Системный анализ механизмов координации экспрессии генов в минимальной клетке на модели бактерий класса Молликут тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Фисунов Глеб Юрьевич

• Фисунов Глеб Юрьевич
• доктор наук
• 2025

Оглавление диссертации доктор наук Фисунов Глеб Юрьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Цели и задачи

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Методология и методы исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Структура диссертации

Личный вклад автора

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Класс Молликуты (Mollicutes) - модельные объекты

данного исследования

1.2. Краткий обзор известных молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов у бактерий

1.3. Системное изучение регуляции экспрессии генов у Молликут

1.3.1. Системное изучение регуляции экспрессии генов

на модели M. pneumoniae

1.4. Механизмы регуляции экспрессии генов,

охарактеризованные у Молликут

1.4.1. Репрессор белков теплового шока HrcA

1.4.2. Пуриновый рибопереключатель из Mesoplasma florum

1.4.3. Альтернативный сигма-фактор

из Mycoplasma genitalium (MG428)

1.4.4. Регуляция экспрессии генов с помощью геномных перестроек

1.5. Минимизация генома ведёт к потере сенсоров внешних пертурбаций

1.6. Локализация регуляторных последовательностей в геноме

1.7. Неудаляемые белки с неизвестной функцией в синтетическом минимальном геноме

Mycoplasma mycoides JCVSyn

1.8. Заключение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Культивирование Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma melliferum

и Mycoplasma gallisepticum

2.2. Генная инженерия M. gallisepticum

2.3. Культивирование и трансформация E. coli

2.4. Получение рекомбинантных белков в E. coli

2.5. Выделение геномной ДНК

2.6. Выделение РНК

2.7. ПЦР в реальном времени

2.8. Капельно-цифровая ПЦР

2.9. Дизайн и синтез олигонуклеотидов

и последовательностей ДНК из них

2.10. Полногеномное картирование точек инициации транскрипции

2.11. Выделение рибосомной фракции, ассоциированных мРНК и белков

2.12. Выделение нуклеоида M. gallisepticum

2.13. Приготовление библиотек и секвенирование РНК

2.14. Аффинная хроматография

2.15. Анализ поверхностного протеома M. gallisepticum

методом Blue-Native

2.16. Электрофорез по Лэммли

2.17. Двумерный дифференциальный электрофорез

2.18. Трипсинолиз

2.19. Идентификация белков методом МАЛДИ

2.20. Идентификация белков методом ВЭЖХ-МС

2.21. Измерение представленности белков методом LFQ

2.22. Исследование ДНК-белковых взаимодействий

методом торможения в геле (EMSA)

2.23. Исследование ДНК-белковых взаимодействи

методом капиллярного термофореза

2.24. Исследование экспрессии генов в единичных клетках методом локализационной микроскопии (SMLM)

2.24.1. Атомно-силовая микроскопия

2.24.2. Докинг и молекулярная динамика

2.25. Разработка программного обеспечения для анализа

и интеграции геномных и транскриптомных данных

2.26. Машинное обучение

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Сравнительный анализ организации промоторов

и систем регуляции экспрессии генов среди Молликут

3.2. Консервативное ядро ТФ у Молликут

3.2.1. ТФ MraZ

3.2.2. ТФ WhiA

3.2.3. Регулятор SpxA

3.3. Кладоспецифичные регуляторы у M. gallisepticum

3.3.1. ТФ HsdC

3.3.2. ТФ Fur

3.4. Эвристический подход к изучению систем регуляции

экспрессии генов у Молликут

3.5. Концепция метода и его проверка на Acholeplasma laidlawii

3.6. Построение модели промотора для M. gallisepticum

и обнаружение новых детерминант силы промотора

3.7. Идентификация новых транскрипционных регуляторов

у M. gallisepticum

3.7.1. Новые регуляторы на основе структур РНК

3.7.2. Поиск новых белковых регуляторов

3. 7 . 3 . ParX - репрессор оперона parA-dnaA

3.7.4. Система активации экспрессии оперона rplJL

3.7.5. Система перераспределения промоторной активности у гена dps

3.7.6. Активаторы генов гемагглютининов vlhA

3.8. Направленное редактирование промоторов vlhA

как механизм адаптивной эволюции

3.9. Глобальная координация экспрессии генов у M. gallisepticum

3.9.1. Структура и состав нуклеоида M. gallisepticum

3.9.2. Транскрипционно-трансляционная координация

у M. gallisepticum

3.9.3. Динамический диапазон регуляции и отбор

против сильного промотора

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

БЛАГОДАРНОСТИ

АСМ

АДФ

АТФ

ВОПГ

ВЭЖХ-МС

ГР

ГМФ

ГТФ

ДТТ

гРНК

ДСН ДКС ЛЦР ОТ-ПЦР

ПВМ ПО ПСА ПЦР

РМ-система

Трис

ТСС

ТФ

УТФ

ЭДТА

ACN

BHQ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

атомно-силовая микроскопия

аденозин-дифосфат

аденозин-трифосфат

высокоориентированный пиролитический графит

высокоэффективная жидкостная хроматография, сопряжённая

с масс-спектрометрией

глобальный регулятор

гуанозин-монофосфат

гуанозин-трифосфат

дитиотреитол

гидовая РНК (guideRNA, англ.), синтетическая РНК, применяемая для нацеливания белка Cas9 или dCas9 на мишень. дуплекс-специфическая нуклеаза двухкомпонентная система лигазная цепная реакция

полимеразная цепная реакция, сопряжённая с обратной транскрипцией

позиционно-весовая матрица (PWM, positional weight matrix)

программное обеспечение

персульфат аммония

полимеразная цепная реакция

система рестрикции-модификации

трис-гидроксиметил аминометан

точка старта считывания, нуклеотид промотора, с которого

начинается считывание РНК. Аббревиатура подобрана по

созвучию с TSS (transcription start site, англ.).

транскрипционный фактор.

уридин-трифосфат

этилендиаминтетрауксусная кислота

ацетонитрил

тушитель black hole quencher

СССР - карбонил-цианид m-хлорофенил-гирдразон

CHAPS - 3-((3-холамидопропил) диметиламмонио)-1-пропансульфонат

ChIP-Seq - иммунопреципитация хроматина, сопряжённая с

высокопроизводительным секвенированием CTAB - бромид цетилтриметиламмония

dCas9 - белок Cas9 с инактивированными эндонуклеазными доменами

DCW кластер - кластер генов, связанных с делением и синтезом клеточной

стенки

DDA - данные-зависимый анализ

DTT - дитиотреитол

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота

EGFP - улучшенный зелёный флуоресцентный белок

EMSA - метод торможения в геле

FAM - 6-карбоксифлуоресцеин

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота

HEX - гексахлорфлуоресцеин

HTH - домен спираль-поворот-спираль, ДНК-связывающий домен,

встречающийся в подавляющем большинстве бактериальных транскрипционных факторах LFQ - безметочная квантификация

MgaS6I - уникальная система рестрикции-модификации из Mycoplasma

gallisepticum S6 mQ - деионизованная вода

NP-40 - 4-нонилфенил-полиэтиленгликоль

PAGE - полиакриламидный гель

(p)ppGpp - гуанозин (пента-) или тетрафосфат

RPKM - прочтений на 1000 пар оснований на миллион картированных

прочтений SDS - додецилсульфат натрия

TAP - щелочная фосфатаза табака

TEMED - тетраметилметилендиамин

Tris - трис-гидроксиметил аминометан

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Системный анализ механизмов координации экспрессии генов в минимальной клетке на модели бактерий класса Молликут»

Актуальность исследования

Минимальная клетка - теоретическая модель в молекулярной биологии. Она представляет собой клетку, содержащую минимально возможное количество генов и, соответственно, кодируемых ими белков или функциональных РНК. Между ними может быть перекрытие по функции. В то же время функции ряда структурных РНК заменить нечем, например рРНК и тРНК. Теоретические модели минимальной клетки рассмотрены во многих работах [1], [2], [3], [4]. Важный вопрос в контексте минимальной клетки - нужны ли ей какие-либо механизмы для регуляции экспрессии генов или достаточно конститутивной экспрессии при условии точно подобранных по силе промоторов, сайтов связывания рибосомы, стабильности мРНК и белков и т.д. В качестве экспериментальной модели минимальной клетки нередко рассматриваются бактерии класса Молликут (Mollicutes) [5], [6], [7], [8]. Выбраны они были в связи с тем, что эти организмы способны расти на искусственной питательной среде, но в то же время ряд представителей класса Молликут имеют существенно редуцированные геномы. В их числе Mycoplasma genitalium - обладатель минимального генома (размером порядка 500 тысяч пар оснований) среди бактерий, способных расти на питательной среде [5]. Таким образом, теоретический вопрос об устройстве минимальной клетки оказывается тесно связанным с вопросами физиологии микоплазм.

Филогенетически Молликуты родственны Грам-положительным бактериям с низким ГЦ-составом геномов, в частности, Фирмикутам (Firmicutes). Наиболее близкие родственники Молликут - бактерии Lactobacillus [9]. В 1898 году Нокардом и Ру был выделен первый представитель Молликут Mycoplasma mycoides -возбудитель плевропневмонии быков [10]. Спустя столетие этот вид Молликут станет первой бактерией, чей геном был успешно искусственно синтезирован и пересажен в донорскую цитоплазму [11]. Клетки представителей Молликут имеют существенно меньшие размеры, чем у большинства бактерий и лишены клеточной стенки [12]. В силу отсутствия клеточной стенки, клетки Молликут чрезвычайно пластичны, однако, чаще всего для них характерна грушевидная форма [12].

Для Молликут характерен низкий ГЦ-состав геномной ДНК порядка 30% [12]. У некоторых представителей Молликут, в частности микоплазм, происходит замена триптофанового кодона UGG на более АТ-богатый UGA. Также для Молликут характерен общий сдвиг частот встречаемости синонимичных кодонов в пользу более АТ-богатых вариантов по сравнению с более ГЦ-богатыми. В свою очередь это затрудняет генно-инженерные манипуляции с микоплазмами с использованием готовых решений.

Большинство Молликут, в частности, микоплазмы являются облигатными паразитами или комменсалами животных (включая человека) и растений [13], чем, по-видимому, обусловлена редукция их геномов. Размеры геномов микоплазм варьируют от примерно 500 тысяч до миллиона пар оснований. Результатом редукции генома у микоплазм является утрата значительной части или большинства метаболических путей, а также ряда других молекулярных систем клетки [14]. Бросается в глаза согласованность между наблюдаемой редукцией систем регуляции экспрессии генов в ряду различных представителей класса Молликут и низкой представленностью регуляторных систем в теоретических моделях минимальной клетки.

Крейгом Вентером и соавторами был проведён ряд работ по созданию синтетических геномов микоплазм и трансплантации их в цитоплазму реципиента (в этой роли использовалась цитоплазма M. capricolum) [7]. В результате ряда попыток создания минимального синтетического генома этой группой был получен редуцированный геном Mycoplasma mycoides JCV SYN 3.0, из которого было удалено максимально возможное количество генов без потери жизнеспособности. Оказалось, что порядка 30% генов данного минимизированного генома не имели известной функции (или она была предсказана «в общем»). Возникает закономерный вопрос, какие конкретно функции выполняют эти гены, и почему такие жизненно-важные функции оказалась за пределами взгляда молекулярных биологов. На основании вышеизложенных данных можно сформулировать первую гипотезу: существует набор жизненно-важных функций (функции «домашнего хозяйства»), которые требуют регуляции на уровне экспрессии генов. Эти новые механизмы регуляции экспрессии генов «домашнего хозяйства» могут реализовываться белками с неизвестной функцией. В частности у M. mycoides JCV SYN 3.0 они могут скрываться среди 30% генов, кодирующих белки с неизвестной

функцией. При этом возникает вопрос, если эти новые регуляторы участвуют в регуляции жизненно-важных функций, то почему их не открыли раньше? Можно сформулировать вторую гипотезу: для регуляции жизненно-важных функций семантика важнее гомологии, т.е. системы, регулирующие экспрессию генов «домашнего хозяйства», могут быть не гомологичными, а наоборот изменчивыми у разных организмов в плане конкретных молекул реализующих регуляторную функцию. Можно также сформулировать третью гипотезу: набор регуляторных систем для генов «домашнего хозяйства» у данного вида имеет некоторую избыточность - запас прочности. Таким образом если начать минимизировать данный конкретный регуляторный репертуар, то можно разными путями прийти к разным минимальным наборам регуляторов, в одном случае пожертвовав одними генами, а в другом случае - другими. Это может создать иллюзию возможности одновременно удалить все регуляторы, которые были удалены хотя бы в одном эксперименте. Тем не менее гены, удаляемые в рамках одного минимального набора могут оказаться неудаляемыми в рамках другого. Таким образом, можно сформулировать гипотезу, почему новые регуляторы генов «домашнего хозяйства» не нашли ранее: они слишком пластичные, чтобы их можно было выявить по гомологии и их можно относительно безболезненно для клетки отключать, но до определённого предела. Какова функция таких регуляторов с точки зрения семантики? Можно предположить, что это не перестройка протеома в ответ на изменившиеся внешние условия, а борьба с самопроизвольно возникающим хаосом внутри клетки. Все клеточные процессы, будучи химическими по своей природе, имеют стохастическую составляющую. Например известно такое явление, как «экспрессионный шум», т.е. стохастическое непостоянство процесса экспрессии генов. Аналогично шум может проявляться в любых других процессах. Можно предположить, что уровень шума в клетке не может быть вообще любым, а должен находиться в определённых границах. Таким образом можно сформулировать гипотезу: системы регуляции экспрессии генов «домашнего хозяйства» ограничивают хаос в клетке, в частности, стохастические вариации в экспрессии генов и, как следствие, представленности белков.

Развитие методов синтетической биологии уже сейчас позволяет создавать полностью искусственные бактериальные геномы и даже отдельные эукариотические хромосомы. К настоящему времени осуществлено несколько

удачных попыток синтеза бактериальных геномов. При этом удачных примеров «оживления» (т.е. пересадки в цитоплазму с дальнейшим делением получившейся клетки) таких геномов меньше, чем удачных попыток синтеза. Чем больше создатели искусственного генома модифицируют его и отклоняются от природной последовательности, тем меньше шансы на успешное «оживление». Наиболее успешная попытка создать существенно модифицированный геном, предпринятая группой К. Вентера, привела к тому, что порядка 30% генов полученного минимизированного генома (Mycoplasma mycoides JCV Syn 3.0) не имеют понятной функции. Это говорит о существенном дефиците знаний системного характера об устройстве клетки и её генома как целого. К настоящему времени получено огромное количество информации об устройстве отдельных клеточных систем, однако этого оказалось недостаточно для уверенного перехода к инженерной биологии.

Одной из важных моделей для инженерной биологии является минимальная клетка, т.е. клетка, обладающая минимальным и достаточных набором генетически-кодируемой информации - белков, структурных и регуляторных РНК. Минимальная клетка представляет собой «платформу», которую можно расширять, добавляя туда целевые функции, например, биосинтетические. Важной проблемой в контексте минимальной клетки является как структура, так и сама необходимость аппарата регуляции экспрессии генов. Бактерии класса Молликут (микоплазмы) являются хорошим приближением минимальной клетки, поэтому используются в таких исследованиях в качестве модельных организмов. Для микоплазм ряд работ демонстрирует предельную редукцию систем регуляции экспрессии генов как на уровне представленности гомологов известных регуляторов, так и на уровне фактически наблюдаемого изменения экспрессии генов в пертурбационных моделях. Результаты этих подходов согласуются друг с другом. Сравнительный геномный анализ показывает, что гомологов регуляторов в геномах микоплазм чрезвычайно мало - как правило, не более десятка (часто меньше). Функциональный анализ показывает, что экспрессия генов в Молликутах мало изменяется в спектре условий, причём изменения малы как по количеству вовлечённых генов, так и по амплитуде изменения, которая редко превышает два раза. Таким образом можно, казалось бы, заключить, что регуляция экспрессии генов в минимальной клетке не важна. Достаточно только правильного распределения весов промоторов,

транскрипционных терминаторов, сайтов связывания рибосомы и стабильности белков, чтобы клетка могла неограниченно делиться. Но даже для решения такой задачи нужен метод взаимно-однозначного сопоставления последовательности промотора и его активности. Необходимо отметить, что К. Вентер и соавторы при создании синтетического минимального генома (Mycoplasma mycoides JCV Syn 3.0) использовали межгенные области дикого типа, т.е. попытка задать уровень экспрессии генов рациональным способом даже не проводилась.

В настоящей работе проведена попытка дать ответ на три вопроса: (1) как задать конститутивный уровень активности промотора на модели Mycoplasma gallisepticum с помощью рационального дизайна его последовательности; (2) зачем нужны оставшиеся консервативные регуляторы экспрессии генов; (3) как показать исчерпывается ли регуляторный репертуар только гомологами уже известных белков и регуляторных РНК. В отсутствие ответа на эти вопросы переход к инженерной биологии невозможен, т.к. оказывается невозможна такая задача, как рациональный дизайн промоторов синтетического генома.

В настоящей работе в качестве основной экспериментальной модели была использована Mycoplasma gallisepticum S6. Размер генома M. gallisepticum составляет порядка 1 миллиона пар оснований, что несколько больше как размера генома M. genitalium (580 тысяч п.о.), так и минимального синтетического генома (531 тысяча п.о.) примерно в два раза. Среди геномов микоплазм, геном M. gallisepticum имеет средний размер. Как впрочем, и геномы других популярных моделей: штаммов M. mycoides (1 миллион п.о.) и M. pneumonia (816 тысяч п.о.) дикого типа. Тем не менее, для M. gallisepticum нами был получен большой набор мультиомиксных данных, что даёт возможность системного подхода. Также в настоящей работе в качестве дополнительных объектов использовались Acholeplasma laidlawii PG-8A и Spiroplasma melliferum KC-3.

Цели и задачи

Цель исследования:

Провести системный анализ организации транскрипционного аппарата и регуляции транскрипции минимальной природной клетки на модели бактерий класса Молликут.

Задачи исследования:

1. Разработать метод измерения транскрипционной активности геномов Молликут с использованием методов нормализации библиотек кДНК и высокопроизводительного секвенирования.

2. Провести сравнительный анализ консервативных механизмов регуляции экспрессии генов у бактерий класса Молликут. Провести сравнительный анализ структуры промоторов и строения регуляторных сетей для трёх представителей класса Молликут: Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma melliferum, Mycoplasma gallisepticum. Провести для этих видов высокопроизводительное картирование точек инициации транскрипции методом 5'-концевого обогащённого секвенирования. Определить консервативное ядро регуляторов, гомологи которых представлены у всех или почти всех Молликут. Определить функции этих гомологов на модели M. gallisepticum. Для этого получить их в рекомбинантном виде и показать активность in vitro или исследовать их функцию методом генетического нокдауна с помощью CRISPR-интерференции.

3. Разработать эвристический метод поиска неконсервативных систем регуляции экспрессии генов, не проявляющих себя в стандартных пертурбационных моделях на основе машинного обучения. Экспериментально верифицировать обнаруженные новые регуляторы на модели M. gallisepticum. Для новых белков-регуляторов провести их аффинное выделение, далее показать их активность в рекомбинантном виде или с помощью генетического нокдауна. Для рибопереключателей и белков также показать их активность в репортерных конструкциях in vivo.

4. Исследовать глобальные механизмы регуляции экспрессии генов на уровне сопряжения транскрипции и трансляции, а также на уровне структуры нуклеоида на модели M. gaШsepticum. Для этого провести количественное транскрипционное и протеомное профилирование рибосомной фракции M. gaШsepticum. Также провести выделение нативного нуклеоида M. gaШsepticum, исследование его структуры методом атомно-силовой микроскопии и исследование содержания белков методом количественного протеомного анализа.

Научная новизна

В настоящей работе было впервые проведено комплексное исследование транскрипционной активности генома M. gaШsepticum. Было описано отсутствие корреляции между изменением в представленности РНК и белка у M. gaШsepticum при тепловом стрессе. На основе полученных данных и их анализа созданы синтетические промоторы с заданным уровнем экспрессии. Были детально исследованы оставшиеся консервативные для микоплазм регуляторы экспрессии генов. Впервые была разработана эвристическая оценка неизученного репертуара регуляторов без использования предварительных знаний о гомологии или дифференциальной экспрессии генов на основе комбинации транскриптомного анализа и машинного обучения. Были открыты новые регуляторы генов домашнего хозяйства у M. gaШsepticum .

В настоящей работе (на модели M. gaШsepticum) показано, что: новые неизвестные регуляторные системы генов домашнего хозяйства действительно присутствуют, некоторые из них охарактеризованы; регуляторные системы генов «домашнего хозяйства» действительно проявляют большую пластичность. Показано, что на системном уровне присутствует «фильтр», препятствующий попаданию большого количества РНК, являющегося продуктом «шумовой» транскрипции на уровень трансляции.

Теоретическая и практическая значимость

В ходе работы был охарактеризован ряд механизмов регуляции экспрессии генов у Молликут, как «глобальные», так и специфические. К глобальным относятся: (1) неспецифические детерминанты промотора и механизм «проскока через терминатор», которые обуславливают перестройку транскрипционного профиля с стрессе, (2) «рибосомный фильтр», т.е. отсутствие корреляции между транскрипцией и трансляцией в стрессе, (3) степень компактизации нуклеоида и перераспределение РНК-полимеразы между нуклеоидом и цитоплазмой в разных фазах роста. Среди специфических механизмов регуляции экспрессии генов были определены и исследованы ряд консервативных для Молликут регуляторов (в скобках их мишени) - MraZ (гены DCW кластера), WhiA (гены рибосомных белков), SpxA (гены белков, поддерживающих гомеостаз окислительно-восстановительного потенциала). Также был исследован ряд видоспецифичных регуляторов Mycoplasma gallisepticum: Fur (транспортёр металлов) и HsdC (система рестрикции-модификации). Был найден новый уникальный регулятор оперона генов белков инициации репликации ДНК (DnaA-ParA). Было показано, ряд генов домашнего хозяйства у M. gallisepticum, несмотря на общую редукцию генома и систем регуляции его экспрессии, регулируется на уровне транскрипции с динамическим диапазоном от порядка и выше.

В ходе работы был разработан набор генно-инженерных методов для M. gallisepticum включая: (1) вектор и метод трансформации, (2) систему для сверхэкспрессии генов, (3) систему для генного нокдауна. Был разработан метод нормализации библиотек кДНК для высокопроизводительного секвенирования с помощью дуплекс-специфической нуклеазы (DSN). Был разработан метод для полногеномного картирования точек инициации транскрипции. Был разработан метод предсказания сила промотора M. gallisepticum исходя из его последовательности. Было создано программное обеспечение (BAC-browser) для визуализации данных геномики и транскриптомики, и для генной инженерии, в частности для дизайна олигонуклеотидов для ПЦР, ДНК-микроматриц и разбиения последовательности ДНК на олигонуклеотиды для последующего химико-ферментативного синтеза генного блока.

Методология и методы исследования

Методы, использованные при выполнение настоящей работы включают: культивирование Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma melliferum и Mycoplasma gallisepticum в разных условиях, генная инженерия M. gallisepticum (трансформация, сверхэкспрессия, нокдаун, флуоресцентные репортеры), получение рекомбинантных белков в E. coli, анализ связывания белков с ДНК методами торможения в геле, капиллярного термофореза, гель-фильтрации, анализ мембранных комплексов методом blue-native электрофореза, ОТ-ПЦР в реальном времени, капельно-цифровая ОТ-ПЦР, транскриптомный анализ методами высокопроизводительного секвенирования и гибридизации на ДНК-микроматрицах, полногеномное картирование точек инициации транскрипции, выделение рибосомной фракции M. gallisepticum, рибосомное профилирование, выделение нуклеоидной фракции M. gallisepticum, атомно-силовая микроскопия, аффинная хроматография, протеомный анализ методом ВЭЖХ-МС, локализационная микроскопия с субдифракционным разрешением.

Основные положения, выносимые на защиту

• Проведён транскрипционный анализ и полногеномное картирование точек инициации транскрипции у Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma melliferum, M. gallisepticum . Установлена структура промоторов и транскрипционных терминаторов.

• Проведено рибосомное профилированиеM. gallisepticum в логарифмической фазе роста и тепловом стрессе. Показано, что корреляция между транскрипцией и трансляцией в тепловом стрессе исчезает на уровне связывания рибосом с мРНК («рибосомный фильтр»).

• Степень компактизации нуклеоида M. gallisepticum зависит от фазы роста и коррелирует с представленностью РНК-полимеразы во фракции нуклеоида. В стационарной фазе уровень компактизации нуклеоида выше и представленность РНК-полимеразы ниже.

• Идентифицированы консервативные и видоспецифичные транскрипционные регуляторы в пангеноме Молликут. Для консервативных регуляторов показано, что MraZ является активатором DCW кластера (mraZ, mraW, ftsA, ftsZ), WhiA является репрессором оперона (rpsJ-map), SpxA является активатором генов osmC, trxA2. Для видоспецифичных регуляторов показано, что Fur является репрессором гена zip. HsdC является репрессором оперона РМ-системы MgaS6I.

• Создана количественная модель промотора M. gallisepticum на основе машинного обучения . Показано, что экспрессия ряда генов домашнего хозяйства регулируется с помощью новых механизмов.

• Найден новый уникальный белок-репрессор оперона dnaA-parA. Найдены новые рибопереключатели оперонов hatABC и infC

Степень достоверности и апробация результатов

Основные положения диссертации докладывались на различных конференциях:

• «Природное редактирование ДНК для ухода от иммунного ответа у Mycoplasma gallisepticum», Вторая Всероссийская научная конференция с международным участием. Иркутск, 2022.

• «Механизм вариабельности поверхностных гемагглютининов у Mycoplasma gallisepticum», VII Съезд биохимиков России. X Российский симпозиум «Белки и пептиды», VII Съезд физиологов СНГ. Москва, 2021.

• «Тёмная материя регуляции экспрессии генов в минимальной клетке», II Объединённый научный форум VI Съезд физиологов СНГ VI Съезд биохимиков России IX Российский симпозиум «Белки и пептиды», Сочи-Дагомыс, 2019.

• «Тёмная материя регуляции экспрессии генов в минимальной клетке», ПОСТГЕНОМ 2018, Казань.

• «Indentification of novel mechanisms of transcriptional regulation in reduced bacteria using machine learning and high-throughput identification of promoters», The FEBS Congress 2018, Прага, Чехия.

• «Reconstruction of transcription control networks in Mollicutes by high-throughput identification of promoters», Moscow Conference on Computational Molecular Biology (MCCMB 2017).

• «Рибосомальное профилирование Mycoplasma gallisepticum», I Объединённый научный форум V Съезд физиологов СНГ V Съезд биохимиков России, Сочи-Дагомыс, 2016.

• «Reconstruction of transcription regulation networks in genome-reduced bacteria (Mollicutes), International Conference on Systems Biology», 2016, Барселона, Испания.

• «Стрессовый ответ у Mycoplasma gallisepticum: адаптивная реакция или сломанные тормоза?», ПОСТГЕНОМ 2014, Казань.

Исследования по теме диссертации были поддержаны грантами РНФ: 1424-00159 «Системное исследование минимальной клетки на модели Mycoplasma gallisepticum» и 19-74-10105 «Роль структуры хроматина минимальной клетки в поддержании гомеостаза протеома домашнего хозяйства», государственным заданием № 122030900107-3 «Создание искусственных клеточных систем».

Все эксперименты проводились в нескольких повторах (три или более). Получаемые результаты валидировались несколькими независимыми методами. Результаты исследования опубликованы в ведущих рецензируемых журналах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 . Fisunov G.Y., Tsvetkov V.B., Tsoy E.A., Evsyutina D.V., Vedyaykin A.D., Garanina I.A., Semashko T.A., Manuvera V.A., Varizhuk A.M., Kovalchuk S.I., Zubov A.I., Barinov N.A., Pobeguts O.V., Govorun V.M. WhiA transcription factor provides feedback loop between translation and energy production in a genome-reduced bacterium // Frontiers in Microbiology. 2024. Vol. 15. P. 1-20.

2. Evsyutina D.V., Fisunov G.Y., Pobeguts O.V., Kovalchuk S.I., Govorun V.M. Gene Silencing through CRISPR Interference in Mycoplasmas. // Microorganisms . 2022. Vol. 10 № 6 . P. 1159 .

3. Evsyutina D.V., Semashko T.A., Galyamina M.A., Kovalchuk S.I., Ziganshin R.H., Ladygina V.G., Fisunov G.Y., Pobeguts O.V. Molecular Basis of the Slow Growth of Mycoplasma hominis on Different Energy Sources // Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 2022. Vol. 12. P. 918557.

4 . Fisunov G.Y., Pobeguts O .V. , Ladygina V.G. , Zubov A . I . , Galyamina M. A. ,

Kovalchuk S . I . , Ziganshin R . K . , Evsyutina D .V. , Matyushkina D . S. , Butenko I . O. , Bukato O.N. , Veselovsky V. A. , Semashko T. A. , Klimina K .M. , Levina G. A. , Barhatova O . I . , Rakovskaya I .V. Thymidine utilisation pathway is a novel phenotypic switch of Mycoplasma hominis // Journal of Medical Microbiology. 2022. Vol. 71, № 1. P. 001468.

5 . Fisunov G.Y., Zubov A.I., Pobeguts O.V., Varizhuk A.M., Galyamina M.A.,

Evsyutina D.V., Semashko T.A., Manuvera V.A., Kovalchuk S.I., Ziganshin R.K., Barinov N.A., Klinov D.V., Govorun V.M. The Dynamics of Mycoplasma gallisepticum Nucleoid Structure at the Exponential and Stationary Growth Phases. // Frontiers in Microbiology. 2021. Vol. 12, № 1. P. 753760 .

6 . Галямина М.А., Зубов А.И., Ладыгина В.Г., Ли А.В., Матюшкина Д.С.,

Побегуц О.В., Фисунов Г.Ю. Сравнительный протеомный анализ фракции нуклеоида Mycoplasma gallisepticum до и после инфекции // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины . 2021. Vol. 172, № 9. P. 336 -340.

7 . Зубов А.И., Ладыгина В.Г., Галямина М.А., Побегуц О.В., Фисунов Г.Ю.

Выделение фракции нуклеоида из клеток Mycoplasma gallisepticum с синхронизированным клеточным делением // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины . 2021. Vol. 171, № 6 . P. 760-763 .

8. Rumyantseva N.A., Vedyaykin A.D., Khodorkovskii M.A., Vishnyakov I.E., Fisunov G.Y. Analysis of stochasticity of gene expression in single cells of Mycoplasma gallisepticum. // Journal of Physics: Conference Series. 2019. Vol. 1400, № 3. P. 033020

9. Garanina I.A., Fisunov G.Y., Govorun V.M. BAC-BROWSER: The Tool for Visualization and Analysis of Prokaryotic Genomes. // Frontiers in Microbiology. 2018. Vol. 9, № 1. P. 2827.

10. Orlov M., Garanina I., Fisunov G.Y., Sorokin A. Comparative Analysis of Mycoplasma gallisepticum vlhA Promoters. // Frontiers in Genetics. 2018. Vol. 9, № 1. P. 569

11. Butenko I., Vanyushkina A., Pobeguts O., Matyushkina D., Kovalchuk S., Gorbachev A., Anikanov N., Fisunov G., Govorun V. Response induced in Mycoplasma gallisepticum under heat shock might be relevant to infection process. // Scientific Reports. 2017. Vol. 7, № 1. P. 11330.

12. Fisunov G.Y., Evsyutina D. V., Manuvera V.A., Govorun V.M. Binding site of restriction-modification system controller protein in Mollicutes. // BMC Microbiology. 2017. Vol. 17, № 1. P. 26.

13 . Fisunov G.Y., Evsyutina D. V., Garanina I.A., Arzamasov A.A., Butenko I.O., Altukhov I.A., Nikitina A.S., Govorun V.M. Ribosome profiling reveals an adaptation strategy of reduced bacterium to acute stress // Biochimie . 2017. Vol. 132. P. 66-74.

14. Butenko I., Pobeguts O., Matyushkina D., Kovalchuk S., Anikanov N., Fisunov G., Govorun V. Data-independent proteome profile of Mycoplasma gallisepticum under normal conditions and heat stress // Data in Brief. 2017. Vol. 16. P. 700-704.

15. Matyushkina D., Pobeguts O., Butenko I., Vanyushkina A., Anikanov N., Bukato O., Evsyutina D., Bogomazova A., Lagarkova M., Semashko T., Garanina I., Babenko V., Vakhitova M., Ladygina V., Fisunov G., Govorun V. Phase Transition of the Bacterium upon Invasion of a Host Cell as a Mechanism of Adaptation: a Mycoplasma gallisepticum Model // Scientific Reports. 2016. Vol 6. P. 35959.

16 . Fisunov G.Y., Evsyutina D. V., Semashko T.A., Arzamasov A.A., Manuvera

V.A., Letarov A.V., Govorun V.M. Binding site of MraZ transcription factor in Mollicutes // Biochimie . 2016. Vol. 125. P. 59-65.

17 . Fisunov G.Y., Garanina I.A., Evsyutina D. V., Semashko T.A., Nikitina A.S.,

Govorun V.M. Reconstruction of Transcription Control Networks in Mollicutes by High-Throughput Identification of Promoters // Frontiers in Microbiology 2016. Vol. 7, №1, P. 1977.

18. Semashko T.A., Arzamasov A.A., Fisunov G.Y., Govorun V.M. Transcription profiling data set of different states of Mycoplasma gallisepticum // Genomic Data. 2016. Vol. 11, №1, P. 49-54.

19 . Fisunov G.Y., Evsyutina D.V., Govorun V.M. Data on translatome analysis of Mycoplasma gallisepticum // Data in Brief. 2016. Vol. 9 . P. 422-424.

20. Matyushkina D., Pobeguts O., Garanina I., Babenko V., Vakhitova M., Fisunov G., Govorun V. Data on genome analysis of Mycoplasma gallisepticum during intracellular infection // Data in Brief. 2016 . Vol. 10. P. 264-268

21. Fisunov G.Y., Evsyutina D. V., Arzamasov A.A., Butenko I.O., Govorun V.M. Profiling of Mycoplasma gallisepticum ribosomes // ActaNaturae . 2015. Vol. 7, № 4(27). P. 107-112.

22. Mazin P.V., Fisunov G.Y., Gorbachev A.Y., Kapitskaya K.Y., Altukhov I.A., Semashko T.A., Alexeev D.G., Govorun V.M. Transcriptome analysis reveals novel regulatory mechanisms in a genome-reduced bacterium // Nucleic Acids Research. 2014. Vol. 42, № 21. P. 13254-13268.

23. Vanyushkina A.A., Fisunov G.Y., Gorbachev A.Y., Kamashev D.E., Govorun V.M. Metabolomic analysis of three Mollicute species // PLoS One. 2014. Vol. 9, № 3. P. e89312 .

Структура диссертации

Диссертационная работа представлена на 240 страницах. Структура диссертации включает следующие разделы: Оглавление, Список сокращений, Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Выводы, Список цитируемой литературы, включающий 266 источников. Диссертация содержит 86 рисунков и 24 таблицы.

Личный вклад автора

Автором проводилось культивирование бактерий Mycoplasma gallisepticum, Spiroplasma melliferum, Acholeplasma laidlawii, E. coli. Автором проводилось выделение РНК и подготовка библиотек для 5'-концевого обогащённого секвенирования и их анализ. Автором проводился сравнительный анализ промоторов микоплазм для поиска возможных сайтов связывания транскрипционных регуляторов в рамках реконструкции транскрипционных сетей у Молликут. Автором проводилось создание генетических конструкций для экспрессии генов в M. gallisepticum и для получения рекомбинантных регуляторов в E. coli. Автором проводилась (и была ранее разработана) методика генетической трансформации M. gallisepticum. Автором предложена методика эффективного синтеза генных блоков и проводился синтез генных блоков при необходимости.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Фисунов Глеб Юрьевич, 2025 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Mushegian A.R., Koonin E. V. A minimal gene set for cellular life derived by comparison of complete bacterial genomes. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1996. Vol. 93, № 19. P. 10268-10273.

2. Kobayashi K. et al. Essential Bacillus subtilis genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003. Vol. 100, № 8. P. 4678-4683.

3. Forster A.C., Church G.M. Towards synthesis of a minimal cell. // Mol. Syst. Biol. 2006.

4. Glass J.I. et al. Essential genes of a minimal bacterium. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. Vol. 103, № 2. P. 425-430.

5. Fraser C.M. et al. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium. // Science. 1995. Vol. 270. P. 397-403.

6. Lartigue C. et al. Creating bacterial strains from genomes that have been cloned and engineered in yeast. // Science. 2009. Vol. 325, № 5948. P. 1693-1696.

7. Hutchison C.A. et al. Design and synthesis of a minimal bacterial genome // Science. 2016. Vol. 351, № 6280. P. aad6253-aad6253.

8. Maier T., Schmidt A., Güell M. Quantification of mRNA and protein and integration with protein turnover in a bacterium // Mol. Syst. Biol. 2011. Vol. 7. P. 511 .

9. Wolf M. Phylogeny of Firmicutes with special reference to Mycoplasma (Mollicutes) as inferred from phosphoglycerate kinase amino acid sequence data // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. Vol. 54, № 3. P. 871-875.

10. Nocard E.I.E., Roux E. The microbe of pleuropneumonia. // Ann. Inst. Pasteur (Paris). 1896. Vol. 12. P. 240-62.

11. Gibson D.G. et al. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome // Science. 2010. Vol. 329, № 5987. P. 52-56.

12. Razin S., Yogev D. Molecular biology and pathogenicity of mycoplasmas // Microbiol. Mol. Biol. 1998. Vol. 62, № 4. P. 1094-1156.

13. Razin S. The Mycoplasmas // Microbiol. Rev. 1978. Vol. 42, № 2. P. 414-470.

14. Sirand-Pugnet P. et al. Being pathogenic, plastic, and sexual while living with a nearly minimal bacterial genome. // PLoS Genet. 2007. Vol. 3, № 5. P. e75.

15. Tully J.G. et al. Revised Taxonomy of the Class Mollicutes : Proposed Elevation of a Monophyletic Cluster of Arthropod-Associated Mollicutes to Ordinal Rank (Entomoplasmatales ord. nov.), with Provision for Familial Rank To Separate Species with Nonhelical Morphology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1993. Vol. 43, № 2. P. 378-385.

16. Naito M., Morton J.B., Pawlowska T.E. Minimal genomes of mycoplasma-related endobacteria are plastic and contain host-derived genes for sustained life within Glomeromycota. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2015. Vol. 112, № 25. P. 7791-7796.

17. Gorbachev A.Y. et al. DNA repair in Mycoplasma gallisepticum // BMC Genomics. 2013. Vol. 14. P. 726.

18. Jacob F., Monod J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. // J. Mol. Biol. 1961. Vol. 3. P. 318-356.

19. Lewis M. et al. Crystal structure of the lactose operon represser and its complexes with DNA and inducer // Science. 1996. Vol. 271, № 5253. P. 1247-1254.

20. Reidl J. et al. Mall, a novel protein involved in regulation of the maltose system of Escherichia coli, is highly homologous to the repressor proteins GalR, CytR, and Lacl. // J. Bacteriol. 1989. Vol. 171, № 9. P. 4888-4899.

21. Semsey S. et al. Operator-bound GAlR dimers close DNA loops by direct interaction: Tetramerization and inducer binding // EMBO J. 2002. Vol. 21, № 16. P. 4349-4356.

22. Meng L.M., Nygaard P. Identification of hypoxanthine and guanine as the co-repressors for the purine regulon genes of Escherichia coli // Mol. Microbiol. 1990. Vol. 4, № 12. P. 2187-2192.

23. Brinkrolf K. et al. The Lacl/GaIR family transcriptional regulator UriR negatively controls uridine utilization of Corynebecterium glutamicum by binding to catabolite-responsive element (cre)-like sequences // Microbiology. 2008. Vol. 154, № 4. P. 1068-1081.

24. Escolar L., Pérez-Martín J., de Lorenzo V. Binding of the fur (ferric uptake regulator) repressor of Escherichia coli to arrays of the GATAAT sequence. // J. Mol. Biol. 1998. Vol. 283, № 3. P. 537-547.

25. Díaz-Mireles E. et al. The Fur-like protein Mur of Rhizobium leguminosarum is a Mn2+ - responsive transcriptional regulator // Microbiology. 2004. Vol. 150, № 5. P. 1447-1456.

26. Patzer S.I., Hantke K. The ZnuABC high-affinity zinc uptake system and its regulator Zur in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 1998. Vol. 28, № 6. P. 1199-1210.

27. An Y.J. et al. Structural basis for the specialization of Nur, a nickel-specific Fur homolog, in metal sensing and DNA recognition // Nucleic Acids Res. 2009. Vol. 37, № 10. P. 3442-3451.

28. Lee J.W., Helmann J.D. The PerR transcription factor senses H2O2 by metal-catalysed histidine oxidation // Nature. 2006. Vol. 440, № 7082. P. 363-367.

29. Qi Z., Hamza I., O'Brian M.R. Heme is an effector molecule for iron-dependent degradation of the bacterial iron response regulator (Irr) protein // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999. Vol. 96, № 23. P. 13056-13061.

30. Baichoo N., Helmann J.D. Recognition of DNA by Fur: a Reinterpretation of the Fur Box Consensus Sequence. 2002. Vol. 184, № 21. P. 5826-5832.

31. Troxell B., Hassan H.M. Transcriptional regulation by Ferric Uptake Regulator (Fur) in pathogenic bacteria // Front. Cell. Infect. Microbiol. 2013. Vol. 4, № OCT. P. 1-13.

32. Fujita Y., Fujita T. The gluconate operon gnt of Bacillus subtilis encodes its own transcriptional negative regulator. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987. Vol. 84, № 13. P. 4524-4528.

33. DiRusso C.C., Heimert T.L., Metzger A.K. Characterization of FadR, a global transcriptional regulator of fatty acid metabolism in Escherichia coli. Interaction with the fadB promoter is prevented by long chain fatty acyl coenzyme As // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267, № 12. P. 8685-8691.

34. Pellicer M.T. et al. Cross-induction of glc and ace operons of Escherichia coli attributable to pathway intersection. Characterization of the glc promoter // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274, № 3. P. 1745-1752.

35. Schöck F., Dahl M.K. Expression of the tre operon of Bacillus subtilis 168 is regulated by the repressor TreR // J. Bacteriol. 1996. Vol. 178, № 15. P. 4576-4581.

36. Edayathumangalam R. et al. Crystal structure of Bacillus subtilis GabR, an autorepressor and transcriptional activator of gabT // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013. Vol. 110, № 44. P. 17820-17825.

37. Ogasawara H. et al. PdhR (pyruvate dehydrogenase complex regulator) controls the respiratory electron transport system in Escherichia coli // J. Bacteriol. 2007. Vol. 189, № 15. P. 5534-5541.

38. Aguilera L. et al. Dual role of LldR in regulation of the lldPRD operon, involved in L-lactate metabolism in Escherichia coli // J. Bacteriol. 2008. Vol. 190, № 8. P. 2997-3005.

39. Lee H.Y., An J.H., Kim Y.S. Identification and characterization of a novel transcriptional regulator, MatR, for malonate metabolism in Rhizobium leguminosarum bv. trifolii // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267, № 24. P. 7224-7230.

40. Allison S.L., Phillips A.T. Nucleotide sequence of the gene encoding the repressor for the histidine utilization genes of Pseudomonas putida // J. Bacteriol. 1990. Vol. 172, № 9. P. 5470-5476.

41. Wiethaus J. et al. The GntR-like regulator TauR activates expression of taurine utilization genes in Rhodobacter capsulatus // J. Bacteriol. 2008. Vol. 190, № 2. P. 487-493.

42. Stragier P., Patte J.C. Regulation of diaminopimelate decarboxylase synthesis in Escherichia coli. III. nucleotide sequence and regulation of the lysR gene // J. Mol. Biol. 1983. Vol. 168, № 2. P. 333-350.

43. Kovacikova G., Lin W., Skorupski K. The LysR-type virulence activator AphB regulates the expression of genes in Vibrio cholerae in response to low pH and anaerobiosis // J. Bacteriol. 2010. Vol. 192, № 16. P. 4181-4191.

44. Chiang S.M., Schellhorn H.E. Regulators of oxidative stress response genes in Escherichia coli and their functional conservation in bacteria. // Arch. Biochem. Biophys. Elsevier Inc., 2012. Vol. 525, № 2. P. 161-169.

45. Singh D.K. et al. A putative merR family transcription factor Slr0701 regulates mercury inducible expression of MerA in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 // Microbiologyopen. 2019. Vol. 8, № 9. P. 1-15.

46. Liu X. et al. Selective cadmium regulation mediated by a cooperative binding mechanism in CadR // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2019. Vol. 116, № 41. P. 20398-20403.

47. Borremans B. et al. Cloning and Functional Analysis of the // Society. 2001. Vol. 183, № 19. P. 5651-5658.

48. Ahmed M. et al. A protein that activates expression of a multidrug efflux transporter upon binding the transporter substrates // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, № 45. P. 28506-28513.

49. Kahmann J.D. et al. Structural basis for antibiotic recognition by the TipA class of multidrug-resistance transcriptional regulators // EMBO J. 2003. Vol. 22, № 8. P. 1824-1834.

50. Nunoshiba T. et al. Negative autoregulation by the Escherichia coli SoxS protein: A dampening mechanism for the soxRS redox stress response // J. Bacteriol. 1993. Vol. 175, № 22. P. 7492-7494.

51. Schmid A.K. et al. HspR is a global negative regulator of heat shock gene expression in Deinococcus radiodurans. // Mol. Microbiol. 2005. Vol. 55, № 5. P. 1579-1590.

52. Bucca G., Hindle Z., Smith C.P. Regulation of the dnaK operon of Streptomyces coelicolor A3(2) is governed by HspR, an autoregulatory repressor protein // J. Bacteriol. 1997. Vol. 179, № 19. P. 5999-6004.

53. Alekshun M.N., Levy S.B. Regulation of chromosomally mediated multiple antibiotic resistance: The mar regulon // Antimicrob. Agents Chemother. 1997. Vol. 41, № 10. P. 2067-2075.

54. Oh H.Y., Lee J.O., Kim O. Bin. Increase of organic solvent tolerance of Escherichia coli by the deletion of two regulator genes, fadR and marR // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012. Vol. 96, № 6. P. 1619-1627.

55. Kong L. et al. CtcS, a MarR family regulator, regulates chlortetracycline biosynthesis // BMC Microbiol. BMC Microbiology, 2019. Vol. 19, № 1. P. 1-11.

56. Gregory G.J., Morreale D.P., Boyd E.F. CosR is a global regulator of the osmotic stress response with widespread distribution among bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2020. № March.

57. Palm G.J. et al. Structural insights into the redox-switch mechanism of the MarR/ DUF24-type regulator HypR. // Nucleic Acids Res. 2012. Vol. 40, № 9. P. 41784192.

58. Schumann W. The Bacillus subtilis heat shock stimulon. // Cell Stress Chaperones. 2003. Vol. 8, № 3. P. 207-217.

59. Zoltowski B.D., Motta-Mena L.B., Gardner K.H. Blue light-induced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein // Biochemistry. 2013. Vol. 52, № 38. P. 6653-6661.

60. Courcelle J. et al. Comparative gene expression profiles following UV exposure in wild-type and SOS-deficient Escherichia coli // Genetics. 2001. Vol. 158, № 1. P. 41-64.

61. Chen Z., Yang H., Pavletich N.P. Mechanism of homologous recombination from the RecA-ssDNA/dsDNA structures // Nature. 2008. Vol. 453, № 7194. P. 489-494.

62. Little J.W. Mechanism of specific LexA cleavage: Autodigestion and the role of RecA coprotease // Biochimie. 1991. Vol. 73, № 4. P. 411-421.

63. Boch J. et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors // Science. 2009. Vol. 326, № 5959. P. 1509-1512.

64. Adams M. a. et al. MraZ from Escherichia coli: Cloning, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis // Acta Crystallogr. Sect. F. 2005. Vol. 61, № 4. P. 378-380.

65. Fisunov G.Y. et al. Binding site of MraZ transcription factor in Mollicutes // Biochimie. Elsevier B.V, 2016. Vol. 125. P. 59-65.

66. Eraso J.M. et al. The highly conserved MraZ protein is a transcriptional regulator in Escherichia coli // J. Bacteriol. 2014. Vol. 196, № 11. P. 2053-2066.

67. Skarstad K., Katayama T. Regulating DNA replication in bacteria // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013. Vol. 5, № 4. P. 1-17.

68. Chen Y., Rosen B.P. Metalloregulatory Properties of the ArsD Repressor // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272, № 22. P. 14257-14262.

69. Ye J. et al. The 1.4 Ä crystal structure of the ArsD arsenic metallochaperone provides insights into its interaction with the ArsA ATPase // Biochemistry. 2010. Vol. 49, № 25. P. 5206-5212.

70. Li S. et al. Evidence for cooperativity between the four binding sites of dimeric ArsD , an As (III)-responsive transcriptional regulator // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, № 29. P. 25992-26002.

71. Crawford J.A., Krukonis E.S., DiRita V.J. Membrane localization of the ToxR winged-helix domain is required for TcpP-mediated virulence gene activation in Vibrio cholerae // Mol. Microbiol. 2003. Vol. 47, № 5. P. 1459-1473.

72. Neely M.N., Dell C.L., Olson E.R. Roles of LysP and CadC in mediating the lysine requirement for acid induction of the Escherichia coli cad operon // J. Bacteriol. 1994. Vol. 176, № 11. P. 3278-3285.

73. Gao R., Stock A. Biological Insights from Structures of Two-Component Proteins // Annu. Rev. Microbiol. 2009. Vol. 63. P. 133-154.

74. Leonardo M.R., Forst S. Re-examination of the role of the periplasmic domain of EnvZ in sensing of osmolarity signals in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 1996. Vol. 22, № 3. P. 405-413.

75. Soncini F.C., Groisman E. a. Mg 2 as an Extracellular Signal : // Cell. 1996. Vol. 84. P. 165-174.

76. Goodman H.M. Regulation of lipid metabolism. // Physiologist. 1970. Vol. 13, № 2. P. 75-88.

77. Bader M.W. et al. Recognition of antimicrobial peptides by a bacterial sensor kinase // Cell. 2005. Vol. 122, № 3. P. 461-472.

78. Jourlin C. et al. An unorthodox sensor protein (TorS) mediates the induction of the tor structural genes in response to trimethylamine N-oxide in Escherichia coli // Mol. Microbiol. 1996. Vol. 20, № 6. P. 1297-1306.

79. Gon S. et al. An unsuspected autoregulatory pathway involving apocytochrome TorC and sensor TorS in Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. Vol. 98, № 20. P. 11615-11620.

80. Williams S.B., Stewart V. Discrimination between structurally related ligands nitrate and nitrite controls autokinase activity of the NarX transmembrane signal transducer of Escherichia coli K-12 // Mol. Microbiol. 1997. Vol. 26, № 5. P. 911-925.

81. Antoine R. et al. The periplasmic binding protein of a tripartite tricarboxylate transporter is involved in signal transduction // J. Mol. Biol. 2005. Vol. 351, № 4. P. 799-809.

82. Epstein W. The KdpD sensor kinase of Escherichia coli responds to several distinct signals to turn on expression of the Kdp transport system // J. Bacteriol. 2016. Vol. 198, № 2. P. 212-220.

83. Schumacher J. et al. Nitrogen and carbon status are integrated at the transcriptional level by the nitrogen regulator NtrC in vivo // MBio. 2013. Vol. 4, № 6. P. 1-9.

84. Malpica R. et al. Identification of a quinone-sensitive redox switch in the ArcB sensor kinase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004. Vol. 101, № 36. P. 13318-13323.

85. Williams C.L., Cotter P.A. Autoregulation is essential for precise temporal and steady-state regulation by the Bordetella BvgAS phosphorelay // J. Bacteriol. 2007. Vol. 189, № 5. P. 1974-1982.

86. Albanesi D. et al. Structural plasticity and catalysis regulation of a thermosensor histidine kinase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2009. Vol. 106, № 38. P. 16185-16190.

87. Moukhametzianov R. et al. Development of the signal in sensory rhodopsin and its transfer to the cognate transducer // Nature. 2006. Vol. 440, № 7080. P. 115-119.

88. Vogt S.L., Raivio T.L. Just scratching the surface: An expanding view of the Cpx envelope stress response // FEMS Microbiol. Lett. 2012. Vol. 326, № 1. P. 2-11.

89. Stiefel A. et al. Control of the Ferric Citrate Transport System of // J. Bacteriol.

2001. Vol. 183, № 1. P. 162-170.

90. Ho T.D., Ellermeier C.D. Extra cytoplasmic function o factor activation. // Current opinion in microbiology. 2012. Vol. 15, № 2. P. 182-188.

91. Reitzer L. Nitrogen Assimilation and Global Regulation in Escherichia coli // Annu. Rev. Microbiol. 2003. Vol. 57, № 1. P. 155-176.

92. Guisbert E. et al. Convergence of molecular, modeling, and systems approaches for an understanding of the Escherichia coli heat shock response. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2008. Vol. 72, № 3. P. 545-554.

93. Hengge-Aronis R. Signal Transduction and Regulatory Mechanisms Involved in Control of the S (RpoS) Subunit of RNA Polymerase // Microbiol. Mol. Biol. Rev.

2002. Vol. 66, № 3. P. 373-395.

94. Chilcott G.S., Hughes K.T. Coupling of Flagellar Gene Expression to Flagellar Assembly in Salmonella enterica Serovar Typhimurium and Escherichia coli // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. Vol. 64, № 4. P. 694-708.

95. Haldenwang W.G. The sigma factors of Bacillus subtilis. // Microbiol. Rev. 1995. Vol. 59, № 1. P. 1-30.

96. Debarbouille M. et al. The Bacillus subtilis sigL gene encodes an equivalent of o54 from gram-negative bacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991. Vol. 88, № 20. P. 9092-9096.

97. Van Schaik W. et al. Analysis of the role of RsbV, RsbW, and RsbY in regulating oB activity in Bacillus cereus // J. Bacteriol. 2005. Vol. 187, № 16. P. 5846-5851.

98. Quin M.B. et al. The bacterial stressosome: a modular system that has been adapted to control secondary messenger signaling. // Structure. 2012. Vol. 20, № 2. P. 350-363.

99. Mukherjee S., Kearns D.B. The structure and regulation of flagella in Bacillus subtilis // Annu. Rev. Genet. 2014. Vol. 48. P. 319-340.

100. Serrano M. et al. Dual-Specificity Anti-sigma Factor Reinforces Control of CellType Specific Gene Expression in Bacillus subtilis // PLoS Genet. 2015. Vol. 11, № 3. P. 1-28.

101. Britton R.A. et al. Genome-wide analysis of the stationary-phase sigma factor (Sigma-H) regulon of Bacillus subtilis // J. Bacteriol. 2002. Vol. 184, № 17. P. 4881-4890.

102. Zhao H., Roistacher D.M., Helmann J.D. Deciphering the essentiality and function of the anti-oM factors in Bacillus subtilis // Mol. Microbiol. 2019. Vol. 112, № 2. P. 482-497.

103. Burton A.T. et al. Transcriptional regulation and mechanism of sigN (ZpdN), a pBS32-encoded sigma factor in bacillus subtilis // MBio. 2019. Vol. 10, № 5. P. 1-15.

104. Ho T.D. et al. The Bacillus subtilis extracytoplasmic function o factor o v is induced by lysozyme and provides resistance to lysozyme // J. Bacteriol. 2011. Vol. 193, № 22. P. 6215-6222.

105. Pietiäinen M. et al. Cationic antimicrobial peptides elicit a complex stress response in Bacillus subtilis that involves ECF-type sigma factors and two-component signal transduction systems // Microbiology. 2005. Vol. 151, № 5. P. 1577-1592.

106. Brutsche S., Braun V. SigX of Bacillus subtilis replaces the ECF sigma factor Fecl of Escherichia coli and is inhibited by RsiX // Mol. Gen. Genet. 1997. Vol. 256, № 4. P. 416-425.

107. Tojo S. et al. Organization and Expression of the Bacillus subtilis sigY Operon // J. Biochem. 2003. Vol. 134, № 6. P. 935-946.

108. Asai K. et al. DNA microarray analysis of Bacillus subtilis sigma factors of extracytoplasmic function family // FEMS Microbiol. Lett. 2003. Vol. 220, № 1. P. 155-160.

109. Matsumoto T. et al. Transcriptional analysis of the ylaABCD operon of Bacillus subtilis encoding a sigma factor of extracytoplasmic function family // Genes Genet. Syst. 2005. Vol. 80, № 6. P. 385-393.

110. Wolz C., Geiger T., Goerke C. The synthesis and function of the alarmone (p) ppGpp in firmicutes. // Int. J. Med. Microbiol. 2010. Vol. 300, № 2-3. P. 142-147.

111. Lemke J., Sanchez-Vazquez P. Direct regulation of Escherichia coli ribosomal protein promoters by the transcription factors ppGpp and DksA // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2011.

112. Roberts J.W. Promoter-specific control of E. coli RNA polymerase by ppGpp and a general transcription factor. // Genes Dev. 2009. Vol. 23, № 2. P. 143-146.

113. You C. et al. Spx mediates oxidative stress regulation of the methionine sulfoxide reductases operon in Bacillus subtilis. // BMC Microbiol. 2008. Vol. 8. P. 128.

114. Wassarman K.M. 6S RNA, a Global Regulator of Transcription // Regul. with RNA Bact. Archaea. 2018. Vol. 6, № 3. P. 355-367.

115. Koh B.T., Tan R.B.H., Yap M.G.S. Modeling of trp Attenuator Mechanism. 1998.

116. Wickiser J.K. et al. The speed of RNA transcription and metabolite binding kinetics operate an FMN riboswitch // Mol. Cell. 2005. Vol. 18, № 1. P. 49-60.

117. Balvay L. et al. Structural and functional diversity of viral IRESes // Biochim. Biophys. Acta - Gene Regul. Mech. 2009. Vol. 1789, № 9-10. P. 542-557.

118. Breaker R.R., Winkler W., Nahvi A. Thiamine derivatives bind messenger RNAs directly to regulate bacterial gene expression // Nature. 2002. Vol. 419, № 6910. P. 952-956.

119. Winkler W.C. et al. An mRNA structure that controls gene expression by binding S-adenosylmethionine // Nat. Struct. Biol. 2003. Vol. 10, № 9. P. 701-707.

120. Bonner E.R. Molecular recognition of pyr mRNA by the Bacillus subtilis attenuation regulatory protein PyrR // Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 29, № 23. P. 4851-4865.

121. Amster-Choder O. The bgl sensory system: A transmembrane signaling pathway controlling transcriptional antitermination // Curr. Opin. Microbiol. 2005. Vol. 8, № 2. P. 127-134.

122. Nocker A. et al. A mRNA-based thermosensor controls expression of rhizobial heat shock genes. // Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 29, № 23. P. 4800-4807.

123. Rinnenthal J. et al. Direct observation of the temperature-induced melting process of the Salmonella fourU RNA thermometer at base-pair resolution. // Nucleic Acids Res. 2010. Vol. 38, № 11. P. 3834-3847.

124. Gutiérrez-Preciado A. et al. Biochemical Features and Functional Implications of the RNA-Based T-Box Regulatory Mechanism // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2009. Vol. 73, № 1. P. 36-61.

125. Deiorio-haggar K., Anthony J., Meyer M.M. RNA structures regulating ribosomal protein biosynthesis in bacilli // RNA Biol. 2013. Vol. 10, № 7. P. 1180-1184.

126. Nomura M. et al. Feedback regulation of ribosomal protein gene expression in Escherichia coli: Structural homology of ribosomal RNA and ribosomal protein mRNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1980. Vol. 77, № 12 II. P. 7084-7088.

127. Williams K.P. Strong mimicry of an rRNA binding site for two proteins by the mRNA encoding both proteins // RNA Biol. 2008. Vol. 5, № 3.

128. Yakhnin H., Yakhnin A. V., Babitzke P. Ribosomal protein L10(L12) 4 autoregulates expression of the Bacillus subtilis rplJL operon by a transcription attenuation mechanism // Nucleic Acids Res. 2015. Vol. 43, № 14. P. 7032-7043.

129. Romby P., Springer M. Bacterial translational control at atomic resolution // Trends Genet. 2003. Vol. 19, № 3. P. 155-161.

130. Climie S.C., Friesen J.D. Feedback regulation of the rplJL-rpoBC ribosomal protein operon of Escherichia coli requires a region of mRNA secondary structure // J. Mol. Biol. 1987. Vol. 198, № 3. P. 371-381.

131. Springer M., Portier C. More than one way to skin a cat: Translational autoregulation by ribosomal protein S15 // Nat. Struct. Biol. 2003. Vol. 10, № 6. P. 420-422.

132. Köhrer C. et al. Interaction of ribosomal L1 proteins from mesophilic and thermophilic Archaea and Bacteria with specific L1-binding sites on 23S rRNA and mRNA // Eur. J. Biochem. 1998. Vol. 256, № 1. P. 97-105.

133. Zengel J.M., Sha Y., Lindahl L. Surprising flexibility of leader RNA determinants for r-protein L4-mediated transcription termination in the Escherichia coli S10 operon // Rna. 2002. Vol. 8, № 5. P. 572-578.

134. Choonee N. et al. Ribosomal protein L20 controls expression of the Bacillus subtilis infC operon via a transcription attenuation mechanism // Nucleic Acids Res. 2007. Vol. 35, № 5. P. 1578-1588.

135. Yanofsky C. et al. The complete nucleotide sequence of the tryptophan operon of Escherichia coli // Nucleic Acids Res. 1981. Vol. 9, № 24. P. 6647-6668.

136. Lynn S.P. et al. Specificity of the Attenuation Response of the Threonine Qperon of Escherichia coli is Determined by the Threonine and Isoleucine Codons in the Leader Transcriptt. 1987. P. 59-69.

137. Springeri M. et al. Attenuation Control of the Escherichia coli Phenylalanyl-tRNA Synthetase Operon. 1985.

138. Huntzinger E. et al. Staphylococcus aureus RNAIII and the endoribonuclease III coordinately regulate spa gene expression // EMBO J. 2005. Vol. 24, №2 4. P. 824-835.

139. Udekwu K.I. et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA // Genes Dev. 2005. Vol. 19, № 19. P. 2355-2366.

140. Aiba H. Mechanism of RNA silencing by Hfq-binding small RNAs // Curr. Opin. Microbiol. 2007. Vol. 10, № 2. P. 134-139.

141. Bruscella P. et al. RNase Y is responsible for uncoupling the expression of translation factor IF3 from that of the ribosomal proteins L35 and L20 in Bacillus subtilis // Mol. Microbiol. 2011. Vol. 81, № 6. P. 1526-1541.

142. Chen S. et al. Crystal structure of a protein associated with cell division from Mycoplasma pneumoniae (GI: 13508053): a novel fold with a conserved sequence motif. // Proteins. 2004. Vol. 55, № 4. P. 785-791.

143. Lwoff A. Lysogeny // Bacteriol. Rev. 1953. Vol. 17, № 4. P. 269-337.

144. Dodd I.B. et al. Cooperativity in long-range gene regulation by the XCI repressor // Genes Dev. 2004. Vol. 18, № 3. P. 344-354.

145. Santillan M., Mackey M.C. Why the Lysogenic State of Phage X Is so Stable: A Mathematical Modeling Approach // Biophys. J. 2004. Vol. 86, № 1 I. P. 75-84.

146. Lou C. et al. A quantitative study of X-phage SWITCH and its components // Biophys. J. 2007. Vol. 92, № 8. P. 2685-2693.

147. Rozanov D. V., D'Ari R., Sineoky S.P. RecA-independent pathways of lambdoid prophage induction in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1998. Vol. 180, № 23. P. 6306-6315.

148. Deutscher J., Francke C., Postma P.W. How Phosphotransferase System-Related Protein Phosphorylation Regulates Carbohydrate Metabolism in Bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006. Vol. 70, № 4. P. 939-1031.

149. Takano E. y-Butyrolactones: Streptomyces signalling molecules regulating antibiotic production and differentiation // Curr. Opin. Microbiol. 2006. Vol. 9, № 3. P. 287-294.

150. Kaiser B.K., Stoddard B.L. DNA recognition and transcriptional regulation by the WhiA sporulation factor // Sci. Rep. 2011. Vol. 1. P. 1-9.

151. Jakimowicz D., Mouz S., Chater K.F. Developmental control of a parAB promoter leads to formation of sporulation-associated ParB complexes in Streptomyces coelicolor // J. Bacteriol. 2006. Vol. 188, № 5. P. 1710-1720.

152. Niehus E., Cheng E., Tan M. DNA supercoiling-dependent gene regulation in Chlamydia. // J. Bacteriol. 2008. Vol. 190, № 19. P. 6419-6427.

153. Horwitz M.S.Z., Loeb L.A. An E. coli Promoter That Regulates Transcription by DNA Superhelix-Induced Cruciform Extrusion // Science. 1988. Vol. 165, № 1981. P. 5-7.

154. Postow L. et al. Topological domain structure ofthe Escherichia coli chromosome // Genes Dev. 2004. Vol. 18, № 14. P. 1766-1779.

155. Lioy V.S. et al. Multiscale Structuring of the E. coli Chromosome by Nucleoid-Associated and Condensin Proteins // Cell. 2018. Vol. 172, № 4. P. 771-783.e18.

156. Marbouty M. et al. Condensin- and Replication-Mediated Bacterial Chromosome Folding and Origin Condensation Revealed by Hi-C and Super-resolution Imaging // Mol. Cell. 2015. Vol. 59, № 4. P. 588-602.

157. Swinger K.K., Rice P.A. IHF and HU: Flexible architects of bent DNA // Curr. Opin. Struct. Biol. 2004. Vol. 14, № 1. P. 28-35.

158. Bonnefoy E., Rouviere-Yaniv J. HU and IHF, two homologous histone-like proteins of Escherichia coli, form different protein-DNA complexes with short DNA fragments. // EMBO J. 1991. Vol. 10, № 3. P. 687-696.

159. Ghosh S., Mallick B., Nagaraja V. Direct regulation of topoisomerase activity by a nucleoid-associated protein // Nucleic Acids Res. 2014. Vol. 42, № 17. P. 11156-11165.

160. Fievet A. et al. IHF is required for the transcriptional regulation ofthe Desulfovibrio vulgaris Hildenborough orp operons // PLoS One. 2014. Vol. 9, № 1. P. 1-9.

161. Hales L.M., Gumport R.I., Gardner J.F. Determining the DNA sequence elements required for binding integration host factor to two different target sites // J. Bacteriol. 1994. Vol. 176, № 10. P. 2999-3006.

162. Kamashev D. et al. Mycoplasma gallisepticum produces a histone-like protein that recognizes base mismatches in DNA // Biochemistry. 2011. Vol. 50, № 40. P. 8692-8702.

163. Lang B. et al. High-affinity DNA binding sites for H-NS provide a molecular basis for selective silencing within proteobacterial genomes // Nucleic Acids Res. 2007. Vol. 35, № 18. P. 6330-6337.

164. Dame R.T. et al. Structural basis for H-NS-mediated trapping of RNA polymerase in the open initiation complex at the rrnB P1 // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, № 3. P. 2146-2150.

165. Pul Ü. et al. LRP and H-NS - Cooperative partners for transcription regulation at Escherichia coli rRNA promoters // Mol. Microbiol. 2005. Vol. 58, № 3. P. 864-876.

166. Khodr A. et al. IHF is a trans-acting factor implicated in the regulation of the proU P2 promoter // FEMS Microbiol. Lett. 2015. Vol. 362, № 3. P. 1-6.

167. Skoko D. et al. Mechanism of Chromosome Compaction and Looping by the Escherichia coli Nucleoid Protein Fis // J. Mol. Biol. 2006. Vol. 364, № 4. P. 777-798.

168. Travers A., Schneider R., Muskhelishvili G. DNA supercoiling and transcription in Escherichia coli: The FIS connection // Biochimie. 2001. Vol. 83, № 2. P. 213-217.

169. Bokal A.J. et al. Molecular anatomy of a transcription activation patch: FIS-RNA polymerase interactions at the Escherichia coli rrnB P1 promoter // EMBO J. 1997. Vol. 16, № 1. P. 154-162.

170. Pukkila P.J. et al. Effects of high levels of DNA adenine methylation on methyl-directed mismatch repair in Escherichia coli. // Genetics. 1983. Vol. 104, № 4. P. 571-582.

171. Yamaki H. et al. The oriC unwinding by dam methylation in Escherichia coli // Nucleic Acids Res. 1988. Vol. 16, № 11. P. 5067-5073.

172. Casadesus J., Low D. Epigenetic Gene Regulation in the Bacterial World // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006. Vol. 70, № 3. P. 830-856.

173. Weiner III J. Transcription profiles of the bacterium Mycoplasma pneumoniae grown at different temperatures // Nucleic Acids Res. 2003. Vol. 31, № 21. P. 6306-6320.

174. Madsen M.L. et al. Transcriptional Profiling of Mycoplasma hyopneumoniae during Heat Shock Using Microarrays. 2006. Vol. 74, № 1. P. 160-166.

175. Musatovova O., Dhandayuthapani S., Baseman J.B. Transcriptional Heat Shock Response in the Smallest Known Self-Replicating Cell, Mycoplasma genitalium // J. Bacteriol. 2006. Vol. 188, № 8. P. 2845-2855.

176. Chang L.-J.J. et al. Mycoplasmas regulate the expression of heat-shock protein genes through CIRCE-HrcA interactions. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. Vol. 367, № 1. P. 213-218.

177. Zhang W., Baseman J.B. Transcriptional regulation of MG_149, an osmoinducible lipoprotein gene from Mycoplasma genitalium. // Mol. Microbiol. 2011. Vol. 81, № 2. P. 327-339.

178. Benders G. a, Powell B.C. Transcriptional Analysis of the Conserved ftsZ gene cluster in Mycoplasma genitalium and Mycoplasma pneumoniae // J. Bacteriol. 2005. Vol. 187, № 13. P. 4542-4551.

179. Güell M. et al. Transcriptome complexity in a genome-reduced bacterium. // Science. 2009. Vol. 326, № 5957. P. 1268-1271.

180. Fisunov G.Y. et al. Ribosome profiling reveals an adaptation strategy of reduced bacterium to acute stress // Biochimie. Elsevier B.V, 2017. Vol. 132. P. 66-74.

181. Taniguchi Y. et al. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells // Science. 2010. Vol. 329, № 5991. P. 533-538.

182. Lluch-Senar M. et al. Defining a minimal cell: essentiality of small ORFs and ncRNAs in a genome-reduced bacterium. // Mol. Syst. Biol. 2015. Vol. 11, № 1. P. 780.

183. Llorens-Rico V. et al. Bacterial antisense RNAs are mainly the product of transcriptional noise // Sci. Adv. 2016. Vol. 2, № 3. P. 1-9.

184. Junier I. et al. Insights into the Mechanisms of Basal Coordination of Transcription Using a Genome-Reduced Bacterium // Cell Syst. 2016. Vol. 2, № 6. P. 391-401.

185. Kühner S. et al. Proteome organization in a genome-reduced bacterium. // Science. 2009. Vol. 326, № 5957. P. 1235-1240.

186. Wodke J. a H. et al. Dissecting the energy metabolism in Mycoplasma pneumoniae through genome-scale metabolic modeling. // Mol. Syst. Biol. 2013. Vol. 9, № 653. P. 653 .

187. Trussart M. et al. Defined chromosome structure in the genome-reduced bacterium Mycoplasma pneumoniae // Nat. Commun. 2017. Vol. 8.

188. Yus E. et al. Determination of the Gene Regulatory Network of a Genome-Reduced Bacterium Highlights Alternative Regulation Independent of Transcription Factors // Cell Syst. 2019. Vol. 9, № 2. P. 143-158.e13.

189. Zuber U., Schumann W. CIRCE, a novel heat shock element involved in regulation of heat shock operon dnaK of Bacillus subtilis. // J. Bacteriol. 1994. Vol. 176, № 5. P. 1359-1363.

190. Roncarati D., Danielli A., Scarlato V. The HrcA repressor is the thermosensor of the heat-shock regulatory circuit in the human pathogen Helicobacter pylori // Mol. Microbiol. 2014. Vol. 92, № 5. P. 910-920.

191. Ohta T. et al. Atomic Force Microscopy Proposes a Novel Model for Stem-Loop Structure That Binds a Heat Shock Protein in the Staphylococcus aureus HSP70 Operon sequence and the first structural gene in a given heat-shock operon , and has been designated suggested to be // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. Vol. 734. P. 730-734.

192. Kim J.N., Roth A., Breaker R.R. Guanine riboswitch variants from Mesoplasma florum selectively recognize 2-deoxyguanosine // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007. Vol. 104, № 41.

193. Zeng Z.B., Cockerham C.C. Molecular basis of Mycoplasma surface antigenic variation: a novel set of divergent genes undergo spontaneous mutation of periodic coding regions and 5' regulatory sequences // Genetics. 1993. Vol. 133, № 3. P. 729-736.

194. Liu L. et al. GAA trinucleotide repeat region regulates M9/pMGA gene expression in Mycoplasma gallisepticum // Infect. Immun. 2000. Vol. 68, № 2. P. 871-876.

195. Liu L., Panangala V.S., Dybvig K. Trinucleotide GAA repeats dictate pMGA gene expression in Mycoplasma gallisepticum by affecting spacing between flanking regions // J. Bacteriol. 2002. Vol. 184, № 5. P. 1335-1339.

196. Glew M.D. et al. pMGA phenotypic variation in Mycoplasma gallisepticum occurs in vivo and is mediated by trinucleotide repeat length variation // Infect. Immun. 2000. Vol. 68, № 10. P. 6027-6033.

197. Levisohn S., Rosengarten R., Yogev D. In vivo variation of Mycoplasma gallisepticum antigen expression in experimentally infected chickens // Vet. Microbiol. 1995. Vol. 45, № 2-3. P. 219-231.

198. Pflaum K. et al. Global changes in Mycoplasma gallisepticum phase-variable lipoprotein gene vlhA expression during in vivo infection of the natural chicken host // Infect. Immun. 2015. Vol. 84, № 1. P. 351-355.

199. Matyushkina D. et al. Phase Transition of the Bacterium upon Invasion of a Host Cell as a Mechanism of Adaptation: a Mycoplasma gallisepticum model // Sci. Rep. 2016. № October. P. 1-13.

200. Noormohammadi a. H. et al. A novel mechanism for control of antigenic variation in the haemagglutinin gene family of Mycoplasma synoviae // Mol. Microbiol. 2000. Vol. 35, № 4. P. 911-923.

201. Bhurga B. et al. Mechanisms of antigenic variation in Mycoplasma pulmonis: interwoven, site-specific DNA inversions // Mol. Microbiol. 1995. Vol. 18, № 4. P. 703-714.

202. Zimmerman C.U.R. et al. Alternate phase variation in expression of two major surface membrane proteins (MBA and UU376) of Ureaplasma parvum serovar 3 // FEMS Microbiol. Lett. 2009. Vol. 292, № 2. P. 187-193.

203. Zimmerman C.U.R., Herrmann R., Rosengarten R. XerC-mediated DNA inversion at the inverted repeats of the UU172-phase-variable element of Ureaplasma parvum serovar 3 // Microbiol. Res. 2015. Vol. 170. P. 263-269.

204. Zimmerman C.U.R., Rosengarten R., Spergser J. Interaction of the putative tyrosine recombinases RipX (UU145), XerC (UU222), and CodV (UU529) of Ureaplasma parvum serovar 3 with specific DNA // FEMS Microbiol. Lett. 2013. Vol. 340, № 1. P. 55-64.

205. Czurda S. et al. Xer1-mediated site-specific DNA inversions and excisions in Mycoplasma agalactiae // J. Bacteriol. 2010. Vol. 192, № 17. P. 4462-4473.

206. Lysnyansky I., Rosengarten R., Yogev D. Phenotypic switching of variable surface lipoproteins in Mycoplasma bovis involves high-frequency chromosomal rearrangements // J. Bacteriol. 1996. Vol. 178, № 18. P. 5395-5401.

207. Rosengarten R., Wise K.S. The Vlp system ofMycoplasma hyorhinis: Combinatorial expression of distinct size variant lipoproteins generating high-frequency surface antigenic variation // J. Bacteriol. 1991. Vol. 173, № 15. P. 4782-4793.

208. Su C.J. et al. Possible origin of sequence divergence in the P1 cytadhesin gene of Mycoplasma pneumoniae // Infect. Immun. 1993. Vol. 61, № 3. P. 816-822.

209. Iverson-Cabral S.L. et al. mgpB and mgpC sequence diversity in Mycoplasma genitalium is generated by segmental reciprocal recombination with repetitive chromosomal sequences // Mol. Microbiol. 2007. Vol. 66, № 1. P. 55-73.

210. Lin G.G., Scott J.G. MG428 is a novel positive regulator of recombination that triggers mgpB and mgpC gene variation in Mycoplasma genitalium // Mol. Microbiol. 2012. Vol. 100, № 2. P. 130-134.

211. Burgos R., Totten P.A. Characterization of the operon encoding the holliday junction helicase RuvAB from Mycoplasma genitalium and its role in mgpB and mgpC gene variation // J. Bacteriol. 2014. Vol. 196, № 8. P. 1608-1618.

212. Dybvig K., Sitaraman R., French A.C.T. A family of phase-variable restriction enzymes with differing specificities generated by high-frequency gene rearrangements // Microbiology. 1998. Vol. 95, № November. P. 13923-13928.

213. Moreno-Campuzano S., Janga S.C., Pérez-Rueda E. Identification and analysis of DNA-binding transcription factors in Bacillus subtilis and other Firmicutes-a genomic approach. // BMC Genomics. 2006. Vol. 7. P. 147.

214. Fisunov G.Y. et al. Reconstruction of Transcription Control Networks in Mollicutes by High-Throughput Identification of Promoters // Front. Microbiol. 2016. Vol. 7, № 1977.

215. Savageau M.A. Demand theory of gene regulation. I. Quantitative development of the theory // Genetics. 1998. Vol. 149, № 4. P. 1665-1676.

216. Martínez-Antonio A. et al. Internal-sensing machinery directs the activity of the regulatory network in Escherichia coli // Trends Microbiol. 2006. Vol. 14, № 1. P. 22-27.

217. Hörnlein C. et al. Circadian clock-controlled gene expression in co-cultured, mat-forming cyanobacteria // Sci. Rep. 2020. Vol. 10, № 1. P. 1-17.

218. Prindle A. et al. Ion channels enable electrical communication in bacterial communities // Nature. 2015. Vol. 527, № 7576. P. 59-63.

219. Chou K. et al. A segmentation clock patterns cellular differentiation in a bacterial biofilm. 2023. Vol. 185, № 1. P. 145-157.

220. Fisunov G.Y. et al. Core proteome of the minimal cell: comparative proteomics of three mollicute species // PLoS One. 2011. Vol. 6, № 7. P. e21964.

221. Savageau M.A. Demand theory of gene regulation. II. Quantitative application to the lactose and maltose operons of Escherichia coli // Genetics. 1998. Vol. 149, № 4. P. 1677-1691.

222. Prajapat M.K. et al. Revisiting demand rules for gene regulation // Mol. Biosyst. Royal Society of Chemistry, 2016. Vol. 12, № 2. P. 421-430.

223. Price M.N. et al. Indirect and suboptimal control of gene expression is widespread in bacteria. // Mol. Syst. Biol. 2013. Vol. 9. P. 660.

224. Martínez-Antonio A., Collado-Vides J. Identifying global regulators in transcriptional regulatory networks in bacteria // Curr. Opin. Microbiol. 2003. Vol. 6, № 5. P. 482-489.

225. Madan Babu M., Teichmann S. a., Aravind L. Evolutionary Dynamics of Prokaryotic Transcriptional Regulatory Networks // J. Mol. Biol. 2006. Vol. 358, № 2. P. 614-633.

226. Freyre-González J.A. et al. Prokaryotic regulatory systems biology: Common principles governing the functional architectures of Bacillus subtilis and Escherichia coli unveiled by the natural decomposition approach // J. Biotechnol. 2012. Vol. 161, № 3. P. 278-286.

227. Aguilar C. et al. Thinking About Bacillus subtilis as a Multicellular Organism // Curr. Opin. Microbiol. 2007. Vol. 10, № 6. P. 638-643.

228. Galán-Vásquez E., Sánchez-Osorio I., Martínez-Antonio A. Transcription factors exhibit differential conservation in bacteria with reduced genomes // PLoS One. 2016. Vol. 11, № 1. P. 1-18.

229. Koonin E. V., Mushegian A.R., Bork P. Non-orthologous gene displacement. // Trends Genet. 1996. Vol. 12, № 9. P. 334-336.

230. Ruff E.F., Thomas Record M., Artsimovitch I. Initial events in bacterial transcription initiation // Biomolecules. 2015. Vol. 5, № 2. P. 1035-1062.

231. Krásny L., Gourse R.L. An alternative strategy for bacterial ribosome synthesis: Bacillus subtilis rRNA transcription regulation. // EMBO J. 2004. Vol. 23, № 22. P. 4473-4483.

232. Rhodius V.A., Mutalik V.K., Gross C.A. Predicting the strength of UP-elements and full-length E. coli o e promoters // Nucleic Acids Res. 2012. Vol. 40, № 7. P. 2907-2924.

233. Stefl R. et al. DNA A-tract bending in three dimensions: Solving the dA4T 4 vs. dT4A4 conundrum // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004. Vol. 101, № 5. P. 1177-1182.

234. Barnard A., Wolfe A., Busby S. Regulation at complex bacterial promoters: How bacteria use different promoter organizations to produce different regulatory outcomes // Curr. Opin. Microbiol. 2004. Vol. 7, № 2. P. 102-108.

235. Browning D.F., Busby S.J.W. Local and global regulation of transcription initiation in bacteria // Nat. Rev. Microbiol. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 14, № 10. P. 638-650.

236. Prosseda G. et al. The virF promoter in Shigella: More than just a curved DNA stretch // Mol. Microbiol. 2004. Vol. 51, № 2. P. 523-537.

237. Dame R.T. et al. Structural basis for H-NS-mediated trapping of RNA polymerase in the open initiation complex at the rrnB P1 // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277, №2 3. P. 2146-2150.

238. Giladi H. et al. Participation of IHP and a distant UP element in the stimulation of the phage X P(L) promoter // Mol. Microbiol. 1998. Vol. 30, № 2. P. 443-451.

239. Sheridan S.D., Benham C.J., Hatfield G.W. Activation of gene expression by a novel DNA structural transmission mechanism that requires supercoiling-induced DNA duplex destabilization in an upstream activating sequence // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, № 33. P. 21298-21308.

240. Haft D.H. TIGRFAMs: a protein family resource for the functional identification of proteins // Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 29, № 1. P. 41-43.

241. Surdova K. et al. The Conserved DNA-Binding protein WhiA is involved in cell division in bacillus subtilis // J. Bacteriol. 2013. Vol. 195, № 24. P. 5450-5460.

242. Mazin P. V. et al. Transcriptome analysis reveals novel regulatory mechanisms in a genome-reduced bacterium // Nucleic Acids Res. 2014. Vol. 42, № 21. P. 13254-13268.

243. Rumyantseva N.A. et al. Analysis of stochasticity of gene expression in single cells of Mycoplasma gallisepticum // J. Phys. Conf. Ser. 2019. Vol. 1400, № 3.

244. Evsyutina D. V. et al. Gene Silencing through CRISPR Interference in Mycoplasmas // Microorganisms. 2022. Vol. 10, № 6.

245. Semashko T.A. et al. BAC-browser: The Tool for Synthetic Biology // BMC Bioinformatics. BioMed Central, 2025. Vol. 26, № 1. P. 27.

246. Fisunov G.Y. et al. Profiling of Mycoplasma gallisepticum ribosomes // ActaNaturae. 2015. Vol. 7, № 4(27). P. 107-112.

247. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. Vol. 227, № 5259. P. 680-685.

248. Wittig I., Braun H.P., Schägger H. Blue native PAGE // Nat. Protoc. 2006. Vol. 1, № 1. P. 418-428.

249. Shevchenko A. et al. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. // Anal Chem. 1996. Vol. 68, № 5. P. 850-858.

250. Kovalchuk S.I., Jensen O.N., Rogowska-Wrzesinska A. FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS // Mol. Cell. Proteomics. 2019. Vol. 18, № 2. P. 383-390.

251. Fisunov G.Y. et al. WhiA transcription factor provides feedback loop between translation and energy production in a genome-reduced bacterium // Front. Microbiol. 2024. Vol. 15. P. 1-20.

252. Garanina I.A., Fisunov G.Y., Govorun V.M. BAC-BROWSER: The tool for visualization and analysis of prokaryotic genomes // Front. Microbiol. 2018. Vol. 9, № NOV. P. 1-6.

253. Rochat T. et al. Genome-wide identification of genes directly regulated by the pleiotropic transcription factor Spx in Bacillus subtilis // Nucleic Acids Res. 2012. Vol. 40, № 19. P. 9571-9583.

254. Kajfasz J.K. et al. Transcription of Oxidative Stress Genes Is Directly Activated by SpxA1 and, to a Lesser Extent, by SpxA2 in Streptococcus mutans. // J. Bacteriol. 2015. Vol. 197, № 13. P. 2160-2170.

255. Bohorquez L.C. et al. The Conserved DNA Binding Protein WhiA Influences Chromosome Segregation in Bacillus subtilis // J. Bacteriol. 2018. P. 1-17.

256. Semashko T.A. et al. Transcription profiling data set of different states of Mycoplasma gallisepticum // Genomics Data. The Authors, 2017. Vol. 11. P. 49-54.

257. Fisunov G.Y. et al. Binding site of restriction-modification system controller protein in Mollicutes. // BMC Microbiol. BMC Microbiology, 2017. Vol. 17, № 1. P. 26.

258. Calhoun L.N., Kwon Y.M. Structure, function and regulation of the DNA-binding protein Dps and its role in acid and oxidative stress resistance in Escherichia coli: a review. // J. Appl. Microbiol. 2011. Vol. 110, № 2. P. 375-386.

259. Orlov M. et al. Comparative analysis of mycoplasma gallisepticum vlha promoters // Front. Genet. 2018. Vol. 9, № November. P. 1-13.

260. Glew M.D. et al. Expression studies on four members of the pMGA multigene family in Mycoplasma gallisepticum S6 // Microbiology. 1995. Vol. 141, № 11. P. 3005-3014.

261. Markham P.F. et al. Expression of two members of the pMGA gene family of Mycoplasma gallisepticum oscillates and is influenced by pMGA-specific antibodies // Infect. Immun. 1998. Vol. 66, № 6. P. 2845-2853.

262. Heller J.L.E., Kamalampeta R., Wieden H.-J. Taking a Step Back from Back-Translocation: an Integrative View of LepA/EF4's Cellular Function // Mol. Cell. Biol. 2017. Vol. 37, № 12. P. 1-14.

263. Fisunov G.Y. et al. The Dynamics of Mycoplasma gallisepticum Nucleoid Structure at the Exponential and Stationary Growth Phases // Front. Microbiol. 2021. Vol. 12, № November. P. 1-13.

264. Durand S. et al. sRNA and mRNA turnover in gram-positive bacteria // FEMS Microbiol. Rev. 2015. Vol. 39, № 3. P. 316-330.

265. Fisunov G.Y. et al. Ribosomal profiling of Mycoplasma gallisepticum // ActaNaturae. 2015. Vol. 7, № 4(27).

266. Butenko I. et al. Response induced in Mycoplasma gallisepticum under heat shock might be relevant to infection process // Sci. Rep. Springer US, 2017. Vol. 7, № 1. P. 1-12.

БЛАГОДАРНОСТИ

Эта работа является продуктом упорного труда целого коллектива сотрудников, без которых она бы не состоялась. Я благодарю своего научного консультанта академика, д.б.н., профессора Говоруна Вадима Марковича за помощь и поддержку на всех этапах работы. Я благодарю коллег из ФНКЦ ФХМ и НИИ СБМ за многолетнее плодотворное сотрудничество и помощь в работе, в частности Евсютину Дарью Сергеевну, Семашко Татьяну Александровну, Гаранину Ирину Андреевну, Мануверу Валентина Александровича, Варижук Анну Михайловну, Побегуц Ольгу Владимировну, Ладыгину Валентину Григорьевну, Бутенко Ивана Олеговича, Матюшкину Дарью Сергеевну, Карпова Владимира Абрамовича, Цой Екатерину Алексеевну. Благодарю Ведяйкина Алексея Дмитриевича из СПбПУ за предоставленные уникальные технические возможности. Также я благодарю свою маму, свою жену и всю свою семью за ценные советы поддержку.