Специфические особенности инициации трансляции на РНК вируса гепатита С тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Бочкаева (Адьянова), Занда Владимировна

• Бочкаева (Адьянова), Занда Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бочкаева (Адьянова), Занда Владимировна

Список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

1. Инициация трансляции у эукариот.

1.1 Ken-зависимый механизм инициации трансляции.

1.2 IRES-зависимые механизмы инициации трансляции.

1.3 5'-зависимая трансляция на мРНК, содержащих гепатитный и гепатитоподобный IRES.

2. Вирус гепатита С.

2.1 Геномная организация вируса гепатита С.

2.2 IRES вируса гепатита С.

2.3 Белки 40S субчастицы рибосомы, взаимодействующие с IRES'ом вируса гепатита С: белок р40.

2.3.1 Белок малой субчастицы рибосомы р

2.4 Домен I 5'-нетранслируемой области мРНК HCV.

2.5 Регуляция трансляции на мРНК вируса гепатита С.

2.5.1 Регуляция трансляции мРНК вируса гепатита С: клеточные белки: Антиген La

Полипиримидиновый тракт-связывающий белок (РТВ) Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин L (hnRNP L) Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин D (hnRNP D) Белок, ассоциированный cNSl 1 (NSAP 1)

Белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 2 (IGF2BP1)

2.5.2 Регуляция трансляции мРНК вируса гепатита С: вирусные белки: Белок core

Неструктурные белки 4А и 4В

2.5.3 Регуляция трансляции мРНК вируса гепатита С: РНК-структуры: Специфическая печеночная микроРНК miR

2.6 З'-нетранслируемая область.

Результаты и обсуждение.

1. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: роль рибосомного белка р40 в связывании IRES-элемента с 40S субчастицей рибосомы.

1.1 Изучение влияния белка р40 на образование бинарного комплекса между IRES-элементом вируса гепатита С с 40S субчастицей рибосомы.

1.1.1 Получение белка р

1.1.2 Исследование малых субчастиц рибосом на наличие белка р40 и насыщение им

1.1.3 Исследование влияния р40 на эффективность связывания малых субчастиц рибосом с мРНК вируса гепатита С

1.2 Исследование необходимости белка р40 для трансляции различных матричных мРНК.

1.2.1 Пробные трансляции для проверки зависимости интенсивности трансляции от количества мРНК

1.2.2 Трансляция мРНК актина с добавлением различного количества моноклональных антител к белку р

1.2.3 Трансляция мРНК вируса гепатита С с добавлением различного количества антител к белку р

1.2.4 Трансляция безлидерной мРНК фага X с добавлением различного количества антител к белку р

2. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: влияние области нт. 1-40 на работу IRES'a.

2.1 Исследование влияния различных мутаций домена I на работу IRES'a HCV.

2.1.1 Создание мутантных конструкций

2.1.2 Удаление домена I повышает эффективность IRES-зависимой трансляции в 1,5-2 раза in vitro

2.1.3 Удаление домена I повышает эффективность IRES-зависимой трансляции в 4 раза в клетках печени человека и в 2 раза - в непеченочных клетках

2.1.4 Удаление домена I не влияет на способность IRES'a связывать малую субчастицу рибосомы

2.1.5 Ken-структура стимулирует IRES-зависимую трансляцию конструкции дикого типа в 2 раза и не стимулирует трансляцию конструкции с удаленным доменом I

2.2 Два механизма трансляции на одной мРНК.

IRES HCV может направлять трансляцию только со своего инициаторного кодона

3. Инициация трансляции на мРНК вируса гепатита С: роль 3 '-НТО.

3.1 Создание химерных конструкций.

3.2 З'-НТО вируса гепатита С не, стимулирует трансляцию, направляемую как

IRES'ом HCV, так и IRES'om PTV-1 in vitro.

3.3 З'-НТО вируса гепатита С стимулирует трансляцию, направляемую как IRES'om HCV, так и IRES'om PTV-1 in vivo.

3.4 Удаление разный областей З'-НТО HCV снижает эффективность IRES-зависимой трансляции.

3.5 Стимуляция трансляции З'-НТО HCV не является следствием разной стабильности мРНК.

3.6 Стимуляция трансляции З'-НТО HCV не зависит от механизма инициации.

Выводы.

Материалы и методы.

Благодарности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Специфические особенности инициации трансляции на РНК вируса гепатита С»

Трансляция мРНК в клетке - это сложный процесс, который разделяют на три основные стадии: инициация, элонгация и терминация. Лимитирующей стадией всего процесса биосинтеза белка является инициация трансляции - стадия, на которой происходит присоединение рибосомы к мРНК и поиск стартового кодона с последующей элонгацией. В силу этого, регуляция процесса трансляции в эукариотической клетке обычно направлена именно на регуляцию стадии инициации. Поэтому неудивительно, что как раз инициация трансляции в первую очерель привлекает внимание ученых, изучающих регуляцию биосинтеза белка.

В клетках эукариот помимо канонического кеп-зависимого механизма, когда рибосома привлекается на мРНК с помощью метилированного остатка гуанозина на 5'-конце мРНК - кепа (от англ. cap), инициация трансляции может осуществляться за счет посадки рибосомы непосредственно внутри мРНК (так называемые участки внутренней посадки рибосомы или IRES, от англ. Internal Ribosomal Entry Site). По кеп-зависимому механизму транслируются если не все, то, по крайней мере, подавляющее большинство всех мРНК эукариот, тогда как IRES-зависимая инициация характерна для РНК вирусов, чей жизненный цикл протекает в цитоплазме. Не имея на 5'-конце собственных мРНК кеп-структуры, они не могли бы эффективно конкурировать с клеточными матрицами, не будь у них специальных механизмов инициации трансляции. Также уже почти два десятка лет продолжается дискуссия о существовании IRES'ob в клеточных мРНК, однако, однозначного мнения по этому вопросу пока нет.

Одним из вирусов, использующих IRES-зависимый механизм инициации для трансляции своей мРНК в клетках, является высокопатогенный вирус гепатита С. В настоящее время по приведенным в литературе оценкам им инфицировано около 3% мирового населения (170 млн человек), и как причина смерти гепатит С выступает даже чаще, чем вирус иммунодефицита человека. При заражении вирус в основном поражает клетки печени, но причины такой тканеспецифичности пока неизвестны. Одна из наиболее вероятных гипотез - регуляция жизненного цикла вируса специфическими белками клеток печени.

Со времени своего открытия в 1989 году вирус гепатита С является одним из самых изучаемых вирусов, однако многие аспекты его жизненного цикла остаются малоизученными в силу отсутствия хороших in vivo систем, где бы вирус эффективно реплицировался. Некоторые важные детали трансляции его мРНК также остаются неразгаданными: как осуществляется регуляция трансляции мРНК вируса, какие 5 рибосомные белки участвуют во взаимодействии рибосомы с IRES'ом, каковы роли отдельных доменов 5'-нетранслируемой области и высоко консервативной 3'-нетранслируемой области мРНК, чем обоснованна такая тканеспецифичность вируса? Все это далеко не полный перечень вопросов, которые до сих пор остаются открытыми и ответы на которые, возможно, позволили бы в перспективе хотя бы снизить риск развития тяжелых заболеваний (цирроз и рак печени) после инфицирования вирусом гепатита С.

В частности по структуре и функциональной роли 5'- и 3'- нетранслируемых областей РНК HCV уже опубликованы сотни работ. И, тем не менее, все время остаются неясные моменты в их организации, механизме взаимодействия с 40S рибосомными субчастицами и друг с другом. Три части этой диссертационной работы и посвящены отдельным, наиболее спорным, аспектам организации и функционирования 5'- и 3'-нетранслируемых областей РНК вируса гепатита С.

Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Бочкаева (Адьянова), Занда Владимировна

Выводы

1. Было показано, что блокирование белка р40 малой рибоеомной субчастицы, несмотря на довольно умеренный вклад белка в образование бинарного комплекса, практически полностью подавляет трансляцию, направляемую IRES'om вируса гепатита С.

2. Домен I 5'-нетранслируемой области мРНК вируса гепатита С не является необходимым элементом трансляции и даже, наоборот, ингибирует работу IRES'a в 2-4 раза. Причем критичным для трансляции является именно наличие межшпилечной области домена I.

3. На основе мРНК HCV была создана модельная РНК, трансляция на которой может осуществляться как по IRES-зависимому, так и по сканирующему механизму. Также было показано, что трансляция может осуществляться только по одному из механизмов. Трансляция, основанная на совокупности механизмов, невозможна.

4. З'-нетранслируемая область мРНК HCV не стимулирует IRES-зависимую трансляцию in vitro в различных бесклеточных системах.

5. З'-нетранслируемая область мРНК HCV неспецифически стимулирует трансляцию in vivo как в печеночных, так и в непеченочных клетках.

Материалы и методы

1. Реактивы и материалы.

В работе были использованы следующие реактивы и материалы: немеченые дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфаты фирмы Хеликон (Россия), рибонуклеозид-5'-трифосфаты фирмы Promega (США), у-[32Р]-АТР и а— [32Р]-АТР из Обнинска, кеп-аналог (Promega (США)) и ApppG (NEB (США). 1,4-дитио-0,Ь-треитол (DTT); Р-меркаптоэтанол фирмы Serva (Германия); акриламид и NjN'-метиленбисакриламид фирм Serva (Германия); агароза фирмы Sigma (США) и нитроцеллюлозную мембрану (). В качестве красителей для электрофореза использовали бромфеноловый синий фирмы Merck (Германия), ксиленцианол фирмы Chemicals (Англия). Использовали неорганические реагенты фирм Sigma (США) и Merck (Германия). В работе использовали бактоагар, бактотриптон, дрожжевой экстракт фирмы DIFCO (США); ампициллин завода "Синтез" (Пенза). Все использованные в данной работе олигонуклеотиды были синтезированы на фирме Synthol (Россия).

Биопрепараты: ингибитор рибонуклеаз, полинуклеотидкиназа фага Т4, ДНК-лигаза фага Т4, РНК-полимераза фага Т7 фирмы Fermentas (Литва), эндонуклеазы рестрикции фирм Fermentas (Литва) и Сибэнзим (Россия), маркеры молекулярного веса ДНК фирм Fermentas (Литва) и Хеликон (Россия), свободная от РНКаз ДНКаза RQ1 фирмы Promega (США) и обратная транскриптаза SuperScript II (Invitrogen (США)). При клонировании использовали штамм Е. coli JM109. Для получения рекомбинантных белков использовали штаммы Е. coli BL21(DE3) и Rosetta (DE3) фирмы Novagen (США).

При проведении центрифугирования в градиенте сахарозы использовалась сахароза фирмы MP Biomedicals (США). При проведении трансляции в * бесклеточной системе in vitro использовали [358]-метионин фирмы Amersham Biosciences (США) и смесь аминокислот без метионина и с метионином фирмы Promega (США). При проведении ПЦР в реальном временно использовали флуоресцирующую смесь EvaGreen Basic Mix фирмы Biotium (США).

При работе с клеточными линиями использовалась среда DMEM (Gibco, США), сыворотку, трипсин и смесь антибиотиков фирмы Sigma (США). В качестве трансфецирующих реагентов использовали Унифектин-56 (Росбиолинк) и ExGen 500 фирмы Fermentas (Литва). Для измерения активности генов репортеров Renilla luciferase и Firefly luciferase использовался набор реагентов фирмы Promega (США).

2. Плазмидные конструкции

Использованная в разделе работы по изучению рибосомного белка р40 плазмидная конструкция была предоставлена коллегами из Новосибирска. Она сконструирована на основе вектора рЕТ-15Ь, и содержит кодирующую часть белка р40 человека, вставленную по сайтам Ndel и BamH I.

Конструкцию HCV-3'utr, содержащую полноразмерные 5'-и З'-НТО HCV, создали на основе имевшейся в лаборатории плазмиды T7-HCV-Fluc (содержала 40-341 нт 5'-НТО HCV сшитые с геном Flue под контролем Т7-промотора в векторе pGL3R). Из плазмидной конструкции, любезно предоставленной нашими немецкими коллегами (описана как pHCV+3'-utr в [11]), мы последовательно клонировали в нашу плазмиду полноразмерную 5'-НТО HCV (по сайтам StuI и Mlul вставили фрагмент Stul-Hindlll из плазмиды pHCV+3'utr) и З'-НТО HCV (по сайтам Xbal и Hpal вставили ПЦР-продукт с праймерами UTRdir и UTRjrev с плазмиды pHCV+3'utr, порезанный по Xbal). Плазмиды PTV-3'utr, EMCV-3'utr и actin-3'utr, содержащие Т7-промотор, соответсвующие названиям 5'-нетранслируемые области, ген люциферазы светлячка и З'-нетранслируемую область HCV в векторе pGL3R, получали путем аналогичного клонирования З'-НТО HCV в имеющиеся в лаборатории конструкции PTV-Fluc, EMCV-Fluc и actin-Fluc.

Конструкции HCV-AIa-3'utr и HCV-AIab-3'utr были созданы на основе конструкции HCV-3'utr путем ПЦР-мутагенеза, используя праймеры HCV-9 rev и HCV-9a dir и HCV-9b dir соответственно с последующим лигированием.

Конструкция с двумя инициаторными AUG-кодонами HCV 11 представляет собой конструкцию HCV-3'utr, из нее методом ПЦРа всей плазмиды и последующим лигированием синтезировали остальные конструкции. Для этого использовали праймеры HCV4-UAG и HCV4-rev для замены 1-го AUG кодона и HCV10dir и HCV10rev для замены 2-го AUG-кодона. Соответствующие конструкции с мутированным субдоменом IHe IRES'a HCV получали ПЦРом всей соответствующей плазмиды с помощью праймеров HCV7-dir и HCV7-rev и последующим лигированием. Использованные праймеры:

3-UTR-rev ACATGATCTGCAGAGAGGCCAG для амплификации 3'-конца и ПЦР-транскрипции

3-UTR-dir CGTGTCTAGAGGTTGGGGTAAACACTCCG для амплификации З'-конца HCV7-dir AAGGTGCTTGCGAGTGCCC 20 nt \

HCV7-rev TCGGCAGTACCACAAGGCC 20 nt / для мутации в домене IHe HCV-9 rev CTATAGTGAGTCGTATTAAAAGC \

HCV-9a dir ACACTCCACCATAGATCACTCC | Удаление доменов la и Ia+Ib HCV-9b dir CCCTGTGAGGAACTACTGTC /

HCV4-UAG TAGAGCACGAATCCTAAACC \

HCV4-rev GGTGCACGGTCTACGAGACC /для замены 1-го AUG-кодона HCVlO-dir TACGAAGACGCCAAAAACATAAAG \

HCV 10-rev GGTTTTTCTTTGAGGTTTAGG / для замены 2-го AUG-кодона

3. Генноинженерные манипуляции

Все операции с ДНК плазмид: расщепление эндонуклеазами рестрикции, кинирование 5'-концов, лигирование, ПЦР, очистку ДНК в агарозном геле, трансформацию клеток Е. coli, выделение плазмид и прочее проводили в соответствии со стандартными протоколами. Секвенирование ДНК осуществляли в фирме ЦКП "Геном" (Россия).

4. Буферные растворы

1) Раствор ТЕ для растворения и хранения ДНК и РНК (рН 7.5)

10 шМ трис-HCl, рН 7.5; 1 шМ ЭДТА рН 8.0.

2) Электрофорезный трис-боратный (ТВЕ) буфер для проведения электрофореза ДНК и РНК:

0.089 М трис-борат; 0.089 М борная кислота.

3) Электрофорезный трис-глициновый буфер для проведения электрофореза белков в ПААГ:

Трис 0.025 М;

Глицин 0.2 М;

SDS 0.1 %.

4) 10х-ный буфер для нанесения при электрофорезе ДНК в агарозном геле:

0.25% бромфеноловый синий; 0.25% ксиленцианол; 50% глицерин.

5) 5х-ный буфер для нанесения при электрофорезе белка в SDS-ПААГ:

50% глицерин; 500 мМ Р-меркаптоэтанол; 0.25% бромфеноловый синий: 250 мМ трис-HCl рН 6.8.

6) Буфер А100:

100мМКС1; 10% глицерин; 0.1 мМ ЭДТА;

20 мМ трис-HCl рН 7.5; 0.5 мМ PMSF; 1 мМ DTT.

5. Трансформация клеток E.coli:

200 мкл суспензии компетентных клеток размораживали во льду, смешивали с 1-5 нг плазмидной ДНК и инкубировали во льду 40-50 минут. Затем проводили тепловой шок выдерживанием клеток в течение 30 секунд в водяной бане при 42°, добавляли 0,8 мл среды LB и инкубировали 1 час при 37°. После к клеткам добавляли антибиотик выращивали при 37° в течение ночи.

Среда LB (Luria-Bertani) для выращивания клеток E.coli. На 1 л: Бакто-триптон 10 г;

Бакто-дрожжевой эксракт 5 г;

NaCl Юг; рН доводили до 7.5 с помощью NaOH. Автоклавировали при давлении 0.5 атм 30 мин.

Антибиотик - ампициллин.

500 мг натриевой соли ампициллина растворяли в 10 мл воды. Рабочая концентрация - 50 мкг/мл.

6. Выделение плазмид:

Клетки осаждали в центрифуге 30 сек. на 14000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора I и инкубировали 10 мин при комнатной температуре, добавляли 150 мкл раствора II и инкубировали 5 мин во льду, затем добавляли 150 мкл раствора III и держали еще 10 минут во льду.

После центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин, отбирали супернатант, депротеинизаровали раствор фенол-хлороформной экстракцией и осаждали нуклеиновые кислоты добавлением 2.5 объемов EtOH, инкубировали 1 час при -20°. Центрифугировали при комнатной температуре 10 мин 13000 об/мин, осадок промывали 300 мкл 70% EtOH и сушили. После осадок растворяли в ТЕ с панкреатической РНКазой и инкубировали 1 час.

После наносили на агарозный гель и смотрели, правильно ли все получилось. Раствор I: 50 мМ глюкозы, 25 мМ трис-HCl рН 8.0, 10 мМ ЭДТА. Раствор II: 1 мл 10% SDS, 1 мл 2н. NaOH, 8 мл воды.

Раствор III: 60 мл 5 М КО Ас, 11.5 мл уксусная кислота (ледяная), 28 мл воды.

7. Экспрессия белка в трансформированных клетках E.coli:

Колонию с чашки пересевали в LB и растили в течение ночи (40 мл среды, 40 мкл ампициллина и 100 мкл культуры, ~ 16 часов на качалке, 22°)

Утром клетки пересаживали в большой объем среды (800 мл среды, 800 мкл ампициллина и 20 мл культуры) и выращивали в течение 3 часов при 22° на качалке. Добавляли 800 мкл IPTG (1М) и выращивали еще 3 часа. После клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в буфере и разрушали ультразвуком (6 циклов по 30 секунд). Дебрис осаждали, а супернатант наносили на колонку, содержащую Ni-NTA агарозу. Буфер для ресуспендирования клеток: 50 мМ трис-HCl рН 7.5; 5% глицерин; 0.5 М NaCl; 2 мМ PMSF.

8. Выделение нативного белка р40:

Колонку перед нанесением промывали сначала 2 V I-EB, затем I-WB, после наносили на нее полученный супернатант. После промывали снова 2 V I-WB и элюировали белок 2 V I-EB. Все собирали фракциями по 0.5 мл. Все манипуляции производили на холоду (при 4°). Полученные фракции анализировали электрофорезом. Имидазол-washbuffer:

50 мМ трис-HCl рН 7.5; 0.5 М NaCl; 20 мМ имидазол. Имидазол-elutionbuffer:

50 мМ трис-HCl рН 7.5;

0.5 М NaCl;

300 мМ имидазол.

9. Получение РНК-транскриптов

РНК получали с помощью Т7-транскрипции. Реакцию проводили в 20 мкл смеси, содержащей 80 мМ Hepes-KOH рН 7.4, 12 мМ Mg(CH3COO)2, 2 мМ спермидина, 10 мМ DTT, по 10 мМ ATP, UTP, СТР и GTP, 3-5 мкг линеаризованной ДНК, 20 ед. акт. рибонуклеазного ингибитора HPRI и 20 ед. акт. РНК-полимеразы фага Т7. После смешивания всех компонентов смесь инкубировали при 37°С в течение 1ч. Для получения кепированных и акепированных мРНК использовали смесь рибонуклеотидтрифосфатов по 10 мМ ATP, UTP, СТР, и 5 мМ m7GpppGTP или ApppG, после предынкубации при 37°С в течение 5 мин добавляли GTP до концентрации 0.5 мМ и инкубировали еще 1 ч. Для получения изотопно-меченой мРНК концентрацию UTP снижали до 1 мМ и добавляли 10

65 мМ a-[32P]-UTP. ДНК разрушали обработкой 3 мкл RQ DNase в течение 5 мин. После фенольной депротеинизации реакционную смесь очищали от солей и нуклеотидов гель-фильтрацией на сефадексе G50, РНК осаждали этанолом и растворяли в воде. Для получения мРНК, используемых для трансляции или РНК-трансфекции (РНК больше 2000 нт) реакционную смесь после разрушения ДНК инкубировали 1 час во льду с LiCl, добавленным до концентрации 2М, после инкубации РНК центрифугировали на охлажденной центрифуге 10 мин при 14000 об/мин, промывали 70% этанолом и растворяли в воде.

10. Трансляция в лизате ретикулоцитов кролика

Для трансляции использовали обработанный нуклеазой лизат ретикулоцитов кролика фирмы "Promega". Реакционная смесь содержала 4.3 мкл лизата, дополненного смесью ос аминокислот и [ SJ-метионином согласно рекомендации изготовителя, и 1 мкл водного раствора мРНК разной концентрации.

Электрофорез продуктов трансляции проводили по Лэммли в 12%-ном полиакриламидном геле. Радиоавтографы гелей получали с помощью прибора "Phosphorimager".

11. Сборка бинарного комплекса:

Собственно сборка бинарных комплексов проводилась в 20 мкл смеси, содержащей 20 мМ трис-HCl (рН 7.4), 120 мМ КС1, 1.5 мМ Mg(OAc)2, 0.25 спермидин-НС1, 1 мМ DTT, 0.4 мМ GTP, 2.5 пмоль 40S субчастиц и 0.1 мкг мРНК и разное количество белка р40 (0 -0.25 мкг). Смесь готовили во льду, затем инкубировали 10 минут при 30°С. Реакционная смесь наносилась на градиент сахарозы (5-20%), и центрифугировалась (ротор Beckman

SW41) в течение 4 часов при 33000 об/мин. Градиент раскапывали по 440 мкл и измеряли радиоактивность в каждой фракции.

12. Насыщение 40s субчастиц рибосом белком р40:

К 100 пмолям 40S добавили 20 мкг белка (5х-ный избыток), объем довели до 0.5 мл буфером А100, содержащим Mg, и инкубировали 10 мин при 37°С. После наносили на 1 мл 10%-го раствора сахарозы и центрифугировали в течение б часов 40000 об/мин (ротор Beckman SW50). Осажденные рибосомы ресуспендировали и анализировали электрофорезом.

13. Трансляция в лизате клеток асцитокарцинома Кребса-2 S30:

Для приготовления лизата клетки асцита Кребс-2 4 раза промыли центрифугированием (Beckman JA-20, 1200 rpm, 10 min) в изотоническом буфере (150 тМ NaCl, 35 тМ Tris-HCl рН 7.5). После четвертого цетрифугирования клетки ресуспендировали в 1,5-ном объеме гипотонического буфера (10 mM Tris-HCl рН 7.5, 10

66 шМ КСНзСОО, 1.5 mM Mg(CH3COO)2, 2.5 шМ DTT) и инкубировали во льду 20 мин. После разрушали гомогенизатором Даунса и лизат центрифугировали 20 мин на 15000 об/мин. Супернатант разаликвотили и хранили на -75°.

Трансляцию осуществляли в объеме 10 мкл, который содержал 5 мкл лизата, 1 мкл 10-кратного трансляционного буфера (200 шМ Hepes-KOH рН 7.6, 10 mM DTT, 5 mM spermidine-HCl, 6 шМ Mg(CH3COO)2, 80 mM creatine phosphate, 10 mM ATP, 2 mM GTP и 25 цМ каждой аминокислоты), отдельно добавленный КСНзСОО до 120 шМ и транслируемую мРНК нужного количества (обычно 200 нг), реакцию проводили на 30° в течение 1 ч. Для наблюдения эффекта подавления трансляции мутантом eIF4A, R362Q, в трансляционную смесь без мРНК добавляли XXX пмоль белка, инкубировали 5 минут, добавляли мРНК и инкубировали еще 1 час.

14. Связывание малых субчастиц рибосом полноразмерной и мутантной 5'-НТО HCV на нитроцеллюлозной мембране

Связывание проводили в специальном буфере (20 mM Hepes-KOH рН 7.6, 60 гпМ КСНзСОО, 60 mM КС1, 1,1 шМ Mg(CH3COO)2, 0,1 mM EDTA и 1 mM DTT) в суммарном л объеме 20 мкл в течение 15 минут на 37". [~P]-UTP -меченой мРНК для связывания брали 10 пмоль, а малых субчастиц рибосом от 0,003 до 20 пмоль. После инкубирования эппендормы держали во льду.

Нитроцеллюлозную мембрану нарезали кружочками, размером с 5-рублевую монету и помещали на вакуумный коллектор. Перед нанесением бинарного комплекса каждый кружочек промывали 1мл буфера для связывания и после нанесения промывали 3 мл того же буфера.

Радиоавтографы мембран со связавшимся бинарным комплексом получали с помощью прибора "Phosphorimager".

15. РНК-трансфекции

Клетки растили до конфлюэнтности 80% на 24-луночной планшете, и трансформировали по 420 нг мРНК на лунку с помощью реагента унифектин 56 согласно протоколу изготовителя. Через 3 часов после трансфекции клетки лизировали с помощью буфера, входящего в состав набора Dual Luciferase Assay (Promega), значения активностей firefly и renilla люцифераз измеряли с помощью реагентов из того же набора на люминометре.

16. Сравнение стабильностей мРНК

Трансфекцию клеток для сравнения стабильностей трансфецированных мРНК осуществляли нелипофильным реагентом ExGen. Через 2, 4, 6 или 8 часов часов клетки промывали фосфатнонатриевым буфером и снимали с поверхности бунки трипсином.

67

Суспензию клеток с каждой делили на 2 равные части: одна для измерения активностей люцифераз, вторая — для выделения суммарной клеточной РНК. Суспензии центрифугировали на 800 об/мин в течение 5 минут и отбирали буфер от клеток. Половину для измерения активностей люцифераз лизировали соответственно стандартному протоколу.

Для выделения суммарной клеточной мРНК клетки . Осадок растворяли в 10 мкл бидистиллированной воды и измеряли концентрацию РНК в растворе.

Перед обратной трансцрипцией проводили отжиг праймеров. Для этого использовали случайные гексамеры и олиго(дТ), которые содержались в специально предварительно приготовленном «миксе 3» (mix3: случайные гексамеры 0,1 мкг/мкл, олиго(дТ) 0,1 мкг/мкл и dNTPs 10mM). К одинаковому количеству РНК добавляли по 4 мкл «микса 3» и доводили объем до 13 мкл - отжигали 6 минут на 66°, после сразу помещали в лед. Обратную транскрипцию осуществляли набором SuperScript II Reverse Transcriptase в суммарном объеме 20 мкл согласно предложенному протоколу, т.е. добавляли по 4 мкл 5-кратного буфера, по 2 мкл 0, 1 М DTT, 0,5 мкл воды и 0,5 мкл SS II RT . Реакционную смесь инкубировали 10 минут на 25°, 55 минут на 43° и 15 минут на 70°. Полученную смесь разводили в 50 раз - матрица для ПЦР в реальном времени.

ПЦР в реальном времени осуществляли на приборе iCycler iQ5 (Bio-Rad) в суммарном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл матрицы, полученной обратной транскрипцией, 10 мкл 2,5-кратного специального буфера EvaGreen, по 5 пмоль специфической пары праймеров и mQ до нужного объема. Использовали следующие специфические праймеры (использованная ТПлавления-560):

RTFd 5' GAGGTTCCATCTGCCAGGTA 3' и RTFr 5' CCGGTATCCAGATCCACAAC 3' - для Flue;

RTRd 5' AACGCGGCCTCTTCTTATTT 3' и RTRr 5' ATTTGCCTGATTTGCCCATA 3' - для Rluc.

Обсчет результатов производили по формуле Xo/Ro=2exp(CtR-CtX), где Хо=количество мРНК Flue, Ro=KonH4ecTBo мРНК Rluc, С1Х=цикл, на котором люминисценция в лунке с праймерами к Flue пересекает пороговое значение, CtR=UHKn, на котором люминисценция в лунке с праймерами к Rluc пересекает пороговое значение.

Благодарности

Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю Ивану Николаевичу Шатскому за организацию работы, грамотное руководство и всестороннюю поддержку. Искренне признательна своему второму научному руководителю Илье Михайловичу Теренину за обучение методам, обсуждение результатов и всевозможную помощь в выполнении и написании работы, выражаю отдельную благодарность Дмитрию Евгеньевичу Андрееву и Сергею Евгеньевичу Дмитриеву - сотрудникам нашей лаборатории - за обсуждение результатов, ценные советы и поддержку.

Благодарю проф. Карпову Г.Г. и Малыгина А.А. из Новосибирского института биотехнологии и фундаментальной медицина за предоставление плазмиды, содержащей ген белка р40, и антител к белку.

Также искренне благодарю проф. Нипмана М. и Бунг К. из Института биохимии (Гиссен) за хорошее сотрудничество и теплое гостеприимство.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бочкаева (Адьянова), Занда Владимировна, 2010 год

1. Iborra F.J., Jackson D.A., Cook P.R.(2004) The case for nuclear translation. J.Cell Sci. 117, 57135720.

2. Brogna S, Sato ТА, Rosbash M. (2002) Ribosome components are associated with sites of transcription. Mol Cell. 4, 93-104.

3. Banerjee A.K.(1980) 5'-terminal cap structure in eucaryotic messenger ribonucleic acids. Microbiol.Rev. 44, 175-205.

4. Lim L., Canellakis E.S.(1970) Adenine-rich polymer associated with rabbit reticulocyte messenger RNA. Nature 227, 710-712.

5. Kozak M.(1978) How do eucaryotic ribosomes select initiation regions in messenger RNA? Cell 15, 1109-1123.

6. Asano K., Clayton J., Shalev A., Hinnebusch A.G.(2000) A multifactor complex of eukaryotic initiation factors, elFl, eIF2, eIF3, eIF5, and initiator tRNA(Met) is an important translation initiation intermediate in vivo. Genes Dev. 14, 2534-2546.

7. Fekete C.A., Applefield D.J., Blakely S.A., Shirokikh N., Pestova Т., Lorsch J.R., Hinnebusch A.G.(2005) The elFIA C-terminal domain promotes initiation complex assembly, scanning and AUG selection in vivo. EMBO J. 24, 3588-3601.

8. Olsen D.S., Savner E.M., Mathew A., Zhang F., Krishnamoorthy Т., Phan L., Hinnebusch A.G.(2003) Domains of elFIA that mediate binding to eIF2, eIF3 and eIF5B and promote ternary complex recruitment in vivo. EMBO J. 22, 193-204.

9. Jackson R.J., Hellen C.U.T., Pestova T.V.(2010) The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Mol. Cell Biol. 10, 113-127.

10. Rogers G.W., Jr., Richter N.J., Merrick W.C.(1999) Biochemical and kinetic characterization of the RNA helicase activity of eukaryotic initiation factor 4A. J.Biol.Chem. 274, 12236-12244.

11. Rogers G.W., Jr., Lima W.F., Merrick W.C.(2001) Further characterization of the helicase activity of eIF4A. Substrate specificity. J.Biol.Chem. 276, 12598-12608.

12. Rogers G.W., Jr., Richter N.J., Lima W.F., Merrick W.C.(2001) Modulation of the helicase activity of eIF4A by eIF4B, eIF4H, and eIF4F. J.Biol.Chem. 276, 30914-30922.15,16,17,18,19,20,21,22,23.