,Messemger RNA in rat liver polyribosomes:evidence that it ex sts as r bonucleoprotein particles.-J.Molec.Biol.,1968,vol.36,N3,p.401-406.

127. Hewish,D.R.,Wheldrake,J.F.,Wells,J.R.E. Incorporation of ■^2P into ribosomal RNA,transfer RNA and inositol hexaphos-.phate in germinating pea cotyledons.-Biochim.et Biophys. Acta,1971,vol.228,N2,p.509-514.

128. Huang,B.F.,Roaway,S.J.,Wood,A.,Marcus,A. RNA synthesis in germinating embryonic axes of soybean and wheat.-Plant

129. Physiol.,1980,vol.65,N6,p.1155-1159.- 145

130. Ingle,J.,Sinclair,J. Ribosomal genes and plant development.-Nature,1972,vol.235,N5332,p.30-32.

131. Jacob,K.M.,Bovey,F. Early nucleic acid and protein synthesis and mitosis in the primary root tips of germinating Vicia faba.-Exp.Cell Res.,1969,vol.54,N1,p.118-126.

132. Jackson,M.,Ingle,J. The interpretation of studies on rapidly labeled RNA in higher plants.-Plant Physiol.,1973,vol. 51, N2,p.412-416.

133. Jendrisak,J. The use of об-amanitin to inhibit in vivo RNA synthesis and germination in wheat embryos,-J.Biol. Chem.,1980a,vol.255,N18,p.852 9-8533.

134. Jendrisak,J. Purification,structure and functions of the nuclear RNA polymerases from higher plants.-In:Genome organozation and expression in plants.N.-Y.:Plenum Press Publish Corp.,1980b,p.77-93.

135. Kaltschmidt,E.,Wittmann,H.G. Ribosomal proteins.XXXII.Comparison of several extraction methods for proteins from Escherichia coli ribosomes.-Biochimie,1972,vol.54,N2,1. P. 165-176.

136. Kato,A.,Fukuei,K.,Tanifuji,S. Histone synthesis during the early stages of germination in Vi ia faba embryonic axes.-Plant Cell Physiol.,1982,vol.23,N6,p.967-976.

137. Key,J. Effect of purine and pyrimidine analogues on growth and RNA metabolism on the soybean hypocotyl selective action of 5-flourouracil.-Plant Physiol.,1966,vol.41,fi8, p.1257-1264.

138. Klein,S.,Barenholz,H.,Budnik,A. The initiation of growth in isolated lima bean axes.Physiological and fine structu- 146 ral effects of AcD,CH and Chloramphenicol.-Plant Cell Physiol., 1971,vol.12,N1,p.41-60.

139. Laemmli,U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.-Nature,1970,vol.227, N15,p.680-685.

140. Larson,L.A. The effect soaking pea seeds with or without seed-coats hason on seedling.—Plant Physiol.1968,vol.43,N2,p.255-259.

141. Latham,H.,Darnell,J.Б. Entrance of mRNA into HeLa cells cytoplasm in puromycinvtreated cells. J.lfoiec.Biol., 1965, vol.14, N 1, p.13-22.

142. Leopold,A.C. Temperature effects on soybean imbibition and leakage.-Plant Physiol.,1980,vol.65,N6,p.1096-1098.

143. Liever,C.J. Ribosomal RNA of plants.-In:Nucleic acid in plants. 1980,vol.1,p.193-215.

144. Lowry,0.H.,Rosenbrough,N.J.,Farr,A.L.,Randall,R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent.-J.Biol.Chem., 1951,vol.193,H1,p.265-275.

145. Maden,B.E.H.,Vaughan,M.H.,Warner,J.R.,Darnell,J.E. Effect of valine deprivation on ribosome formation in HeLa cells.-J.Molec.Biol.,1969,vol.45,N2,p.265-275.

146. Maizel,J.V. Polyacrylamide gel electrophoresis of viral proteins. -Methods in Virology,1971,vol.5,p.179-246.

147. Mandal,N.C.,Biswas,B.B. Metabolism of inositol phosphate. I.Phytase synthesis during germination in cotyledons of mung beans Phaseolus aureus.-Plant Physiol.,1970,vol.45,N1, p.4-9.

148. Manickam,A.,Carlier,A.R. Isolation and function of low mole- 147 cular weight protein of rating bean embryonic axes .-Plant a, 1980,vol.149,N2,p.234-240.

149. Mans,R.J.,Novelli,G.D. Measurement of the incorporation of radioactive amino acids into protein by a filter-paper disk method.-Arch.Biochem.and Biophys. ,1961 ,vol.94,N1,p.48-53.

150. Marcus,A. Seed germination and the capacity for protein synthesis.-Soc.Exp.Biol.Symp. , 1969,vol.23,N1 ,p.143-160.

151. Marcus,A.,Peeley,J. Activation of protein synthesis in the imbibition phase seed germination.-Proc.Nat.Acad.Sci.USA,1964, vol.51,П6,p.1075-1079.

152. Marcus,A.,Feeley,J. Protein synthesis in imbibed seeds.1..Polysome formation during imbibition.-J.Biol.Ghem.,1965, vol.240,N4,p.1675-1680,

153. Marcus,A,,Feeley,J. Ribosome activation and polysome formation in vitro: requirement for ATP.-Proc.Hat.Acad.Sci.USA, 1966,vol.56,N10,p.1770-1777.

154. Marcus,A,,Feeley,J.,Volcani,T. Protein synthesis in imbibed seeds.III.Kinetics of amino acid incorporation,ribosome activation and polysome formation.-Plant Physiol.,1966,vol. 41,N7,p.1167-1172.

155. Marcus,A.,Weeks,D.P.,Seel,S.N. Protein chain initiation in wheat embryo.-Biochem.Soc.Symp.,1973,vol.38,Np.97-109.

156. Matilla,A.,Nicolas,G.,Vicente,0.,Sierra,J.M. Preformed . mRNA in cotyledons of ungerminated seeds of Cicer arietinum L.-Plant Physiol.,1980,vol.65,N6,p.1128-1132.

157. Matilia,A.,Nicolas,G.,Sierra,J.M. Changes in messenger RNA in Cicer arietinum L. cotyledons seeds during germination,-Plant Sci.Letters,1982,vol.25,N2,p.209-217.

158. Millerd, A., Biochemistry of legume seed proteins.-Ann. Re v. Plant Physiol.,1975,vol.26,p.53-72.

159. Mory,Y.,Chen,D.,Sarid,S. Onset of deoxyribonucleic acid synthesis in germinating wheat embryos.-Plant Physiol.,1972,vol. 49,N1,p.20-23.

160. Могу,Y.,Chen,D.,Sarid,S. De novo synthesis of DNA polymerase during wheat embryo germination.-Plant Physiol.,1975,vol.55, N3,P.437-442.

161. Mori,Т., Matsushita,S, Isolation of ribonucleic acids having template activities from particulate components of soybean seeds.-Agric.Biol.Chem.,1970,vol.34,N7,p.1004-1008.

162. Mori,T.,Yokoyama,Z. Ribonucleic acids with messenger activities in the cotyledons of soybean seeds.-Agric.Biol.Chem., 1975,vol.39,U4,p.785-790,

163. Mori,T.,Wakabayashi,Y.,Takagi,S. Occurrence of mRNA for storage proteins in dry soybean seeds.-J.Bioche, ,1978,vol.84,1. U5,p.1 ЮЗ-1111.

164. Nawa,Y.,Asahi,T. Rapid development of mitochondria in pea cotyledons during the early stage of germination.-Plant Physiol., 1971,vol.48,116,p.671-674.

165. Nawa,Y.,Asahi,T. Effect of cycloheximide on development of mitochondria in germinating pea cotyledons.-Agric.Biol.Chem., 1973,vol.37,N4,p.937-941.

166. Neumann,J. The effect of actinomycin D on lettuce seedlings and its differential uptake by roots and shoots.-Physiol. Plantarum,1964,vol.17,N2,p.363-370.

167. Payne,P.I. The long-lived messenger ribonucleic acid of flowering plant seeds.-Biol.Rev.,1976,vol.51,N3,P.329-363.

168. Payne,P.I. Synthesis of poly(A)rich RNA in embryo of rye during imbibition and early germination.-Phytochemistry,1977, vol.16,N4,p.431-434.

169. Payne,J.T.,BalfA.K. DNA polymerase activity in embryos of Alliumcepa seeds.-Phytochemistry,1973,vol.12,N11,p.2613-2616.

170. Payne,P.I.,Boulter,D. Free and membrane bound ribosomes of the cotyledons of Vicia faba L. II.Seed germination.-Planta, 1969,vol.87,N1,p.63-68.

171. Payne,P.I.,Gordon,M.E.,Barlow,P.,Parker,M.L. The subcellular localisation of the long-lived messenger RNA of rape seeds.-InsTranslation of natural and synthetic polynucleotides. Poznan,Publ.Poznan Agric.Univ.,1977a,p.386-391.

172. Payne,P.I.,Gordon,M.E.,Dobrzanska,M.,Parker,M.L.,Barlow,P.W. The long-lived messenger RNA of dry seeds:evidence for its existance,intracellular location and role in germination. -Colloq.Inter.CNRS,1977b,vol.261,p.487-499.

173. Payne,P.I.,Dobrzanska,M.,Barlow,P.W.,Gordon,M.E. The synthe- 150 sis of RNA in imbibing seed of rape (Brassica napus) prior to the onset of germination a biochemical and cytological study,-J.Exp.Bot.,1978,vol.29,N108,p.77-88.

174. Penman,S.,Vesco,C.,Penman,M. Localization and kinetics of formation of nuclear heterodisperse RNA,cytoplasmic hetero-disperse RNA and polyribosome-associated messenger RNA in Hela cells.-J.Molec.Biol.,1968,vol.34,N1,p.49-69.

175. Perry,D.A.,Harrison,J.G. The deleterious effects of water and low temperature on germination of pea seed.-J.Exp.Bot., 1970,vol.21,N67,p.504-512.

176. Perry,R.P.,Kelly,D,E, Messenger RNA-protein complex and newly synthesized ribosomal subunitsianalysis of free particles and components of polyribosomes.-J.Molec.Biol.,1968,vol.35, N1,p.37-59.

177. Perry,R.P.,Kelly,D.E. Inhibition of RHA synthesis by actino-mycin D:Characteristic dose-response of different RNA species.-J.Cell Physiol.,1970,vol.76,N2,p.127-140.

178. Peuman^W,J,,Carlier,A,R, Messenger ribonucleoprotein particles in dry wheat and rye embryos.-Planta,1977,vol.136,N3,p.195-201.

179. PeumansW.J.,Carlier,A.R.,Caers,L.J. Sedimentation properties of preformed messenger particles in dry rye embryo extracts,-Planta,1978,vol.140,N2,p.171-176.

180. PeumansW,J,,Caers,L,J,,Carlier,A,R, Some aspects of the synthesis long-lived messenger ribonucleoproteins in developing rye embryos.-Planta,197 9,vol.144,N5,p.485-490.

181. Peumans,W.J.,Delaey,B.M.,Manickam,A.,Carlier,A.R. Efficient translation of long-lived messenger in extracts from dry- 151 pea primary axes.-Planta, 1980a,vol. 150,N4,p.286-290.

182. Peumans,W.J.,Carlier,A.R.,Delaey,B. Preparation and characterization of a highly active cell-free protein-synthesizing system from dry pea primary axes.-Plant Physiol.,1980b,vol. 66,N4,p.584-590.

183. Peumans,W.J.,Delaey,B.M.,Carlier,A.R. Translation and characterization of long-lived messengers from dry pea primary axes.-Biochem.Physiol.Pflanzen,1981,vol.176,N2,p.129-138.

184. Pollock,B.M.,Toole,V,K. Imbibition period as the critical temperature sensitive stage in germination of lima bean seeds.-Plant Physiol.,1966,vol.41,N2,p.221-229.

185. Powell,A.A.,Matthews,S.S. The damagin effect of water on dry pea embryos during imbibition.-J.Exp.Bot.,1978,vol.29, N112,p.1215-1229.

186. Reger,B.J. The effects of cordycepin on early germination events of common purslen seeds.-Plant Physiol.,1975,vol.56, suppl.85.

187. Roberts,L.M.,Lord,J.M. Developmental changes in the activity of messenger RNA isolated from germinating castor bean endosperm. -Plant Physiol.,1979a,vol.64,N4,p.630-634.

188. Roberts,L.M.,Lord,J.M. Ribonucleic acid synthesis in germinating castor bean endosperm.-J.Exp.Bot.,1979b,vol.30,N117, p.739-749.

189. Robinson,N.E.,Bryant,J.A. Onset of nucleic acid synthesis during germination of Pisum sativum L.-Planta,1975$,vol.127, N1,p.63-68.

190. Robinson,N.E.,Bryant,J.A, Development of chromatin-bound and soluble DNA polymerase activities during germination- 152 of Pisum sativum L.-Planta,1975b,vol.127,H1,p.69-75.

191. Rose,C.,Coddington,R.L.,Murray,M.G.,Bledshoe,C. Pyrimidine metabolism in cotyledons of germinating Alaska peas,-Plant Physiol., 1971, vol. 47,111,p.71-74.

192. Sanchez de Jemenez,Aguilar,R.,Lopez,S, Distinctive characteristics of protein synthesis in maize embryos during the early etages of germination.-Biochem.and Biophys.Res. Commun., 1981,vol.99,Ш,p.445-450.

193. Schaffner,W.,Weissmann,C. A rapid sensitive and specific method for the determination of protein in dilute solution. -Anal. Biochem., 1973, vol.56, N 3, p.502-514.

194. Schultz,G.A.,Chen,D.,Katchalski,E. Localization of a messenger RHA in ribosomal fraction from ungerminated wheat embryos.-. . Mole c. Biol., . . 1972,vol.66,Ю,p.379-390.

195. Sen,S.,Payne,P.I.,Osborne,D.J. Early ribonucleic acid synthesis during the germination of rye (Secale cereale) embryosand the relationship to early protein synthesis.-Biochem.J., 1975, vol. 148, Ю, p. 381-387.

196. Sieliwanowicz,B. The effect of cordycepin on the formation of pea embryo axes polysomes.-Bull.Acad.Pol.Biol.Sci.,1980, vol.28,N4,p.209-214.

197. Simon,E.W. Phospholipids and plant membrane permeability.-Hew Phytolog, ,1974,vol,73,Ю,p.377-420.

198. Smith,H. Phytochrome-mediated assembly of polyribosomes in etiolated bean leaves.-Eur.J.Biochem.,1976,vol.65,N1,р.1б1-170.

199. Smith,C.A.D.,Bray,C.M. Intracellular levels of polyadnylated RNA and loss of viger in germinating wheat embryos.-Planta,- 153 -1982,vol.156,N5,P.413-418.

200. Sopory,S.K.,Puri-Avinashi,M.,Deka,N.,Datta,A. Early protein synthesis during germination of barley embryos and its relationship to ETTA synthesis.-Plant Cell Physiol., 1980, vol.21,N4,p.649-657.

201. Spiegel,S.,Marcus,A. Polyribosome formation in early wheat embryo germination independent of either transcription or polyadenylat ion.-Nature,1975,vol.2 5 6,N5 514,Р.228-230.

202. Spiegel,S.,0bendorf,R.,Marcus,A. Transcription of ribosomal and messenger RNAs in early wheat embryo germination.-Plant Physiol.,1975,vol.56,N4,p.502-507.

203. Studier,F,W. Analysis of bacteriophage T4 early RNAs and proteins on slab gels.-J.Molec.Biol.,1973,vol.79,N2,p.237-248.

204. Takahashi,N.,Takaiwa,F.,Fukuei,K.Sakamaki,T.,Tanifuji,S. Appearance of newly formed mRNA and rRNA as ribonucleopro-tein-particles in the cytoplasmic subribosomal fractionof pea embryos.-Plant Cell Physiol.,1977,vol.18,N2,p.235-246.

205. Takaiwa,F.,Tanifuji,S. RNA synthesis in embryo axes of germinating pea seeds.-Plant Cell Physiol.,1979a,vol.20, N5,p,875-884.

206. Takaiwa,F.,Tanifuji,S. Relationship between translation control and reduced polyadenylation of mRNA in elongated roots of pea seedling.-Plant Cell Physiol.,1979b,vol.20, N5,p.885-897.

207. Tanifuji,S.,Asamizu,T.,Sakaguchi,K. DNA-like RNA synthesized in pea embryos at very early stage of germination.-Bot.Mag,- 154

208. Tokyo,1969,vol.82,N1,p.56-68.

209. Tanifuji,S.,Higo,M.,Shimada,T,,Higo,S. High molecular weight RNA synthesized in nucleoli of higher plants.-Biochim. et Biophys.Acta,1970,vol.217,N3,p.418-425.

210. Tao Kao-ling,Khan,A. Differential effects of actinomycin D and cordycepin in lettuce seed germination and RNA synthesis.-Plant Physiol.,1976,vol.58,N6,p.769-772.

211. Thompson,E.W.,Lane,B.G. Relation of protein synthesis in imbibing wheat embryos to the cell free translatfonal capacities of balk mRNA from dry and imbibing embryos.-J.Biol.Chem., 1980,vol.255,N12,p.5965-5970,

212. Walbot,V. RNA-metabolism during embryo development and germination of Phaseolus vulgaris.-Develop. Biol.,1971,vol.26, N4,P.369-379.

213. Walbot,V. Role of RNA synthesis and tRNA end-labeling during early germination of Phaseolus.-Planta,1972,vol.108,N2,p.161-171.

214. Walton,D.С. Germ nation of Phaseolus vulgaris. I.Resumption of axes growth.-Plant Physiol.,1966,vol.41,N3,p.298-302.

215. Walton,D.C.,Soofi,G.C. Germination of Phaseolus vulgaris. III.The role of nucleic acid and protein synthesis in the initiation of axis elongation.-Plant Cell Physiol.,1969, vol.10,N2,p.307-315.

216. Watanabe,A.,Nitta,T.,Shiroya,T. RNA synthesis in germinating red bean seeds.-Plant Cell Physiol.,1973,vol.14,N1,p.29-38.

217. Waters,L.,Dure,L. Ribosomal-RNA synthesis in the absence of ribosome synthesis in germinating cotton seeds.-Science, 1965,vol.149,N3680,p.188-190.- 155

218. Waters,L.C.,Dure,L.S.III. Ribonucleic acid synthesis in germinating cotton seeds.-J.Molec.Biol.,1966,vol.19,N1,p.1-13.214» Weeks,D.,Marcus,A. Preformed messenger of quiescent wheat embryos.-Biochim. et Biophys.Acta,1971,vol.232,N4,p.671-684.

219. Wells,G.N.,Beevers,L. Protein synthesis in the cotyledons of Pisum sativum L.-Biochem.J.,1974,vol.139,N1,р.б1I-69.

220. Westerberg,U.-B.,Bolcsfoldi,C.,Eliasson,E. Control of transfer RNA synthesis in the presence of inhibitor on protein synthesis.-Biochim. et Biophys.Acta,1976,vol.447,N2,p.203-213.

221. Willems,M.,Penman,-M.,Penman,S. The regulation of RNA synthesis and processing in the nucleolus during inhibition of protein synthesis.-J.Cell Biol.,1969,vol.41,N1,p.177-187.

222. Van de Walle,C. ,Deltour,R. ,Forgeur,G. Species of RITA synthesized during early germination in the radicle of the lentil embryo.-Physiol. Plant arum, 1983, vol. 57, 1T2, p . 181 -188.

223. Verma,D.P.S.,Marcus,A. Regulation of RNA synthesis in plant cell culture:delayed synthesis of ribosomal RNA during transition from the stationary phase to active growth.-Develop. Biol.,1973,vol.30,N1,p.104-111.

224. Vinograd,J.,Hearst,J.E. Equilibrium sedimentation of macro-molecules and viruses in a density gradient.-Portsch.Chem. Org.Naturst offe,1962,vol.20,p.372-422.

225. YufF.-L.,Fiegelson,P. Paper disc estimation of radioactive RNA:studies on the presence and elimination of metabolically generated artifacts from labeled purine and pyrimidine precursors. -Anal.Biochem.,1971,vol.39,N2,p.319-321.