Рибосомный белок S26 человека: взаимодействие с собственной пре-м РНК и участие в регуляции ее сплайсинга тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Иванов, Антон Валерьевич

• Иванов, Антон Валерьевич
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Иванов, Антон Валерьевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Рибосомные белки эукариот: регуляция экспрессии их генов и внерибосомные функции (Обзор литературы)

1.1. Регуляция экспрессии генов рибосомных белков

1.1.1. Регуляция на уровне транскрипции

1.1.2. Регуляция на стадии сплайсинга

1.1.2.1. Традиционный сплайсинг

1.1.2.2. Альтернативный сплайсинг

1.1.3. Регуляция на стадии трансляции

1.1.3.1. Особенности регуляции трансляции мРНК рибосомных белков

1.1.3.2. Структурные элементы мРНК рибосомных белков, участвующие в регуляции трансляции

1.1.3.3. Белковые факторы, связывающиеся с 5'-UTR мРНК рибосомных белков

1.1.3.4. Роль компонентов аппарата трансляции в регуляции трансляции мРНК рибосомных белков

1.2. Внерибосомные функции рибосомных белков

1.2.1. Ферментативная активность рибосомных белков

1.2.2. Связь между рибосомными белками и апоптозом

1.2.3. Роль рибосомных белков при злокачественной трансформации клеток

1.2.3.1. Экспрессия генов рибосомных белков в опухолевых клетках

1.2.3.2. Функции рибосомных белков при злокачественной трансформации

1.2.4. Рибосомные белки как антигены при аутоиммунных заболеваниях

1.2.5. Участие рибосомных белков в клеточном ответе на вирусную инфекцию

1.2.6. Влияние рибосомных белков на эмбриональное развитие

1.2.7. Несистематизированные внерибосомные функции

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рибосомный белок S26 человека: взаимодействие с собственной пре-м РНК и участие в регуляции ее сплайсинга»

В состав эукариотической рибосомы входят четыре РНК и около 80 белков. Точная регуляция биосинтеза рибосомных компонентов является необходимым условием для полноценной жизнедеятельности как отдельной клетки, так и целых органов. Нарушение этой регуляции приводит к таким критическим последствиям, как злокачественные трансформации, апоптоз, отклонения в развитии органов и т.д. Поэтому неудивительно, что на исследовании биосинтеза компонентов эукариотической рибосомы, в частности, рибосомных белков в настоящее время сосредоточены усилия многих исследовательских групп. Вначале необходимо отметить принципиальные различия в регуляции биосинтеза рибосомных белков у про- и эукариот. У прокариот гены рибосомных белков сосредоточены в оперонах, и регуляция их экспрессии в основном происходит по принципу "обратной связи" на стадии трансляции [1]. У эукариот гены рибосомных белков диспергированы в геноме [2], и регуляция их экспрессии происходит на стадиях транскрипции [3], сплайсинга [4] и трансляции [5]. Кроме того, у эукариот регуляция количества рибосомных белков в клетке может осуществляться за счет изменения скорости деградации вновь синтезированных белков [6]. К настоящему времени времени достигнуты значительные успехи в изучении регуляции транскрипции у дрожжей [3] и трансляции у высших эукариот [5]. Согласно полученным данным, в обоих случаях регуляция происходит координирование для генов всех рибосомных белков. Координация достигается благодаря наличию общих cw-активных элементов как в генах рибосомных белков, так и в их мРНК. С другой стороны, с помощью анализа EST последовательностей, соответствующих мРНК рибосомных белков человека [7], выявлены существенные различия в количествах мРНК, кодирующих разные рибосомные белки, в клетках нормальных тканей. Есть все основания полагать, что эти различия связаны с регуляцией экспрессии генов рибосомных белков на стадии сплайсинга их пре-мРНК. Однако экспериментальных доказательств регуляции биосинтеза рибосомных белков на стадии сплайсинга к настоящему времени получено мало, и большинство из них касается рибосомных белков низших эукариот (см., например, [4]). Согласно этим данным рибосомные белки могут связываться с собственными пре-мРНК и ингибировать их сплайсинг. Данные по регуляции сплайсинга пре-мРНК рибосомных белков млекопитающих, в частности человека, на момент начала настоящей работы полностью отсутствовали.

Целью настоящей работы являлось изучение связывания рибосомных белков человека с пре-мРНК и мРНК rpS26 и выявление роли rpS26 в сплайсинге своей пре-мРНК. Рибосомный белок S26 является одним из ключевых белков мРНК-связывающего центра рибосом млекопитающих [8] и не имеет гомологов среди рибосомных белков прокариот [9].

Основными задачами являлись: -- выявление рибосомных белков, взаимодействующих с пре-мРНК и мРНК rpS26; ~ получение рекомбинантного rpS26 человека и характеризация его взаимодействия с фрагментами пре-мРНК и мРНК rpS26;

-- определение участков связывания rpS26 на своих мРНК и пре-мРНК; ~ изучение сплайсинга in vitro фрагмента пре-мРНК rpS26, содержащего первый экзон, первый интрон и часть второго экзона, и выяснение роли rpS26 в этом процессе.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Иванов, Антон Валерьевич

Выводы.

1. Изучено взаимодействие белков малой субчастицы рибосомы человека с фрагментами пре-мРНК и мРНК рибосомного белка S26. а) Обнаружено, что рибосомные белки S23 и S26 специфично связываются с первым интроном пре-мРНК и в меньшей степени с фрагментом мРНК. б) Показано, что рибосомные белки 40S субчастицы значительно стимулируют связывание первого интрона пре-мРНК с белками ядерного экстракта клеток HeLa.

2. Изучено взаимодействие рибосомного белка S26 (rpS26) человека с фрагментами собственных пре-мРНК и мРНК. а) Установлено, что rpS26 как в свободном состоянии, так и в составе ядерного экстракта клеток HeLa специфично связывается с первым интроном своей пре-мРНК и в меньшей степени с фрагментом мРНК. б) Показано, что участок связывания rpS26 на пре-мРНК расположен в районе основного и альтернативного 3 '-сайтов сплайсинга первого интрона, а на мРНК - в районе, примыкающем к основному З'-сайту сплайсинга.

3. Изучен сплайсинг in vitro пре-мРНК рибосомного белка S26 (rpS26) человека, и выявлена роль rpS26 в этом процессе. а) Показано, что в результате сплайсинга фрагмента пре-мРНК, содержащего первый экзон, первый интрон и часть второго экзона, образуются два продукта, один из которых соответствует фрагменту зрелой мРНК, а другой является продуктом альтернативного сплайсинга. б) Установлено, что rpS26 специфично ингибирует образование обоих продуктов сплайсинга.

4. Предложена схема регуляции экспрессии гена рибосомного белка S26 человека на стадии сплайсинга по двум независимым механизмам. Один из них включает деградацию продукта альтернативного сплайсинга. В основе другого механизма лежит принцип "обратной связи", согласно которому при избытке рибосомного белка в клетке последний связывается с первым интроном своей пре-мРНК и тем самым подавляет сплайсинг.

2.3. Заключение

Представленная работа является первым принципиально важным этапом исследования, нацеленного на изучение регуляции сплайсинга пре-мРНК рибосомных белков человека. В частности, на примере rpS26 и его пре-мРНК установлено, что, как и в случае низших эукариот, регуляция сплайсинга пре-мРНК по крайней мере некоторых рибосомных белков человека может происходить по принципу "обратной связи", т.е. избыток свободного рибосомного белка в клетке может значительно ингибировать (или даже полностью подавлять) сплайсинг своей пре-мРНК. В настоящей работе получены также первые указания на то, что в регуляции экспрессии генов рибосомных белков млекопитающих могут принимать участие неродственные рибосомные белки. Кроме того, на примере пре-мРНК rpS26 показано, что пре-мРНК рибосомных белков человека могут подвергаться альтернативному сплайсингу, который может лежать в основе другого механизма регуляции биосинтеза рибосомных белков, связанного со специфичной деградацией продуктов альтернативного сплайсинга. Реализуются ли в клетках млекопитающих предложенные нами механизмы регуляции экспрессии генов рибосомных белков, покажут будущие эксперименты.

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть 3.1. Материалы

В работе использовали дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, дидезоксирибонуклеозидтрифосфаты и рибонуклеозидтрифосфаты фирмы "Sigma" (США); акриламид, дезоксихолат натрия, DTT, HEPES, LiClOi, N-N'-метиленбисакриламид, пуромицин, SDS, Трис, циклогексимид и краситель "Понсо С" фирмы "Fluka" (Швейцария); 2-меркаптоэтанол фирмы "Macherey-Nagel" (Германия); кумасси бриллиантовый голубой - "Ferak" (Германия); TEMED, спермидин и поли(А-и) -"Reanal" (Венгрия); полный и неполный адъюванты Фрейнда фирмы "Difco" (США); ферменты: AMV-ревертазу фирмы "Life Science" (США), РНКазу А фирмы "Sigma" (США), щелочную фосфатазу фирмы "Boehringer Mannheim" (Германия), полинуклеотидкиназу фага Т4 фирмы "Сибэнзим" (Россия), РНК-полимеразу фага Т7фирмы "Promega" (США), плазмиду рЕТ-15Ь "Ыоуа§еп"(Великобритания). a-32P]UTP (1000 Ки/ммоль) и [у-32Р]АТР (1000 Ки/ммоль) синтезированы в лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН; олигодезоксирибонуклеотиды, комплементарные нуклеотидиым последовательностям мРНК и пре-мРНК rpS26 человека, синтезированы в лаборатории медицинской химии ИХБФМ СО РАН. Клетки HeLa выращены в лаборатории биохимии нуклеиновых кислот ИХБФМ СО РАН. Линеаризованная плазмидная ДНК, содержащая 3'- и 5'-фланкирующие последовательности, Т7-промотор и последовательности, соответствующие первому интрону, второму экзону, второму интрону и части третьего экзона гена rpS26 человека, любезно предоставлена M.JI. Филипенко (ИХБФМ СО РАН). ДНК-матрица для синтеза фрагмента 18S рРНК человека получена Д.Д. Яньшиной (ИХБФМ СО РАН). ДНК-матрица для синтеза фрагмента пре-мРНК rpS13 человека и рекомбинантный rpS16 любезно предоставлены Н.М. Парахневич (ИХБФМ СО РАН). Рекомбинантные белки rpSlO и rpS19 получены О.И. Барановской (ИХБФМ СО РАН) и А.А. Малыгиным (ИХБФМ СО РАН), соответственно.

Прочие неназванные реактивы были марки "хч", "чда" или "осч". Для приготовления всех растворов использовали деионизованную воду (прибор для очистки воды VHQ-PS фирмы "SITA", Великобритания). Для фильтрования растворов и анализа связывания белков с РНК-транскриптами использовали нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0,45 мкм фирмы "Millipore" (США), для иммуноблотинга -фирмы "Amersham" (Великобритания).

УФ-индуцируемое сшивание рибосомных белков с РНК-транскриптами проводили, используя УФ-лампу фирмы "SpotCure" (Великобритания). Препараты сушили на вакуумном испарителе "UNIVAPO 100Н" (Германия). Измерение рН проводили на рН-метре ОР-264/1 "Radelkis" (Венгрия). Радиоактивность просчитывали на счётчиках "Rackbeta" и "Minibeta" фирмы "LKB-Pharmacia" (Швеция). Гели радиоавтографировали с использованием рентгеновской плёнки фирмы "Conica" (Япония). В работе использовали ультрацентрифугу "Beckman L8M", а также центрифуги "Beckman J2-21M", "Eppendorf 5403" и "Eppendorf 5415С" (Германия). Наработку рекомбинантного rpS26 проводили в вихревом биореакторе "БИОК" (производство ЗАО "Саяны") на базе Лаборатории генотерапии Института молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия). Нуклеотидные последовательности ДНК определяли с помощью автоматического секвенатора API PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) в "Межинститутском центре секвенирования ДНК" (Новосибирск, Россия).

3.2. Выделение 40S субчастиц рибосом человека

Рибосомные 40S и 60S субчастицы выделяли из нормальной послеродовой плаценты по методике, описанной в [243], в которую внесены небольшие изменения. Замороженную плаценту размалывали на миксере и суспендировали при 4°С в равном по весу количестве буфера, содержащего 250 мМ сахарозу, 1 г/л гепарина и 0.05 г/л циклогексимида. Полученный гомогенат центрифугировали на центрифуге "Beckman J2-21М" (ротор JA-14) при 4°С и 13000 об/мин в течение 30 мин. К постмитохондриальному супернатанту добавляли дезоксихолат натрия до концентрации 1% и перемешивали в течение 30 мин при 4°С. Постмитохондриальный супернатант, обработанный дезоксихолатом, центрифугировали в течение 40 мин при 4°С (центрифуга "Beckman J2-21М", ротор JA-20, 18000 об/мин). По окончании центрифугирования супернатант осторожно сливали. Осадок полисом растворяли при 4°С в 10 мл буфера 20 мМ Трис-НС1, рН 7.5, содержащего 100 мМ NH4C1, 3 мМ MgCl2, 0.125 мМ EDTA и 10 мМ 2меркаптоэтанол; нерастворившийся материал удаляли центрифугированием (центрифуга "Beckman J2-21M", ротор JA-20, 17000 об/мин, 15 мин, 4°С). Раствор полисом обрабатывали 0.5 мМ пуромицином 10 мин при 0°С, затем к раствору добавляли по каплям при постоянном помешивании 3 М КС1 до концентрации 0.5 М и инкубировали 20 мин при 37°С, после чего раствор наносили на линейный градиент плотности сахарозы (10 - 30%) в буфере 20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 500 мМ КС1, 3 мМ MgCl2, 0.125 мМ EDTA и 10 мМ 2-меркаптоэтанол, и центрифугировали 18 ч при 4°С (центрифуга "Beckman L8M", ротор SW-28, 20000 об/мин). Фракции, соответствующие 40S и 60S субчастицам, осаждали 0.7 объемами этанола (центрифуга "Beckman J2-21M", ротор JA-20, 18000 об/мин, 30 мин, 4°С), предварительно повысив концентрацию Mg2+ до 20 мМ и снизив концентрацию КС1 до 120 мМ. Осадки растворяли в воде до концентрации 80-120 оегбо/мл и хранили в жидком азоте порциями по 25 мкл.

3.3. Выделение суммарного 40S рибосомного белка

Рибосомные белки выделяли из 40S субчастиц рибосом человека (см. п. 3.2) двумя способами. В первом случае к охлажденному раствору 40S рибосомных субчастиц (см. п. 3.2) добавляли 2-меркаптоэтанол до концентрации 10 мМ, 1/20 объема 2 М MgCh и два объема ледяной уксусной кислоты (которую добавляли по каплям при перемешивании). Полученную суспензию выдерживали при постоянном перемешивании в течение 1 ч при 0°С для формирования осадка РНК, который отделяли с помощью центрифугирования (14000 об/мин, 30 мин, 4°С). К супернатанту добавляли 6 объемов ацетона и выдерживали 1 ч при -20°С. Рибосомные белки осаждали центрифугированием (13000 об/мин, 15 мин, ф 4°С), растворяли в 2%-ной уксусной кислоте, содержащей 10 мМ 2-меркаптоэтанол, и лиофилизововали.

Во втором случае нативный суммарный 40S рибосомный белок выделяли, добавляя к раствору 40S рибосомных субчастиц V* объма 100 мМ буфера Трис-HCl рН 7.5, содержащего 65 мМ MgCh, 3.25 мМ EDTA и 600 мМ КС1, с последующей инкубацией при 37°С в течение 10 мин. Затем раствор охлаждали при 0°С и медленно добавляли к нему 8 * М LiCl до концентрации 2 М. Полученную суспензию дополнительно выдерживали 1 ч при 0°С для формирования осадка РНК, который отделяли с помощью центрифугирования

14000 об/мин, 30 мин, 4°С). Супернатант, содержащий рибосомные белки, диализовали против 50 мМ буфера Трис-HCl, рН 7.5, содержащего 20 мМ MgCh, 250 мМ КС1 и 5 мМ DTT), в течение 12 ч при 4°С.

3.4. Анализ рибосомных белков одномерным и двумерным гель-электрофорезом

Для одномерного гель-электрофореза 15 мкг рибосомных белков, выделенных с помощью уксусной кислоты (см. п. 3.3), растворяли в 5 мкл буфера 60 мМ Трис-HCl, рН 6.8, содержащего 20%-ный глицерин, 0.05%-ный бромфеноловый синий, 1%-ный 2-меркаптоэтанол, 2%-ный SDS, инкубировали 10 мин при 60°С и анализировали с помощью одномерного электрофореза в ПААГ по методу Лэммли [244]. Для этого использовали ступенчатый ПААГ, состоящий из разделяющего (15%-ный акриламид, 0.4%-ный бисакриламид, 375 мМ Трис-HCl, рН 8.8 и 0.1%-ый SDS) и концентрирующего (4.5%-ный акриламид, 0.125%-ный бисакриламид, 125 мМ Трис-HCl, рН 6.8 и 0.1%-ный SDS) гелей, применяя в качестве электродного буфера 25 мМ Трис-глицин, рН 8.3, содержащий 0.1%-ный SDS. Электрофорез прекращали после выхода бромфенолового синего из геля.

Разделение рибосомных белков двумерным гель-электрофорезом проводили в двух системах, как описано в [235].

В первой системе 100-120 мкг рибосомных белков растворяли в 3 мкл 20 мМ буфера Трис-НзВОз, рН 8.3, содержащего 1 мМ EDTA, 8 М мочевину, 1%-ный 2-меркаптоэтанол и 0.01%-ный пиронин-G. Разделение в первом направлении (8%-ный акриламид, 0.132%-ный бисакриламид, 8 М мочевина, 10 мМ EDTA и 200 мМ Трис-Н3ВО3, рН 8.6) проводили в стеклянных трубках с внутренним диаметром 1 мм при токе 0.5 мА в течение 2 ч (в качестве верхнего электродного буфера использовали 60 мМ Трис-Н3ВО3, рН 8.3, содержащий 3 мМ EDTA, а в качестве нижнего электродного буфера - тот же буфер, но с рН 8.6). После разделения белков проводили диализ геля против 40 мМ буфера бис-Трис-НАс, рН 6.0, содержащего 6 М мочевину, 1%-ный SDS, 1%-ный 2-меркаптоэтанол и 0.1%-ный бромфеноловый синий, в течение 20 мин. Затем гель наслаивали на гель для электрофореза во втором направлении. Разделение белков проводили в присутствии SDS (разделяющий гель: 12.5%-ный акриламид, 0.25%-ный бисакриламид, 6 М мочевина и 100 мМ бис-Трис-НАс, рН 6.75; концентрирующий гель: 4%-ный акриламид, 0.07% бисакриламид, 6 М мочевина, 40 мМ бис-Трис-НАс, рН 6.0 и 0.2%-ый SDS; верхний электродный буфер: 50 мМ бис-Трис-MES, рН 6.5, содержащий

0.2%-ный SDS и 0.02%-ную тиогликолевую кислоту; нижний электродный буфер: 20 мМ бис-Трис-НАс, рН 6.75). Электрофорез проводили до выхода бром фенолового синего из геля.

Разделение суммарного 40S рибосомного белка двумерным гель-электрофорезом во второй системе проводили аналогичным образом, но с использованием других ПААГ и электродных буферов. Для разделения в первом направлении использовали ступенчатый ПААГ, состоящий из разделяющего (8%-ный акриламид, 0.132%-ный бисакриламид, 8М мочевина, 10 мМ EDTA и 200 мМ Трис-НзВОз, рН 8.6) и концентрирующего (4%-ный акриламид, 0.2%-ный бисакриламид, 8 М мочевина, 1 мМ EDTA и 20 мМ Трис-НзВОз, рН 8.2) гелей, применяя в качестве электродного буфера 60 мМ Трис-НзВОз, рН 8.2, содержащий 3 мМ EDTA. Гель после первого направления диализовали против раствора геля второго направления. Для разделения во втором направлении использовали 18%-ный ПААГ, содержащий 150 мМ ацетат калия, рН 4.5, и электродный буфер - 1.4%-ный глицин-уксусная кислота рН 4.0.

3.5. Получение кДНК для синтеза фрагментов мРНК и пре-мРНК рибосомного белка

S26 человека

Для синтеза фрагмента III пре-мРНК rpS26, соответствующего первому интрону, второму экзону, второму интрону и части третьего экзона, использовали ДНК-матрицу, любезно предоставленную M.JI. Филипенко (см. п.3.1). Матрицы для синтеза фрагментов

1, II и III пре-мРНК получали амплификацией вышеуказанной ДНК-матрицы, с использованием олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, последовательности которых приведены в табл. 3 (см. п. 2.1.1). Матрицу для синтеза фрагмента IV пре-мРНК получали в две стадии. Сначала проводили амплификацию суммарной кДНК клеток HeLa с использованием двух пар праймеров. В качестве первой пары использовали праймеры 1 и 4, а в качестве второй пары - 2 и 5. Затем полученные кДНК амплифицировали с использованием праймеров 1 и 5. Матрицу для синтеза мРНК получали амплификацией суммарной кДНК клеток HeLa с использованием праймеров 1 и 6. Во всех случаях продукты амплификации анализировали с помощью 2%-ного агарозного гель-электрофореза.

3.6. Получение меченых и немеченых РНК-транскриптов

Меченные Р фрагменты I, II, III и IV пре-мРНК и фрагмент мРНК получали транскрипцией in vitro, используя соответствующие ДНК-матрицы. Реакцию проводили в 20 мкл 40 мМ буфера Трис-HCl, рН 7.5, содержащего 6 мМ MgCh, 2 мМ спермидин, 5 мМ NaCl, 15-20 ед. акт. РНК-полимеразы фага Т7, рибонуклеозид-5'-трифосфаты: ATP, GTP, СТР (в концентрации 0.5 мМ каждый), UTP (в концентрации 0.05 мМ) и 10 мкКи [а-32P]UTP. Полученные транскрипты выделяли с помощью электрофореза в 5%-ном ПААГ в присутствии 8 М мочевины. Синтез немеченых РНК-транскриптов проводили в 100 мкл 120 мМ буфера HEPES-KOH, рН 7.6, содержащего 20 мМ MgCl2, 4 мМ DTT, по 0.4 мкмоль АТР, СТР, GTP и UTP, 0.1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 0.2 мМ спермидин, 5 мкг ДНК-матрицы, 20 ед. акт. РНКазина и 0.5 ед. акт. Т7 РНК-полимеразы, в течение 3 ч при 37°С. РНК-транскрипты выделяли с помощью электрофореза в 5%-ном денатурирующем ПААГ.

3.7. Получение рекомбинантного рибосомного белка S26 человека

Суммарную РНК из плаценты человека выделяли по методу, описанному в работе [245]. Выделение полиаденилированной РНК из суммарной клеточной РНК и синтез первой цепи кДНК с помощью праймера d(T)i2-i8 проводили в соответствие со . стандартными протоколами, описанными в [246]. кДНК rpS26 получали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием набора фирмы "Advanced Biotechnology". В качестве праймеров для амплификации использовали олигодезоксирибонуклетиды GGGAATTCGGATCCTTACATGGGCTTTGGTG и CGGGAATTCCATATGACAAAGAAACGCAGGAACAATGGTCG. Реакционную смесь предварительно инкубировали при 94°С 3 мин, после чего проводили амплификацию в • течение 30 циклов (30 с - 95°С, 40 с - 55°С и 1 мин - 72°С). Последнюю элонгацию проводили при 72°С в течение 7 мин. Продукты амплификации анализировали в 2%-ном агарозном геле. После гидролиза полученной ДНК рестриктазами BamHI и Ndel ее лигировали с плазмидой рЕТ-15Ь, которая предварительно была линеаризована по тем же самым сайтам рестрикции. После трансформации полученных плазмид в штамм E.coli XLl-Blue клетки наращивали в 100 мл среды LB, и плазмиду выделяли согласно [246]. Нуклеотидную последовательность кДНК rpS26, клонированную в плазмиду, определяли с помощью секвенированиия. Полученную плазмиду трансформировали в штамм E.coli BL21 (DE3), содержащий хромосомную копию гена РНК-полимеразы фага Т7. Посевной материал выращивали в 100 мл среды LB в присутствии 100 мкг/мл ампицилина до ОП580 2 о.е./мл, затем переносили в вихревой биореактор "БИОК", и проводили культивирование клеток согласно [247]. Синтез рекомбинантного белка индуцировали добавлением изопропил-р-О-тиогалактозида до концентрации 1 мМ. Клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием, ресуспендировали в 20 мМ буфере HEPES-KOH, рН 7.6, содержащем 20 мМ КС1, 6 мМ 2-меркаптоэтанол и 2 мМ фенилметансульфонил фторид, и лизировали с помощью 100 мкг/мл лизоцима в течение 30 мин при 0°С. После этого лизированные клетки обрабатывали ультразвуком (44 кГц) в течение 1.5 мин при 0°С, тельца включения осаждали с помощью центрифугирования при 18000 об/мин, 15 мин, 4°С, растворяли в 6 М гуанидингидрохлориде и осветляли центрифугированием при тех же условиях. Рекомбинантный белок выделяли из телец включения с помощью хроматографии на колонке, содержащей Ni-NTA-агарозу, как описано в инструкции фирмы-производителя. Белок элюировали 200 мМ имидазолом в буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, рН 7.5 и 6 М гуанидингидрохлорид. После выделения rpS26 ренатурировали методом ступенчатого диализа против 10 объемов 50 мМ буфера HEPES-KOH, рН 7.6, содержащего 1 М КС1, 20 мМ MgCh, 10 мМ 2-меркаптоэтанол и 1 М гуанидингидрохлорид на первой ступени, 0.5 М - на второй, 0.25 М - на третьей. На последней ступени диализа использовали тот же буфер, но без гуанидингидрохлорида. На каждой ступени диализ проводили в течение 2 ч при 0°С. После ренатурации концентрацию белка определяли по Брэдфорду. Полученный рекомбинантный rpS26 анализировали с помощью одномерного гель-электрофореза и двумерного гель-электрофореза в первой системе (см. п. 3.4).

3.8. Получение специфичной антисыворотки против рибосомного белка S26

Для иммунизации кроликов фрагмент геля, содержащий 100-120 мкг rpS26 (после двумерного гель-электрофореза во второй системе (см. п. 3.4)), гомогенизировали в 0.7 мл 10 мМ буфера Трис-HCl рН 7.5, содержащего 130 мМ NaCl и 50%-ный полный адъювант Фрейнда. Полученную суспензию вводили кроликам подкожно в область холки в четыре места. Последующие три иммунизации проводили анологичным образом с интервалом 1 месяц, но вместо полного адьюванта Фрейнда использовали неполный адъювант. Забор крови у кроликов проводили из крайней ушной вены через неделю после трех последних иммунизаций. Сыворотку очищали с помощью центрифугирования при 10000 об/мин в течение 15 мин, замораживали и хранили при -10°С.

Специфичность полученной атисыворотки проверяли с помощью иммуноблотинга. Для этого суммарный 40S рибосомный белок разделяли с помощью одномерного или двумерного (первая система) гель-электрофореза (см. п. 3.4) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану в 192 мМ буфере Трис-глиции, рН 7.5, содержащем 0.05%-ный SDS и 10%-ный метанол, в течение 30 мин при силе тока 100 мА на 50 см2 геля. После этого нитроцеллюлозную мембрану выдерживали в 50 мМ буфере Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 150 мМ NaCl, 0.05%-ный Tween 20 и 5%-ное обезжиренное молоко, в течение 1 ч и затем инкубировали 2 ч со специфичной антисывороткой, разбавленной в 1000 раз вышеуказанным буфером. После этого мембрану промывали три раза по 5 мин буфером А (50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, содержащим 150 мМ NaCl, 0.2%-ный Tween 20 и 5 мМ MgCb), инкубировали 2 ч с разбавленными в 1000 раз буфером А антителами против IgG кролика, конъюгированных со щелочной фосфатазой, и промывали 3 раза по 5 мин буфером А. После этого мембрану промывали в течение 2 мин в 50 мМ буфере Трис-HCl, рН 9.2, содержащем 150 мМ NaCl, 0.2%-ный Tween 20 и 5 мМ MgCb, и инкубировали в этом же буфере с субстратами щелочной фосфатазы, а с именно 0.33 мг/мл нитротетразолевого синего и 0.165 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата.

3.9. Выделение антител против рибосомного белка S26

Сто миллиграммов BrCN-агарозы инкубировали в 1 мМ НС1 в течение 15 мин при 20°С, после чего промывали 0.1 М NaiCC^ рН 9.0. Активированную BrCN-агарозу инкубировали при перемешивании с 15.6 нмоль рекомбинантного rpS26 в течение 2 ч при 20°С. К раствору белка предварительно добавили 0.1 М Na2C03, рН 9.0 до конечного рН 8.5. Затем сорбент попеременно промыли 4 раза по 1 мл 0.1 М СНзСОСЖа, рН 5.5 и 0.1 М ЫагСОз, рН 9.0, оба буфера содержали 0.5 М NaCl. Полученный аффинный сорбент уравновешивали 100 мМ буфером Трис-HCl, рН 7.5, содержащим 150 мМ NaCl (буфер Б), и инкубировали с 1 мл предварительно осветленной антисыворотки в течение 16 ч при 4°С. После этого сорбент промывали 2 мл 50 мМ буфера Трис-HCl, рН 7.5, содержащего 120 мМ NaCl и 0.5%-ный Нонидет Р-40 (буфер В), 2 мл 50 мМ буфера Трис-HCl, рН 7.5, содержащего 1.0 М LiCl и 0.5%-ный Нонидет Р-40, 4 мл буфера В и 4 мл буфера Б. Связавшиеся с сорбентом антитела элюировали 50 мМ буфером глицин-HCl, рН 2.5, содержащим 150 мМ NaCl. Очищенные антитела анализировали с помощью иммуноблотинга, как описано в. п. 3.8.

ЗЛО. Получение ядерного экстракта клеток HeLa

Клетки HeLa, выращенные в 0.5 л среды до концентрации 5х105 клеток/мл, осаждали низкоскоростным центрифугированием, промывали 20 мл буфера PBS (137 мМ

NaCl, 2.7 мМ КС1, 8 мМ Na2HP04, 1.5 мМ КН2Р04 и 0.5 мМ MgCl2), ресуспендировали в 5 мл 10 мМ буфера HEPES-KOH, рН 8.0, содержащего 10 мМ КС1, 1.5 мМ MgCl2 и 1 мМ DTT (буфер Г), и выдерживали в течение 10 мин при 0°С. После этого клетки снова осаждали низкоскоростным центрифугированием и осторожно гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе в 2 мл буфера Г. Для выделения ядер полученный лизат центрифугировали 10 мин при 3200 об/мин, супернатант удаляли, и образовавшийся ^ осадок центрифугировали 20 мин при 17000 об/мин. Осажденные ядра гомогенизировали в 340 мкл 20 мМ буфера HEPES-KOH, рН 8.0, содержащего 600 мМ КС1, 1.5 мМ MgCl2, 0.2 мМ EDTA, 20%-ный глицерин, 0.5 мМ PMSF и 0.1 мМ DTT, выдерживали 40 мин при 0°С и центрифугировали 30 мин при 17000 об/мин. После этого ядерный экстракт дважды (сначала 15 ч, а затем 4 ч) диализовали при 4°С против 200 мл 20 мМ буфера HEPES-KOH, рН 8.0, содержащего 100 мМ КС1, 0.2 мМ EDTA, 20%-ный глицерин, 0.5 мМ PMSF и 0.1 • мМ DTT.

3.11. Связывание рибосомных белков с РНК-транскриитами.

3.11.1. Связывание на нитроцеллюлозных фильтрах

Связывание РНК-транскриптов (~0.5 фмоль, 4000 имп/мин) с нативным суммарным 40S рибосомным белком человека (см. 3.3) проводили в 50 мМ буфере Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 20 мМ MgCh, 250 мМ КС1, 5 мМ DTT и 1 мг/мл БСА, в течение 1 ч при 0°С. РНК-транскрипты были предварительно предынкубированы в этом же буфере в течение 10 мин при 37°С и затем охлаждены до 0°С. Степень связывания определяли с помощью фильтрования комплексов через нитроцеллюлозные фильтры. Затем фильтры дважды промывали буфером связывания (по 1 мл), в котором отсутствовал бычий сывороточный альбумин, высушивали и просчитывали радиоактивность по Черенкову. Связывание РНК-транскриптов с рекомбинантными рибосомными белками S19 и S26 человека проводили аналогичным образом в 20 мМ буфере Трис-HCl, рН 7.5, содержащем 10 мМ MgCh, 300 мМ КС1, 2.5 мМ 2-меркаптоэтанол, 0.1%-ный Тритон Х-100 и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Кажущуюся константу ассоциации (Ка) РНК с белками определяли как величину, обратную концентрации белка при половинном значении плато изотермы.

3.11.2. РНК-белковый блотинг

Рибосомные белки 40S субчастицы после разделения одномерным (30 мкг) или двумерным (120 мкг) гель-электрофорезом переносили на нитроцеллюлозную мембрану (см. пп. 3.4 и 3.8). Мембрану окрашивали Понсо С для последующей идентификации связанных белков. Для блокирования неспецифических мест связывания использовали 20 мМ буфер Трис-HCl, рН 8.0, содержащий 60 мМ КС1, 1 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 0.2 мМ EDTA, 8%-ный глицерин, 0.5%-ный бычий сывороточный альбумин и 0.5 мкг/мл немеченой суммарной тРНК E.coli. Затем мембрану инкубировали 5 ч в этом же буфере, содержащем 0.75 нМ РНК-транскрипт (6 х 105 имп/мин), три раза промывали по 5 мин, высушивали и радиоавтографировали. Все процедуры проводили при комнатной температуре.

3.11.3. Связывание в составе ядерного экстракта клеток HeLa Связывание РНК-транскриптов с rpS26 в составе ядерного экстракта проводили при 0°С в течение 1 ч в 100 мкл 50 мМ буфера Трис-HCl, рН 7.5, содержащего 300 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 0.1%-ный Тритон Х-100 (буфер Д). Для этого 15 мкл ядерного экстракта клеток HeLa предварительно инкубировали в течение 5 мин при 30°С в буфере Д, а РНК-транскрипты (~0.5 фмоль, 4000 имп/мин) - 30 мин при тех же условиях. В определенных случаях к ядерному экстракту перед инкубацией добавляли 30 мкмоль рекомбинантного rpS26. Антитела, специфичные к rpS26, иммобилизовали на белок А -сефарозе, перемешивая 20 мг сорбента с 10 мкл антисыворотки в течение 2 ч при 0°С. Сорбент с иммобилизованными антителами промывали 5 раз по 1 мл буфера Д и добавляли к смеси, содержащей предынкубированные РНК-транскрипты и белки ядерного экстракта клеток HeLa, смесь выдерживали в течение 1 ч при 0°С. РНК-белковые комплексы, связавшиеся с сорбентом, выделяли низкоскоростным центрифугированием, промывали 5 раз по 1 мл буфера Д и разрушали инкубацией в 100 мкл 100 мМ буфера Трис-HCl, рН 7.5, содержащего 10 мМ EDTA, 10 мМ DTT и 2%-ный SDS, в течение 20 мин при 60°С. РНК-транскрипты выделяли фенольной депротеинизацией смеси и анализировали в 5%-ном денатурирующем полиакриламидном геле.

3.12. Прямые УФ-иидуцируемые сшивки белков ядерного экстракта с РНКтранскриптами

Смесь РНК-транскриптов (5 фмоль, 40000 имп/мин), белков (~ 40 мкг) ядерного экстракта клеток HeLa, 10 мкл буфера Е (17 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, содержащий 2.7 мМ MgCl2, 17 мМ креатинфосфат, 0.4 мМ АТР, 0.005%-ный Нонидет Р40, 1.8%-ный поливиниловый спирт и 1 ед. акт./мкл РНКазина) и 3 мкл 20 мМ ТЕА-НС1 буфера, рН 7.9, содержащего 100 мМ КС1, 0.2 мМ EDTA и 5%-ный глицерин, инкубировали в отсутствие или в присутствии белков (10 мкг) 40S субчастицы рибосом человека в течение 10 мин при 30°С. Затем к смеси добавляли гепарин до концентрации 5 мг/мл и смесь дополнительно инкубировали в течение 5 мин при той же температуре. Комплексы РНК-транскриптов (5 фмоль, 40000 имп/мин) с рибосомными белками (10 мкг) 40S субчастицы получали в тех же условиях, но в отсутствие белков ядерного экстракта. Полученные

РНК-белковые комплексы облучали в течение 30 с при 0°С прямым УФ-светом (А=254 нм, интенсивность 15 мВт/см2). После этого в реакционную смесь добавляли 30 мкл 8 М мочевины и 1 ед. акт. РНКазы Т1 и смесь инкубировали 1 ч при 37°С. Белки осаждали 4 объемами ацетона, высушивали, разделяли с помощью одномерного гель-электрофореза и переносили на нитроцеллюлозную мембрану, как описано выше (см. п.3.8). Мембрану окрашивали Понсо С и радиоавтографировали.

3.13. Сплайсинг фрагмента пре-мРНК in vitro и анализ продуктов сплайсинга

Меченный [32Р] РНК-транскрипт IV был приготовлен и очищен, как описано выше (см. п.3.6), но реакционная смесь дополнительно содержала 10 мМ GpppG в качестве аналога кэпа, а [а-32Р] UTP был заменен на [а-32Р] GTP. Сплайсинг проводили в 10 мкл буфера Е. Эту смесь предынкубировали при 30°С в течение 15 мин, затем к ней добавляли транскрипт (25000 имп/мин) и инкубировали при 30°С в течение 1 ч. По окончании инкубации к реакционной смеси добавляли 50 мкл раствора, содержащего 0.15 М NaCl, 0.1%-ный SDS, 12.5 мМ EDTA, 100 мМ Трис-HCl, рН 7.5, и 0.5 мкл протеиназы К (10 мг/мл), и выдерживали при 37°С 15 мин. РНК осаждали этанолом, промывали 70%-ным этанолом и анализировали электрофорезом в 6%-ном ПААГ в присутствии 8 М мочевины. В отдельных экспериментах к реакционным смесям добавляли соответствующие количества рекомбинантного рибосомного белка S26, SI0, S16 или S19 человека. Продукты сплайсинга выделяли с помощью электрофореза в 5%-ном денатурирующем ПААГ и использовали в качестве матриц для обратной транскрипции (см. выше). В качестве затравки использовали праймер 6. Полученную кДНК амплифицировали с помощью праймеров 1 и 6, после чего продукты амплификации клонировали в плазмиду pBlueScript II KS(-) по сайту рестрикции Smal. Нуклеотидную последовательность полученной конструкции определяли с помощью секвенированиия на автоматическом секвенаторе API PRISM 310 Genetic Analyzer.

3.14. Тоу-принтинг комплексов рибосомного белка S26 с фрагментами своих мРНК и пре-мРНК

Комплекс rpS26 с фрагментом мРНК и фрагментом IV пре-мРНК получали инкубацией 10 пмоль РНК-транскрипта с 16 пмоль рекомбинантного rpS26 в 10 мкл буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 60 мМ КС1, 8 мМ MgCl2 и 10 мМ DTT), содержащего по 10 нмоль dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 2 ед. акт. РНКазина и 10 пмоль соответствующего [32Р]-меченого праймера, в течение 30 мин при 30°С. Затем к реакционной смеси добавляли 2 ед. акт ревертазы AMV и дополнительно инкубировали в течение 40 мин при 30°С. В качестве контроля для обратной транскрипции использовали реакционную смесь, которая не содержала рекомбинантного rpS26. В паралельных экспериментах проводили секвенирование фрагментов мРНК и пре-мРНК по методу Сэнгера. Для этого 1 пмоль РНК-транскрипта инкубировали с 2 пмоль соответствующего [ Р]-меченого праймера в 2 мкл воды в течение 10 мин при 70°С, после чего выдерживали 10 мин при 0°С. Затем к смеси добавляли 2 мкл lOxAMVRT буфера (50 мМ Трис-HCl рН 8.3, 6 мМ MgCb, 40 шМ КС1 и 10 гпМ DTT), содержащего 2 мкл 0.1 М DTT, по 2 нмоль dATP, dCTP, dGTP и dTTP, 2 ед. акт. РНКазина, 4 ед. акт. AMV ревертазы и по 0.2 нмоль соответствующего дидезоксирибонуклеозидтрифосфата, и смесь инкубировали в течение 10 мин при 42°С. Во всех случаях реакцию останавливали'добавлением 100 мкл 1%-го SDS; ДНК выделяли с помощью фенольной депротеинизации смеси с последующим осаждением этанолом и анализировали электрофорезом в 8%-ном денатурирующем ПААГ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Иванов, Антон Валерьевич, 2005 год

1. Nomura М. Regulation of ribosome biosynthesis in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae: diversity and common principles // J. Bacteriol. 1999. V.181 P. 6857-6864.

2. Yoshihama M., Uechi Т., Asakawa S., Kawasaki K, Kato S., Higa S., Maeda N., Minoshima S., Tanaka Т., Shimizu N. Kenmochi N. The human ribosomal protein genes: sequencing and comparative analysis of 73 genes // Genome Res. 2003. V. 12. P. 379-390.

3. Zhao Y., SohnJ.H., Warner J.R. Autoregulation in the biosynthesis of ribosomes // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 699-707.

4. Vilardell J., Chartrand P., Singer R.H., Warner J.R. The odyssey of a regulated transcript // RNA. 2000. V. 6. P. 1773-1780.

5. Meyuhas O., Avni D., Shama S. Translational control of ribosomal protein mRNAs in eukaryotes // Translational control / Eds J.W.B. Hershey, M.B. Mathews, N. Sonenberg. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996. P. 363-388.

6. Bortoluzzi S., d'Alessi F., Romualdi C., Danieli G.A. Differential expression of genes coding for ribosomal proteins in different human tissues // Bioinformatics. 2001. V. 17. P. 1152-1157.

7. Грайфер Д.М., Карпова Г.Г., Кнорре ЦТ. Расположение матрицы на рибосоме человека по данным аффинной модификации реакционноспособными аналогами мРНК // Биохимия. 2001. Т.66. Вып. 6. С. 725-744.

8. D.C. A map of 75 human ribosomal protein genes // Genome Res. 1998. V. 8. P. 509-523.

9. Warner J.R. The economics of ribosome biosynthesis in yeast // Trends Biochem. Sci. 1999. V. 24. P. 437-440.

10. Lascaris R.F., Mager W.H., Planta R.J. DNA-binding requirements of the yeast protein Raplp as selected in silico from ribosomal protein gene promoter sequences // Bioinformatics.1999. V. 15. P. 267-277.

11. Yarragudi A., Miyake Т., Li R„ Morse R.H. Comparison of Abfl and Rapl in chromatin opening and transactivator potentiation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae И Mol. Cell. Biol. 2004. V. 24. P. 9152-9164.

12. Li В., Nierras C.R., Warner J.R. Transcriptional elements involved in the repression of ribosomal protein synthesis // Mol. Cell. Biol. 1999. V. 19. P. 5393-5404.

13. Lascaris R.F., de Groot E., Hoen P.-В., Mager W.H., Planta R.J. Different roles for Abflp and T-rich promoter element in nucleosome organization of the yeast RPS28A gene // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 1390-1396.

14. Shore D. RAP1: a protein regulator in yeast//Trends Genet. 1994. V. 10. P. 408-412.

15. Schmelzle Т., Веек Т., Martin D.E., Hall M.N. Activation of the RAS/Cyclic AMP pathway suppresses a TOR deficiency in yeast // Mol. Cell. Biol. 2004. V. 24. P. 338-351.

16. Klein C., Struhl K. Protein kinase A mediates growth-regulated expression of yeast ribosomal protein genes by modulating RAP1 transcriptional activity // Mol. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 1920-1928.

17. Neuman-Silberberg F.S., Bhattacharya S., Broach J.R. Nutrient availability and the

18. RAS/cyclic AMP pathway both induce expression of ribosomal protein genes in Saccharomyces but different mechanisms // Mol. Cell. Biol. 1995. V. 15. P. 3187-3196.

19. Mencia M., Moqtaderi Z, Geisberg J. V., Kuras L., Struhl K. Activator-specific recruitment of TFIID and regulation of ribosomal protein genes in yeast // Mol. Cell. 2002. V. 9. P. 823-833.

20. Mizuta K., Warner J.R. Continued functioning of the secretory pathway is essential for * ribosome synthesis // Mol. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 2493-2502.

21. Mizuta К., Tsujii R., Warner J.R., Nishiyama M. The C-terminal silencing domain of Raplp is essential for the repression of ribosomal protein genes in response to a defect in secretory pathway//Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1063-1069.

22. Fingerman I., Nagaraj V., Norrisa D„ Vershon A.K. Sfpl plays a key role in yeast ribosome biogenesis // Eukar. Cell. 2003. V. 2. P. 1061-1068.

23. Jorgensen P., Nishikawa J.L., Breitkreutz B.J., Tyers M. Systematic identification of pathways that couple cell growth and division in yeast // Science. 2002. V. 297. P. 395-400.

24. Marion R.M., Regev A., Segal E., Barash Y., Koller D., Friedman N., O'Shea K. Sfpl is a stress- and nutrient-sensitive regulator of ribosomal protein gene expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 14315-14322.

25. Jorgensen P., Rupes I., Sharom J.г., Shcneper L., Broach J.R., Tyers M. A dynamic transcriptional network communicates growth potentional to ribosome synthesis and critical cell size // Genes Dev. 2004. V. 18. P. 2491-2505.

26. Schawalder S.B., Kabani M., Howald I., Choudhury U,, Werner M., Shore D. Growthregulated recruitment of the essential yeast ribosomal protein gene activator Ifhl // Nature. 2004. V. 432. P. 1058-1061.

27. Wade J.T., Hall D.B., Struhl K. The transcription factor Ifhl is a key regulator of yeast ribosomal protein genes //Nature. 2004. V. 432. P. 1054-1058.

28. Rudra D., Zhao Y., Warner J.R. Central role of Ifhlp-Fhllp interaction in the synthesis of • yeast ribosomal proteins // EMBO J. 2005. V. 24. P. 533-542.

29. Durocher D., Jackson S.P. The FHA domain // FEBS Lett. 2002. V. 513. P. 58-66.

30. ReidJ.L., Iyer V.R., Brown P.O., Struhl K. Coordinate regulation of yeast ribosomal protein genes is associated with targeted recruitment of Esal histoneacetylase // Mol Cell. 2000. V. 6. P. 1297-1307.

31. Sienna N. Larson D.E., Sells B.H. Dexamethasone stimulates ribosomal protein L32 gene transcription in rat myoblasts//Mol. Cell. Endocrinol. 2000. V. 167. P. 127-137.

32. Curcic D., Glibetic M., Larson D.E., Sells B.H. GA-binding protein is involved in altered expression of ribosomal protein L32 gene // J. Cell. Biol. 1997. V. 65. P. 287-307.

33. Tasheva E.S., Roufa D.J. Regulation of human RPS14 transcription by intronic antisense RNAs and ribosomal protein S14 // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 304-316.

34. Jurica M.S., Moore M.J. Pre-mRNA splicing: awash in sea of proteins // Mol. Cell. 2003. V. 12. P. 5-14.

35. Caffarelli E., Fragapane P., Gehring C., Bozzoni I. The accumulation of mature RNA for the Xenopus laevis ribosomal protein LI is controlled at the level of splicing and turnover of the precursor RNA. // EMBO J. 1987. V. 6. P. 3493-3498.

36. Presutti C., Ciafre S.-A., Bozzoni I. The ribosomal protein L2 in S. cerevisiae controls the level of accumulation of its own mRNA // EMBO J. 1991. V. 10. P. 2215-2221.

37. Presutti C., Villa Т., Hall D„ Petrica C., Bozzoni I. Identification of the m-elements mediating the autogenous control of ribosomal protein L2 mRNA stability in yeast // EMBO J. 1995. V. 14. P. 4022-4030.

38. Dabeva M.D., Warner J.R. Ribosomal protein L32 of Saccharomyces cerevisiae regulates both splicing and translation of its own transcript. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 1966919674.

39. Li H., Dalai S., KohlerJ., Vilardell J., White S.A. Characterization of the pre-mRNA binding site for yeast ribosomal protein L32: the importance of a purine-rich internal loop. // J. Mol. Biol. 1995. V. 250. P. 447-459.

40. Vilardell J., Warner J.R. Ribosomal protein L32 of Saccaromyces cerevisiae influences both the splicing of its own transcript and the processing of rRNA // Mol. Cell. Biol. 1997. V. 17. P. 1959-1965.

41. Mao H., Williamson J.R. Local folding coupled to RNA binding in the yeast ribosomal protein L30 // J. Mol. Biol. 1999. V. 292. P. 345-359.

42. Mao H., White S.A., Williamson J.R. A novel loop-loop recognition motif in the yeast ribosomal protein L30 autoregulatory RNA complex // Nat. Struct. Biol. 1999. V. 6. P. 11391147.

43. Li Z, Paulovich A.G, Woolford J.L.Jr. Feedback inhibition of the yeast ribosomal protein gene CRY2 is mediated by the nucleotide sequence and secondary structure of CRY2 pre-mRNA // Mol. Cell. Biol. 1995. V. 15. P. 6454-6464.

44. Zheng Z.-M. Regulation of alternative RNA splicing by exon definition and exon sequences in viral and mammalian gene expression // J. Biomed. Sci. 2003. V. 11. P. 278-294.

45. Hilleren P., Parker R. Mechanisms of mRNA surveillance in eukaryotes. Annu. Rev. Genet. 1999. V. 33. P. 229-260.

46. Lee C., Atanelov L., Modrek В., Xing Y. ASAP: the alternative splicing annotation project // Nucl. Acids Res. 2003. V. 31. P. 101-105.

47. Lewis В.P., Green R.E., Brenner S.E. Evidence for the widespread coupling of alternative splicing and nonsense-mediated mRNA decay in humans // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. V. 100. P. 189-192.

48. Aw W.-B., Roufa D.J. The gene encoding human ribosomal protein S24 and tissue-specific expression of differentially spliced mRNAs // Gene. 1996. V. 169. P. 257-262.

49. Mitrovich Q.M., Anderson P. Unproductively spliced ribosomal protein mRNAs are natural targets of mRNA surveillance in C.elegans II Genes Dev. 2000. V. 14. P. 2173-2184.

50. Angelastro J.M., Klimaschewski L., TangS., Vitolo OV„ Weisman ТА., DonlinLT., Shelanski

51. ML., Green L.A. Identification of diverse nerve growth factor-regulated genes by serial analysis of gene expression (SAGE) profiling // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 1042410429.

52. Levi-Montalcini R. The saga of the nerve growth factor // Neuroreport. 1998. V. 9. P. R71-83.

53. Al-Atia G.R., Fruscoloni P., Jacobs-Lorena M. Translational regulation of mRNAs forribosomal proteins during early Drosophila development // Biochemistry. 1985. V. 24. P. 57985803.

54. Loreni F., Amaldi F. Translational regulation of ribosomal protein synthesis in Xenopus cultured cells: mRNA relocation between polysomes and RNP during nutritional shifts // Eur. J. Biochem. 1992. V. 205. P. 1027-1032.

55. Loreni F., Francesconi A., Amaldi F. Coordinate translational regulation in the synthesis of elongation factor la and ribosomal protein in Xenopus laevis И Nucl. Acids Res. 1993. V. 21. P. 4721-4725.

56. Amara F.M., Sun J., Wright J. A. Defining a novel c/s-element in the 3'-untranslated region of mammalian ribonucleotide reductase component R2 mRNA // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P.20126-20131.

57. Levi S., Avni D., Hariharan N., Perry R.P., Meyuhas O. Oligipyrimidine tract at the 5' end of mammalian ribosomal protein mRNAs is required for their translational control // Proc. Natl. Acad. Sci. 1991. V. 88. P. 3319-3323.

58. Kaspar R.L., Kakegava Т., Cranston H., Morris D.R., White M.W. A regulatory cis element and a specific binding factor involved in the mitogenic control of murine ribosomal protein L32 translation // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 508-514.

59. Severson W.E., Mascolo P.L., White M. W. Lymphocyte p56L32 is a RNA/DNA binding protein which interacts with conserved elements of the murine L32 ribosomal protein mRNA.// Eur. J. Biochem. 1995. V. 229. P. 426-432.

60. Patton J.G., Mayer S.A., Tempst P., and Nadal-Ginard B. Characterization and molecular • cloning of polypyrimidine tract binding protein: a component of a complex necessary for premRNA splicing//Genes Dev. 1991. V. 5. P. 1237-1251.

61. Pellizzoni L., Lotti F., Maras В., Pierandrei-Amaldi P. Cellular nucleic acid binding protein binds a conserved region of the 5' UTR of Xenopus laevis ribosomal protein mRNAs // J. Mol. Biol. 1997. V. 267. P. 264-275.t

62. Pellizzoni L., Lotti F., Rutjes S.A., Pierandrei-Amaldi P. Involvement of the Xenopus laevis Ro60 autoantigen in the alternative interaction of La and CNBP proteins with the 5' UTR of L4 ribosomal protein mRNA //J Mol. Biol. 1998. V. 281. P. 593-608.

63. Pruijn G.J.M., Slobbe R.L., van Venrooij W.J. Analysis of protein-RNA interaction within Ro ribonucleoprotein complexes//Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 5173-5180.

64. Cardinali В., Carissimi C., Gravina P., Pierandrei-Amaldi P. La protein is associated with terminal oligopyrimidine mRNAs in actively translating polysomes // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 35145-35151.

65. Crossio С., BoylP.P., Loreni F., Pierandrei-Amaldi P., Amaldi F. La protein has a positive effect on the translation of TOP mRNA in vivo H Nucl. Acids Res. 2000. V. 28. P. 2927-2934.

66. Duncan R., Milburn S.C., Hershey J.W.B. Regulated phosphorylation and low abundance of HeLa cell initiation factor eIF-4F suggest a role in translational control. Heat shock effects on eIF-4F // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 380-388.

67. Shama S., Avni D., Frederickson R.M., Sonenberg N. Meyuhas O. Overexpression of initiation factor eIF-4E does not relieve the translational repression of ribosomal protein mRNAs in quiescent cells // Gene Expr. 1995. V. 4. P. 241-252.

68. Reboud A.M., Dubost S., Reboud J.P. Identification of the proteins interacting with tRNA in rat liver small ribosomal subunits // FEBS Lett. 1983. V. 158. P. 285-288.

69. Westermann P., Heumann W., Bommer W.A., Bielka H„ Nygard O., Hultin T. Cross-linking of initiation factor eIF-2 to proteins of the small subunit of rat liver ribosomes // FEBS lett. 1979. V 97. P. 101-104.

70. Nygars O., Nilsson L., Westermann P. Characterisation of the ribosomal binding site for eukaryotic elongation factor 2 by chemical cross-linking // Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 910. P. 245-53.

71. Stewart M.J., Thomas G. Mitogenesis and protein synthesis: A role for ribosomal protein S6 phosphorylation? // BioEssays. 1994. V. 16. P. 1-7.

72. Terada N. Patel H.R., Takase K, Kohno K, Nairin A.C., and Gelfand E.W. Rapamicin selectively inhibits translation of mRNA encoding elongation factors and ribosomal proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. V.91.P. 11477-11481.

73. Je/feries H.B., Reinhard C., Kozma S.C., and Thomas G. Paramycin selectively represses ^ translation of the "polypyrimidine tract" mRNA family // Proc. Natl. Acad. Sci. 1994. V. 91. P.4441-4445.

74. Jefferies H.B.J., Fumagalli S., Dennis P.В., Reinhard C., PearsonR.B., and Thomas G. Rapamicin suppresses 5'TOP mRNA translation through inhibition p70s6k // EMBO J. 1997. V. 16. P. 3693-3704.

75. Reiter A.K., Anthony T.G., Anthony J.C., Jefferson L.S., Kimball S.R. The mTOR signaling # pathway mediates control of ribosomal protein mRNA translation in rat liver // Int. J. Biochem.

76. Cell Biol. 2004. V. 36. P. 2169-2179.

77. Hyman L.E., Wormington W.M. Translational inactivation of ribosomal protein mRNAs during Xenopus oocyte maturation // Genes Dev. 1988. V. 2. P. 598-605.

78. Minden S.L., Bassuk E.L., Nadler S.P. Lithium intoxication: a coordinated treatment approach // J. Gen. Intern. Med. 1993. V. 8. P. 33-40.

79. Stolovich M„ Lerer Т., Bolkier K, Cohen H„ Meyuhas O. Lithium can relieve translational repression of TOP mRNAs, elicited by various blocks along the cell cycle, in GSK3- and S6K-independent manner // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 5336-5342.

80. Caldarola S., Amaldi F., Proud C.G., Loreni F. Translation regulation of terminaloligopyrimidine mRNAs induced by serum ad amino acids involves distinct signaling event // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 13522-13531.

81. Kakegaxva Т., Ito M., Hayakawa A., Matsuda M., Tamura S., Saito H., Kaspar R.L., Kobayashi H. Rapamycin induces binding activity to the terminal oligopyrimidine tract of ribosomal protein mRNA in rats // Arch. Biochem. Biophys. 2002. V. 402. P. 77-83.

82. Kim J., Chubatsu L.S., Admon A., Stahl J., Fellows R., Linn S. Implication of mammalian ^ ribosomal protein S3 in the processing of DNA damage // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 1362013629.

83. Wilson D.M.lll, Deutsch W.A., Ketley M.R. Drosophila ribosomal protein S3 contains an activity that cleaves DNA at apurinic/apyrimidinic sites // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 2535925364.

84. Jung S.O., Lee J.Y., Kim J. Yeast ribosomal protein S3 has an endonuclease activity on • AP DNA//Mol. Cells. 2001. V. 12. P. 84-90.

85. Yacoub A., Kelley M.R., Deutsch W.A. Drosophila ribosomal protein P0 containsьapurinic/apyrimidinic endonuclease activity // Nucl. Acids Res. 1996. V. 24. P. 4295-4303.

86. Grabowski D.T., Pieper R.O., Futscher B. W., Deutsch W.A., Erickson L.C., Kelley M.R. Expression of ribosomal phosphoprotein P0 is induced by antitumor agents and increased in Mer- human tumor cell lines // Carcinogenesis. 1992. V. 13. P. 259-263.

87. Nadano D., Sato T.-A. Caspase-3-dependent and -independent degradation of 28S ribosomal RNA may be involved in the inhibition of protein synthesis during apoptosis initiated by death receptor engagement // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 13967-13973.

88. Nishida J., Shiratsuchi A., Nadano D., Sato T.-A., Nakanishi Y. Structural change of ribosomes during apoptosis: degradation and externalization of ribosomal proteins in doxorubicin-treated Jurkat cells // J.Biochem. 2002. V. 131. P. 485-493.

89. Spahn C.M.T., Beckmann R., Eswar N. Penczek P.A., Sali A., Blobel G., Frank J. Structure of the 80S ribosome from Saccharomyces cerevisiae tRNA-ribosome and subunitsubunit interaction // Cell. 2001. V. 107. P. 373-386.

90. Malygin A.A., Shaulo D.D., Karpova G.G. Proteins S7, S10, S16 and S19 of the human 40S ribosomal subunit are most resistant to dissociation by salt. // Biochim.Biophys.Acta. 2000. V.1494. P. 213-216.

91. Yamamoto T. Molecular mechanism of monocyte predominant infiltration in chronic inflammation: mediation by a novel monocyte chemotactic factor, S19 ribosomal protein dimer // Parhol. Int. 2000. V. 50. P. 863-871.

92. Shibuya Y., Shiokawa M., Nishiura H„ Nishimura Т., Nishino N„ Okabe H., Takagi K„ Yamamoto T. Identification of receptor-binding sites of monocyte chemotactic S19 ribosomal protein dimer//Am. J. Pathol. 2001. V. 159. P. 2293-2301.

93. Khanna N„ Reddy V.G., Tuteja N. Singh N. Differantial gene expression in apoptosis: identification of ribosomal protein S29 as an apoptotic inducer // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 277. P. 476-486.

94. Zhou ZD., Bao L., Liu D.G., Li M.Q., Ge Y.Z, Huang Y.L., Liu W.Y. Low content of protein S29 in ribosomes of human lung cancer cell line A549: detected by two-dimensional electrophoresis //Protein Pept. Lett. 2003. V. 10. P. 91-97.

95. Schimmer A.D., Hedley L.Z., Penn M.D., Minden M.D. Receptor- and mitochondrial-mediated apoptosis in acute leukemia: a translational view// Blood. 2001. V. 98. P. 3541-3553.

96. KangJ.J., Schaber M.D., Srinivasula S.M., Alnemri E.S., Litwack G., Hall D.J., Bjornsti M.A. Cascades of mammalian caspase activation in the yeast Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 3189-3198.

97. Khanna N., Sen S., Sharma H., Singh N. S29 ribosomal protein induces apoptosis in H520 cells and sensitizes them to chemotherapy // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 304. P. 26-35.

98. Naora H., Naora H. Involvement of ribosomal proteins in regulating cell growth and apoptosis: translational modulation or recruitment for extraribosomal activity? // Immunol. Cell Biol. 1999. V. 77. P. 197-205.

99. Song D., Sakamoto S., Taniguci T. Inhibition of Poly(ADP-ribose) polymerase activity by Bcl-2 in association with ribosomal protein S3a // Biochemistry. 2002. V. 41. P. 929-934.

100. Ни Z, Minden M.D., McCulloch E.A., Stahl J. Regulation of drug sensitivity by ribosomal protein S3a//Blood. 2000. V. 95. P. 1047-1055.

101. Kuo M.L., Shen S.C., Yang C.H., Chuang S.E., Cheng A.L., Huang T.S. Bcl-2 prevents topoisomerase II inhibitor GL331-induced apoptosis is mediated by down-regulation of poly(ADP-ribose)polymerase activity//Oncogene. 1998. V. 17. P. 2225-2234.

102. Jang C.-Y., Lee J. Y., Kim J. RpS3, a DNA repair endonuclease and ribosomal protein, is involved in apoptosis // FEBS Lett. 2004. V. 560. P. 81-85.

103. Neumann F., Krawinkel U. Constitutive expression of human ribosomal protein L7 arrests the cell cycle in G1 and induces apoptosis in Jurkat T-lymphoma cells // Exp. Cell. Res.1997. V. 230. P. 252-61

104. Berghoefer-Hochheimer Y., Zurek C., Woelfl S., Hemmerich P., Munder T. L7 protein is a coregulator of vitamin D receptor-retionoid X receptor-mediated transactivation // J. Cell. Biol. 1998. V. 69. P. 1-12.ri

105. Lopez C.D., Martinovsky G., Naumovski L. Inhibition of cell death by ribosomal protein L35a // Cancer Res. 2002. V. 180. P. 195-202.

106. Gross A., McDonnell J.M., Korsmeyer S.J. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis//Genes Dev. 1999. V. 13. P. 1899-1991.

107. Zhang L., Zhou W., Velculescu V.E., Kern S.E., Hruban R.H., Hamilton S.R., Vogelstein

108. В., Kinzler K. W. Gene expression profiles in normal and cancer cells // Science. 1997. V. 276. P. 1268-1272.

109. Amsterdam A., Sadler K.C., Lai K., Farrington S., Bronson R.T., Lees J.A., Hopkins N. Many ribosomal protein genes are cancer genes in zebrafish // PLoS Biol. 2004. V. 2. P. 06900698.

110. Barnard G.F., Staniunas R.J., Mori M., Puder M., Jessup M.J., Steele G.D.Jr., Chen L.B. Gastric and hepatocellular carcinomas do not overexpress the same ribosomal protein messenger RNAs as colonic carcinoma // Cancer Res. 1993. V. 53. P. 4048-4052.

111. Barnard G.F., Staniunas R.J., Bao S., Mafune K., Steele G.D.J.r, Gollan J.L., Chen L.B. Increased expression of human ribosomal phosphoprotein P0 messenger RNA in hepatocellular carcinoma and colon carcinoma // Cancer Res. 1992. V. 52. P. 3067-3072.

112. Starkey C.R., Levy L.S. Identification of differentially expressed genes in T-lymphoid malignancies in an animal model system // Int. J. Cancer. 1995. V. 62. P. 325-331.

113. Lian Z., Liu J., Li I, Li X, Tufan N.L.S., Wu M.-C., Wang H.-Y., Arbuthot P., Kew M., Feitelson M.A. Human SI 5a expression is upregulated by hepatitis В virus X protein I I Mol. Carcinogen. 2004. V. 40. P. 34-46.

114. Diamantis I.D., McGandy C.E., Chen T.J., Liaw Y.F., Gudat F., Bianchi L. Hepatitis В X-gene expression in hepatocellular carcinoma // J. Hepatol. 1992. V. 15 P. 400-403.

115. Pellegrini R., Martignone S., Merand S., Colnaghi M.I. Laminin receptor expression and function in small-cell lung carcinoma // Int. J. Cancer. 1994. V. 8. P. 116-120.

116. Castronovo V. Laminin receptors and laminin-binding proteins during tumor invasion and metastasis//Invasion Metastas. 1993. V. 13. P. 1-30.

117. Moll U.M., Petrenko O. The MDM-2-p53 interaction // Mol. Cancer Res. 2003. V. 1. P. 1001-1008.

118. Loging W.T., Reisman D. Elevated expression of ribosomal protein genes L37, RPP-1, and S2 in the presence of mutant p53 // Cancer Epidem. Biomark. Prevent. 1999. V8. P. 10111016.

119. Modugno M„ Tagliabue E., Ardini E„ Вето V., Galmozzi E., De Bortoli M„ Castronovo V., Menard S. p53-dependent downregulation of metastasis-associated laminin receptor // Oncogene. 2002. V. 21. P. 7478-7487.

120. Shi Y„ Zhai H., Wang X, Wu H., Ning X., Han Y., Zhang D., Xiao В., Wu K, Fan D. Multidrug-resistance-associated protein MGrl-Ag is identical to the human 37-kDa laminin receptor precursor // Cell. Mol. Life Sci. 2002. V. 59. P. 1577-1583.

121. Iwakuma Т., Lozano G. MDM2, an introduction // Mol. Cancer Res. 2003 V. 1. P. 9931000.

122. Dai M.-S., Lu H. Inhibition of MDM2-mediated p53 ubiquitination and degradation by ribosomal protein L5 // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 44475-44482.

123. Zhang Y., Wolf G.W., Bhat K, Jin A., Allio Т., Burkhart W.A., Xiong Y. Ribosomal protein LI 1 negatively regulates oncoprotein MDM2 and mediates a 53-dependent ribosomal-stress checkpoint pathway // Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 8902-8912.

124. Dai M.-S., Zeng S.X., Jin Y, SunX-X, David L., Lu H. Ribosomal protein L23 activates p53 by inhibiting MDM2 function in response to ribosomal perturbation but not to translation inhibition // Mol. Cell Biol. 2004. V. 24. P. 7654-7668.

125. Jin A., Itahana K, O'Keefe K, Zhang Y. Inhibition of HDM2 and activation of p53 by ribosomal protein L23 // Mol. Cell. Biol. 2004. V. 24. P. 7669-7680.

126. Bhat K.P., Itahana K, Jin A., Zhang Y. Essential role of ribosomal protein Lll in mediating growth inhibition-induced p53 activation // EMBO J. 2004. V. 23. P. 2402-2412.

127. Voit R., Kuhn A., Sander E.E., Grummt I. Activation of mammalian ribosomal gene transcription requires phosphorylation of the nucleolar transcription factor UBF // Nucleic. Acids Res. 1995. V. 23. P. 2593-2599.

128. Ahn B.H., Kim Т.Н., Bae Y.S. Mapping of the interaction domain of the protein kinase CKII p subunit with target proteins // Mol. Cells. 2001. V. 12. P. 158-63.

129. Soulet F., Saati T.A., Roga S., Amalric F., Bouche G. Fibroblast growth factor-2 interacts with free ribosomal protein S19 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V. 289. P. 591-596.

130. Williams B.R. Signal transduction via PKR // Science's STKE. 2001. V. 89. P. 1-10.

131. Meurs E.F., Galabru J., Barber G.N., Katze M.G., Hovanessian A.G. Tumor suppressor function of the interferon-induced double-stranded RNA-activated protein kinase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993. V. 90. P. 232-236.

132. Proud C.G. PKR: a new name and new roles // Trends Biochem. Sci. 1995. V. 20. P. 241246.

133. Koromilas A.E., Roy S., Barber G.N., Katze M.G., Sonenberg N. Malignat transformation by a mutant of the interferon-inducible double-stranded RNA dependent protein kinase // Science. 1992. V. 257. 1685-1689.

134. Kumar K.U., Srivastava S.P., Kaufman R.J. Double-stranded RNA-activated protein kinase (PKR) is negatively regulated by 60S ribosomal subunit protein LI 8 // Mol. Cell. Biol. 1999. V.19. P. 1116-1125.

135. Hamaguchi I., Ooka A., Brun J., Richter J., Dahl N., Karlsson S. Gene transfer improves erythroid development in ribosomal protein S19-deficient Diamond-Blackfan anemia // Blood. 2002. V. 100. P. 2724-2731.

136. Koga M., Shichijo S., Yamada A., Ashihara J., Sawamizu H., Kusukawa J., Itoh K. Identification of ribosomal proteins S2 and LlOa as tumor antigens recognized by HLA-A26-restricted CTL // Tissue Antigens. 2003. V. 61. P. 136-145.

137. Marks P.A., Richon V.M., Rifkind R.A. Cell cycle regulatory proteins are targets for induced differentiation of transformed cells: Molecular and clinical studies employing hybrid polar compounds // Int. J. Hematol. 1996. V. 63. PI-17.

138. The L.C., Bedwell A.E., Iseberg D.A., Gordon C., Emery P., Charles P.J., Harper M„ Amos N., Williams B.D. Antibodies to protein P in systemic lupus erythematosus // Ann. Rheum. Dis. 1992. V. 51. P. 489-494.

139. Derksen R.H., van Dam A.P., Gmelig Myling F.H., Bijlsma J.W., Smeenk R.J. A prospective study on antiribosomal P proteins in two cases of familial lupus and recurrent psychosis // Ann. Rheum. Dis. 1990. V. 49. P. 779-782.

140. Elkon K.B., Parnassa A.P., Foster C. Lupus autoantibodies target ribosomal P proteins // J. Exp. Med. 1985. V. 162. P. 459-471.

141. Isshi K., Hirohata S. Differential roles of the anti-ribosomal P antibody and anti-neuronal antibody in the pathogenesis of central nervous system involvement in systemic lupus erythematosu // Artthritis. Rheum. 1998. V. 41. P. 1819-1827.

142. Martin A., Reichlin M. Fluctuations of antibody to ribosomal 'P' proteins correlate with appearance and remission of nephritis in SLE // Lupus. 1996. V. 5. P. 22-29.

143. Koren E., Reichlin M.W., Koscec M., Fugate R.D., Reichlin M Autoantibodies to the ribosomal P proteins react with a plasma membrane related target on human cells // J. Clin. Invest. 1992. V. 89. P. 1236-1241.

144. Koscec M., Koren E., Wolfson-Reichlen M., Fugate R.D., Trieu E., Targoffl.N., Reichlin M. Autoantibodies to ribosomal P proteins penetrate into live hepatocytes and cause cellular dysfunction in culture//J. Immunol. 1997. V. 159. P. 2033-2041.

145. Chan E., Ко О., Lawton J., Lau C. The use of anti-ribosomal P antibodies in the diagnosis of cerebral lupus superiority of western blotting over enzyme-linked immunosorbent assay // Hong Kong Med J. 1998. V. 4. P. 145-150.

146. Reichlin M. Ribosomal P antibodies and CNS lupus // Lupus. 2003. V. 12. P. 916-918.

147. Hasegawa Я, Uchiumi Т., Sato Т., Saito A., Nakano M., Gejyo F. Autoantibody against ribosomal protein L14 in patients with systemic lupus erythematosus // Clin. Exp. Rheumat. 2002. V. 20. P. 139-144.

148. IVitte S., Krawinkel U. Specific interaction of the autoantigen L7 with multi-zink finger protein ZNF7 and ribosomal protein S7 // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 22243-22247.

149. Anderson C.J., Neas B.R., Uchiumi Т., Stafford A. Autoantibodies to the 20-kDa ribosomal proteins: identification, characterization, and new aspects on prevalence in systemic lupus erythematosus//Clin. Immun. 2001. V. 98. P. 249-257.

150. Apcher S., Fahraeus R., Manoury B. Epstein-Barr virus: exploiting the immune system by interfering with defective ribosomal products 11 Microb. Infect. 2004. V. 6. P. 1212-1218.

151. Clarke P.A., Schwemmle M., Schickinger J., Hilse K, Clemens M.J. Binding of Epstein-Barr virus small RNA EBER-1 to the double-stranded RNA-activated protein kinase DAI // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19. P. 243-248.

152. Nanbo A., Inoue K, Adachi-Takasawa K., Takada К Epstein-Barr virus RNA confers resistence to interferon-A-induced apoptosis in Burkitt's lymphoma // EMBO J. 2002. V. 21. P. 954-965.

153. Toczyski D.P., Matera A.G., Ward D.C., Steitz J.A. The Epstein-Barr virus (EBV) small RNA EBER1 binds and relocalizes ribosomal protein L22 in EBF-infected human В lymphocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V.91. P. 3463-3467.

154. Elia A., Vyas J., Laing K.G., Clemens M.J. Ribosomal protein L22 inhibits regulation of cellular activities by the Epstein-Barr virus small RNA EBER-1 // Eur. J. Biochem. 2004. V. 271. P. 1895-1905.

155. Rao C.N., Barsky S.H., Terranova V.P., Liotta L.A. Isolation of a tumor cell laminin receptor//Biochem. Biophys. Res. Common. 1983. V. 111. P. 804-808.

156. Rao C.N., Castronovo V., Schmitt M.C., Wewer U.M., Claysmith A.P., Liotta L.A., Sobel M.E. Evidence for a precursor of the high-affinity metastasis-associated murine laminin receptor // 1989. Biochemistry. V 28. P. 7476-7486.

157. Tohgo A., Takasawa S., Munakata H., Yonekura H., Hayashi N., Okamoto H. Structural determination and characterization of a 40 kDa protein isolated from rat 40S ribosomal subunit // FEBS Lett. 1994. V. 340. P. 133-138.

158. Kinoshita K, Kaneda Y„ Sato M., Saeki Y., Wataya-Kaneda M., Hoffmann A, LBP-p40 binds DNA tightly through associations with histones H2A, H2B, and H4 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V. 253. P. 277-282.

159. Gloe Т., Riedmayr S., Sohn H.-Y., Pohl U. The 67-kDa laminin-binding protein is involved in shear stress-dependent endothelial nitric-oxide synthase expression // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 15996-16002.

160. Бондаренко Е.И., Протопопова Е.В., Некрасов В.М., Локтев В.Б. Моноклональные антитела к рекомбинантному ламининсвязывающему белку человека. Получение и иммунохимическая характеристика // Вестник РАМН. 2004. Т. 8. С. 31-35.

161. Bridges C.B., Morgan Т.Н. The third chromosome group of mutant characters of Drosophila melanogaster II Carnegie Inst. Wash. Publ. 1923.

162. Marygold S.J., Coelho C.M., Leevers S.J. Genetic Analysis of RpL38 and RpL5, Two Minute Genes Located in the Centric Heterochromatin of Chromosome 2 of Drosophila melanogaster II Genetics. 2005. V. 169. P. 683-695.

163. Enerly E., Larsson J., Lambertsson A. Silencing the Drosophila ribosomal protein L14 gene using targeted RNA interference causes distinct somatic anomalies // Gene. 2003. V. 320. P. 41-48.

164. Saeboe-Larssen S., Lyamouri M., Merriam J., Oksvold M.P., Lambertsson A. Ribosomal protein insufficiency and the minute syndrome in Drosophila: a dose-response relationship // Genetics. 1998. V. 148. P. 1215-1224.

165. Oliver E.R., Saunders T.L., Tarle S.A., Glaser T. Ribosomal protein L24 defect in Belly spot and tail (BST), a mouse Minute 11 Development. 2004. V. 131. P. 3907-3920.

166. Matsson H., Davey E.J., Draptchinskaia N. Hamagichi I., OokaA., Leveen P., Forsberg E., Karlsson S., Dahl N. Target disruption of the ribosomal protein S19 gene is lethal prior to implantation // Mol. Cell. Biol. 2004. V. 24. P. 4032-4037.

167. Mazumder В., Mukhopadhyay C.K., Prok A., Cathcart M.K., Fox P.L. Induction of ceruloplasmin synthesis by IFN-y in human monocytic cells// J. Immunol. 1997. V. 159. P. 19381944.

168. Klebanoff S.J. Bactericidal effect of Fe2+, ceruloplasmin, and phosphate 11 Arch. Biochem. Biophys. 1992. V. 295. P. 302-308.

169. Mazumder В., Fox P.L. Delayed translational silencing of ceruloplasmin transcript in gamma interferon-activated U937 monocytic cells 11 Mol. Cell. Biol. 1999. V. 19. P. 6898-6905.

170. Mazumder В., Sampath P., Seshadri V., maitra R.K., DiColreto P.E., Fox P.L. Regulated release of LI3a from the 60S ribosomal subunit as a mechanism of transcript-specific translational control // Cell. 2003. V. 115. P. 187-198.

171. Kusui K., Sasaki H„ Adachi R., Matsui S., Yamamoto K., Yamaguchi Т., Kasahara Т., Suzuki K. Ribosomal protein SI8 identified as a cofilin-binding protein by using phage display library//Mol. Cell. Biochem. 2004. V. 262. P. 187-193.

172. Bamburg J.R. Proteins of the ADF/cofilin family: essential regulators of actin dynamics // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1999. V. 15. P. 185-230.

173. Pei L. Pituitary tumor-transforming gene protein associates with ribosomal protein S10 and novel human homologue of DnaJ in testicular cells // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 31513158.

174. Pei L„ Melmed S. Isolation and characterization of a pituitary tumor-transforming gene (PTTG) // Mol. Endocrinol. 1997. V. 11. P. 433-441.

175. Weinberg R.A. The retinoblastoma protein and cell cycle control // Cell. 1995. V. 81. P. 323-330.

176. Moorthamer M., Chaudhuri B. Identification of ribosomal protein L34 as a novel Cdk5 inhibitor// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 255. P. 631-638.

177. Koyama Y., Katagiri S., hanai S., Uchida K., Miwa M. Poly(ADP-ribose) polymerase interacts with novel Drosophila ribosomal proteins, L22 and L23a, with unique histone-like amino-terminal extension // Gene. 1999. V. 226. P. 339-345.

178. Miwa M., Hanai S., Poltronieri P., Uchida M., Uchida K. Functional analysis of poly(ADP-ribose) polymerase in Drosophila melanogaster II Mol. Cell. Biochem. 1999. V. 193. P. 103-107.

179. Myokai F., Oyama M„ Nishimura F., Ohira Т., Yamamoto Т., Arai Т., Takashiba S. Murayama Y. Unique genes induced by mechanical stress in periodontal ligament cells // J. Periodont. Res. 2003. V. 38. P. 255-261.

180. Brosche M„ Strid A. The mRNA-binding ribosomal protein S26 as a molecular marker in plants: molecular cloning, sequencing and differential gene expression during environmental stress // Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1445. P. 342-344.

181. Zhu Y, Lin H., Li Z., Wang M., Lao J. Modulation of expression of ribosomal protein L7a (L7a) ethanol in human breast cancer cells // Breast Cancer Res. Treat. 2001. V. 69. P. 29-38.

182. Lang C.H., Pruznak A.M., Deshpande N. Palopoli M.M., Frost R.A., Vary T.C. Alcohol intoxication impairs phosphorylation of S6K1 and S6 in skeletal muscle independently of ethanol metabolism //Alcohol. Clin. Exp. Res. 2004. V. 28. P. 1758-1767.

183. Ju Z., Dunham R.A., Liu Z. Differential gene expression in the brain of channel catfish (Ictalurus punctatus) in response to cold acclimation // Mol. Genet. Genomics. 2002. V. 268. P. 87-95.

184. Madjar J.-J., Arpin M., Buisson M., Reboud J.-P. Spot position of rat liver ribosomal proteins by four different two-dimentional electrophoresis in polyacrylamide gel // Mol. Gen. Genet. 1979. V.171. P.121-134.

185. Chen G.T., Inouye M. Role of the AGA/AGG codons, the rarest codons in global gene expression in Escherichia coli // Genes Dev. 1994. V. 8. P. 2641-2652.

186. O'Mullane L., Eperon J.C. The pre-mRNA 5' cap determines whether U6 small nuclear RNA succeeds U1 small nuclear ribonucleoprotein particle at 5' splice sites // Mol. Cell. Biol. 1998. V. 18. P. 7510-7520.

187. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 3406-3415.

188. Филипенко M.JI., Виниченко H.A., Карпова Г.Г., Мертвецов Н.П., Амалди Ф. Клонирование и структурно-функциональный анализ гена рибосомного белка S26 человека//Генетика. 1998. Т. 34. С. 469-474.

189. Liu Z.-R., Sargueil В., Smith С. W.J. Methylene blue-mediated cross-linking of proteins to double-stranded RNA // Methods Enzymol. 2000. V. 318. P. 35-47.

190. Бабкина Г.Т., Владимиров C.H., Грайфер Д.М., Матасова Н.Б., Смоленская И.А., Карпова Г.Г. Выделение рибосом и субчастиц из плаценты человека и определение их функциональной активности // Изв. Сиб. Отд. АН СССР. 1989. Вып. 2. С. 92-98.

191. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 277. P. 680-685.

192. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction//Anal. Biochem. 1987. - V. 162. - P. 156-159.

193. Sambrook J., Russell D. Molecular cloning: a laboratory manual // Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.

194. Кислых В.К, Рамазанов Ю.А., Майстренко В.Ф., Мертвецов Н.П. Вихревой биореактор "БИОК". I. Опыт культивирования штамма E.coli BL21 (DE3) pZZSA, продуцирующего рекомбинантный ангиогенин человека // Биотехнология. 2001. № 3. С. 72-79.1. БЛАГОДАРНОСТИ

195. В качестве своей признательности автор выражает Малыгину Алексею Аркадьевичу свое искреннее восхищение его бескрайней научной эрудицией, творческим воодушевлением и способностью критически осмысливать полученные результаты.

196. Особое удовольствие автору приносит возможность поблагодарить Яныпину Дарью Дмитриевну за доброе отношение и помощь в оформление диссертации.

197. Автор искренне благодарит всех и каждого, кто работал и продолжает работать в самой замечательной Лаборатории структуры и функции рибосом и от чистого сердца желает им успехов во всех их делах.