Расположение матрицы в области декодирования по данным аффинной модификации рибосом человека производными олигорибонуклеотидов с концевыми реакционноспособными группами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Булыгин, Константин Николаевич

• Булыгин, Константин Николаевич
• кандидат химических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат химических наук Булыгин, Константин Николаевич

СОДЕРЖАНИЕ.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Сходство и различия во взаимодействии мРНК с рибосомами про- и эукариот на различных стадиях трансляции: элонгации и терминации. (обзор литературы).

1.1. Строение и функция рибосомы.

1.2. Матричные РНК.

1.3. Основные аспекты взаимодействия мРНК и тРНК с рибосомами на разных стадиях трансляции.

1.3.1. Стадия элонгации трансляции.

1.3.2. Стадия терминации трансляции.

1.4. Структурная организация мРНК-связывающего центра рибосомы.

1.4.1. Подходы и методы, применяемые для изучения мРНК-связывающего центра рибосомы.

1.4.1.1. Короткие аналоги мРНК - производные олигорибонуклеотидов.

1.4.1.2. Синтетические аналоги мРНК, полученные с помощью Т транскрипции.

1.4.1.2.1. Фотоактивируемые аналоги мРНК.

1.4.1.2.2. Аналоги мРНК, содержащие тиофосфатные группы.

1.4.2. мРНК-связывающий центр рибосом Е.соЦ.

1.4.2.1. Результаты, полученные с помощью аналогов мРНК - производных олигорибонуклеотидов.

1.4.2.2. Результаты, полученные с помощью аналогов мРНК - длинных синтетических матриц.

1.4.2.2.1. Рибосомные белки и нуклеотиды рРНК, сшивающиеся с фотоактивируемыми аналогами мРНК.

1.4.2.2.2. Результаты, полученные с помощью аналогов мРНК, содержащих тиофосфатные группы.

1.4.3. мРНК-связывающий центр рибосом эукариот.

1.4.3.1. Результаты, полученные с помощью аналогов мРНК - производных олигорибонуклеотидов.

1.4.3.2. Результаты, полученные с помощью аналогов мРНК - длинных синтетических матриц.

1.4.4. Универсальные элементы, формирующие мРНК-связывающий центр рибосом про- и эукариот.

1.4.5. Различия в организации мРНК-связывающего центра рибосом про- и эукариот.

ГЛАВА 2. Аффинная модификация рибосом из плаценты человека производными олигорибонуклеотидов, несущими алкилирующую группу на З'-конце или фотоактивируемую группу на 5'-конце. (результаты и их обсуждение).

2.1. Аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека (Up)n-iU[32P]pC>CHRCl (п=3, 6, 12).

2.1.1. Образование комплексов (Up)n.,U[32P]pC>CHRCl (п=3, 6, 12) с 80S рибосомами в присутствии Phe-TPHKPhe.

2.1.2. Ковалентное присоединение (Up) п - I U[ PjpOCHRCl (n=3, 6, 12) к 80S рибосомам.

2.1.3. Анализ распределения сшивок между 18S рРНК и рибосомными белками.

2.1.4. Идентификация фрагментов 18S рРНК, содержащих сайты модификации

Up)n.|U[32P]pC>CHRCl (п=3, 6,12).

2.1.5. Идентификация сайтов модификации 18S рРНК, сшивающихся с

Up)n-iU[32P]pC>CHRCl (п=3, 6,12).

2.1.6. Идентификация рибосомных белков, модифицируемых

Up)n-iU[32P]pC>CHRCl (п=3, б, 12).

2.1.7. Обсуждение результатов модификации 80S рибосом аналогами мРНК

Up)n-iU[32P]pC>CHRCl (п=3, 6, 12).

2.2. Аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека производными

5'-32P]pGUGUUU, [5"-32P]pUUUGUU и [5'-32P]pUUCUAAA, содержащими перфторарилазидную группу на 5'- ■ конце.

2.2.1. Образование комплексов фотоактивируемых производных [5'

32P]pGUGUUU, [5'-32P]pUUUGUU и [5'-32P]pUUCUAAA с 80S рибосомами в присутствии родственных тРНК.

2.2.2. Образование сшивок фотоактивируемых аналогов мРНК - с 80S рибосомами в составе модельных комплексов.

2.2.3. Идентификация фрагментов 18S рРНК, содержащих сайты модификации фотоактивируемыми аналогами мРНК.

2.2.4. Идентификация сайтов модификации 18S рРНК, сшивающихся с фотоаналогами мРНК.

2.2.5. Идентификация рибосомных белков, сшивающихся с азидо-[5'

32P]pGUGUUU.

2.2.6. Обсуждение результатов модификации 80S рибосом фотоактивируемыми производными [5'-32P]pGUGUUU, [5'-32P]pUUUGUU и [5'-32P]pUUCUAAA.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Расположение матрицы в области декодирования по данным аффинной модификации рибосом человека производными олигорибонуклеотидов с концевыми реакционноспособными группами»

Изучение биосинтеза белка на рибосоме, заключительного этапа реализации генетической информации, является одной из фундаментальных проблем молекулярной биологии. Подавляющее большинство исследований в этой области выполняется на рибосомах бактерий (преимущественно Е.соИ). Получаемая при этом информация хотя и носит фундаментальный характер, она не может быть безоговорочно перенесена на организмы с более сложным строением клетки, т.е. на эукариоты. Поэтому изучение рибосом эукариот, в частности, человека, может рассматриваться как самостоятельное направление в молекулярной биологии. Лаборатория Структуры и Функции Рибосом НИБХ СО РАН является единственной точкой в мире, где ведутся исследования на рибосомах человека. Следует признать, что многие исследователи считают эукариотическую рибосому лишь усложненной копией прокариотической рибосомы. Очевидно, что такая точка зрения может существовать только при отсутствии достаточной информации об устройстве и молекулярных механизмах функционирования эукариотической рибосомы. Кроме того, следует отметить, что рибосомы являются мишенью для большинства антибиотиков. Связываясь с определенными участками рибосомы, антибиотики способны блокировать ее работу и, таким образом, подавлять трансляцию. Важно, чтобы этот процесс происходил в клетках патогенных организмов (многие из которых являются прокариотами) и не затрагивал «хозяйские» клетки. Очевидно, что для изучения механизмов действия антибиотиков необходима информация об особенностях структурно-функциональной организации эукариотической рибосомы и ее отличиях от рибосом прокариот, что является исключительно важным при поиске новых антибиотиков. Наконец, исследования, проводимые на рибосомах человека, могут дать ценнейшую информацию, которая, в связи с бурным развитием молекулярной биологии и медицины в последнее время, может найти самое неожиданное применение.

Одним из подходов, широко используемым для изучения таких сложных надмолекулярных структур, какими являются рибосомы, является аффинная модификация (или в современном варианте аффинное химическое сшивание) с использованием peai ционноспособных аналогов компонентов аппарата трансляции (мРНК, тРНК и др.) (для обзора см. Карпова и Кнорре, 1991). Например, для изучения мРНК-связываюгцего центра рибосом E.coli до последнего времени интенсивно использовались синтетические мРНК длиной до 50 нуклеотидных звеньев, несущие остатки тиоуридина, реже тиогуанина, а также аналоги мРНК, содержащие диазирильные или азидофенилацильные группы (см. Bhangu and Wollenzien, 1992; Rinke-Appel et al., 1994; Донцова, 1997; Sergiev et al., 1997).

Целью настоящей работы явилось изучение декодирующего центра 80S рибосом человека с помощью метода аффинной модификации с использованием коротких аналогов мРНК, производных олигорибонуклеотидов, несущих реакционноспособную группу на 3'- или 5'- конце, в составе модельных комплексов, имитирующих различные состояния рибосом в процессе элонгации. Хотя к настоящему времени накоплено много информации о структурно-функциональной организации рибосом человека, позволяющей сделать важные выводы о сходстве и различиях в строении декодирующего центра рибосом разных организмов, на момент начала настоящей работы была известна лишь область 18S рРНК (длиной около 80 нуклеотидных звеньев), содержащая сайт ковалентного присоединения производного гексауридилата с алкилирующей группой на 5'- конце (Graifer et al., 1990).

Основными задачами настоящей работы являлись:

- изучение аффинной модификации 80S рибосом аналогами мРНК, производными олигоуридилатов разной длины, несущими 2',3'-0-[4-(К-2-хлорэтил)-Н-метиламино]бензилиденовую группу на З'-конце, в составе комплексов с одним или двумя кодон-антикодоновыми взаимодействиями;

- изучение фотоаффинной модификации 80S рибосом аналогами мРНК, производными олигорибонуклеотидов, содержащими два различных кодона и ß-[«-азидотетрафторбензамидно]этильную группу на 5'-конце, в комплексах с одним или двумя кодон-антикодоновыми взаимодействиями;

- определение нуклеотидов 18S рРНК и рибосомных белков, сшивающихся с алкилирующими и фотоактивируемыми производными олигорибонуклеотидов в составе модельных комплексов.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Булыгин, Константин Николаевич

выводы.

1. Изучена аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека реакционноспособными аналогами мРНК, производными олигорибонуклеотидов (Up)3C, (Ир)бС и (Up)I2C, несущими алкилирующую 2',3'-0-[4-(Н-2-хлорэтил)-Н-метиламино]бензилиденовую группу на 3' конце, в составе комплексов, полученных с участием родственной РЬе-тРНКРЬе. а) Показано, что модификации во всех случаях подвергается в основном 40S субчастица, а в её составе - как 18S рРНК. так и белки; относительная степень модификации 18S рРНК уменьшается с увеличением длины олигоуридилатной части реагента и, соответственно, повышается относительная степень модификации рибосомных белков; в случае производного (Up)3C наблюдается незначительная модификация 60S субчастицы. б) Установлены нуклеотидные остатки 18S рРНК, сшивающиеся с производными олигоуридилатов, и показано, что производные (Up)3C и (Up)i2C сшиваются в основном с нуклеотидами G1763/G1764 (и в незначительной степени с G1702), а производное (Up)6C сшивается в основном с G1702 (и в незначительной степени с G i 763/G1764). в) Определены рибосомные белки, сшивающиеся с производными олигоуридилатов, и показано, что производные (Up)óC и (Up)i2C модифицируют цримерно в одинаковой степени белки S3 и S3a и незначительно белок S26, а производное (Up)3C сшивается в основном с белком S26 и незначительно с белками S3 и S3a.

2. Изучена фотоаффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека реакционноспособными аналогами мРНК, производными олигорибонуклеотидов pGUGUUU, pUUUGUU и pUUCUAAA. несущими фотоактивируемую р-{п-азидотетрафторбензамидо]этильную группу на 5'-конце, в составе модельных комплексов, имитирующих различные состояния рибосомы в процессе трансляции. а) Показано, что во всех типах комплексов модификации подвергается исключительно 40S субчастица, а в её составе - как 18S рРНК, так и белки; относительные степени модификации 18S рРНК и белков существенно зависят от типа комплекса -.наибольшая степень модификации 18S рРНК наблюдается в тройных комплексах рибосом с кодон-антикодоновым взаимодействием в Р-сайте и вакантным A-сайтом, а наименьшая степень модификации 18S рРНК - в комплексе с молекулой тРНК в Е-сайте. б) Определены рибосомные белки, сшивающиеся с производным GUGUUU во всех типах комплексов, ,и показано, что наборы модифицированных белков резко зависят от типа комплекса. В случае, когда деацилированная тРНКУа| находилась в Е-сайте, а Phe-TPHKPhe - в Р-сайте, аналог мРНК сшивался в основном с белками S6 и S26 (и в небольшой степени с белком S30); когда TPHKVal находилась в Р-сайте, a ValPhe-тРНКРНе - в A-сайте, в большей степени модифицировались белки S2 и S6 (в меньшей степени - S26). В комплексе рибосом с РЬе-тРНКРЬе в Р-сайте и кодоном GUG в Е-сайте производное GUGUUU сшивалось с белками S2, S6 и S26, в то время как в комплексе с Val-TPHKVal в Р-сайте и кодоном UUU в A-сайте модифицировался в основном белок S2. в) Определён нуклеотидный остаток 18S рРНК, сшивающийся с производными pGUGUUU, pUUUGUU и pUUCUAAA в составе различных типов комплексов, образованных с участием тРНК, и показано, что, независимо от типа комплекса, модификации подвергается нуклеотид G1207.

3. Сопоставление результатов по аффинной модификации 80S рибосом человека с данными о расположении мРНК на рибосомах E.coli впервые позволило выявить универсальные элементы структуры рРНК малой субчастицы, формирующие декодирующий центр рибосомы (нуклеотиды Gl207 и G1702 18S рРНК человека и соответствующие им нуклеотиды G926 и G1401 16S рРНК E.coli), а также сходство и различия в белковом окружении матрицы (белки S3a, S6 и S26, расположенные в декодирующей области 80S рибосом, не имеют гомологов среди рибосомных белков прокариот, а рибосомные белки S2, S3 человека и S5, S3 E.coli хотя и гомологичны, в 80S и 70S рибосомах они формируют разные участки декодирующего центра).

2.3. Заключение.

На основании полученных результатов, а также принимая во внимание предыдущие данные (см. п.1.4.3.1 и 1.4.3.2, табл.10 и 11), мы предлагаем следующую схему расположения матрицы на 80S рибосоме человека в процессе элонгации (рис.24). Согласно этой схеме, нуклеотид в положении -6 располагается вблизи белков S3 и S3a. Нуклеотид в положении -3 находится вблизи основания G961 18S рРНК и белков S2, S3, S3a, S6 и S26. Нуклеотиды в положениях -3 и -1 (или один из них) прямо контактируют с основаниями U1 Ill/All 12 18S рРНК. Нуклеотид в положении +1 находится вблизи нуклеотидов Cl057 и G1207 18S рРНК и белков S2, S6, S15 и S26. Нуклеотид в положении +4 расположен вблизи нуклеотидов G1763/G1764 и А1823/А1824 18S рРНК и белков S15 и S26. Нуклеотид в положении +7 оказывается сближенным с G1702 18S рРНК и белками S3 и S3a. Нуклеотид в положении +13 матрицы также находится вблизи белков S3 и S3a, как и положение +7, и вблизи нуклеотидных остатков G1763/G1764 18S рРНК, как и положение +4, т.е. З'-сторона матрицы перед входом в А-сайт делает изгиб. Как уже упоминалось, вблизи этих же белков (S3 и S3a) располагаются положения -6 и -3 матрицы. Следовательно, матрица, выходя из Р-сайта, также делает изгиб, в результате чего сближается с 3'-стороной мРНК в районе белков S3 и S3a. Таким образом, матрица образует петлю на рибосоме, в результате чего её 5'-и 3"-стороны, удалённые от Р- и A-сайтов более, чем на 20 нуклеотидов, оказываются сближенными и контактируют с одним и тем же нуклеотидом U630 18S рРНК. Белки S3, S3a, SI5 и S26 находятся в центральной части мРНК-связывающего центра, при этом белок S26 несколько смещён в 5'-область (т.е. в область связывания S'-cropoHbi матрицы), а белки S2 и S6 расположены в 5'-области. Такое расположение белков S2 и S3 согласуется с данными о белковом окружении последовательностей 609-618 и 10471061 18S рРНК, полученными в экспериментах по сайт направленной модификации 40S субчастиц и их комплексов с мРНК и тРНК фотоактивируемыми производными

E-сайт

A-сайт тРНК

Л1823/4 ^

С1057, «V V \ч>® и 1111 п ta}^1 ^ 20 /

G1702 -7 01763/4

S6

S26

5'-сторона мРНК S3

S3a

З'-сторона мРНК

Рис.24. Схема расположения матрицы в декодирующем центре 80S рибосомы. Рибосомные белки представлены в виде больших окружностей, нуклеотиды 18S рРНК - в виде маленьких. Тёмным цветом выделены рибосомные белки и нуклеотиды 18S рРНК, выявленные в настоящей работе. олигонуклеотидов, комплементарных этим последовательностям (Malygin et al., 1999). Среди белков S2, S3, S3a, S6, SI5 и S26, расположенных в декодирующей области рибосомы человека, только белки S2, S3 и S15 имеют гомологов среди рибосомных белков E.coîi - это белки S5, S3 и S19, соответственно (Wool et al., 1996). Белки S3 и S5 являются компонентами декодирующего центра 70S рибосомы, согласно модели предложенной Сергеевым и соавт. (1998), причём оба белка расположены в области связывания 3'-стороны матрицы (положения от +11 до +16 для белка S3 и положения от +4 до +8 для белка S5). Что касается рРНК, то на модели пространственного расположения компонентов декодирующего центра рибосомы E.coli нуклеотиды G926 и G1401, соответствующие нуклеотидам G1207 и G1702 18S рРНК, расположены в области связывания кодон-антикодонового дуплекса в Р-сайте (Сергиев и соавт., 1998). Примерно в той же области 80S рибосомы расположены нуклеотиды G1207 и G1702 18S рРНК, при этом G1207 несколько смещён в 5'-область декодирующего центра, а нуклеотид G1702 - в область связывания кодон-антикодонового дуплекса в А-сайте (см. рис.24). Таким образом, проведённый анализ впервые позволил выявить сходство и различия в организации декодирующего центра про- и эукариот.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Материалы и вспомогательные методики.

В работе использовали дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты и АТР фирмы «Sigma» (США); акриламид, N-NP-метиленбисакриламид, GDPCP, LICIO4, 2,2-диметоксипропан, DTT, DEPC, SDS, DMSO, пуромицин, циклогексимид, дезоксихолат натрия и краситель «Stains all» фирмы «Fluka» (Швейцария); 2-меркаптоэтанол, Трис, сорбент Lichrosorb RP-18 фирмы «Merck» (Германия); сорбент Nucleosil 5С18 фирмы «Macherey-Nagel» (Германия); кумасси бриллиантовый голубой - «Ferak» (Германия); N,N,N',N?-тетраметилэтилендиамин и poly(U) - «Reanal» (Венгрия). тРНКР|1е (1800 пмоль/ОЕ260), РЬе-тРНКР|1е (1800 пмоль/ОЕ26о), [14С]РЬе-тРНКРНе (800 dpm/пмоль, 1300 пмоль/ОЕ260) и Val-TPHKVai (1800 пмоль/ОЕ260) любезно предоставлены Т.Г.Шапкиной (СПиЯФ им. Б.П.Константинова, г.Гатчина); олигоуридилаты (pU)3, (pU)ö и (pU)|2 - В.И.Ямковым (НГУ); олигорибонуклеотиды GUGUUU, UUUGUU и UUCUAAA были синтезированы в Группе Химии Олигорибонуклеотидов (Лаборатория Химии Нуклеиновых Кислот, НИБХ СО РАН);

32

5'- Р]рСр (450 Ки/ммоль) был синтезирован В.Н.Карамышевым (Лаборатория Радиохимии, НИБХ СО РАН); [у-32Р]АТР (1000 Ки/ммоль) был синтезирован Д.В.Семёновым (Лаборатория Радиохимии, НИБХ СО РАН). Двадцатизвенные дезоксирибонуклеотиды - праймеры для экспериментов по гидролизу рРНК РНКазой Н и обратной транскрипции были любезно предоставлены П.Воллензиеном (Университет штата Северная Каролина, г.Роли, США).

Ферменты: РНКаза А фирмы «Sigma» (США), щелочная фосфатаза и AMV-ревертаза фирмы «Boehringer Mannheim» (Германия), РНКаза Н (10 ед.акт./мкл) фирмы «Биопол» (г.Новосибирск). Т4 полинуклеотидкиназа и Т4 РНК-лигаза любезно предоставлены В.И.Ямковым (НГУ).

Антитела против индивидуальных рибосомных белков крысы, не обладающие «кросс-реактивностью» по отношению к неспецифическим белкам, получены в группе доктора Й.Шталя (J.Stahl, Центр Молекулярной Медицины ул. Макса Дельбрюка, Берлин-Бух, Германия).

Нерадиоактивный рСр, [4-(1Ч-2-хлорэтил)-Н-метиламино]бензальдегид, и N-гидроксисукцинимидный эфир 4-азидотетрафторбензойной кислоты были синтезированы Т.М.Ивановой (Лаборатория Исследования Модификации Биополимеров, НИБХ СО РАН).

Прочие неназванные реактивы были марки «хч», «осч» или «чда» для спектрального анализа. Для приготовления всех буферных растворов и растворов препаратов использовали бидистиллированную воду. Для фильтрования растворов и анализа связывания меченых лигандов с 80S рибосомами использовали нитроцеллюлозную мембрану фирмы «Millipore» (США) с диаметром пор 0,45 мкм.

Оптическую плотность регистрировали с помощью микроспектрофотометра «Милихром» (НПО «Научприбор», г.Орёл). Препараты сушили на вакуумном испарителе UNIVAPO 100Н (Германия). Измерение pH проводили на рН-метре ОР-264/1 «Radelkis» (Венгрия). Радиоактивность просчитывали на счётчиках «Rackbeta» и

1 4

Minibeta» фирмы «LKB-Pharmacia» (Швеция). Пробы, меченные С, просчитывали в 5

32 мл толуольного сцинтиллятора (5 л толуола. 20 г РРО, 1 г РОРОР), меченные Р, - в 1 мл воды по Черенкову. Гели и мембраны радиоавтографировали с использованием рентгеновской плёнки фирмы Cónica (США). Радиоавтографы анализировали на сканере «Ultroscan XL» фирмы «LKB-Pharmacia» (Швеция). В работе использовали ультрацентрифугу «Beckman L8M», а также центрифуги «Beckman J2-21M», «Eppendorf 5403» и «Eppendorf 5415С» (Германия).

3.2. Выделение рибосомных 40S и 60S субчастиц из плаценты человека.

Рибосомные 40S и 60S субчастицы с интактной рРНК выделяли из нормальной послеродовой плаценты по методике, описанной в работе (Matasova et al., 1991). Промежуток времени между родами и гомогенизацией ткани не превышал 30 мин. Плаценту немедленно погружали в ледяной буфер А (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 125 мМ KCl. 10 мМ MgCL, 0.5 мМ EDTA, 4 мМ 2-меркаптоэтанол), нарезали кусочками по 25

30 г, освобождаясь при этом от мембран и соединительных тканей, отмывали от крови и суспендировали при 2°С в равном по весу количестве буфера А, содержащего 250 мМ сахарозу, 1 г/л гепарина и 0,05 г/л циклогексимида. Полученный гомогенат центрифугировали на центрифуге «Весктап 12-21М» (ротор 1А-14) при 4°С и 13000 об/мин в течение 30 мин. К постмитохондриальному супернатанту добавляли дезоксихолат натрия до концентрации 1,2% и перемешивали на магнитной мешалке 1 ч при 4°С. Затем 25 мл обработанного дезоксихолатом постмитохондриального супернатанта наносили на двухступенчатый градиент плотности сахарозы (6 мл 25%-ного и 6 мл 48%-ного раствора сахарозы в буфере Б: 20 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 100 мМ Ш4С1, 3 мМ Mg(CHзCOO)2, 0,15 мМ ЕЭТА, 5 мМ 2-меркаптоэтанол) и центрифугировали при 4°С 20 ч (ультрацентрифуга «Весктап Е8М», ротор Б\У-28, 26000 об/мин). По окончании центрифугирования супернатант осторожно сливали. Полисомы растворяли при 4°С в буфере Б, содержащем 5 мМ ЭТТ и 1 ед. акт./мл РНКазина из плаценты человека, до концентрации 100-200 ед. А260 в 1 мл, нерастворившийся материал удаляли центрифугированием (центрифуга «Весктап. 12-21М», ротор М-20, 17000 об/мин, 15 мин, 4°С). Выделенные препараты полисом обрабатывали 0,5 мМ пуромицином 10 мин при 0°С, добавляли по каплям 3 М КС1 до концентрации 0,5 М и инкубировали 45 мин при 37°С, после чего наносили на линейный градиент плотности сахарозы (10-30%) в буфере 20 мМ Трис-НС1, рН 7,5, содержащем 500 мМ КС1, 3 мМ М^СЬ, 0,125 мМ ЕЭТА и 10 мМ 2-меркаптоэтанол. и центрифугировали 18 ч при 4°С (ультрацентрифуга «Весктап Ь8М», ротор 8Ш-28, 20000 об/мин). Фракции 40Б и 608 субчастиц осаждали добавлением 0,7 объёма охлаждённого этанола, предварительно доведя концентрацию М£2+ до 20 мМ. Осадки отделяли центрифугированием при 4°С (центрифуга «Весктап 12-21М», ротор М-14, 5000 об/мин, 10 мин), подсушивали на воздухе в течение 15-20 мин и растворяли в буфере 20 мМ Трис-НС1, рН 7,5. содержащем 80 мМ КС1. 3 мМ М£(СН3СОО)2 и 1 мМ ЭТТ, до концентрации 80-120 ед. А2бо/мл и хранили в жидком азоте порциями по 20 мкл. Перед использованием 408 и 60Б субчастицы разбавляли в 2-4 раза буфером БС (20 мМ Трис-НСК рН 7.5. 120 мМ КС1. 13 мМ МцСЬ и 0.65 мМ ЕОТА) до концентрации 15-20 ед. Агбо/мл, реактивировали в течение 10 мин при 37°С, осветляли центрифугированием в течение 1 мин и замеряли оптическую плотность, полагая, что 1 ед. Агбо соответствует 50 пмоль 40S или 25 пмоль 60S субчастиц по данным (Semenkov et al., 1985). Для получения 80S рибосом субчастицы смешивали в мольном соотношении 40S:60S = 1:1,3, при этом практически все 40S субчастицы были ассоциированы с 60S субчастицами. Конечная концентрация реактивированного препарата 80S рибосом составляла примерно 10"6 М. Активность 80S рибосом в ро1у(и)-зависимом связывании [l4C]Phe-TPHKPhe измеряли по методике, описаннои в работе (Matasova et al., 1991), она составляла примерно 70% (т.е. около 1,4 моль [,4C]Phe-TPHKPhe связывалось с 1 моль 80S рибосом).

3.3. Введение радиоактивной метки в олигоуридилаты.

Олигоуридилаты (pU)3, (pU)6 и (pU)i2 дефосфорилировали инкубацией со щелочной фосфатазой в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5 при 37°С в течение 15 мин. Продукты выделяли высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) на микроколонке (объём колонки 200 мкл) на смоле с обращенной фазой Lichrosorb RP-18 или Nucleosil 5С18 (элюция ступенчатым градиентом концентрации 1, 10, 20, 30, 40 и 90%-ного метанола в 50 мМ ТЭА-ацетате рН 7.5 за 24 мин, скорость элюции 100 мкл/мин, детекция на А.=260 нм, как описано в работе Зенковой и соавт., 1991). Времена удерживания (Up)2U, (UpXsU и (Up)nU составляли 10,8, 11,5 и 12,1 мин, соответственно. Нуклеотидный материаа осаждали, добавляя 10 объёмов 2%-ного LÍCIO4 в ацетоне, и центрифугировали при 14000g в течение 6-10 мин при комнатной температуре. Осадок промывали 200 мкл ацетона. К дефосфорилированным олигоуридилатам присоединяли [5'-j2P]pCp с помощью Т4 РНК-лигазы по методу Тюлькиной и Манькина (1984), с небольшими изменениями - реакцию вели 30 мин при 37°С. Реакционные смеси объёмом 50 мкл содержааи 0,2-0,4 ед. А260 олигоуридилата, 100-300 пмоль [5'-j2P]pCp и 100 ед. акт. РНК-лигазы. После этого добавляли примерно 1 мкмоль нерадиоактивного рСр и инкубировааи ещё 30 мин при 37°С По окончании реакции меченые олигонуклеотиды выделяли ВЭЖХ, осаждачи, дефосфорилироваш т.е. удаляли З'-концевой фосфат) в указанных выше условиях, выделяли ВЭЖХ и вновь осаждали, как описано выше.

3.4. Получение 2',3'-0-бензилиденовых производных олигорибонуклеотидов.

Синтез 2',3'-0-[4-(Ы-2-хлорэтил)-К-метиламино]бензилиденовь1х производных олигорибонуклеотидов (ир)2и[32Р]рС, (ир)5и[32Р]рС и (ир)ми[32Р]рС проводили согласно методике, описанной в работе Зенковой и соавт., 1991. К 0,5-1 ед. А2бо олигорибонуклеотида. растворённого в 5-10 мкл воды, добавляли 1 мкл 8%-ного водного раствора цетавлона и упаривали (не досуха) на маслянном насосе с 6-кратньгм объёмом абсолютного ДМФА. Эту процедуру повторяли 6-7 раз для более полного обезвоживания, в конце упаривали досуха. Полученную цетавлоновую соль растворяли в 50 мкл абсолютного ДМФА, к раствору добавляли 6 мг [4-(М-2-хлорэтил)-М-метиламино]бензальдегида и 4,4 мкл 2,2-диметоксипропана. Смесь замораживали в жидком азоте, а затем добавляли 8.9 мкл трифторуксусной кислоты, при этом реакционная смесь в течение 5-10 мин приобретала тёмно-зелёный цвет. Реакцию вели 45 мин при комнатной температуре. Перед нейтрализацией реакционную смесь снова замораживали в жидком азоте и добавляли 66,4 мкл абсолютного ТЭА, при этом раствор становился оранжево-красным. Для удаления избытка ТЭА реакционную смесь упаривали на масляном насосе на треть объёма. Нуклеотидный материал осаждали, добавляя 10 объёмов 2%-ного 1лС104 в абсолютном ацетоне, и центрифугировали при 14000g в течение 6-10 мин при комнатной температуре. Осадок промывали 200 мкл абсолютного ацетона, высушивали при комнатной температуре в течение 10-15 мин и растворяли в 10 мкл 50 мМ ТЭА-ацетата, рН 7,5 при 0°С. Бензилиденовые производные олигорибонуклеотидов выделяли ВЭЖХ (времена удерживания производных (Ьтр)зС. (ир)6С и (11р)12С составляли 21.4 мин. 19.4 мин и 18.2 мин. соответственно), как описано в п.3.3, растворяли в 20 мкл воды при 0°С и хранили в замороженном виде в жидком азоте. Молярную экстинкцию олигорибонуклеотидов рассчитывали, исходя из значений молярной экстинкции для соответствующих нуклеозидмонофосфатов. При расчете молярной экстинкции алкилируьощих производных олигорибонуклеотидов молярную экстинкцию бензилиденовой части реагента принимали равной 18,5*10 моль"1 «см"1 (Беликова и соавт., 1971). Степень присоединения алкилирующей группы к олигорибонуклеотидам контролировали по сравнению поглощения на 1=350 нм бензилиденового производного и его гидролизата (рН 2, 20°С, 1 ч). Поглощение гидролизата на А.=350 нм обусловлено наличием в нём свободного альдегида ОСНЯС1, образующегося при гидролизе бензилиденовой связи. Молярную экстинкцию ОСНЯС1

3 1 1 при рН 2 на А.=350 нм принимали равной 28,8*10 моль" *см" (Беликова и соавт., 1971). Степень присоединения бензилиденовой группы к олигорибонуклеотидам составляла 90-100%. Удельная активность препаратов была (30-60)* 103 имп/мин на пмоль по Черенкову к моменту выделения.

3.5. Введение радиоактивной метки на 5'-конец олигонуклеотидов.

32

Перед введением метки Р в олигонуклеотиды 5'-концевой фосфат (если он т 9 присутствовал) удаляли, как описано в п.3.3. Введение метки Р на 5'-конец олигонуклеотидов проводили с помощью [у-32Р]АТР и Т4 полинуклеотидкиназы. Для этого реакционную смесь, содержащую в 20 мкл 100 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 60 мМ МёС12, 1 мМ ЕБТА, 5-15 нмоль олигонуклеотида, 20-40 МБк [у-32Р]АТР и 15 ед. акт. Т4 полинуклеотидкиназы. инкубировали в течение 15 мин при 37°С, затем добавляли примерно 1 мкмоль нерадиоактивного АТР и инкубировали ещё 15 мин при 37°С. Нуклеотидный материал осаждали, добавляя 10 объёмов 2%-ного ПС104 в ацетоне, и центрифугировали при 14000g в течение 6-10 мин при комнатной температуре. Осадок высушивали при комнатной температуре в течение 10-15 мин, растворяли в 10 мкл 50 мМ ТЭА-ацетата, рН 7.5 и выделяли ВЭЖХ, как описано в п.3.3.

3.6. Синтез 5'-азидопроизводных олигорибонуклеотидов.

Присоединение фотоактивируемой группы по 5"-фосфату [5 - Р]рииШШ и [5'-"^Р]риисиААА проводили в две стадии. Сначала получали Р-аминоэтил-[5'-32Р]-фосфамидные производные олигорибонуклеотидов конденсацией радиоактивномеченого олигонуклеотида с 1,2-этилендиамином согласно методике, описанной в работе (Graifer й а!., 1990). Для этого 0,1 мМ раствор цетавлоновой соли меченого олигонуклеотида в абсолютном ОМБО обрабатывали 4 мкл этилендиамина в присутствии конденсирующего агента - смеси 0,5 М трифенилфосфина и 0,5 М дипиридилдисульфида. В качестве катализатора использовали 1 М Ы-метилимидазол. Реакционную смесь выдерживали в течение 60 мин при комнатной температуре. По окончании реакции нуклеотидный материал осаждали 2%-ным ЫС104 в ацетоне, как описано выше. Осадок промывали ацетоном, растворяли в 5 мкл Н2О, затем к раствору добавляли 10 мкл ЭМБО и присоединяли фотоактивируемую группу по алифатической КНг-группе остатка 1,2-этилендиамина, пришитого к олигорибонуклеотиду, используя Ы-гидроксисукцинимидный эфир 4-азидотетрафторбензойной кислоты (ИЭи-Аг) согласно методике, описанной в работе (Репкова с соавт. 1996). Для этого 1,8 мг N811-Аг растворяли в 20 мкл 0М80 и добавляли порциями (сначала 10 мкл, затем, два раза по 5 мкл) при комнатной температуре через каждые полчаса к раствору олигонуклеотида. Нуклеотидный материал осаждали, добавляя 10 объёмов 2%-ного ЫСЮ4 в ацетоне, и центрифугировали при 14000§ в течение 6-10 мин при комнатной температуре. Осадок высушивали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. растворяли в 10 мкл 50 мМ ТЭА-ацетата. рН 7.5 и выделяли ВЭЖХ, как описано в п.3.3. Как и в случае алкилирующих производных (см. п.3.4), время удерживания фотоактивируемых производных было значительно выше, чем исходных олигорибонуклеотидов. из-за наличия гидрофобной арилазидогруппы и составляло приблизительно 19,2 мин для 5"-азидопроизводных рОиОиии, риииоии и риисиААА. Для расчета молярной экстинкции фотоактивируемых производных олигорибонуклеотидов полагали молярную экстинкцию арилазидной части реагента равной 23,3• 1моль"'см"' (Ье\тпа й а1„ 1993). Удельная активность препарата была (60-100)* 103 имп/мин на пмоль по Черенкову к моменту выделения.

3.7. Ацетилирование РЬе-тРНКРЬе.

Один мг N-гидроксисукцинимидного эфира уксусной кислоты (NSu-Ac) растворяли в 18 мкл DMSO и добавляли порциями по 6 мкл при 0°С через каждые полчаса к раствору 1 ед. A2óo РЬе-тРНКР|1е в 3 мкл 0,1 М NaOAc, pH 5. Затем к реакционной смеси добавляли 10 мкл воды, 2 мкл 3 М NaOAc, pH 5 и 105 мкл этанола. тРНК осаждали .в течение 1-2 ч при -20°С. Осадок АсРЬе-тРНКр,,е отделяли центрифугированием (центрифуга «Eppendorf 5403», 12000 об/мин, 4°С, 7 мин), промывали 200 мкл 70%-ного охлажденного этанола, высушивали на воздухе (20-30 мин), растворяли в 20 мкл воды и переосаждали таким же образом ещё два раза.

3.8. Получение комплексов 80S рибосом с реакционноспособными аналогами мРНК в присутствии родственных тРНК.

Препараты тРНК (как и 80S рибосомы, см п.3.2) перед использованием реактивировали в буфере БС при 37°С в течение 5 мин и помещали в лёд. Связывание

32

80S рибосом с меченными Р аналогами мРНК проводили, инкубируя смесь соответствующих компонентов в буфере БС при 20°С в течение 40 мин. При получении комплексов рибосом, содержащих одновременно АсРЬе-тРНКр|1е (или РЬе-тРНКр'1е) и Val-TPHKVal (или TPHKVal) сначала проводили связывание 80S рибосом с аналогом мРНК и тРНК, направляемой в Р-сайт, затем добавляли другую тРНК и выдерживали ещё 40 мин. В реакционных смесях концентрация рибосом составляла

3*10" М; AcPheтРНКР|1е (или РЬе-тРНКР'1е) - 2*10"6 М и Val-TPHKVal (или тРНКУа1) - 4*10"6 М. Концентрации аналога мРНК составляли 1,1*10"5 М для (Up)2U[32P]pC>CHRCl и 3*10"6 М для других матриц. По окончании инкубации реакционные смеси фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры, промывали два раза буфером БС (порциями по 1 мл) и связанную на фильтрах радиоактивность просчитывали во флаконах в воде по Черенкову.

3.9. Аффинная модификация 80S рибосом производными олигорибонуклеотидов с алкилирующей группой на З'-конце:

Модельные комплексы получали, как описано в п.3.8. Аффинную модификацию 80S рибосом 2',3'-0-[4-(ТЧ-2-хлорэтил)-Ы-метиламино]бензилиденовыми производными олигорибонуклеотидов (Up)2U[32P]pC, (Up)5U[32P]pC и (Up)nU[32P]pC проводили, инкубируя соответствующие комплексы в течение 28 ч при 20°С. В экспериментах использовали 50-150 пмоль 80S рибосом и соответствующие количества остальных компонентов.

3.10. Аффинная модификация 80S рибосом производными олигорибонуклеотидов с фотоактивируемой группой на 5'-конце.

Модельные комплексы получали, как описано в п.3.8. Аффинную модификацию 80S рибосом производными олигорибонуклеотидов [5"-32P]pGUGUUU, [5!-PjpUUUGUU и [5'-32P]pUUCUAAA, несущими фотоактивируемую ß-[«-азидотетрафторбензамидо]этильную группу на 5'-конце проводили, облучая соответствующие комплексы в течение 10 мин при 0°С УФ-светом (лампа ДРШ-1000, 380>?v>270 нм. интенсивность светового потока Ю1'"1 квант*с"'*см"2). В экспериментах использовали 50-150 пмоль 80S рибосом и соответствующие количества остальных компонентов.

3.11. Разделение модифицированных 80S рибосом на субчастицы.

После окончания модификации к реакционным смесям добавляли 2-меркаптоэтанол до концентрации 20 мМ и осаждали рибосомы добавлением 0,7 объема охлажденного этанола. Осадок отделяли центрифугированием (4°С, 7 мин, 12000 об/мин на настольной центрифуге «Eppendorf 5403»), сушили на воздухе 20-30 мин, растворяли в буфере БД (300 мМ KCl. 3 мМ MgCb, 0,2 мМ EDTA, 20 мМ Трис-HCl. pH 7,5) и инкубировали 10 мин при 37°С для диссоциации 80S рибосом на субчастицы. Затем смесь наносили на градиент плотности сахарозы (10-30%) в буфере БД и центрифугировали на центрифуге «Beckman L8M» (ротор SW-40, 24000 об/мин, 4°С, 17 ч). Содержимое пробирок фракционировали через проточную кювету микроспектрофотометра по 0.8 мл и просчитывали радиоактивность каждой фракции. Рибосомные 40S субчастицы осаждали из соответствующих фракций добавлением 0,7 объема охлажденного этанола, предварительно увеличив концентрацию MgCb до 20 мМ. Осадок рибосом отделяли центрифугированием (центрифуга «Beckman J2-21M», ротор JA-21, 18000 об/мин, 4°С, 30 мин).

3.12. Анализ распределения радиоактивной метки между рРНК и белками.

Анализ относительной степени модификации рРНК и белков в 40S субчастицах проводили центрифугированием в градиенте плотности сахарозы по методике, предложенной в работе (Kruze et al., 1982). Осадки модифицированных 40S субчастиц, полученных, как описано в п.3.11, растворяли в буфере БДГ (20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 5 мМ EDTA, 1% SDS), инкубировали 5 мин при 37°С и центрифугировали в градиенте плотности сахарозы (5-20%) в буфере БДГ на центрифуге «Beckman L8M» (ротор SW-40, 36000 об/мин, 4°С, 19 ч). По окончании центрифугирования содержимое пробирок фракционировали, как указано в п.3.11, и просчитывали радиоактивность во фракциях.

3.13. Выделение 18S рРНК из 40S субчастиц.

Осадок модифицированных 40S субчастиц, полученный, как описано в п.3.11, растворяли в 200 мкл буфера 10 мМ Трис-HCl, pH 7,5,'содержащего 1 мМ EDTA и 0,1%-ный SDS, инкубировали 10 мин при 37°С и проводили двукратную депротеинизацию 18S рРНК равным объёмом водонасыщеного фенола. По окончании остатки фенола из водной фазы, содержащей модифицированную 18S рРНК. удаляли экстракцией равным объёмом серного эфира. Затем к водной фазе добавляли 0,1 объёма 3 M NaOAc, pH 5 и 3 объёма холодного этанола. РНК осаждали в течение 1-2 ч при -20°С. Осадок 18S рРНК отделяли центрифугированием (центрифуга «Eppendorf 5403», 12000 об/мин. 4°С. 7 мин), промывали 200 мкл 70%-ного охлажденного этанола, высушивали на воздухе (20-30 мин) и растворяли в 100 мкл воды.

3.14. Установление района 18S рРНК, содержащего участок сшивки с аналогом мРНК, с помощью блот-гибридизации.

Наработка, выделение и рестрикция плазм иды рНг13, содержащей полную копию гена 18S рРНК человека, а также приготовление блотов, с иммобилизованными фрагментами рестрикции, проводились М.А.Зенковой по методике, описанной Маниатисом и соавт. (1984). Фрагмент, длиной около 3200 п.н., содержащий рДНК, получали гидролизом плазмиды рНг13 с помощью ферментов рестрикции Sali и Kpnl с последующим электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Выделенный фрагмент ДНК гидролизовали в четырёх параллельных экспериментах ферментами рестрикции Mspl, HaelII, Alul и Sau3A. Каждый из четырёх получившихся гидролизатов разделяли электрофорезом в 10%-ном ПААГ (15x20x0,05 см) параллельно на соседних дорожках; электрофорез проводили до выхода красителя бромфенолового синего из геля. Фрагменты ДНК окрашивали в геле бромистым этидием, затем переносили на нейлоновую мембрану (30 мин при силе тока 0,5 А) и иммобилизовали на мембране с помощью УФ-облучения. В качестве маркера длины использовался Mspl-гидролизат плазмиды pTZl 8U.

Мембрану с иммобилизованными фрагментами ДНК перед использованием выдерживали при комнатной температуре 8 мин в 0,5 M NaOH, 2 мин в 0,5 M Трис-НС1, рН 7,5 и 30 мин в 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5. Затем мембрану инкубировали при 37°С в течение 6 ч в 1 мл буфера 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, содержащего 50%-ный формамид, 1 мМ EDTA, 0,1% SDS. 0,75 M NaCl, 75 мМ цитрат натрия, 0,4%-ный фикол-400, 0.4%-ный БСА. 0.4%-ный поливинилпирролидон. 10 мкг/мл денатурированной ДНК из спермы лосося и 0,1 мкг/мл poly(A). Иммобилизованные на мембране фрагменты ДНК гибридизовали с частично фрагментированной (100 мМ NaHC03, рН 8,9, 90°С, 5 мин) модифицированной 18S рРНК при 37°С в течение 18 ч в тех же условиях. После гибридизации мембрану промывали при 37°С дважды по 15 мин в растворе, содержащем 0,3 M NaCl, 30 мМ цитрат натрия (2xSSC) и 0,1%-ный SDS. затем дважды по 15 мин в растворе O.lxSSC и 0.1%-ный SDS. Отмытую таким образом мембрану инкубировали 30 мин при 37°С в растворе РНКазы А (40 мкг/мл) в

2xSSC. После инкубации с ферментом мембрану промывали также как и в первый раз и радиоавтографировали. После экспозиции мембрану регенерировали. Для этого её дважды промывали 50 мл 50 мМ NaOH при комнатной температуре, пять раз - в тех же условиях в буфере 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, содержащем 1 мМ EDTA, и высушивали. После такой обработки мембрана могла быть снова использована для гибридизации.

3.15. Установление района 18S рРНК, содержащего участок сшивки с аналогом мРНК, с помощью РНКазы Н.

Район 18S рРНК, содержащий участок сшивки с аналогом мРНК, определяли с помощью гидролиза модифицированной рРНК РНКазой H в присутствии 20-звенных олигодезоксирибонуклеотидов, комплементарных различным последовательностям рРНК. Для образования гетеродуплексов смесь 4 пмоль 18S рРНК с 60 пмолями дезоксирибонуклеотида инкубировали 2 мин при 90°С в 8 мкл воды, затем охлаждали до 0°С и добавляли 2 мкл 5-кратного буфера БС. Для гидролиза рРНК по участкам связывания дезоксирибонуклеотида к реакционной смеси добавляли 3 ед. акт. РНКазы H и инкубировали 40-60 мин при комнатной температуре. Затем РНК осаждали этанолом, растворяли в 5 мкл деионизованного формамида, содержащего 0,01%-ный бромфеноловый синий и 0,01%-ный ксиленцианол, инкубировали в течение 2 мин при 90°С и анализировали в 4%-ном ПААГ в буфере ТБЕ (0,089 M Трис-борат, 0,089 борная кислота, 2 мМ EDTA). По окончании, гель прокрашивали красителем «Stains ail» и радиоавто графировали.

3.16. Идентификация модифицированных оснований в 18S рРНК с помощью метода обратной транскрипции.

Для определения модифицированных оснований использовали 18S рРНК, выделенную фенольной депротеинизацией (см. п.3.13). В качестве праймеров для обратной транскрипции использовали синтетические меченные "2Р по 5'-концу (см. п.3.5) 20-звенные дезоксирибонуклеотиды, комплементарные различным последовательностям 18S рРНК. Удельная радиоактивность праймеров составляла (5

10)*105 имп/мин на пмоль по Черенкову. Отжиг праймера проводили в 1 мкл буфера 80 мМ PIPES, рН 7, содержащего 80%-ный формамид, 0,8 M NaCl, 0,2 мМ EDTA и по 1 пмолю 18S рРНК и праймера, при 45°С в течение 10 мин. Затем реакционную смесь помещали в лёд и добавляли к ней 20 мкл раствора, содержащего 40 мМ КС1, 6 мМ MgCh, 50 мМ Трис-HCl. рН 8,3, 10 мМ DTT, смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (0,5 мМ концентрация по каждому из четырёх компонентов) и 1 ед. акт. AMV-ревертазы. Синтез цепи кДНК проводили в течение 10 мин при 42°С и останавливали добавлением к реакционной смеси 20 мкл воды и 40 мкл водонасыщенного фенола, после чего проводили депротеинезацию. как описано в п.3.13.

Секвенирование 18S рРНК проводили по методу Сэнгера. Отжиг праймера осуществляли, как описано выше, используя в этом случае немодифицированную 18S рРНК. Синтез цепи кДНК проводили, как описано выше, при этом, чтобы получить остановки обратной транскрипции по одному из оснований А, С, G или Т, в реакционную смесь добавляли дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dTTP, ddGTP, ddCTP или ddATP, соответственно) до конечной концентрации 0,05 мМ. По окончании реакции проводили фенольную депротеинезацию. Нуклеотидный материал анализировали с помощью гель-электрофореза в 8%-ном ПААГ в буфере ТБЕ.

3.17. Идентификация модифицированных рибосомных белков с помощью одномерного гель-электрофореза.

Модифицированные 40S субчастицы осаждали центрифугированием (см. п.3.11) и растворяли в 100 мкл буфера 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, содержащего 2 мМ EDTA и 1%-ный SDS и выдерживали при 37°С в течение 10 мин. Белковый материал осаждали 5 объёмами ацетона и анализировали одномерным гель-электрофорезом по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Для этого готовили ступенчатый ПААГ, состоящий из 12%-ного разделяющего и 5%-ного концентрирующего гелей. Пробы наносили в растворе следующего состава: 60 мМ Трис-HCl. рН 6.8. 20%-ный глицерин. 0.01%-ный бромфеноловый синий. 1%-ный 2-меркаптоэтанол и 2%-ный SDS. Электрофорез проводили в буфере 25 мМ Трис-HCl, рН 8,3, содержащем 0,1%-ный SDS и 0.192 M глицин. После разделения белков гель окрашивали красителем кумасси бриллиантовый голубой, высушивали и радиоавтографировали.

3.18. Идентификация модифицированных рибосомных белков с помощью иммунопреципитации.

Анализ модифицированных белков с использованием антител проводился в группе И.Шталя (J.Stahl, Центр Молекулярной Медицины им. Макса Дельбрюка, Берлин-Бух, Германия). Модифицированные 40S субчастицы осаждали центрифугированием (см. п.3.11), растворяли в 100 мкл буфера 20 мМ Трис-HCl, pH 7,5, содержащего 2 мМ EDTA и 1%-ный SDS и выдерживали при 37°С в течение 10 мин. Белковый материал осаждали 5 объёмами ацетона, высушивали на воздухе (10-15 мин) и растворяли в 20 мкл буфера 60 мМ Трис-HCl, pH 6,8, содержащего 20%-ный глицерин, 0,01%-ный бромфеноловый синий, 1%-ный 2-меркаптоэтанол и 2%-ный SDS. Раствор инкубировата в течение 5 мин при 65°С и разбавляли в 20 раз буфером 20 мМ фосфата натрия, pH 7,3, содержащим 150мМ NaCl, 1%-ный тритон Х-100 и 1%-ный дезоксихолат натрия. Затем каждую пробу делили на две части и проводили две серии экспериментов. В первой серии к каждой пробе добавляли по 30 мкг смеси антител против белков S3 и S26. во второй серии - по 30 мкг антител против белка S3a. После инкубации при 4°С в течение 2 ч при слабом перемешивании к каждой пробе добавляли по 50 мкл Protein-A Sepharose 4MB и выдерживали ещё 18 ч в тех же условиях. По окончании инкубации пробы центрифугировали 30 с при 3000 об/мин. Осадки промывали 4 раза буфером 20 мМ фосфат натрия, pH 7,3, содержащим 150мМ NaCl, 1%-ный тритон Х-100 и 0,1%-ный дезоксихолат натрия, растворяли в 10 мкл буфера 120 мМ Трис-HCl, pH 6,8. содержащего 40%-ный глицерин, 0,02%-ный бромфеноловый синий, 2%-ный 2-меркаптоэтанол и 4%-ный SDS. и инкубировали при 65°С в течение 5 мин. Затем пробы осветляли центрифугированием при 13000 об/мин 5 мин и анализировати с помощью одномерного гель-электрофореза (см. п.3.17).

3.19. Идентификация модифицированных рибосомных белков с помощью двумерного гель-электрофореза.

В экспериментах по идентификации белков двумерным гель-электрофорезом к модифицированным 40S субчастицам перед разделением на рРНК и белки (см. п.3.12) добавляли носитель - немодифицированные 40S субчастицы так, чтобы их суммарное количество в каждой пробе составляло около 180 пмоль. После разделения на 18S рРНК и белки к объединённым верхним фракциям сахарозного градиента, содержащим белки, добавляли 2-меркаптоэтанол до концентрации 1%. Белковый материал концентрировали до объёма 50-100 мкл с помощью микроконцентратора Centricon-10 («Amicon», США), центрифугируя их в течение 5-10 ч на центрифуге «Beckman J2-2IM» (ротор JA-21, 4000 об/мин, 10°С). После этого для удаления сахарозы и снижения концентрации SDS к пробам добавляли по 1 мл буфера 10 мМ Трис-HCl, pH 7,5, содержещего 0,05%-ный SDS и 1%-ный 2-меркаптоэтанол, и повторяли концентрирование. Затем белки осаждали добавлением 5 объёмов ацетона, осадок отделяли центрифугированием при 13000g и высушивали на воздухе (10-15 мин). Выделенные препараты рибосомных белков анализировали двумерным гель-электрофорезом в условиях, предложенных в работе (Madjar et al., 1979). Разделение в первом направлении (8%-ный ПААГ, pH 8,6) проводили в стеклянных трубках с внутренним диаметром 1 мм при напряжении 240 В в течение 2.5 ч. Во втором направлении разделение белков осуществлялось в присутствии SDS (как описано в п.3.17). После разделения белков гель окрашивали красителем кумасси бриллиантовый голубой, высушивали и радиоавтографировали.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Булыгин, Константин Николаевич, 2000 год

1. Бабкина Г.Т., Кнорре Д.Г. Электростатические эффекты в реакциях водорастворимого карбодиимида с нуклеотидами и полинуклеотидами // Изв. СО АН СССР. Сер.хим.наук. 1973. Вып.6. С.74-80.

2. Бабкина Г.Т., Зарытова В.Ф., Кнорре Д.Г. Получение у-амидов нуклеозид-5'-трифосфатов в водном растворе с помощью водорастворимого карбодиимида // Биоорган.химия. 1975. Т.1. С.611-615.

3. Беликова A.M., Гринёва Н.И. Алкилирование нуклеиновых кислот и их компонентов. VIII. Реакция 2\3'-0-4-(Н-2-хлорэтил-1\[-метиламино).бензилиден]-уридина и -аденозина с тРНК // Изв.Сиб.Отд. АН СССР, сер.хим.наук. 1971. Вып.5. С. 119127.

4. Будкер В.Г., Гиршович A.C.,'Гринева Н.И., Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г., Кобец Н.Д. Специфическая химическая модификация рибосом вблизи мРНК-связывающего центра // Докл.АН СССР. 1973. Т.211. С.725-728.

5. Власов В.В., Гринёва Н.И., Кнорре Д.Г. Алкилирующие производные нуклеиновых кислот. VI. Ионизация 4-(К-2-хлорэтил-М-метиламино)-бензальдегида и его ацеталей // Изв. СО АН СССР. Сер.хим.наук. 1969. Вып.1. С. 104-109.

6. Гимаутдинова О.И., Карпова Г.Г., Кобец НД. Аффинная модификация рибосом E.coli 4-(Ы-2-хлорэтил-Ы-метил)амино.-бензил-5'-фосфамидом гептауридиловой кислоты //Молекуляр.биология. 1981. Т. 15. С.797-804.

7. Гимаутдинова О.И., Карпова Г.Г., Козырева Н. А. Аффинная модификация рибосом E.coli 4-(Ъ1-2-хлорэтил-1\1-метил)амино.-бензил-5'-фосфамидами олигоуридилатов разной длины // Молекуляр.биология. 1982. Т. 16. С.752-762.

8. Гимаутдинова О.И., Зенкова М.А., Карпова Г.Г., Подуст JI.M. Аффинная модификация рибосом Escherichia coli фотоактивируемыми аналогами мРНК // Молекуляр.биология. 1984. Т.18. С.907-917.

9. Гимаутдинова О.И., Карпова Г.Г., Комарова Н.И., Фролова С.Б. Аффинная модификация рибосом E.coli аналогом мРНК производным 5'-трифосфата гептауридиловой кислоты // Биоорган.химия. 1985. Т.П. С.499-507.

10. Гринёва Н.И., Зарытова В.Ф., Кабашева Т.Н., Кнорре Д.Г., Козоровицкий А.Я. О конформации 2',3'-бензилиденовых производных олигонуклеотидов // Докл.АН СССР. 1971. Т.198. С.582-584.

11. Донцова O.A., Богданова С.Л., Розен КВ., Скрябин Г.А., Скрипкин Е.А., Копылов A.M., Богданов A.A. Фотоаффинная модификация малой субчастицы рибосом Escherichia coli 5'-диазирильными производными мРНК//Док.Акад.Наук. 1990. Т.313. С.730-733.

12. Донцова O.A. Развитие химических методов изучения структуры и функции сложных рибонуклеопротеидных систем // Дисс. докт.хим.наук. Москва, МГУ. 1997.

13. Дорохов Д.В., Одинцов В.Б., Кириллов C.B. Связывание аминоацил-тРНК с А-участком не вызывает удаления деацилированной тРНК из Е-участка 70S рибосомы // Биополимеры и клетка. 1989. Т.5. С.32-35.

14. Карпова Г.Г. Химические аспекты комплементарно-адресованной модификации нуклеиновых кислот // Изв.СО АН СССР, сер.хим.наук. 1987. Вып.4. С.82-95.

15. Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г. Структурно-функциональная топография рибосом E.coli по данным аффинной модификации реакционноспособными аналогами мРНК и тРНК // Успехи химии. 1991. Т.32. С.3-49.

16. Кнорре Д.Г., Карпова ГГ., Кобец Н.Д. Аффинная модификация рибосом E.coli вблизи мРНК- и тРНК-связывающих центров // Итоги Науки и Техники. M.: ВИНИТИ. 1985. Т.4. С.87-143.

17. Кнорре Д.Г., Зарытова В.Ф., Бадашкеева А.Г., Фёдорова О.С. Реакционноспособные производные олигонуклеотидов как ген-направленные биологически активные вещества // Итоги Науки и Техники. М.: ВИНИТИ. 1991. Т.37. С.3-180.

18. Кобец Н.Д., Карпова Г.Г. Белки большой 50S субчастицы рибосом E.coli расположенные вблизи мРНК-связывающего участка рибосомы // Биоорган.химия. 1980. Т.6. С.1585-1586.

19. Малыгин A.A., Грайфер Д.М., Зенкова М.А., Мамаев C.B., Карпова Г.Г. Аффинная модификация 80S рибосом из плаценты человека производными три- и гексауридилатов в качестве аналогов мРНК // Молекуляр.биология. 1992. Т.26. С.369-378.

20. Манисипис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование // пер. с англ. / М.: «Мир». 1984. С.74-83.

21. Репкова М.Н., Иванова P.M., Филиппов Р.В., Веньяминова А.Г. Фотоактивируемые перфторарилазидные производные олигорибонуклеотидов: синтез и свойства // Биоорган.химия. 1996. Т.22. С.432-440.

22. Сергиев П.В., Лаврик H.H., Докудовская С.С., Донцова O.A., Богданов A.A. Строение декодирующего центра рибосомы // Биохимия. 1998. Т.63. С.1129-1143.

23. Agrawal R.K., Penczek P., Grassucci R.A., Li Y., Leith A., Nierhaus K.H., Frank J. Direct visualization of A-, P- and E-site transfer RNA's in the Escherichia coli ribosome // Science. 1996. V.271. P.1000-1002.

24. Axelos M., Bardet C., Liboz Т., Le Van Thai A., Curie C., Lescure B. The gene family encoding the Arabidopsis thaliana translation elongation factor EF-la: Molecular cloning, characterization and expression // Mol.Gen.Genet. 1989. V.219. P. 106-112.

25. Ban N., Nissen P., Hansen J., Capel M., Moore P.B., Steitz T.A. Plasement of protein and RNA structures into a 5A-resolution map of the 50S ribosomal subunit // Nature. 1999. V.400. P.841-847.

26. Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Synthesis of ribonucleotides and diribonucleotide phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues // Tetr.Lett. 1967. P.3557-3562.

27. Beyer D., Skripkin E., Wadzack J., Nierhaus K.H. How the ribosome moves along the mRNA during protein synthesis // J.Biol.Chem. 1994. V.269. P.30713-30717.

28. Bhangu R., Wollenzien P. The mRNA binding track in the Escherichia coli ribosome for mRNAs of different sequences // Biochemistry. 1992. V.31. P.593 7-5944.

29. Bhangu R., Juzumiene D., Wollenzien P. Arrangement of messenger RNA on Escherichia coli ribosomes with respect to 10 16S rRNA cross-linking sites // Biochemistry. 1994. V.33. P.3063-3070.

30. Bommer U.-A., Noll F., Putsch G., Bielka H. Immunochemical detection of proteins in the small subunit of rat liver ribosomes involved in binding of the ternary initiation complex // FEBS Lett. 1980. V. 11. P. 171-174.

31. Brennicke A., March/elder A., Binder S. RNA editing // FEMS Microbiol.Rev. 1999. V.23. P.297-316.

32. Burkhardt N. Junemann R., Spahn C.M.T., Nierhaus K.H. Ribosomal tRNA binding sites: three-site model of translation'// Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 1998. V33. P.95-149.

33. Chakraburtty K. Functional interaction of yeast elongation factor 3 with yeast ribosomes //The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 1999. V.31. P. 163-173.

34. Chittum H.S., Lane W.S., Carlson B.A., Roller P.P., Lung F.D., Lee B.J., Hatfield D.L. Rabbit beta-globin is extended beyond its UGA stop codon by multiple suppressions and translational reading gaps // Biochemistry. 1998. V.37. P. 10866-10870.

35. Clark B.F.C., Grunberg-Monago M., Gupta N.K., Hershey J.W.B., Hinnebusch A.G., Jackson R.J., Maitra U., Mathews M.B. Merrick IV.C., Rhoads R.E., Sonenberg N. Spremulli

36. L., Trachsel H., Voorma H.O. Prokaryotic and eukariotic Unslation factors // Biochimie. 1996. V.78. P. 1119-1122.

37. Clark B.F.C., Thirup S., Kjeldgaard M, Nyborg J. Structural information for explaining the molecular mechanism of protein biosynthesis // FEBS Lett. 1999. V.452. P.41-46.

38. Clemons Jr W.M., May J.L.C., Wimberly B.T., McCutcheon J.P., Capel M.S., Ramakrishnan V. Structure of a bacterial 30S ribosomal subunit at 5.5A resolution // Nature, 1999. V.400. P.833-840.

39. Commons S., Bock A. Selenocysteine inserting tRNAs: an overview // FEMS Microbiol.Rev. 1999. V.23. P.335-351.

40. Craigen W.J., Cook R.G., Tate W.P., Caskey C.T. Bacterial peptide chain release factors: conserved primary structure and possible frameshift regulation of release factor 2 // Proc.NatI.Acad.Sci. 1985. V.82. P.3616-3620.

41. Cunningham P.R., Nurse K., Weilzmann C.J. Negre D., Ofengand J. G1401: a keystone nucleotide at the decoding site of Escherichia coli 30S ribosomes // Biochemistry. 1992. V.31. P.7629-7637.

42. Curran J.F., Yarns M. Use of tRNA suppressors to probe regulation of Escherichia coli release factor 2 // J.MoI.BioL 1988. V.203. P.75-83.

43. Dabrowski M., Spahn C.M.T., Schafer M.A., Patzke S., Nierhaus K.H. Protection patterns of tRNA do not change during ribisomal translocation // J.Biol.Chem. 1998. V.273. P.32793-32800. '

44. Dokudovskaya S.S., Dontsova O.A. Bogdanova S.L. Bogdanov A.A., Brimacombe R. mRNA-ribosome interactions // Biotechnol.Appl.Biochem. 1993. V.18. P.149-155.

45. Dontsova O.A., Rosen K.V., Bogdanova S.L., Skripkin E.A., Kopylov A.M., Bogdanov A.A. Identification of the Escherichia coli 30S ribosomal subunit protein neighboring mRNA during initiation of translation // Biochimie. 1992a. V.74. P.363-371.

46. Dube P., Wieske M., Stark H., Schatz M, Stahl J., Zemlin F., Lutsch G., van Heel M. The 80S rat liver ribosome at 25Ä resolution by electron cryomicroscopy and angular reconstitution // Structure. 1998. V.6. P.389-398.

47. Favre A. 4-thiouridine as an intrinsic photoaffinity probe of nucleic acid structure and intractions // In: Morrison H., ed. Bioorganic photochemistry: photochemistry and the nucleic acids, New York: John Wiley & Sons, Inc. 1990. V. 1. P.379-425.

48. Favre A., Saintome C., Fourreu J.-L, Clivio P., Laugaa P. Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid protein interactions // Journal of Photochemistry and Photobiology. 1998. V.42. P. 109-124.

49. Felden B., Hi me no H., Muto A., McCutcheon J., Atkins J. F., Gesteland R.F. Probing the structure of the Escherichia coli 10Sa RNA (tmRNA) // RNA; 1997. V.3. P.89-103.

50. Frolova L., Le GoffX., Zhouravleva G., Davydova E., Philippe M., Kisselev L. Eukariotic polypeptide chain release factor eRF3 is an eRFl- and ribosome-dependent guanosine triphosphatase // RNA. 1996. V.2. P.334-341.

51. Gimautdinova O.I., Karpova G.G., Knorre D.G., Kobetz N.D. The proteins nf the messenger RNA binding site of Escherichia coli ribosomes // Nucl. Acid.Res. 1981. V.9. P.3465-3481.

52. Gnirke A., Geigenmuller U., Rheinberger H.-J., Nierhaus K.H. The allosteric three-site model for the ribosomal elongation cycle analysis with a heteropolymeric mRNA // J.Biol.Chem. 1989. V.264. P.7291-7301.

53. Gontarek R.R., Li H., Nurse K., Prescott C D. The N terminus of eukaryotic translation elongation factor 3 interacts with 18S rRNA and 80S ribosomes // J.Biol.Chem. 1998. V.273. P.10249-10252.

54. Grcievskaja R.A., Ivanov Y. V., Saminsky E.M. 70S ribosomes of Escherichia coli have an additional site for deacylated tRNA binding // Eur.J.Biochem. 1982. V.128. P.47-52.

55. Graifer D.M., Zenkova M.A., Malygin A.A., Mamaev S.V., Mundus D.A., Karpova G.G. Identification of site on 18S rRNA of human placenta ribosomes in the region of the mRNA binding center //J.MoI.Biol. 1990. V.214. P.121-128.

56. Graifer D.M., Nekhai S.Y., Mundus D.A., Fedorova OS., Karpova G.G. Interaction of human and Escherichia coli tRNAPhc with human 80S ribosomes in the presense of oligo- and polyuridylate templates // Biochem.Biophys.Acta. 1992. V.l 171. P.56-64.

57. Graifer D.M., Juzumiene D.I., Karpova G.G. Wollenzien P. mRNA binding track in the human 80S ribosome for mRNA analogues randomly substituted with 4-thiouridine residues // Biochemistry. 1994a. V.33. P.6201-6206.

58. Gray N.K., Wickens M. Control of translation initiation in animals // Annu.Rev.Cell Dev.Biol. 1998. V.14. P.399-458.

59. Green Noller HF. Ribosomes.and translation II Annu.Rev.Biochem. 1997. V.66. P.679-716.

60. Grentzmann G.t Brechemier-Baey D., Heurgue F., Mora L., Buckingham R.H. Localization and characterization of the gene encoding release factor RF3 in Escherichia coli II Proc.Natl.Acad.Sci, 1994. V.91. P.5848-5852.

61. Gutell R.R. Collection of small subunit (I6S and 16S-Iike) ribosomal RNA structures // Nucl.Acid.Res. 1993. V.21. P.3051-3054.

62. Gutell R., Larsen N., Woese C. Lessons from an evolving rRNA: 16S and 23S rRNA structures from a comparative perspective // Microbiol.Rev. 1994. V.58. P. 10-26.

63. Gutell R.R. Ribosomal RNA: Structure, evolution, processing and function in protein biosynthesis / Eds Zimmermann R.A., Dahlberg A.E. New York, London and Tokyo: CRC press, 1996, P.l 11-128.

64. Horowitz S., Gorovsky M.A. An unusual genetic code in nuclear genes of Tetrahymena II Proc.Natl.Acad.Sei. 1985. V.82. P.2452-2455.

65. Huttenhofer A., Noller H.F. Footprinting mRNA-ribosome complexes with chemical probes//EMBO J. 1994. V.13. P.3892-3901.

66. Juzumiene D.I., Shapkina T.G., Wollenzien P. Distribution of cross-links between mRNA analogues and 16S rRNA in Escherichia coli 70S ribosomes made under equilibrium conditions and their response to tRNA binding//J.Biol.Chem. 1995. V.270. P.12794-12800.

67. Kawashima T., Berthet-Colominas C., Wulff M., Cusack S., Leberman R. The structure of the Escherichia coli EF-Tu*EF-Ts complex at 2.5Ä resolution // Nature. 1996. V.379. P.511-518.

68. Kirillov S.V., Makarov E.M., Semenkov Yu.P. Quantitative study of interaction of deacylated tRNA with Escherichia coli ribosomes: role of 50S in formation of E-site // FEBS Lett. 1983. V.157. P.91-94.

69. Kovalchuke O., Ziehler J., Chakraburtty K. Comparative analysis of ATPase of yeast elongation factor 3 and ATPase associated with Tetrahymena ribosomes // Biochimie. 1995. V.77. P.713-718.

70. Kozak M. Primer extention analysis of eukaryotic ribosome-mRNA complexes // Nucl.Acid.Res. 1998. V.26. P.4853-4859.

71. Maden B.E.H., Dent C.L., Farrel T.E., Garde J., McCallum F.S., Wakeman J.A. Clones of human ribosomal DNA containing the complete 18S-rRNA and 28S-rRNA genes // Biochem.J. 1987. V.246. P.519-522.

72. Madjar J.-J., Arpin M., Buisson M., Reboud J.-P. Spot position of rat liver ribosomal proteins by four different two-dimentional electrophoresis in polyacrylamide gel // Mol.Gen.Genet. 1979. V.171. P.121-134.

73. Malygin A.A., Dobrikov M.I., Repkova M.N., Shishkin G.V., Ven'yaminova A.G., Karpova G.G. Proteins neighboring 18S rRNA conserved sequences 609-618 and 1047-1061 within the 40S human ribosomal subunit//RNA. 1999. V.5. P.1656-1664.

74. Martin R. On the relationship between preferred termination codon context and nonsense suppression in human cells //Nucl.Acid.Res. 1994. V.22. P.15-19.

75. Matasova N.B., Myltseva S.V., Zenkova M.A., Graifer D.M., Vladimirov S.N., Karpova G.G. Isolation of ribosomal subunits containing intact rRNA from human placenta. Estimation of functional activity of 80S ribosomes//Anal.Biochem. 1991: V.198. P.219-223.

76. Matassova N.B., Venjaminova A.G., Karpova G.G. Nucleotides of 18S rRNA surrounding mRNA at the decoding site of translating human ribosome as revealed from the cross-linking data//Biochim.Biophys.Acta. 1998. V.1397. P.231-239.

77. McCaughan KK, Brown C.M., Berry M.J. Tate W.P. Translation termination efficiency in mammals is influenced by the base following the stop codon // Proc.Natl.Acad.Sci. 1995. V.92. P.5431-5435.

78. Merrick W.C. Eucaryotic mRNAs: strange solutions require unusual problems // The ribosome: structure, function and evolution / Hill W.E. Dahlberg A.E. Garret R.A. et al. Eds. Washington DC: American Society for Microbiology, 1990. P.292-298.

79. Mikuni 0., Ito K., Moffat J., Matsumura K., McCaughan K., Nobukuni T., Tate W., Nakamura Y. Identification of the prfC gene, which encodes peptide-chain-release factor 3 of Escherichia coli II Proc.Natl.Acad.Sci. 1994. V.91. P.5798-5802.

80. Mizumoto K., Yagi Y., Itoh N, Toyama R., Kaziro Y. Mechanism of mRNA capping reaction // Cellular Regulation and Malignant Growth / Ebashi S., Ed. Tokyo: Sei.Soc.Press, / Berlin: Springer-Verlag, 1985. P.134-143.

81. Moazed D., Noller H.F. Binding of tRNA to the ribosomal A and P sites protect two distinct sets of nucleotides in 16S rRNA // J.Mol.Biol. 1990. V.211. P.135-145.

82. Mueller F., Brimacombe R. A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli 16S ribosomal RNA. I. Fitting the RNA to a 3D electron microscopic map at 20Ä // J.Mol.Biol. 1997. V.271. P.524-544.

83. Mueller F., Stark H., van Heel M. Rinke-Appel J., Brimacombe R. A new model for the three-dimensional folding of Escherichia coli 16S ribosomal RNA. III. The topography of the functional centre//J.Mol.Biol. 1997. V.271. P.566-587.

84. Mundus D„ Wollenzien P. Neighborhood of 16S rRNA nucleotides U788/U789 in the 30S ribosomal subunit determined by site-directed crosslinking // RNA. 1998. V.4. P.1373-1385.

85. Munroe D., Jacobson A. Poly(A) is a 3' enhancer of translatonal initiation // The ribosome: structure, function and evolution / Eds Hill W.E., Dahlberg A.E., Garret R.A. et al. Washington D.C.: American Society for Microbiology, 1990. P.299-305.

86. Nameki N., Tadaki T., Muto A. Amino acid acceptor identity switch of Escherichia coli tmRNA from alanine to histidine in vitro 11 J.Mol.Biol. 1999. V.289. P. 1-7.

87. Neefs J.-M., Van de Peer Y., Hendriks L., De Wächter R. Compilation of small ribosomal subunit RNA sequences // Nucl.Acid.Res. 1990. V. 18(Suppl.). P.2237-2242.

88. Nierhaus K.H. The allosteric three-site model for the ribosomal elongation cycle: features and future // Biochemistry. 1990. V.29. P.4997-5008.

89. Oba T., Andachi Y., Muto A., Osawa S. CGG: an unassigned or nonsense codon in Mycoplasma capricolum II Proc.Natl.Acad.Sci. 1991. V.88. P.921-925.

90. O'Connor M., Thomas C.L., Zimmermann R.A., Dahlberg A. E. Decoding fidelity at the ribosomal A and P sites: influence of mutations in three different regoins of the decoding domain in 16S rRNA //Nucl.Acid.Res. 1997. V.25. P.l 185-1 193.

91. Ogawa K., Kaji A. Ribosome run through of the termination codon in the absence of the ribosome releasing factor// Biochim.Biophys.Acta. 1975. V.402. P.288-296.

92. Poole E.S., Brown C.M., Tate W.P. The identity of the base following the stop codon determines the efficiency of in vivo translational termination in Escherichia coli II EMBO J. 1995. V.14. P.151-158.

93. Poot R.A., van der Worm S.H.E., Pleij C.W.A., van Duin J. Base complementarity in helix 2 of the central pseudoknot in 16S rRNA is essential for ribosome functioning // Nucl.Acid.Res. 1998. V.26. P.549-553.

94. Presutti C., Ciafre S.-A., Bozzoni I. The ribosomal protein L2 in S.cerevisiae controls the level of accumulation of its own mRNA // EMBO J. 1991. V. 10. P.2215-2221.

95. Proud C.G. Peptide-chain elongation in eukaryotes // Mol.Biol.Rep. 1994. V.19. P. 161170.

96. Riis B., Rattan S.I.S., Clark B.F.C., Merrick W.C. Eukaryotic protein elongation factors // TIBS. 1990. V.15. P.420-424.

97. Ringquist S., MacDonald M., Gibson T., Gold L. Nature of the ribosomal mRNA track: analysis of ribosome-binding sites containing different sequences and secondary structures // Biochemistry. 1993. V.32. P.10254-10262.

98. Rheinberger H.-J., Nierhaus K.H. Simultaneous binding of three tRNA molecules by the ribosome of Escherichia coli II Biochem.Int. 1980. V.l. P.297-303.

99. Rheinberger H.-J., Sternbach H., Nierhaus K.H. Three tRNA binding sites on Escherichia coli rihosomes // Proc.Natl.Acad.Sci. 1981. V.78. P.5310-5314.

100. Rheinberger H.-J., Nierhaus K.H. Allosteric interactions between the ribosomal transfer RNA-binding sites A and E // J.Biol.Chem. 1986. V.261. P.9133-9139.

101. Rheinberger H.-J., Sternbach H., Nierhaus K.H. Codon-anticodon interaction at the ribosomal E site//J.Biol.Chem. 1986. V.261. P.9140-9143.

102. Rheinberger H.-J. and Nierhaus K.H. The ribosomal E site at low Mg2+: coordinate inactivation of ribosomal functions at Mg2+ concentrations below 10 mM and its prevention by polyamines // J.Biomol.Struct.Dyn. 1987. V.5. P.435-446.

103. Robertson J.M., Wintermeyer W. Mechanism of ribosomal translocation. tRNA binds transiently to an exit site before leaving the ribosome during translokation // J.Mol.Biol. 1987. V.196. P.525-540.

104. Rodnina M.V., El'skaya A.V., Semenkov Yu.P., Kir ill ov S.V. Number of tRNA binding sites on 80S ribosomesand their subunits //FEBS Lett. 1988. V.231. P.71-74.

105. Rodnina M. V., El'skaya A. V., Semenkov Yu.P., Kirillov S. V. Interaction of tRNA with the A and P sites of rabbit-liver ribosomes and their 40S subunits // Eur.J.Biochem. 1989. V.l85. P.563-568.

106. Ryoji M., Berlcind R., Kaji A. Reinitiation of translation from the triplet next to the amber termination codon in the absence of ribosome-releasing factor // Proc.Natl.Acad.Sci. 1981. V.78. P.5973-5977.

107. Ryoji M., Yamane T., Gordon M, Kaji A. Two modes of amber codon read-through in vitro II Arch.Biochem.Biophys. 1985. V.238. P.636-641.

108. Santos M.A.S. Tuite M.F. The CUG codon is decoded in vivo as serine and not leucine in Candida albicans 11 Nucl. Acids Res. 1995. V.23. P.1481-1486.

109. Schmitt E., Guillon J.M., Meinnel T., Mechulam Y., Dardel F., Blanqi.it S. Molecular recognition governing the initiation of translation in Escherichia coli. A review // Biochimie. 1996. V.78. P.543-554.

110. Semenkov Yu.P., Kirillov S. V., Stahl J. 40S subunits from rat liver do contain two codon-dependent sites for transfer RNA//FEBS Lett. 1985. V.193. P.105-108.

111. Shatsky I.N., Bakin A.V., Bogdanov A.A., Vasiliev V.D. How does the mRNA pass through the ribosome? // Biochimie. 1991. V.73. P.937-945.

112. Spahn C.M.T., Nierhaus K.H. Models of the elongation cycle: an evaluation // Biol.Chem. 1998. V.379. P.753-772.

113. Spirin A.S. Storage of messenger RNA in eukaryotes: envelopment with protein, translational barrier at 5' side, or conformational masking by 3' side? // Mol.Reprod.Dev. 1994. V.38. P.107-117.

114. Stahl J., Kobets N.D. Affinity labelling of proteins at the mRNA binding site of rat liver ribosomes by an analogue of octauridylate containing an alkylating group attached to the 3'-end //FEBS Lett. 1981. V.123. P.269-272.

115. Stahl J., Kobets N.D. Affinity labelling of rat liver ribosomal protein S26 by heptaurigylate containing a 5"-terminal alkylating group // Molec.Biol.Rep. 1984. V.9. P.219-222.

116. Stahl J., Karpova G.G. Investigations on the messenger RNA binding site of eukaryotic ribosomes by using reactive oligo(U) derivatives // Biomed.Biochim.Acta. 1985. V.44. P. 10571064.

117. Staler J.P. Guthrie C. Mechanical devices of the spliceosome: motors, clocks, springs and things//Cell. 1998. V.92. P.315-326.

118. Stern S. Purohit P. An oligonucleotide analog approach to the decoding region of 16S rRNA //Bichem.Cell Biol. 1995. V.73. P,899-905. ■

119. Svoboda A.J., McConkey E.H. Cross-linking of proteins to ribosomal RNA in HeLa cell polysomes by sodium periodat // Biochim.Biophys.Res.Comm. 1978. V.81. P.l 145-1152.

120. Takahashi J., Ogata K. Ribosomal proteins cross-linked to natural mRNA by UV irradiation of rat liver polysomes // J.Biochem. 1981. V.90. P.1549-1552.

121. Tapprich W.E., Goss D.J., Dahlberg A.E. Mutation at position 791 in Escherichia coli 16S ribosomal RNA affects processes involved in the initiation of protein synthesis // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1989. V.86. P.4927-4931.

122. Tate W., Greuer B., Brimacombe R. Codon recognition in polypeptide chain termination: site directed crosslinking of termination codon to Escherichia coli release factor 2 // Nucl.Acid.Res. 1990. V.18. P.6537-6544.

123. Tate W.P., Brown C.M. Translational termination: «Stop» for protein synthesis or «Pause» for regulation of gene expression//Biochemistry. 1992. V.31. P.2443-2450.

124. Tate W.P., Poole E.S., Dalphin M.E., Major L.L. Crawford D.J.G., Mannering S.A. The translational stop signal: Codon with a context, or extended factor recognition element? // Biochimie. 1996. V.78. P.945-952.

125. Tolan D.R., Traut R.R. Protein topography of the 40S ribosomal subunits from rabbit reticulocytes shown by cross-linking with 2-iminothiolane // J.Biol.Chem. 1981. V.256. P.10129-10136.

126. Tuite M.F., StcinsfieldI. Knowing when to stop // Nature. 1994. V.372. P.614-615.

127. Tuite iVI.F., Stansfield I. Termination of protein synthesis // Mol.Biol.Rep. 1994b. V.19. P.171-181.

128. VanLoock M.S., Easterwood T.R., Harvey S.C. Major groove binding of the tRNA/mRNA complex to the 16S ribosomal RNA decoding site // J.Mol.Biol. 1999. V.285. P.2069-2078.

129. Varani G., Nagai K. RNA recognition by RNP proteins during RNA processing II Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct. 1998. V.27. P.407-445.

130. Verschoor A., Srivastava S., Grassucci R., Frank J. Native 3D structure of eukaryotic 80S ribosome:morphologocal homology with the E.coli 70S ribosome // The Journal of Cell Biology. 1996. V.133. P.495-505.

131. Wahle E., Ruegsegger U. 3"-end processing of pre-mRNA in eukaryotes // FEMS Microbiol.Rev. 1999. V.23. P.277-295.

132. Westermann P., Heumann W. Bommer V.-A., Bielka H., Nigard O. Hultin T. Cross-linking of initiation factor eIF-2 to proteins of the small subunit of rat liver ribosomes // FEBS Lett. 1979. V.97. P.101-104.

133. Westermcmn P. Nigard O., Bommer V.-A., Bielka H. Function and topography of components of initiation complexes of eucariotic translation // Nucl.Acid.Res. 1981. V.9. P.2387-2396.

134. Westermann P., Nygard O. The spartial arrangement of the complex between eucariotic initiation factor eIF-3 and 40S ribosomal subunit // Biochem.Biophys.Acta. 1983. Y.741. P.103-108.

135. Williams J.M., Donly B.C., Brown C.M., Adamski P.M., Trotrnan C.N., Tale W.P. Frameshifting in the synthesis of Escherichia coli polypeptide chain release factor two on eukaryotic ribosomes // Eur.J.Biochem. 1989. V.186. P.515-521.

136. Wilson S.K., Noller H.F. Molecular movement inside the translation engine // Cell. 1998. V.92. P.337-349.

137. Wool I.G., Chan Y.-L, Gluck A. Mammalian ribosomes: the structure and the evolution of the proteins /7 Translational control / Hershey J.W.B., Mathews M.B., Sonenberg N., Eds. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996. P.685-732.

138. Woodcock J., Moazed D., Cannon M. Davies J., Noller H.F. Interaction of antibiotics with A- and P-sitc-specific bases in 16S ribosomal RNA // EMBO J. 1991. V.10. P.3099-3103.

139. Yoshizawa S., Four my D., Puglisi J.D. Recognition of the codon-anticodon helix by ribosomal RNA // Science. 1999. V.285. P. 1722-1725.

140. Особую благодарность автор выражает своему научному руководителю Галине Георгиевне Карповой за постоянную заботу и опеку, за неоценимую помощь в критическом осмыслении полученных результатов и огромный труд, вложенный в написание данной работы.