Совершенствование методов и алгоритмов математической обработки спектральных данных в исследованиях биологических материалов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Бойченко Екатерина Сергеевна
Бойченко Екатерина Сергеевна
кандидат наук
2022
- Специальность ВАК РФ00.00.00
- Количество страниц 152
Оглавление диссертации кандидат наук Бойченко Екатерина Сергеевна
РЕФЕРАТ
SYNOPSIS
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ
1.1 Спектроскопические методы в исследованиях биологических материалов
1.2 Спектроскопия в ближней инфракрасной области как метод неразрушающего контроля биологических материалов
1.3 Математическая обработка спектральных данных
1.3.1 Построение классификационных моделей методами машинного обучения
1.3.2 Валидация классификационных моделей: вопросы, остающиеся открытыми
1.4 Выводы по Главе
ГЛАВА 2 ПОЛУЧЕНИЕ СПЕКТРОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ В БЛИЖНЕЙИНФРАКРАСНОЙ ОБЛАСТИ
2.1 Описание измерительной установки №1
2.2 Описание измерительной установки №2
2.3 Описание измерительной установки №3
2.4 Методика экспериментального определения минимально распознаваемого числа клеток
2.5 Характеристики полученных выборок спектральных данных в ближней инфракрасной области
2.5.1 Спектры образцов биологических материалов с различной химической фиксацией
2.5.2 Спектры образцов биологических материалов с различными вариантами образцов класса «норма» и «отклонение»
2.5.3 Спектральные данные в динамике изменения состояния биологических образцов
2.6 Выводы по Главе
ГЛАВА 3 МАТЕМАТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА СПЕКТРАЛЬНЫХ ДАННЫХ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ИНДИКАТОРОВ СОСТОЯНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
3.1 Общий вид классификационной модели, построенной методами машинного обучения
3.2 Бинарная классификация биологических материалов на основе полученных оптических спектральных данных
3.3 Подбор алгоритма предобработки и классификации биологических материалов с различными видами образцов класса «норма»
3.4 Стратегии классификации биологических материалов на несколько классов
3.5 Выводы по Главе
ГЛАВА 4 РАЗРАБОТКА ПОДХОДА К ЕДИНОЙ СТРАТЕГИИ ВАЛИДАЦИИ КЛАССИФИКАЦИОННЫХ МОДЕЛЕЙ
4.1 Алгоритм генерации выборок спектральных данных
4.2 Апробация единого подхода к валидации классификационных моделей
4.3 Выводы по Главе
ГЛАВА 5 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ АПРОБАЦИЯ АЛГОРИТМОВ КЛАССИФИКАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
5.1 Апробация сочетания статистических тестов и методов машинного обучения для классификации образцов биологических материалов
5.2 Аквафотомный подход к обработке спектральных данных в ближней инфракрасной области
5.2.1 Основные определения
5.2.2 Образцы биологических жидкостей, собранных до и после оперативного вмешательства
5.2.3 Обработка экспериментальных данных биологических жидкостей с помощью аквафотомики
5.3 Выводы по Главе
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ А. Блок-схема алгоритма генерации выборок спектральных
данных
ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Код алгоритма генерации выборок спектральных данных в
среде MATLAB
ПРИЛОЖЕНИЕ В. Блок-схема алгоритма, реализующего единый подход к валидации классификационных моделей в исследованиях биологических
материалов
ПРИЛОЖЕНИЕ Г. Тексты публикаций
РЕФЕРАТ
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Анализ комбинационного рассеяния и автофлуоресценции оптических неоднородностей биологических сред2019 год, кандидат наук Артемьев Дмитрий Николаевич
Разработка методики неразрушающего контроля физико-химических характеристик композиционных материалов органического происхождения2021 год, кандидат наук Верховская Яна Ивановна
Мультивариативный метод спектрального анализа в ближнем ИК диапазоне многокомпонентных сред2021 год, кандидат наук Христофорова Юлия Александровна
Алгоритмы переноса градуировочных моделей внутри серии ИКФ-спектрометров2005 год, кандидат технических наук Сулима, Елена Леонидовна
Химический анализ для идентификации лекарственных растений: хромато-масс-спектрометрия с интерпретацией данных методами машинного обучения2019 год, кандидат наук Назаренко, Дмитрий Владимирович
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Совершенствование методов и алгоритмов математической обработки спектральных данных в исследованиях биологических материалов»
Актуальность работы и степень ее разработанности.
Спектроскопические методы анализа биологических объектов широко применяются в аналитическом контроле процессов как на производстве, так и в других отраслях деятельности человека. Оптическая спектроскопия зарекомендовала себя как недеструктивный и экспрессный метод качественного иколичественного анализа газообразных, жидких или твердых образцов, широко применяемый для решения прикладных аналитических задач. Преимуществами этого метода являются быстрота анализа, возможность исследовать объекты в разных агрегатных состояниях с использованием световодов, минимальная пробоподготовка образца. В связи с этим, применение оптической спектроскопии для задач неразрушающего контроля объектов природной среды и биоматериалов в режиме реального времени (онлайн-анализ), а не только в рамках лабораторного анализа, является перспективным.
Зачастую анализ биологических объектов сводится к решению задачи классификации, или оценке вероятности принадлежности конкретного образца к одному из классов на основании того, есть ли у него специфичные для этого класса признаки, или нет. Это позволяет судить об эффективности или полноте проведения контролируемых процессов, затрагивающих ту или иную биологическую среду. Задачи классификации успешно решаются математическими алгоритмами обработки аналитических сигналов, в том числе методами хемометрики. В данном случае на вход алгоритма подается полученный в ходе измерений массив спектральных данных, называемый обучающим, и соответствующие образцам этого массива принадлежности к классам. Итогом работы алгоритма является оптимизированное уравнение (модель), позволяющее соотносить спектральные данные и соответствующий класс образцов.
Проблема классификации в рамках локального контроля индикаторов состояния материалов и образцов биологического
происхождения (например, химического состава) является одной из наиболее актуальных задач. Традиционно аналогичные задачи решаются комплексным изучением биологического объекта, в том числе при помощи ряда лабораторных анализов, которые обладают высокой точностью и воспроизводимостью получаемых результатов. Однако, скорость их получения не позволяет контролировать процесс и принимать решения в режиме реального времени. Методы онлайн-анализа позволяют контролировать процессы без задержки во времени, но вопросы надежности предоставляемых результатов и валидности методик математической обработки данных по-прежнему остаются открытыми.
Таким образом, существует ряд проблем, затрудняющих переход от научных исследований и прототипов к реальному внедрению методов онлайн-анализа биологических объектов. Часто поднимается вопрос отсутствия корректного и единого алгоритма валидации классификационных моделей, предлагаемых в научных исследованиях. На практике часто используется однократное случайное разбиение общего массива данных на тренировочный и тестовый, что также ставит вопрос о воспроизводимости характеристик обученной таким образом модели.
На данный момент в области неразрушающего контроля биологических материалов методами оптической спектроскопии не существует единого подхода к методике выбора обучающего массива данных и валидации полученных моделей. Это существенно усложняет сравнение исследований, проводимых различными научными группами, а также тормозит развитие метрологического обеспечения и стандартизации таких методов контроля, что затрудняет их внедрение в широкую практику. В целом, усовершенствование схем и алгоритмов классификации биологических объектов является актуальным направлением в аналитическом контроле процессов, постоянно нуждающимся в новых подходах и методиках.
Достаточно большое количество работ по классификации биологических объектов обусловлено многообразием методик регистрации спектров и видов
материалов, что в сочетании с различными алгоритмами обработки данных делает эту область исследований практически неисчерпаемой. Среди крупных научных групп, ведущих работу в этом направлении, можно выделить группы Т. Руерса (Университет Твенте), Стеренборга (Нидерландский Институт рака), Ф. Леблона (Технологический университет Монреаля), Н. Стоуна (Университет Эксетера).
В области обработки спектральных данных методами машинного обучения можно отметить систематические исследования Ф. Марини (Университет Сапиенца), А. Оливьери (Университет Розарио), А. Л. Померанцева и О.Ю. Родионовой (Федеральный исследовательский центр химической физики им.Н.Н.Семенова РАН), К. Эсбенсена, С. Кучерявского (Университет Ольборга). В частности, последней научной группой был предложен алгоритм генерирования псевдовалидационного тестового набора, расширяющего возможности традиционных подходов к валидации классификационных моделей. Стоит отметить, что в рамках предложенного алгоритма возможна генерация только одного набора для каждого массива реальных спектральных данных.
Целью работы является разработка алгоритмов математической обработки данных, позволяющих классифицировать образцы биологических материалов по результатам оптических спектральных измерений с удовлетворительной точностью.
В рамках работы поставлены следующие задачи:
1. Экспериментальное получение спектральных данных в ближнем инфракрасном диапазоне (940-1940 нм).
2. Расширение перечня типов биологических объектов, которые могут использоваться для получения обучающих массивов оптических спектральных данных.
3. Разработка алгоритма генерации выборок спектральных данных и усовершенствование алгоритма валидации классификационной модели.
4. Применение новых методов математической обработки
спектральных данных (аквафотомики), полученных в ближнем инфракрасном диапазоне, для классификации биологических объектов.
5. Экспериментальная апробация разработанных схем на биологических жидкостях и твердых объектах различного типа.
Научная новизна работы
1. Впервые научно обосновано, что алгоритмы математической обработки данных в БИК области позволяют классифицировать биологические материалы с различной химической фиксацией (формалин, парафин) на классы «норма» и «отклонение» на всех этапах с точностью выше 90%. Это открывает возможности для создания конкретного дизайна эксперимента с заданным распределением классов и количеством образцов, что позволяет формировать более представительные массивы спектральных данных.
2. Разработан единый подход к валидации классификационных моделей, обученных на спектральных данных, получаемых от биологических объектов. В основе разработанного подхода лежит оригинальный метод генерации спектральных данных, заключающийся в разложении спектров по методу главных компонент и случайном перемешивании полученной матрицы остатков. Сгенерированные данные с заданными характеристиками (размер массива, распределение классов и др.) предлагается использовать для оптимизации классификационных моделей и тестирования их работы в различных условиях, представляющих интерес для конкретной задачи. В рамках такого подхода более полно исследуются границы применимости классификационной модели, ее характеристики (точность, чувствительность, специфичность) надежнее отражают возможности метода. Предложенный подход апробирован на экспериментально полученных спектрах, измеренных в ближней инфракрасной области в режиме диффузного отражения.
3. Впервые показана перспективность аквафотомики для обработки спектральных данных в рамках неразрушающего контроля индикаторов состояния биологических материалов в жидком состоянии. Идентифицированы длины волн, соответствующие изменениям водной матрицы, и осуществлена
классификация образцов. Применение этого метода позволяет расширить возможности спектрального анализа биологических объектов в ближней инфракрасной области с повышением информативности результатов. Метод был апробирован на трех типах биологических жидкостей с целью выявить общие закономерности изменения водной матрицы объектов в ходе воздействия внешних факторов.
Теоретическая значимость работы
Разработан единый подход к валидации классификационных моделей, в основе которого лежит оригинальный алгоритм генерации выборок спектров. Предложенный алгоритм является универсальным и применим к спектральным данным в различных областях аналитического контроля биологических объектов. Он позволяет оценивать точность, чувствительность и специфичность модели по нескольким тестовым наборам и предоставить для этих характеристикстатистически обоснованную интервальную оценку.
Практическая значимость работы
Экспериментальная апробация на биологических материалах в твердом и жидком состояниях демонстрирует применимость методик для надежной классификации биологических образцов в рамках контроля индикаторов состояния биологических процессов. Предложенный алгоритм классификации образцов биологических жидкостей методом логистической регрессии на основе данных, полученных методом атомной спектроскопии, позволяет корректно определить состояние «норма» и «отклонение» в 89% случаев (чувствительность 100%, специфичность 80%), что превосходит точность общепринятого метода диагностики (определение уровня простат-специфического антигена), дающего75% ложноположительных результатов.
Методы исследования
Основным методом получения спектральных данных является спектроскопия в ближней инфракрасной области в режиме диффузного отражения. Для анализа жидких биологических образцов также использовался диапазон длин волн 170 - 900 нм, измерения проводились в режиме атомной
эмиссии. В работе получены представительные выборочные совокупности измерений методами оптической спектроскопии в диапазонах длин волн от 940нм до 1940 нм и от 170 нм до 900 нм.
Использованы современные методы математической статистики и обработки данных спектрального анализа методами машинного обучения, реализованных в программной среде MATLAB и программном обеспечении The Unscrambler. В качестве основного метода классификации данных применялся метод опорных векторов с различными кернел-функциями, зарекомендовавший себя как наиболее универсальный для данного типа задач. Для разведочного анализа спектральных данных использовался метод главных компонент. Также применялся недавно разработанный в Университете г. Кобе (Япония) метод аквафотомики, заключающийся в изучении изменений в структуре водной матрицы биологических образцов, связанных с внешним воздействием (в том числе изменений клеточных структур). Информация об этих изменениях содержится в спектрах, измеренных в видимой и ближней инфракрасных областях, и может быть получена из них путем специальной математической обработки.
Соответствие паспорту специальности
Работа соответствует п. 1, 6 области исследований паспорта специальности 2.2.8 — «Методы и приборы контроля и диагностики материалов, изделий, веществ и природной среды»: п. 1 - «Научное обоснование новых и совершенствование существующих методов, аппаратных средств и технологий контроля, диагностики материалов, изделий, веществ и природной среды, способствующее повышению надёжности изделий и экологической безопасности окружающей среды.»; п. 6 -«Разработка математических моделей, алгоритмического и программно-технического обеспечения обработки результатов регистрации сигналов в приборах и средствах контроля и диагностики с целью автоматизации контроля и диагностики, подготовки их для внедрения в цифровые информационные технологии».
Положения, выносимые на защиту
1. Разработанные алгоритмы построения классификационных моделей на основе результатов спектральных измерений в диапазоне длин волн 940 -1940 нм в режиме диффузного отражения позволяют определять принадлежность биологических объектов к классам «отклонение» и «норма» с точностью не ниже 85%.
2. Алгоритмы математической обработки данных в БИК области позволяют классифицировать биологические материалы с различной химической фиксацией (без фиксации, формалин, парафин) на классы «норма» и «отклонение» на всех этапах (in vivo, ex vivo) с точностью выше 90%.
3. Алгоритм генерации выборок спектральных данных с заданными характеристиками для создания моделей классификации образцов биологических материалов позволяет рассчитать интервальную оценку для основных метрик классификации (чувствительность, специфичность, точность), уменьшая их неопределенность.
4. Впервые показано, что метод аквафотомики позволяет провести классификацию образцов биологических материалов в жидком состоянии в рамках контроля процесса изменения состояния биоматериала.
5. Математические модели на основе результатов спектральных измерений в диапазоне длин волн 170 - 900 нм в режиме атомной эмиссии позволяют определять принадлежность биологических жидкостей к классам «отклонение» и «норма» с точностью не ниже 89%.
Апробация работы
Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались на десяти международных и российских конференциях в рамках двух постерных и восьми устных докладов:
1. Международная конференция Европейской ассоциации по изучению рака (EACR) Tracking Cancer, 2019, Барселона, Испания.
2. Международная конференция «Mendeleev 2019», 2019, Санкт-Петербург.
3. XLIX научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО, 2020, Санкт-Петербург.
4. Международная конференция «XII Winter Symposium of Chemometrics», 2020, Саратов.
5. Международная студенческая конференция "Science and Progress", 2020, Санкт-Петербург.
6. V Всероссийский молодежный форум «Наука будущего - наука молодых», 2020, Москва.
7. Пятидесятая научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО, 2021, Санкт-Петербург.
8. Международная конференция «Mendeleev 2021», 2021, Санкт-Петербург.
9. Международная конференция «17th Scandinavian Symposium on Chemometrics», 2021, Ольборг, Дания.
10. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2022», 2022, Москва.
Личный вклад
Заключается в постановке цели; формулировании задач; анализе и интерпретации литературных данных; участии в проведении исследований с биологическими объектами; разработке единого подхода к валидации классификационных моделей и создании алгоритма генерации выборок спектров; математической обработке спектральных данных; анализе и обобщении полученных результатов; участии в написании статей и тезисов по темедиссертационной работы.
Достоверность научных достижений
Результаты получены с применением сертифицированного оборудования (Avantes, Polychromix, OceanOptics), а также программного обеспечения, широко используемого в мировой практике (MATLAB, The Unscrambler). Полученные в ходе научных исследований результаты (вид спектров, характеристики классификационных моделей) не противоречат данным,
изложенным в других публикациях в этой области. Работа построена на известных стандартных методиках анализа методами оптической спектроскопии, на алгоритмах машинного обучения, статистических тестах и методиках обработки экспериментально полученных данных. Результаты подтверждаются независимыми референтными методами (гистологический анализ). Достоверность полученных результатов также подтверждается их успешным представлением на тематических конференциях и публикацией в рецензируемых научных изданиях.
Публикации
По теме диссертационного исследования соискателем опубликовано 13 печатных работ, из которых три представлены в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в международной реферативной базе Web of Science/Scopus (второй квартиль), десять - в материалах международных конференций.
Объем и структура работы
Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы и четырех приложений. Во введении обосновывается актуальность исследований, проводимых в рамках данной диссертационной работы, степень разработанности темы исследований, формулируется цель, ставятся задачи работы, указаны научная новизна, теоретическая и практическая значимость, а также методы исследования, соответствие паспорту специальности, положения, выносимые на защиту, и личный вклад соискателя.
Первая глава посвящена обзору современного состояния исследований биологических материалов спектроскопическими методами. Проведено сравнение основных методов оптической спектроскопии, рассмотрены методы математической обработки спектральных данных, выявлены актуальные проблемы в данной области исследований. Описаны преимущества и недостатки спектроскопии в ближней инфракрасной области как метода неразрушающего контроля биологических материалов. Спектроскопия в
ближней инфракрасной области активно исследуется как перспективный метод онлайн-контроля процессов и состояния различных материалов, в том числе биологического происхождения, благодаря ее преимуществам (большая глубина проникновения в образец, минимальная пробоподготовка, возможность использования оптоволоконных зондов, простота оборудования для регистрации спектров, высокая скорость анализа). Сделан вывод, что единый подход к валидации классификационной модели и оценке чувствительности, специфичности и точности получаемых результатов не разработан. Это усложняет сравнение исследований, проводимых различными научными группами, а также тормозит развитие метрологического обеспечения и стандартизации таких методов контроля, что затрудняет их внедрение в широкую практику.
Во второй главе описано экспериментальное получение спектральных данных в ближней инфракрасной области. Спектрометры для измерений в БИК области технически схожи со спектрометрами в УФ-Вид диапазоне и состоят из монохроматора, системы оптических линз и детекторов излучения. Источником излучения чаще всего служат галогеновые лампы со спектром излучения от 360 до 2500 нм, покрывающие весь диапазон ближней инфракрасной области. Общий вид измерительных установок, использованных в диссертационной работе, приведен на Рисунке 1.
Рисунок 1 - Общая схема измерительной установки для регистрации спектров в ближнем инфракрасном диапазоне
Также приведены характеристики полученных выборок спектральных данных в ближней инфракрасной области. Примеры БИК спектров, измеренных на первом этапе эксперимента, показаны на Рисунке 2. Первый пик при 1200 нм соответствует второму обертону колебаний связи С-Н и может быть ассоциирован с содержанием липидов. Второй пик при 1455 нм, главным образом связанный с содержанием воды, соответствует первому обертону колебаний О-Н, и С-Н. Два менее интенсивных пика при 1726 нм
свидетельствуют о присутствии жировой ткани.
"отклонение" (обр. №3) д
- "норма" (обр. №3)
"отклонение" (обр. №5)
- "норма" (обр. №5)
-
i . i i . i . i
800 1000 1200 1400 1600 1800
Длина волны, нм
Рисунок 2 - Примеры спектров образцов биоматериалов классов «отклонение» и «норма», измеренных в начале контролируемого процесса
Были проведены измерения БИК-спектров образцов различных биоматериалов, соответствующих классам «отклонение» и «норма». Были получены спектры как в ходе процесса in vivo, так и от биоматериалов с различной химической фиксацией. Такой экспериментальный дизайн с измерениями БИК спектров одного и того же образца биоматериала на нескольких стадиях процесса и в различных условиях хранения позволяет расширить диапазон образцов, которые могут быть использованы для тестирования нового оборудования для неразрушающего контроля состояния биологических объектов.
В третьей главе представлены результаты математической обработки экспериментально полученных спектральных данных. Для классификации спектральных данных применяются различные методы машинного обучения, от линейного дискриминантного анализа до нейронных сетей. Метод опорных векторов (Support Vector Machines, МОВ) популярен в спектроскопических исследованиях. МОВ является очень гибким благодаря широкому выбору функций ядра, позволяющих как линейное, так и нелинейное разделение классов данных. В качестве входных данных для обучения классификационной модели выступают матрица предикторов X (или интенсивностей поглощения в данном случае), вектор априорно известных принадлежностей образцов к классам Y (для его получения используются референтные методы, например, гистологический анализ или методики по ГОСТ), указывается выбранный тип кернел-функции. Модель подбирает коэффициенты уравнения связи X и Y, минимизируя ошибку классификации. Далее матрицу коэффициентов можно использовать для предсказания принадлежности к тому или иному классу образцов, не участвовавших в обучении модели, на основании их спектральных интенсивностей. МОВ применялся как способ классификации спектров образцов, полученных в конце контролируемого процесса in vivo и от парафиновых блоков ex vivo. Результаты классификации образцов по методу МОВ показали 100% чувствительность и специфичность модели, построенной по данным, полученным in vivo: все 12 образцов тестового набора были определены правильно. Для модели, построенной по данным, измеренным на парафиновых блоках ex vivo, также была достигнута 100% специфичность и чувствительность при использовании спектральной области от 939 до 1633 нм (Таблица 1).
Таблица 1. Результаты валидации классификационных моделей, построенных методом МОВ, с использованием независимого тестового набора
Характеристика Центрированные спектры
Полный спектр Диапазон 939—1633 нм
Чувствительность 56% 100%
Специфичность 100% 100%
Также были применены различные методы классификации образцов в сочетании с алгоритмами предобработки спектральных данных и проведено сравнение полученных результатов на основе чувствительности и специфичности классификационных моделей. Показано, что лучшей стратегией обработки полученных спектральных данных является сочетание сглаживания спектров с методом опорных векторов с квадратичной кернел-функцией (чувствительность 90%, специфичность 94%).
В четвертой главе описана разработка подхода к единой стратегии валидации классификационных моделей и приведен алгоритм генерации спектральных выборок. Процесс генерирования основан на разложении матрицы, состоящей из реальных БИК-спектров, по методу главных компонент, и случайной перестановке их остатков. Спектры, сгенерированные с помощью предложенного алгоритма, имеют те же среднее значение и стандартное отклонение, что и реальные данные, следовательно, принадлежат к тому же распределению. Число возможных перестановок матрицы Е равно факториалу числа ее строк, что в большинстве случаев позволяет генерировать огромное количество спектров с пренебрежимо малой вероятностью полного сходства между двумя наборами данных. Предлагается использовать перестановку остатков для генерации спектральных наборов данных, меньших по размеру или сравнимых с реальными. Также важно применять алгоритм к классам данных по отдельности, чтобы избежать переноса аналитических сигналов из спектров одного класса в другой.
Реальные БИК спектры имеют две большие спектральные полосы при 1138-1272 нм и 1360-1633 нм и незначительные пики около 1750 нм (Рисунок 3, сплошные линии). Для всех спектров наблюдалось значительное смещение базовой линии, вызванное рассеянием света. Сгенерированные спектры (50 образцов) показаны на Рисунке 3 (точечные линии). Они сохраняют ту же форму, что и реальные спектры, и смещение базовой линии, а также те же значения среднего и стандартного отклонения, что обеспечивает сходство реальных и сгенерированных спектров.
0,10
д6Ь-I-|-1-,-1-■-1-,-1-1-1-.-1-,-1-,---010^-1-.-1-.-1-.-1-1-1-,-1-.-1-1-1-.-
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
Длина волны, нм Длина волны, нм
Рисунок 3 - А - примеры измеренных БИК спектров (сплошные линии), сглаженных фильтром Савицкого-Голэя, и сгенерированных спектров (точечные линии). Б - соответствующие остатки
Предложена следующая стратегия валидации для классификационных моделей, построенных на спектральных данных: (1) провести перестановочный перед валидацией, чтобы исключить случайную корреляцию; (2) оценить особенности измеренного набора спектральных данных: например, размер, распределение классов; (3) учесть потенциальные проблемы дальнейшего применения модели классификации в реальной практике; (4) найти подходящий алгоритм генерирования спектральных данных; (5) убедиться, что сгенерированные спектры адекватно имитируют соответствующие спектральные особенности реального набора данных; (6) создать пространство для тестирования различных подходов к валидации, содержащее несколько наборов спектральных данных (обучающих и тестовых) для проверки всех интересующих сценариев; (7) найти значимые факторы с помощью ЛКОУЛ или других статистических тестов; (8) рассчитать интервальные оценки для метрик точности, чувствительности, специфичности.
В пятой главе приведены полученные данные по экспериментальной апробации алгоритмов классификации биологических материалов. Для апробации схем классификации биологических объектов были обработаны данныеэлементного анализа жидких образцов классов «отклонение» и «норма», полученные методом атомной спектроскопии в режиме абсорбции и эмиссии.
Похожие диссертационные работы по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Комбинированный спектроскопический метод исследования сильнорассеивающих биологических сред2013 год, кандидат наук Савельева, Татьяна Александровна
Стандартизация анализаторов на основе Фурье-спектроскопии в ближней инфракрасной области для контроля показателей качества зерна2007 год, кандидат технических наук Лузанов, Павел Александрович
Оптика эндогенных флуорофоров: фотофизические процессы и применение для биомедицинской диагностики2023 год, доктор наук Ширшин Евгений Александрович
Формирование предельно коротких импульсов среднего инфракрасного диапазона и их применение для нелинейной спектроскопии полупроводников на основе генерации высших оптических гармоник2022 год, кандидат наук Степанов Евгений Александрович
Нелинейные явления в жидкостях в поле широкополосного излучения инфракрасного и терагерцового диапазона спектра2020 год, доктор наук Цыпкин Антон Николаевич
Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бойченко Екатерина Сергеевна, 2022 год
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Carneiro I. et al. Enhanced ultraviolet spectroscopy by optical clearing for biomedical applications //IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. -2020. - Т. 27. - №. 4. - С. 1-8.
2. Evers D. J. et al. Optical spectroscopy: current advances and future applications in cancer diagnostics and therapy //Future oncology. - 2012. - Т. 8. - №.
3. - С. 307-320.
3. Manley M. Near-infrared spectroscopy and hyperspectral imaging: nondestructive analysis of biological materials //Chemical Society Reviews. - 2014. - Т. 43. - №. 24. - С. 8200-8214.
4. Shenk J. S., Workman Jr J. J., Westerhaus M. O. Application of NIR spectroscopy to agricultural products //Handbook of near-infrared analysis. - CRC Press, 2007. - С. 365-404.
5. Woodcock T., Downey G., O'Donnell C. P. Better quality food and beverages: the role of near infrared spectroscopy //Journal of Near Infrared Spectroscopy. -2008. - Т. 16. - №. 1. - С. 1-29.
6. Cheung A. et al. Detection of hypoxia by near-infrared spectroscopy and pulse oximetry: a comparative study //Journal of Biomedical Optics. - 2022. - Т. 27. - №.
7. - С. 077001.
7. Reich G. Near-infrared spectroscopy and imaging: basic principles and pharmaceutical applications //Advanced drug delivery reviews. - 2005. - Т. 57. - №.
8. - С. 1109-1143.
8. Sandak J., Sandak A., Meder R. Assessing trees, wood and derived products with near infrared spectroscopy: hints and tips //Journal of Near Infrared Spectroscopy. - 2016. - Т. 24. - №. 6. - С. 485-505.
9. Tsuchikawa S. A review of recent near infrared research for wood and paper //Applied Spectroscopy Reviews. - 2007. - Т. 42. - №. 1. - С. 43-71.
10. Stenberg B. et al. Visible and near infrared spectroscopy in soil science //Advances in agronomy. - 2010. - Т. 107. - С. 163-215.
11. Goecks J. et al. How machine learning will transform biomedicine //Cell. -2020. - T. 181. - №. 1. - C. 92-101.
12. Rehman I. U., Khan R. S., Rehman S. Role of artificial intelligence and vibrational spectroscopy in cancer diagnostics //Expert Review of Molecular Diagnostics. - 2020. - T. 20. - №. 8. - C. 749-755.
13. Kendall C. et al. Vibrational spectroscopy: a clinical tool for cancer diagnostics //Analyst. - 2009. - T. 134. - №. 6. - C. 1029-1045.
14. Khanmohammadi M., Garmarudi A. B. Infrared spectroscopy provides a green analytical chemistry tool for direct diagnosis of cancer //TrAC Trends in Analytical Chemistry. - 2011. - T. 30. - №. 6. - C. 864-874.
15. Cerussi A. et al. Predicting response to breast cancer neoadjuvant chemotherapy using diffuse optical spectroscopy //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2007. - T. 104. - №. 10. - C. 4014-4019.
16. Ij H. Statistics versus machine learning //Nat Methods. - 2018. - T. 15. - №. 4. - C. 233.
17. Li J. J., Tong X. Statistical hypothesis testing versus machine learning binary classification: Distinctions and guidelines //Patterns. - 2020. - T. 1. - №. 7. - C. 100115.
18. De Boer L. L. et al. Towards the use of diffuse reflectance spectroscopy for real-time in vivo detection of breast cancer during surgery //Journal of translational medicine. - 2018. - T. 16. - №. 1. - C. 1-14.
19. de Boer L. L. et al. M. Sterenborg HJC, Ruers TJM," //Fat/water ratios measured with diffuse reflectance spectroscopy to detect breast tumor boundaries," Breast Cancer Res. Treat. - 2015. - T. 152. - №. 3. - C. 509-518.
20. de Boer L. L. et al. Optical tissue measurements of invasive carcinoma and ductal carcinoma in situ for surgical guidance //Breast cancer research. - 2021. - T. 23. - №. 1. - C. 1-15.
21. Canpolat M. et al. Intra-operative brain tumor detection using elastic light single-scattering spectroscopy: a feasibility study //Journal of biomedical optics. -2009. - T. 14. - №. 5. - C. 054021.
22. Baltussen E. J. M. et al. Diffuse reflectance spectroscopy as a tool for real-time tissue assessment during colorectal cancer surgery //Journal of biomedical optics. -
2017. - T. 22. - №. 10. - C. 106014.
23. Tanis E. et al. In vivo tumor identification of colorectal liver metastases with diffuse reflectance and fluorescence spectroscopy //Lasers in surgery and medicine. -2016. - T. 48. - №. 9. - C. 820-827.
24. Baltussen E. J. M. et al. Using diffuse reflectance spectroscopy to distinguish tumor tissue from fibrosis in rectal cancer patients as a guide to surgery //Lasers in surgery and medicine. - 2020. - T. 52. - №. 7. - C. 604-611.
25. Langhout G. C. et al. Differentiation of healthy and malignant tissue in colon cancer patients using optical spectroscopy: A tool for image-guided surgery //Lasers in surgery and medicine. - 2015. - T. 47. - №. 7. - C. 559-565.
26. de Koning S. G. B. et al. Toward complete oral cavity cancer resection using a handheld diffuse reflectance spectroscopy probe //Journal of biomedical optics. -
2018. - T. 23. - №. 12. - C. 121611.
27. Jermyn M. et al. Highly Accurate Detection of Cancer In Situ with Intraoperative, Label-Free, Multimodal Optical Spectroscopy Intraoperative Multimodal Spectroscopy Detects Cancer //Cancer research. - 2017. - T. 77. - №. 14. - C. 3942-3950.
28. Haka A. S. et al. In vivo margin assessment during partial mastectomy breast surgery using Raman spectroscopy //Cancer research. - 2006. - T. 66. - №. 6. - C. 3317-3322.
29. Haka A. S. et al. In vivo margin assessment during partial mastectomy breast surgery using Raman spectroscopy //Cancer research. - 2006. - T. 66. - №. 6. - C. 3317-3322.
30. Zuniga W. C. et al. Raman spectroscopy for rapid evaluation of surgical margins during breast cancer lumpectomy //Scientific reports. - 2019. - T. 9. - №. 1. - C. 1-16.
31. Barroso E. M. et al. Raman spectroscopy for assessment of bone resection margins in mandibulectomy for oral cavity squamous cell carcinoma //European Journal of Cancer. - 2018. - T. 92. - C. 77-87.
32. Cals F. L. J. et al. Investigation of the potential of Raman spectroscopy for oral cancer detection in surgical margins //Laboratory Investigation. - 2015. - T. 95. - №. 10. - C. 1186-1196.
33. Pence I. J. et al. Discrimination of liver malignancies with 1064 nm dispersive Raman spectroscopy //Biomedical optics express. - 2015. - T. 6. - №. 8. - C. 27242737.
34. Zhou Y. et al. Optical biopsy identification and grading of gliomas using labelfree visible resonance Raman spectroscopy //Journal of biomedical optics. - 2019. -T. 24. - №. 9. - C. 095001.
35. Grillone G. A. et al. The color of cancer: margin guidance for oral cancer resection using elastic scattering spectroscopy //The Laryngoscope. - 2017. - T. 127. - C. S1-S9.
36. Bigio I. J. et al. Diagnosis of breast cancer using elastic-scattering spectroscopy: preliminary clinical results //Journal of biomedical optics. - 2000. - T. 5. - №. 2. - C. 221-228.
37. Ollesch J. et al. Clinical application of infrared fibre-optic probes for the discrimination of colorectal cancer tissues and cancer grades //Vibrational Spectroscopy. - 2017. - T. 91. - C. 99-110.
38. Nachabé R. et al. Diagnosis of breast cancer using diffuse optical spectroscopy from 500 to 1600 nm: comparison of classification methods //Journal of biomedical optics. - 2011. - T. 16. - №. 8. - C. 087010.
39. Shalaby N. et al. Time-resolved fluorescence (TRF) and diffuse reflectance spectroscopy (DRS) for margin analysis in breast cancer //Lasers in Surgery and Medicine. - 2018. - T. 50. - №. 3. - C. 236-245.
40. Ben-Israel D. et al. The impact of machine learning on patient care: a systematic review //Artificial Intelligence in Medicine. - 2020. - T. 103. - C. 101785.
41. Sattlecker M., Stone N., Bessant C. Current trends in machine-learning methods applied to spectroscopic cancer diagnosis //TrAC Trends in Analytical Chemistry. - 2014. - T. 59. - C. 17-25.
42. Kennard R. W., Stone L. A. Technometrics //Comp Aided Design Exp. - 1969.
- T. 11. - C. 137-148.
43. de Aguiar P. F. et al. D-optimal designs //Chemometrics and intelligent laboratory systems. - 1995. - T. 30. - №. 2. - C. 199-210.
44. Brereton R. G. Chemometrics for pattern recognition. - John Wiley & Sons, 2009.
45. Brereton R. G., Lloyd G. R. Support vector machines for classification and regression //Analyst. - 2010. - T. 135. - №. 2. - C. 230-267.
46. Jolliffe I. T. Principal component analysis for special types of data. - Springer New York, 2002. - C. 338-372.
47. Ripley B. D. Stochastic simulation. - John Wiley & Sons, 2009.
48. Metz M. et al. A note on spectral data simulation //Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. - 2020. - T. 200. - C. 103979.
49. Saiz-Abajo M. J. et al. Ensemble methods and data augmentation by noise addition applied to the analysis of spectroscopic data //Analytica chimica acta. -2005. - T. 533. - №. 2. - C. 147-159.
50. Harpen M. D. Monte Carlo simulation of spectroscopic imaging data //Medical physics. - 1986. - T. 13. - №. 6. - C. 954-958.
51. Kucheryavskiy S. et al. Procrustes cross-validation—a bridge between cross-validation and independent validation sets //Analytical Chemistry. - 2020. - T. 92. -№. 17. - C. 11842-11850.
52. Rao C. R., Wu Y. Linear model selection by cross-validation //Journal of Statistical Planning and Inference. - 2005. - T. 128. - №. 1. - C. 231-240.
53. Youden W. J. Index for rating diagnostic tests //Cancer. - 1950. - T. 3. - №. 1.
- C. 32-35.
54. Sreekumar A. et al. Metabolomic profiles delineate potential role for sarcosine in prostate cancer progression //Nature. - 2009. - T. 457. - №. 7231. - C. 910-914.
55. Wang J. et al. Development and evaluation of novel statistical methods in urine biomarker-based hepatocellular carcinoma screening //Scientific reports. - 2018. - T. 8. - №. 1. - C. 1-8.
56. Varmuza K., Filzmoser P. Introduction to multivariate statistical analysis in chemometrics. - CRC press, 2016.
57. Myles A. J. et al. An introduction to decision tree modeling //Journal of Chemometrics: A Journal of the Chemometrics Society. - 2004. - T. 18. - №. 6. - C. 275-285.
58. Kourou K. et al. Machine learning applications in cancer prognosis and prediction //Computational and structural biotechnology journal. - 2015. - T. 13. - C. 8-17.
59. Aceto M. et al. Determination of metals in wine with atomic spectroscopy (flame-AAS, GF-AAS and ICP-AES); a review //Food Additives & Contaminants. -2002. - T. 19. - №. 2. - C. 126-133.
60. Bangma C. H., Roemeling S., Schröder F. H. Overdiagnosis and overtreatment of early detected prostate cancer //World journal of urology. - 2007. - T. 25. - №. 1. - C. 3-9.
61. Tsenkova R. Aquaphotomics: dynamic spectroscopy of aqueous and biological systems describes peculiarities of water //Journal of Near Infrared Spectroscopy. -2009. - T. 17. - №. 6. - C. 303-313.
62. Vanoli M. et al. Influence of innovative coatings on salami ripening assessed by near infrared spectroscopy and aquaphotomics //Journal of Near Infrared Spectroscopy. - 2019. - T. 27. - №. 1. - C. 54-64.
63. Jinendra B. et al. Near infrared spectroscopy and aquaphotomics: Novel approach for rapid in vivo diagnosis of virus infected soybean //Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2010. - T. 397. - №. 4. - C. 685-690.
64. Malegori C. et al. Analysing the water spectral pattern by near-infrared spectroscopy and chemometrics as a dynamic multidimensional biomarker in preservation: Rice germ storage monitoring //Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. - 2022. - T. 265. - C. 120396.
65. Muncan J. et al. Aquaphotomics approach for monitoring different steps of purification process in water treatment systems //Talanta. - 2020. - Т. 206. - С. 120253.
66. Tsenkova R. AquaPhotomics: water absorbance pattern as a biological marker //NIR news. - 2006. - Т. 17. - №. 7. - С. 13-23.
67. Kinoshita K. et al. Spectral pattern of urinary water as a biomarker of estrus in the giant panda //Scientific reports. - 2012. - Т. 2. - №. 1. - С. 1-9.
68. Kinoshita K. et al. Detection of urinary estrogen conjugates and creatinine using near infrared spectroscopy in Bornean orangutans (Pongo Pygmaeus) //Primates. - 2016. - Т. 57. - №. 1. - С. 51-59.
69. Dang H. V. et al. Essentials of Aquaphotomics and Its Chemometrics Approaches.
70. Muncan J., Tsenkova R. Aquaphotomics—From innovative knowledge to integrative platform in science and technology //Molecules. - 2019. - Т. 24. - №. 15. - С. 2742.
ПРИЛОЖЕНИЕ А. Блок-схема алгоритма генерации выборок спектральных данных
ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Код алгоритма генерации выборок спектральных данных в среде МЛТЬЛБ
function зimulated_spectua = simulating (data, quantity)
f ^Запуск генерации выборки данных.
%Аргументы функции: data - набор реальных данных размерности %т х п, где га - образцы (строки) , п - интенсивности аналитического ^сигнала (столбцы). %quantity - количество спектров в генерируемой выборке
n = quantity; з = size(data,1);
times = floor(n / s); remainder = mod(n, s); for i = 0:times-l
simulated_spectra(l+i*s:s+i*s,:) end
shuffling(data)
r = shuffling(data) ;
simulated_spectra(n-remainder+1: n, : ) = r(1:remainder,:) ; end
function spectra_final = shuffling(data, num_of_PC)
% Функция реализует алгоритм генерации выборки данных. % Аргументы функции: data - набор реальных данных размерности
х 11, где m - образцы (строки) , п - интенсивности аналитического %сигнала (столбцы).
%num_of_PC - количество значимых главных компонент
р = num_of_PC; % стандартизация данных [2, ш, sigma] = zscore (data) ; % сингулярное разложение матрицы [U,S,V] = svd(Z); Т = U*S;
% реконструкция матрицы с использованием значимых главных компонент data_z = Т(:,1:р)* V(:,l:p)';
% возвращение матрицы к виду до стандартизации
data_undo_z = data_z.*sigma + mu;
% вычисление остатков
residuals = data - data_undo_z;
% случайная перестановка остатков
index = randperm(size(data,1),size(data, 1) ) ;
shuffled_residuals = residuals(index,:);
^генерация выборки]
spectra final = data undo z + shuffled residuals;
end
ПРИЛОЖЕНИЕ В. Блок-схема алгоритма, реализующего единый подход к валидации классификационных моделей в исследованиях биологических материалов
ПРИЛОЖЕНИЕ Г. Тексты публикаций
Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 213 (2019) 12-18
Contents lists available at ScienceDirect
ELSEVIER
Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular
Spectroscopy
journal homepage: www.elsevier.com/locate/saa
In vivo and in vitro application of near-infrared fiber optic probe for
Check lew
Ehrlich carcinoma distinction: Towards the development of real-time tumor margins assessment tool
Ekaterina Oleneva Andrey Panchenko b, Maria Khaydukovac, Ekaterina Gubareva b, Olga Bibikova d, Viacheslav Artyushenko d, Andrey Legina,c, Dmitry Kirsanova,c
a Laboratory of AiTiftcial Sensory Systems, ITMO University. 197101. Kronverksky prospect 49. St. Petersburg. Russia
b Laboratory ofCarcinogenesis and Aging. FSBI "N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology" of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation. 197758, Leningradskaya street. 68. Pesochny. St Petersburg Russia
c Institute of Chemistry. Sl Petersburg State University. 199034. Universitetskaya emb, 7-9. St. Petersburg Russia d Art photonics GmbH, 12489. Rudower Chaussee. 46. Berlin, Germany
ARTICLE INFO
Article history:
Received 21 May 2018
Received in revised form 26 October 2018
Accepted 15January 2019
Available online 16 January 2019
Keywords:
Near-infrared spectroscopy Ehrlich carcinoma Support vector machines Cancer distinction
ABSTRACT
This report describes a full-scale experiment on intradermal Ehrlich carcinoma (EC) differentiation in mouse model using N1R spectroscopy in diffuse reflectance mode and chemometric data processing. EC is widely used as an experimental tumor model due to its resemblance with human undifferentiated epithelial tumors and can be applied as a preclinical testing in order to verily the capability of N1R spectroscopy to distinguish cancer from healthy tissues before a clinical research with an aim of creating a new analytical tool for on-line intraoperative tumor margins assessment. The study consists of five steps of NIR spectra measurements: in vivo on the early stage of carcinoma growth; in vivo on the advanced stage of carcinoma growth; in vivo during the surgery; in vitro study of the post-operative materials stored in formalin; in vitro study of the post-operative materials stored in paraffin. It was shown that reliable tumor differentiation with a compact optic fiber probe was possible in all these cases.The classification models were built on two data sets, obtained during in vivo and in vitro measurements; both of them demonstrated 100% specificity and sensitivity.
® 2019 Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction
In recent decades, cancer has become not only the disease of septuagenarians and older population, but a dangerous threat for all age groups. According to the Cancer Research UK statistics, the largest increase of cancer incidence has been observed for 0-24 years age group (more than 20% since 1990s) [11. Nevertheless, the survival rate is also the highest for people from 15 to 40 years old [2]. This fact can be partially explained by better physical condition of younger patients who are able to successfully undergo a severe treatment such as surgery, chemotherapy, radiotherapy and even more toxic protocols in case of cancer recurrence, if they are available. The real perspectives to improve the five-year survival rate and the number of patients in complete remission, with modem, advanced treatment protocols, however, add a supplementary aspect to be taken into account: quality of patient's life after the cancer treatment
Surgery is the most common method of solid tumors treatment [3]. In the UK. 45% patients with primary cancer underwent surgery as the
Corresponding author.
E-mail address: ekaterina.oleneva@>inbox.ru (E. Oleneva}.
first step of their treatment |4|. Evidently, the quality of performed surgery and the volume of removed tissue define the frequency and severity of side effects. On the one hand, the radical surgery is more reliable in terms of tumor and its metastatic extensions removal. However, the common trend in modern oncology is to prefer organ preservation treatment as less harmful: thus, in Western Europe 60-80% of patients with primary breast cancer undergo breast conserving surgery instead of radical mastectomy [5].
The choice of resection margins in case of organ conserving treatment is the first and foremost challenge for a surgeon. Inadequate resection margins may lead to the increased risk of local recurrence [6| or to the additional surgery: from 20% to 70% patients with primary breast tumor have to return to the hospital for tumor re-excision |7], The real cancer cells dissemination cannot be precisely evaluated without special equipment, which is capable to accurately assess the tumor margins and to distinguish malignant tissues from normal ones or, moreover, from the inflammation zones etc. Nowadays, a few intraoperative techniques are available in oncological clinical practice such as tissue staining [6,8] or frozen section analysis [9]. Both of them are based on a pathologist intervention during the surgery: a specialist should evaluate the presence of cancer cells either on the borders of removed tissue
https://doi.org/l 0.1016/j.saa2019.01.061 1386-1425/® 2019 Elsevier B.V. All rights reserved
£. Oieneva et ai / Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 213 (2019) 12-18 13
fragment or in tissue cryosections cut along the operation field. Despite their advantages, the intraoperative assessment of resection margins is not a common practice for most of the hospitals [7] due to the lack of special expertise and the necessity of additional complex equipment. Moreover, these techniques do not allow for fast on-line tumor margins evaluation in order to reduce the surgery duration and, consequently, the risk of morbidity. Microendoscopes can provide real-time histology-like images using confocal microscopy, but their price makes this equipment unavailable for small hospitals.
The application of various spectroscopic methods for such medical tasks has been extensively studied during the past decades [10]. Most of the studies have been performed ex vivo or in vitro using postoperative or biopsy material [ 11 -13]. For example, Raman spectroscopy in combination with atomic force topography has been investigated ex vivo as a potential biomedical diagnostic tool for monitoring of brain cancer development by Abramczyk et al.; high sensitivity (96%) and specificity (92%) have been attained f 14]. Nevertheless, several in vivo researches have been proposed. In 2002, Ntziachristos et al. developed a combined system with magnetic resonance imaging (MR1) guidance and near-infrared spectroscopy (NIR) for breast cancer in vivo study [ 15]. The difference in hemoglobin concentration and its saturation level, obtained from the NIR spectra, allows for reliable differentiation between normal tissue and malignant breast tumors. Later, Cerussi et al. proposed a broadband diffuse optical spectroscopy (DOS) technique for breast cancer physiologic and optical properties investigation during the surgery and after the following neoadjuvant chemotherapy [16,17]. Complementary to hemoglobin and associated oxygen concentration, the authors added three other parameters significant for tumor and normal tissue differentiation: lipid and water content in cancer cells, and scatter power. The authors also made an attempt to find the correlation between the identified properties and patient's age. In 2003, Asgari et al. performed a study of intraoperative characterization of gliomas (glioblastoma and astrocytoma) by NIR spectroscopy 118]. Some of the identified properties (microvascular blood volume and oxygen saturation) were successfully associated with survival rate of the patients. Furthermore, in the recent work of Kaznowska et al. the applicability of Fourier transform infrared spectroscopy (FT1R) for determination of lung cancer malignancy degree was presented [ 19]. Excellent results were obtained by Hagerlind et al. in their study of skin malignant and benign tumors differentiation by NIR spectroscopy combined with skin impedance [20]. The sensitivity and specificity attained the level of 100%, which was the significant improvement of previous work of Boden et al. [21,22]. Recently, a lot of studies have been devoted to the development of NIR spectroscopy in combination with fluorescence contrast as a technique of image-guided surgery for regional lymph nodes [23], canine lung cancer [24]. and prostate cancer (25J. Another noninvasive in vivo technique was proposed by Kameyama et al. for uveal melanoma and other intraocular tumors differentiation (26], based on a hybrid of NIR spectroscopy and hyperspectral imager (HS1).
In vivo measurements are more preferable than other types of studies because of better reproduction of real surgery conditions. Nevertheless, the access to patients is usually restricted by ethical considerations and clinical formalities thus making certain types of the experiments hardly possible with real patients. At the same time, there are well established protocols of tumor modelling in mice and the idea of this study is to perform full-scale experiment on tumor differentiation with mouse model. In our work we were focused on in vivo and in vitro differentiation of solid Ehrlich carcinoma (EC) on a mouse model as a first preclinical step of the research with the final aim of creating a new instrument for a surgeoa EC is widely used in oncological research as an experimental tumor due to its resemblance with human undifferentiated epithelial tumors [27]. In order to investigate the possible changes of tumor integral spectral characteristics (e.g. peaks shape) under various conditions, the study consists of five steps of NIR spectra measurements:
• in vivo on the early stage of carcinoma growth;
• in vivo on the advanced stage of carcinoma growth;
• in vivo during the surgery;
• in vitro study of the post-operative materials stored in formalin;
• in vitro study of the post-operative materials stored in paraffin.
Such novel experimental design with multiple NIR measurements of the same tumor sample from in vivo to in vitro stage allows for comparison and compatibility verification of the spectra obtained from different types of biological materials. Principal Component Analysis (PCA) has been used on each step to evaluate the potential capability of the proposed technique to distinguish EC from normal tissue. In addition, a classification of the spectra, measured in vivo and in vitro, respectively, has been performed using Support Vector Machines (SVM) method.
2. Materials and Methods
2.1. Animals
Ten BALB/c strain mice (3 male and 7 female) were purchased from the Rappolovo Animal Facility (Rappolovo, Russia). At the beginning of the experiment, the weight of the animals was 21.0 ± 2.2 g. The animals were maintained in a 12-hlightydarkcycleat21 ± 2°Cwith the average humidity in the range from 20% to 50% and with ad libitum access to the laboratory chow (Laborotorkorm Ltd., Moscow, Russia) and tap water. The experiments were performed according to the regulations of European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. CETS No. 123 and were approved by the Local Ethics Committee of the N.N. Petrov National Medical Research Center of Oncology (extract #10/10 from the Protocol #1 of 2018.01.05, Saint-Petersburg, Russia). Number of animals is sufficient for the observation of all the effects under study and for the further statistical processing of the obtained results.
22. Mouse Tumor Model and Protocol
All mice were intradermal^ inoculated with 1 x 105 EC cells in 0.05 ml of 0.9% NaCI solution into the depilated skin of the right hind thigh. The tumor was characterized by rapid broad and deep growth into the skin tissues. When tumor diameter reached 1.5 cm, the mice were euthanized by C02 inhalation with following autopsy for tumor tissue excision. After mice euthanasia, the autopsy materials have been either stored in formalin at the room temperature for 48 h (10 samples; 10% neutral buffered formalin, EigoProduction LLC, St. Petersburg, Russia) or frozen with non-toxic cooling agent (5 samples) in order to observe the influence of the storage mode on the NIR spectra. Later, ten paraffin blocks (Tissue-Tek III paraffin wax, Sakura Finetek Europe B.V., Netherlands) were prepared from the autopsy materials according to the common procedure |28]. For the following tumor verification, the histological sections were cut at thickness of 4 Jim and stained with haematoxylin and eosin.
2.3. NIR Measurements and Experiment Design
NIR spectra measurements were performed via the portable fiber optic spectrometer (Polycromix, USA) and the fiber optic probe (lxNIR400/400/AL + 7xNIR400/44/OPI-150-2xSMA. artphotonics, Germany); a scheme of the measurement set-up is shown on the Fig. 1. NIR spectra were registered within the region from 939 to 1796 nm with a resolution of 9 nm. Each spectrum represents an average over ten consecutive scans; the estimated time of one full spectrum acquisition is about 15 s. The halogene lamp (MobiLight SN LABPOD-1624—1506) was used as a light source. The reference spectrum was measured using Spectralon - white diffuse reflectance standard (labsphere, Inc., North Sutton, NH, USA) and subtracted from each spectrum.
E. Oleneva et aL ¡ Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 213 (2019) 12-18
Halogene lamp
PC
NIR spectrometer
Optic fiber
Fig. 1. Schematic representation ofthe experimental set up. The photo at the bottom ofthe figure has been taken during the first step NIR spectra measurements.
Description of the NIR spectra sets obtained on different stages of the experiment.
Stage of the Number of tumor Number of skin Total
expenment spectra spectra number
3rd day 10 10 20
7th day 28 11 39
10th day 16 18 34
Formalin fixation 24 23 47
Paraffin blocks 32 28 60
Table 2
Description ofthe SVM classification models.
Data set Box constraint value Calibration set size Test set size
In vivo 1 22 12
In vitro 10 40 20
Spectralon for the correct spectra acquisition. Scan points were chosen to be the same as on the previous stages. In case of the paraffin blocks measurements, the number of scan points was varied depending on a sample size (Fig. S3, Supplementary). The total number of measured spectra in each case is presented in the Table 1. All spectra measured from the different sites of tumor were attributed to the "tumor spectra" class regardless of their exact position; the same for "skin spectra".
2.4. Data Analysis
Principal Components Analysis (PCA) was applied for spectroscopic data, obtained on all stages of the experiment, in order to verify if the samples can be separated into groups corresponding to the normal tissue, tumor, etc. The mathematical description of PCA can be found elsewhere [29]. No data pretreatment except centering has been applied, unless otherwise specified. The spectral region 1641-1796 nm was excluded from the processing due to its irrelevance to the tumor/skin differentiation task and high noise level.
Support vector machine (SVM) has been applied as a binary classification method with linear kernel function to the following data sets: in vivo, obtained on the 10th day of the experiment, and in vitro (paraffin blocks). In this method, the separation of the samples is carried out by a margin which lies on the maximal distance from the both classes [30]. The parameter which controls the model overfitting and, consequently, the number of support vectors, is called a box constraint. The best model with the lowest misclassification rate was chosen by 10-fold cross validation among the train set samples; the optimization procedure was performed by the grid search (10 levels of the parameter value). To verify the classification results, the initial data sets were divided into the training set and the test set by Kennard-Stone algorithm [31 ]. The latter set was not used during the model calibratioa The ratio of "tumor" and "skin" samples was kept 1:1 in each data subset. The information about the data sets partition and models' parameters is detailed in the Table 2.
The results were presented in the form of a confusion matrix, where tumor presence and tumor absence were indicated, respectively, as true positive and true negative result; sensitivity (true positive rate), specificity (true negative rate) and false negative ratio (FNR) have been calculated according to the Eqs. (1 )-(3):
Spectra measurements were performed in dynamics during three stages of EC growth (on the 3rd, 7th and 10th day after the inoculation respectively) from different sites of the tumor and healthy skin; scan points are shown on the Fig. SI (Supplementary). During the measurements, mice were manually restrained for approximately 1 min with no anesthesia usage. On the 10 th day of the experiment, three female mice anesthetized by isoflurane inhalation underwent a surgery for scanning the tumors on the reverse of skin flap with maintained blood flow (Fig. S2, Supplementary). On the first in vitro measurements stage, thick tumor samples, frozen or fixed in formalin, were placed on the
Sensitivity -
TP
TP+FN
c c TN
Specificity = m + Fp
(1)
(2)
FNR
FN
FN+W (3)
where TP - true positive, TN - true negative, FN - false negative, FP -false positive.
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 Wavelength (nm)
1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 Wavelength (nm)
Fig.2.NIRspectrataken on the 3rd day after EC cells inoculation. Dashed lines correspond to the tumor spectra, solid lines-to the skin spectra. A-examples of the raw spectra (tumor/skin for mouse #3 and #5), B - averaged spectra (10 mice) with standard deviations shown by dotted line: the baseline shift has been removed before averaging for illustrative purposes.
e
o
<n
900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 Wavelength (nm)
Fig. 3. Averaged NIR spectra taken on the 7th day after EC cells inoculation. Dashed line corresponds to the tumor spectra, solid line - to the skin spectra, dashed dotted line - to the erosion zone spectra. The baseline shift has been removed for illustrative purposes.
PCA was performed using The Unscrambler 9.7 (CAMO Software AS, Norway) and SVM calculations were done in MATLAB R2014b (The MathWorks, USA) using Statistics and Machine Learning toolbox.
3. Results and Discussion
Upon the injection, in 9 mice out of 10 the EC growth at the tumor inoculation site has been observed (one male mouse did not demonstrate any tumor signs in the inoculation zone and was later excluded from the study group on the third stage of the experiment; histological examination confirmed tumor absence). Average tumor diameter reached 7.7 ± 1.6 mm on the 3rd day, 8.7 ± 0.9 mm on the 7th day and 10.6 ±1.8 mm on the 10th day (the tumor size is presented as mean ± standard deviation). The tumor growth was not associated with any serious inflammatory changes. Histological evaluation confirmed the presence of undifferentiated epithelial tumor at the injection site with necrotic focuses mainly observed at the tumor center with moderate inflammatory infiltration.
3.1. NIR Spectra on the Early Stage of the EC Growth
Examples of the NIR spectra measured on the 3rd day of the experiment are shown in the Fig. 2A. The first peak at 1200 nm corresponds to
the CH second overtone region and can be attributed to the lipid content The second peak at 1455 nm, principally assigned to the water content, corresponds to the OH, NH, and CH first overtone. Two less intensive peaks at 1726 nm are associated with the presence of adipose tissue [32].
It can be noticed that the tumor N1R spectra has greater baseline shift than normal unaffected skin ones, possibly due to the high heterogeneity of the EC cells |33|. The same fact could serve as an explanation for the specific shape of the "water" peak (1430-1470 nm) in case of EC presence (Fig. 2B). In accordance with the results of the studies mentioned above, the "water" peak intensity is higher for the tumor spectra.
3.2. NIR Spectra on the Advanced Stage of the EC Growth
On the 7th day of the experiment, the zones of erosion appeared in the central part of the tumor (Fig. 1. Supplementary). However, the NIR spectra did not undergo any significant changes (Fig. 3), except the intensity increase in comparison with 3rd day results. The erosion spectrum is indistinguishable from the spectra measured on the rest of the tumor, but both of them demonstrate significant difference from the spectrum of normal tissue. NIR spectra, taken on the 10th day, repeat the results of the 7th day of the experiment (Fig. S5A, Supplementary).
33. NIR Spectra Obtained During the Surgery
The last part of in vivo experiments was performed on three mice during the surgery on the 10th day after the EC inoculation in order to approximate the spectra measurement conditions to the real ones. Maintained blood circulation (Fig. S2, Supplementary) complicates the NIR spectra acquisition from a nonstationary object due to the blood vessels proximity to the tumor surface, more significant than in the previous cases. Nevertheless, this factor seriously influences only on the "water" peak shape (Fig. S4, Supplementary) which does not impede the tumor/skin differentiation.
3.4. Effect of the Post-surgery Materials Storage Mode on the NIR Spectra
According to the common histological practice, biopsy materials were stored in formalin for the following preparation of paraffin blocks. In order to observe the spectral changes occurred upon the tissues storage and to verify the applicability of such materials for the further research, the NIR spectra measurements have been performed for all 10 tumor samples (Fig. 4A).
As shown in the Fig. 4B and C, neither freezing nor formalin fixation do not significantly affect the NIR spectra shape. On the contrary, further
B
skin
frozen ,1 Y\ ■
formalin
C
tumor
frozen
\ \ №
in vivo J \ J formalin
1DOO 1100 1200 1300 1400 1500 1800 1700 1000 900 1000 11» 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
Wavelength (nm) Wavelength (nm)
Fig. 4. A - a biopsy fragment {3 x 1.5 cm} fixed in formalin (mouse #5). Scan points are indicated by arrows (S- skin, T - tumor. E-erosion}. B.C - comparison of different storage modes influence on the NIR spectra for the normal skin (B) and the tumor (C). Solid lines correspond to the frozen samples, dashed lines - to the in vivo measurements (on the 7th day}, dashed dotted lines - to the samples stored in formalin. All spectra were averaged over 5 scan points. The baseline shift has been removed before averaging for illustrative purposes.
18 £ Oleneva etaL / Spectrodiimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 213 (2019) 12-18
[4) National Cancer Registration & Analysis Service and Cancer Research UK, Chemotherapy, Radiotherapy, and Tumour Resections in England: 2013-2014, NCRAS, London, 2017.
[5| E. Senkus, S. Kyriakides, S. Ohno, F. Penault-Uorca, P. Poortmans, E. Rutgers, S. Zackrisson, F. Cardoso. Primary breast cancer: ESMO Clinical Practice. Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up, Ann. OncoL 26 (2015) 8-30.
[6| M.S. Moran, S.J. Schnitt, AE. Giuliano. J.R Harris. SA Khan. J. Horton, S. Klimberg, M. Chavez-MacGregor, G. Freedman, N. Houssami, P.L Johnson, M. Morrow, Society of Surgical Oncology-American Society for Radiation Oncology consensus guideline on margins for breast-conserving surgery with whole-breast irradiation in stages I and II invasive breast cancer, Ann. Surg. Oncol. 21 (2014) 704-716.
|7J J.Q. Brown, T.M. Bydlon, L.M. Richards. B. Yu. S.A. Kennedy. J. Geradts, LG. Wilke, M. Junker, J. Gallagher, W. Barry, N. Ramanujam, Optical assessment of tumor resection margins in the breast. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 16 (3) (2010) 530-544.
[8| A.H. Fischer, KA.Jacobson, J. Rose, R Zeller, Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 3 ( 5) (2008) (2008:pdb.prot4986).
[9| H. Jaafar, Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations, Malays. J. Med. Sci. 13 (1) (2006) 4-12.
( 10 J V.R. Kondepati, M.M. Heise, J. Backhaus, Recent applications of near-infrared spectroscopy in cancer diagnosis and therapy, Anal. BioanaL Chem 390 (2008) 125-139.
[11) C. Liu, Y. Zhang, X. Yan, X. Zhang, C. Li. W. Yang, D. Shi, Infrared absorption of human breast tissues in vitro, J. Lumin. 119-120 (2006) 132-136.
[12] X. Sun, Y. Xu, J. Wu, Y. Zhang, K. Sun, Detection of lung cancer tissue by attenuated total reflection - Fourier transform infrared spectroscopy - a pilot study of 60 samples. J. Surg. Res. 179 (2013) 33-38.
113) H. Chen. Z. Lin, L. Mo, T. Wu. C. Tan, Near-infrared spectroscopy as a diagnostic tool for distinguishing between normal and malignant colorectal tissues, Biomed. Res. Int. 2015 (2015), 472197. (7 pp.).
[ 14) H. Abramczyk, A. Imiela, The biochemical, nanomechanical and chemometric signatures of brain cancer, Spectrochim Acta A 188 (2018) 8-19.
115) V. Ntziachristos, AG. Yodh, M.D. Schnall, B. Chance, MRI-guided diffuse optical spectroscopy of malignant and benign breast lesions. Neoplasia 4 (4) (2002) 347-354.
[16) A. Cerussi, N. Shah. D. Hsiang, A Durkin.J. Butler. B.J.Tromberg In vivo absorption, scattering and physiologic properties of 58 malignant breast tumors determined by broadband diffuse optical spectroscopy. J. Biomed Opt. 11 (4) (2006). 044005..
117) A. Cerussi, D. Hsiang. N. Shah, R. Mehta. A. Durkin, J. Butler. B.J. Tromberg, Predicting response to breast cancer neoadjuvant chemotherapy using diffuse optical spectroscopy. Proc. NatL Acad. Set U. S. A 104 (10) (2007) 4014-4019.
[ 18) S. Asgari, H.J. Rohrborn, T. Engelhorn, D. Stolke, Intra-operative characterization of gliomas by near-infrared spectroscopy: possible association with prognosis. Acta Neurochir. 145 (2003) 453-460.
119) E. Kaznowska, J. Depciuch, K. Lach, M. Kolodziej, A. Koziorowska, J. Vongsvivut, I. Zawlik, M. Cholewa, J. Cebulski, The classification of lung cancers and their degree
of malignancy by FTIR, PCA-LDA analysis, and a physics-based computational model Talanta 186 (2018) 44-52.
[20) E. Hagerlind, M. Falk, T. Lofstedt, B. Lindholm-Sethson, I. Boden, Near infrared and skin impedance spectroscopy - a possible support in the diagnostk process of skin tumours in primary health care, Skin Res. Technol. 21 (2015) 493-499.
[21) I. Boden. W. Larsson, D. Nilsson, E. Forssell, P. Naredi, B. Lindholm-Sethson, In vivo skin measurements with a novel probe head for simultaneous skin impedance and near-infrared spectroscopy. Skin Res. Technol. 17 ( 2011) 494-504.
[22) I. Boden, J. Nystrom, B. Lundskog. V. Zazo. P. Geladi, B. Lindholm-Sethson, P. Naredi. Non-invasive identification of melanoma with near-infrared and skin impedance spectroscopy. Skin Res. Technol. 19 (1) (2013 ) 473-478.
[23| A.L Vahrmeijer, M. Hutteman, J.R. van der Vorst, CJ.H. van de Velde, J.V. Frangioni, Image-guided cancer surgery using near-infrared fluorescence. Nat. Rev. Clin. Oncol. 10 ( 2013) 507-518.
[24| D. Holt, O. Okusanya, R. Judy. O. Venegas, J. Jiang, E. Dejesus, E. Eruslanov, J. Quatromoni, P. Bhojnagarwala, C. Deshpande, S. Albelda, S. Nie, S. Singhal, Intraoperative near-infrared imaging can distinguish cancer from normal tissue but not inflammation. PLoS One 9 (7) (2014), el03342..
[25| B.P. Neuman, J.B. Eifler, M. Castanares, W.H. Chowdhury, Y. Chen. R.C. Mease. R. Ma. A. Mukherjee, S.E. Lupoid, M.G. Pomper. R. Rodriguez, Real-time, near-infrared fluorescence imaging with an optimized dye/light source/camera combination for surgical guidance of prostate cancer, Clia Cancer Res. 21 (4) (2015) 771-780.
[26) 0. Kameyama, Y. Usui, K. Kimura, A Nakamura, T. Sota, H. Goto. Noninvasive diagnostics supporting system for choroidal melanoma: a pilot study, Jpn. J. Ophthalmol. 59(1) (2015) 48-54.
[27| M. Ozaslan, I.D. Karagoz, I.H. Kilic, M.E. Guldur, Ehrlich ascites carcinoma, Afr. J. Biotechnol. 10 (13) (2011) 2375-2378.
[28) L Winsor,Tissue processing, in: A Woods, R.Ellis (Eds.), Laboratory Histopathology, Churchill Livingstone, New York 1994, pp. 4.2-1 ^12-39.
[29| I.T. Jolliffe, Principal Component Analysis. 2nd ed. Springer-Verlag. New York, 2002.
[30) I. Steinwart, A. Christmann, Support Vector Machines, Springer-Verlag, New York, 2008.
[31) R.W. Kennard, LA Stone, Computer aided design of experiments, Technometrics 11 (1)(1969) 137-148.
[ 32) VR. Kondepati, M. Keese, R. Mueller, B.C. M anegold, J. Backhaus. Application of near-infrared spectroscopy for the diagnosis of colorectal cancer in resected human tissue specimens. Vib. Spectrosc. 44 (2007) 236-242.
[33) F.T.T. Frajacomo. C. Padilha, P.C Marinello. FA. Guarnier. R. Cecchini, JAR Duarte, R. Deminice, Solid Ehrlich carcinoma reproduces functional and biological characteristics of cancer cachexia. Life Sci. 162 (2016) 47-53.
Microchemical Journal 159 (2020) 105464
ELSEVIER
Contents lists available at Si nceDiiect
Microchemical Journal
journal homepage: www.elsevier.com/locate/microc
Non-invasive prostate cancer screening using chemometric processing of macro and trace element concentration profiles in urine
Ekaterina Martynko , Ekaterina Oleneva1', Evgeny Andreev1, Sergey Savinov ', Svetlana Solovieva', Vladimir Protoshchak , Evgenii Karpushchenko , Aleksandr Sleptsov , Vitaly Panchuk ', Andrey Legin1'1', Dmitry Kirsanov1'1''
1 Institute of Chemistry. Saint Petersburg State University. Universitetskaya Nab.. 7/9. Saint Petersburg 199034. Russia b Laboratory of Artificial Sensory Systems. ITMO University. Kronverksky prospect 49. Saint Petersburg 197101. Russia ' Urology Department of S.M. Kirov Military Medical Academy. uL Akademika Lebedeva 6. Saint Petersburg 194044. Russia
n>
ARTICLE INFO
ABSTRACT
Keywords: Prostate cancer Non-invasive screening Elemental profiling Urine
Chemometrics
We report on the attempt to develop a simple non-invasive screening protocol for prostate cancer (PCa). Absolute concentrations of 19 macro and trace elements (Ag, Al, B, Ba, Ca, Cd, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P, Pb, S, Si, Sr, Tl, Zn) were determined using inductively coupled plasma optical emission spectroscopy (ICP-OES) and atomic absorption spectroscopy (AAS) techniques in 34 urine samples from patients with biopsy-confirmed PCa and 32 urine samples from controls. All the possible concentration ratios were calculated as well. Various data processing methods, including Principal Component Analysis, Logistic Regression, and Decision Trees, were applied for data modeling to study if the elemental concentration profile may contribute to the development of new screening tools for prostate cancer. Several statistically significant differences between die two groups were observed both in the individual element concentrations and in their ratios. The mathematical classification models built for the prediction of the patient's status with respect to PCa based on elemental profile have shown the accuracy of up to 89%, thus exceeding the accuracy of the standard prostate-specific antigen testing.
1. Introduction
Prostate cancer (PCa) is one of the leading causes of cancer mortality in males and happens to be the first most common male cancer. The overall five-year survival rate is high, but only in cases of early-diagnosed non-metastasized PCa [1]. The early detection of PCa is complicated because of the two main reasons. First is the fact that most prostate cancers cause no symptoms at the early stages, and when the symptoms are evident to the patient, the PCa is already advanced. The second reason is that patients tend to avoid the recommended prostate screening. Therefore, it is crucial to develop appropriate methods for the early detection of PCa, preferably simple and non-invasive ones.
Nowadays, PCa diagnosis is based on prostate digital rectal examination (DRE) findings and elevated levels of prostate-specific antigen (PSA) in blood. PSA level is determined in blood serum with a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) test kit The PSA test is known to have quite low sensitivity and specificity at 4.0 ng/ml traditional cutoff level; however, changes in the cutoff level do not result in any improvements [2]. This
underperformance is explained by the fact that a high level of PSA is not necessarily associated with PCa and can also be caused by other reasons, such as trauma, infection, benign prostate, or even medication use. That main drawback of PSA testing leads to unnecessary biopsies, over-diagnosing, or over-treating insignificant prostate pathologies 13]. There are several other PCa biomarkers and their combinations in clinical practice: prostate cancer antigen 3 (PCA3) score [4], Four-kallikrein panel (4 K) [5], Prostate Health Index (PHI) [6], various combinations of proteomic markers [7.8]. Existing approaches also include the development of sensors for all the possible biomarkers based on such biostructures as aptamers [9] and exosomes [ 10]. Metaanalyses label them as more accurate and precise, showing higher sensitivity and specificity values [11-13], meaning that these analyses may significantly reduce the number of unnecessary biopsies [14]. Nevertheless, these tests are more expensive and much less in use than classic PSA level determination with ELISA kit Currently, the prostate biopsy remains a golden standard of PCa diagnostics. It is a reliable but highly invasive approach, which is associated with possible side effects, e.g., bleeding and infections [15].
' Corresponding author at: Institute of Chemistry, Saint Petersburg State University, Universitetskaya Nab., 7/9, Saint Petersburg 199034, Russia. E-mail address: d.kiisanov@gmail.com (D. Kirsanov).
https://d0i.0rg/l 0.1016/j. microc.2020.105464
Received 4 June 2020; Received in revised form 29 July 2020; Accepted 25 August 2020
Available online 30 August 2020
0026-265X/ © 2020 Elsevier B.V. All rights reserved.
The development of new simple, and non-invasive tools for PCa diagnostics is of great interest. One of the attractive approaches is to detect cancer biomarkers in different biofluids. Biological fluids with potential for PCa screening include prostate serum, semen, plasma, and urine [16]. Urine is a promising source for the development of new PCa biomarkers [17], such as DNAs, RNAs, proteins, amino acids, and different volatile compounds. At the same time, urine seems to be the most convenient biological fluid for PCa biomarkers detection due to simple and non-invasive sample collection. There are various studies focused on PCa detection based on selective quantification of particular substances with liquid [18] or gas chromatography [19], mass spectrometry [20], surface-enhanced Raman spectroscopy [21], aptasensors [22,23] and many other analytical methods [24]. Different proteins were suggested as potential PCa biomarkers [25]. High sensitivity and specificity metrics were achieved for a-methylacyl coenzyme A race-mase [26], and prostate secretory protein (PSP94) to serum PSA ratio [27]. As for small molecules, glycine derivative sarcosine is known to be significantly elevated in the urine of patients with biopsy-confirmed PCa [28]. Also, a combination of four volatile organic compounds (2,6-dimethyl-7-octen-2-ol, pentanal, 3-octanone, 2-octanone) was suggested as a fast method of PCa detection with a rather high accuracy [29].
Another diagnostic strategy is to evaluate the integral composition or characteristic sample profile, instead of searching for a particular biomarker. This approach was applied to different types of cancer in several studies. Thus, elemental concentrations (Cd, Ni, Zn, Cu, Fe, Mg, Ca) were estimated in 11 malign and 6 benign prostate tissue samples with atomic absorption spectrophotometry 130], and it was concluded that the concentrations of calcium and zinc in the malign human prostate are significantly higher than those in the benign human prostate (p < 0.05 for both metals). The levels of 12 elements (P, S, K, Ca, Cr, Fe, Cu, Zn, As, Se, Br, Rb) were measured in the liver tissue of patients with secondary colorectal liver cancer (24 tumor and 24 control samples) using X-ray fluorescence spectroscopy [31]. Micro X-ray fluorescence spectroscopy was also applied to estimate the concentrations of P, S, CI, K, Ca, Fe, Cu, and Zn in 26 regions of 11 neoplastic and healthy brain tissue samples and it was shown that it is possible to properly classify the patient status based on the concentrations of Cu, K, Fe, Ca, and Zn [32]. The quantitative analysis of 22 elements in nontumor and esophageal squamous cell carcinoma tissues with ICP-MS showed significant differences in concentrations of Mn, Se, Cu, Ti, Mg, Fe, Co, Zn, Sr, Ca (p < 0.001) [33]. Statistically significant differences in homeostasis of several essential and toxic elements were found in hair of patients with head and neck cancers [34] and in hair and nails of patients with laryngeal cancer [35,36].
As for biological fluids analysis, metal concentrations were determined in urine, blood, and lung fluid samples of 48 patients diagnosed with lung cancer and 39 healthy volunteers using quadrupole ICP-MS. Not only absolute concentrations (V, Cr, Cu) but also concentrations ratios (Cr/Cd, Mn/Cd, V/Cd, Co/Cd, Cd/Pb) show statistically significant differences between patients with lung cancer disease and the control group [37]. Laser-induced breakdown spectroscopy was applied to the 48 serum samples to obtain elemental profiles that allowed successful discrimination between patients with lymphoma and multiple myeloma and healthy volunteers [38]. In all of these studies, statistically significant differences in elemental concentrations were found to be possible biomarkers for various cancers. It was also hypothesized that concentrations of chemical elements are significant for the PCa diagnosis [39]. Profiling approach has significant benefits compared to the detection of specific substances: it does not require selective detection methods; therefore, it is less time-consuming and less expensive. Instead, the integral sample profile is being determined and analyzed with appropriate multivariate data processing methods.
This research aimed to explore whether elemental analysis with modern atomic spectrometry methods (Inductively coupled plasma optical emission spectroscopy (ICP-OES) and Atomic absorption
spectroscopy (AAS) can be a way to distinguish between urine samples obtained from the patients with diagnosed PCa and the control group. Besides, not only absolute element concentrations in urine but also element concentration ratios were determined for full profiling and analysis. Both concentrations and ratios were compared pairwise and engaged in logistic regression and decision trees modeling for classification purposes. In this project, we were aiming at constructing a simple and cost-effective method, where only an initial investment in the equipment would be necessary; therefore, it was decided not to perform any additional experiments, such as urea or creatinine level determination. The elemental concentrations were not normalized regarding creatinine levels, and only one morning urine sample was used instead of a 24-h urine collection approach. To the best of our knowledge, this is the first systematic study of this kind.
2. Materials and methods
2.1. Power calculations
For this work, we performed a priori statistical power calculations to understand the possibilities of this research as a feasibility study. The number of samples was calculated using the G*Power 3.1.9.4 software [40]. The calculated required sample size was 60 for the following parameters:
• Wilcoxon rank-sum test for two groups;
• Two tails distribution;
• Effect size = 0.8;
• a error probability = 0.05;
• Statistical power = 0.8;
• Allocation ratio = 1.
Therefore, it is possible to detect rather significant effects with statistical power that should be considered appropriate [41] with the total sample size of 60. These calculations are in agreement with the later formed the greatest possible sample size of 66 participants with the allocation ratio close to 1 (34 patients in the prostate cancer group and 32 in the control group).
2.2. Urine samples
66 urine samples were provided by the Urology Clinic of S.M. Kirov Military Medical Academy (St. Petersburg, Russia). 34 samples were from Caucasian patients with PCa diagnosis confirmed by prostatic puncture biopsy. The Gleason scores varied from 6 to 9 for these patients, and PSA levels were in the range of 2.5-298 ng/ml. 32 samples were obtained from age-matched Caucasian anonymous male volunteers with no PCa diagnosis, no previous medical history of prostate diseases, and no complaints. No further information on the samples was available due to the considerations of ethics and confidentiality. All subjects gave their informed consent for inclusion before they participated in the study. The study was conducted in accordance with the Declaration of Helsinki, and the protocol was approved by the Ethics Committee of S.M. Kirov Military Medical Academy (Project KMA/138/ 17). Urine collection procedure was identical for both PCa patients and healthy volunteers: only one portion of urine was collected at the same time in the morning after a 12-h fasting period to reduce the influence of dietary differences. Analysis of only one urine portion is faster and more convenient than 24-h urine collection for screening purposes. The samples were provided for analysis in a frozen form and stored in the laboratory refrigerator at -21 °C. The samples were thawed before the analysis using a water bath at room temperature. Each sample was diluted ten times (1 ml of urine in 9 ml of 1% HN03 solution in bi-distilled water) before the spectroscopic measurements. No additional parameters of the urine samples, such as urea or creatinine levels, were determined, and no normalization of the elemental profiles was
Macro element concentration profiles
Ei3 Healthy Controls Prostate Cancer
150-
100
50
0-
Mg
Na
300-
p* 200 H
100-
0-
2000-
_ 1500-o> 1000-
o
500 OH
Ca
Fig. 1. Macro elements concentrations profiles in the urine of biopsy-confirmed prostate cancer patients and healthy volunteers represented as boxplots. The width of the box represents the 1st and the 3rd quaitiles of data. The band inside the box shows the median value. The whiskers are extended to the 1.5 interquartile range (IQR) to indicate variability outside the upper and lower quartiles. The dots show the outliers that go beyond the 1.5 IQR from the box.
performed, as we would like to make the methodology as simple and cost-efficient as possible and to avoid any additional measurements and sample manipulations.
2.3. Measurements
Elemental analysis was performed with atomic absorption spectrophotometer AA-7000 (Shimadzu) (Al, Cd, Pb) and with multitype inductively coupled plasma emission spectrometer ICPE-9000 (Shimadzu) for other metals (Ag, Ba, Ca, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, Sr, Tl, Zn). The samples for quantification of the elements with high concentrations (Ca, K, Mg, and Na) were diluted 100 times. The most prominent and overlap-free spectral line was selected as the analytical line for each element. Certipur (Merck) standard multi- and single-element solutions were diluted with 1% HN03 solution in bidistilled water to set up calibration solutions from 0.1 pg/L to 10 mg/L and to get a calibration curve. Limits of detection (mg/L): Ag 0.1, Al 0.01, B 0.4, Ba 0.01, Ca 0.4, Cd 0.004, Cu 0.04, Fe 0.1, K 1, Mg 0.4, Mn 0.01, Na 0.4, P 0.1, Pb 0.01, S 0.4, Si 0.1, Sr 0.01, Tl 0.04, Zn 0.04. 1% HN03 solution in bidistilled water was analyzed as a blank sample to check for any additional metals in reagents.
2.4. Data processing
The normality of distribution in all variables was checked with the Shapiro-Wilk normality test [42]. Since most of the variables showed skewed distribution, non-parametric methods, such as Wilcoxon rank-sum test [43], were used for pairwise comparisons of elemental concentrations in the urine of healthy volunteers and PCa patients. Only p-values below 0.05 were regarded as statistically significant.
The following data processing methods were applied: principal component analysis (PCA) [44], logistic regression (LR) [45], decision trees (DT) [46].
PCA is used as a projection method that is widely applied for sample
mapping in different classification studies. LR is a typical classification method in cancer studies [47], which allows making simple and effective discriminating models for diagnostics. DT is a popular method in machine learning studies for classification purposes [48] because it can discover and identify patterns and relationships between the status of the patient and measured parameters in complex datasets.
Samples were encoded either as positive (P - when the patient is considered as ill) or negative (N - when the patient is considered as healthy). After classification, the sample is regarded as true positive (TP), when the ill patient is correctly classified as ill. The sample is marked true negative (TN) when a healthy volunteer is classified as healthy. False positive (FP) samples stand for cases where a healthy person is misclassified as ill. False negative (FN) sample is where an ill patient is incorrectly classified as healthy.
In order to compare the results, the metrics of sensitivity, specificity, and accuracy were employed according to the following equations:
Sensitivity = TP/(TP + FN); Specificity = TN/(TN + FP); Accuracy = (TP + TN)/(TP+FP + TN+FN),
where TP - true positive samples (P classified as P), FN - false negative (P classified as N), TN - true negative samples (N classified as N), FP -false positive samples (N classified as P).
PCA models were calculated in The Unscrambler 9.7 (CAMO, Norway). Normality test, Wilcoxon rank-sum test, LR, and DT modeling were performed in Matlab R2019a (MathWorks, Natick, USA).
3. Results and discussion
In this work, the total concentrations of 19 elements were determined in urine samples from 34 patients with biopsy-confirmed PCa and 32 healthy volunteers, the overall median age of 69.5 years (mean 68.6; range 45-89 years). Concentrations of Ag, Ba, Cu, Tl were found
PCA score plots for element concentrations
• Healthy Controls • Prostate Cancer
o 2
PC1 (31%)
Fig. 4. PCA score plots for PC1-PC2 (A) and PC3-PC4 (B). Red circles - urine samples from PCa patients, green circles - urine samples from controls. Explained variance per principal component is given in parentheses.
Table 1
Performance metrics for LR and DT classification models.
Logistic regression
Sensitivity Specificity Accuracy
Absolute concentrations 100% 80% 89%
Concentration ratios 33% 100% 68%
Decision trees
Sensitivity Specificity Accuracy
Absolute concentrations 100% 60% 79%
Concentration ratios 100% 60% 79%
ratios. Test sets were randomly formed by the 70:30 splitting of the datasets: 47 samples for calibration and 19 samples for prediction. 10fold cross-validation was applied both for logistic regression and for decision trees modeling. For all the obtained predictions, the number of properly classified (TP, TN) and misclassified (FN, FP) samples were determined, and based on these values, the metrics of specificity, sensitivity, and accuracy were calculated (Table 1).
Sensitivity is a characteristic of correctly classified patients with biopsy-confirmed PCa, i.e., the model's ability to detect ill patients. Specificity shows how many healthy volunteers were classified correctly, i.e., the ability to distinguish controls from patients with cancer. Accuracy metric shows how many of all samples were classified correctly, i.e., how suitable the model is for both accurate detections of healthy and unhealthy patients.
The results on obtained elemental profiles in urine were analyzed in relation to the existing literature on the elemental metabolism in malignant and benign human tissues.
It was previously shown that exposure to cadmium is a risk factor for PCa [50,51]. We found no statistically significant differences in cadmium concentrations in urine samples obtained from patients with PCa and healthy volunteers. As for calcium and magnesium, there are also indications that an imbalance in concentrations of these metals [52,53] and higher calcium dietary intake [54] is associated with PCa diagnosis, including highly aggressive forms :55], It is postulated that
calcium affects PCa development by the suppression of the biologically active form of vitamin D 25-hydroxyvitamin D [56]. Sodium concentrations in the peripheral zone PCa were reported to be significantly higher than in the prostate tissues without pathologies [57]. All these facts combined allow us to suppose that lower excretion of Ca, Mg, Na with urine has some connection with tumor-related metabolic disorders in PCa patients. Due to a relatively small number of samples, it is rather difficult to suggest a satisfactory explanation for the differences in Sr and S concentrations; further experiments are necessary.
It was suggested that metal concentration ratios also might find application as cancer biomarkers [37]; thus, all the possible concentration ratios were calculated. According to the Shapiro-Wilk normality test, these ratios show skewed distribution. Pairwise comparison for previously described two groups was also performed with Wilcoxon rank-sum test and statistically significant differences were found in the following ratios: Al/Mg, Al/Na, Al/Sr, B/Na, Ca/Sr, Cd/Sr, K/Mg, K/ Na, K/Sr, Mg/P, Mg/S, Mg/Si, Mg/Zn, Na/P, Na/S, P/Sr, S/Sr, Si/Sr, Sr/Zn (p < 0.05). It is noteworthy that all of the identified significant ratios have at least one element from the list of individual elements found to be significantly different. Another important observation is that three of the significant ratios contain zinc. This is probably associated with the fact that zinc levels were found to be important in the pathogenesis and progression of prostate malignancy [58-60]; thus, zinc excretion in urine may also be affected by PCa.
As can be seen from LR and DT metrics, the ability of these models to predict a patient's status based on absolute concentrations or their ratios is satisfactory with a maximum accuracy of 89% for the model based on logistic regression and absolute elemental concentrations. Both models based on absolute concentrations of Ca, Mg, Na, S, Sr are satisfactory, but they lack specificity, meaning that a certain number of PCa patients (20% in the case of LR and 40% in the case of DT) are improperly classified as healthy. As for the models based on the concentration ratios, only the DT model performs reasonably good with the total accuracy of 79%, while LR model gives poor prediction with the accuracy of 68% due to the low sensitivity values, i.e., the model misclassifies samples from healthy volunteers as having PCa. To sum up, the LR model with absolute concentration values shows promise for reliable prediction of the patients PCa status based on the urine
elemental profile, and we suggest that it can be potentially employed as an additional diagnostic method after a thorough validation of the suggested approach with sufficiently large datasets.
4. Conclusions
Macro and trace elemental profiling of the urine samples from patients with biopsy-confirmed prostate cancer and healthy volunteers was performed using ICP-OES and AAS techniques. It was shown that concentrations of Ca, Mg, Na, S, Sr differ significantly between two groups, and possible reasons for these findings were suggested. All the possible concentration ratios were calculated, and it was found that some of the ratios show statistically significant differences (Al/Mg, Al/ Sr, Ca/Sr, Ca/Zn, K/Mg, K/Na, K/Sr, Mg/Zn, Sr/Zn). Non-linear classification methods such as logistic regression and decision trees yielded satisfying performance metrics with the accuracy up to 89%, and the obtained metal concentration profiles may be sufficient for reliable discrimination of PCa patients and control group as an additional noninvasive screening tool. Further dedicated validation studies with the extended number of representative samples should be performed to confirm the validity of these findings. Hie determined concentration profiles are provided in Supplementary Materials to encourage further studies.
CRediT authorship contribution statement
Ekaterina Martynko: Formal analysis, Visualization, Writing -original draft Ekaterina Oleneva: Formal analysis. Evgeny Andreev: Methodology, Investigation. Sergey Savinov: Investigation. Svetlana Solovieva: Investigation. Vladimir Protoshchak: Resources, Methodology, Investigation. Evgenii Karpushchenko: Writing - original draft. Aleksandr Sleptsov: Data curation. Vitaly Panchulc Validation, Conceptualization. Andrey Legin: Resources, Writing - review & editing. Dmitry Kirsanov: Writing - review & editing, Supervision.
Declaration of Competing Interest
The authors declare that they have no known competing financial interests or personal relationships that could have appeared to influence the work reported in this paper.
Acknowledgements
AL and DK acknowledge the partial financial support of this study by RFBR-NSFC project #18-53-53016 GFEN_a (NSFC-RFBR Cooperation of China Grant No. 8171101322). EO, AL, and DK acknowledge the support from the Government of Russian Federation, Grant 08-08. The authors acknowledge the Research park of St. Petersburg State University's «Center for Chemical Analysis and Materials Research» and «Educational Resource Center of Chemistry» for spectroscopic measurements.
Appendix A. Supplementary data
Supplementary data to this article can be found online at https:// doi.org/10.1016/j.microc. 2020.105464.
References
[1] R.C. Wender, K.S. Andrews, D. Brooks, O.W. Brawley, D. Saslow, S.A. Fedewa, D. Manassaram-Baptiste, R.A. Smith, Cancer screening in the United States, A review of current American Cancer Society guidelines and current issues in cancer screening, CA. Cancer J. Clin. 68 (2018) (2018) 297-316, https: doi.org 10.3322/ caac.21446.
[2] P.-O. Gaudreau, J. Stagg, D. Soulieres, F. Saad, The present and future of bio-markers in prostate cancer: proteomics, genomics, and immunology advancements,
Biomark. Cancer. 8s2 (2016) BIC.S31802, https: doi.org/10.4137. bic.s31802.
[3] C.H. Bangma, S. Roemeling, F.H. Schroder, Overdiagnosis and overtreatment of early detected prostate cancer, World J. Urol. 25 (2007) 3-9, https://doi.org/10 1007/S00345-007-0145-z.
[4] J. Hansen, M. Auprich, S.A. Ahyai, A. De La Taille, H. Van Poppel, M. Marberger, A. Stenzl, P.FA. Mulders, H. Huland, M. Flsch, C.C. Abbou, J A. Schalken, Y. Fradet, L.S. Marks, W. Ellis, A.W. Partin, K. Pummer, M. Graefen, A. Haese, J. Walz,
A. Briganti, S.F. Shariat, F.K. Chun, Initial prostate biopsy: Development and internal validation of a biopsy-specific nomogram based on the prostate cancer antigen 3 assay, Eur. Urol 63 (2013) 201-209, https: doi.org/10.1016 j.eururo. 2012.07.030.
[5] A J. Vickers, A.M. Cronin, G. Aus, C.-G. Pihl, C. Becker, K. Pettersson, P.T. Scardino, J. Hugosson, H. Lilja, A panel of kallikrein markers can reduce unnecessary biopsy for prostate cancer: data from the European Randomized Study of Prostate Cancer Screening in Goteborg, Sweden, BMC Med. 6 (2008) 19, https: doi.org, 10.1186 1741-7015-6-19.
[6] W.J. Catalona, A.W. Partin, M.G. Sanda, J.T. Wei, G.G. Klee, C.H. Bangma, K.M. Slawin, L.S. Marks, S. Loeb, D.L. Broyles, S.S. Shin, A.B. Cruz, D.W. Chan, LJ. Sokoll, W.L. Roberts, R.H.N. Van Schaik, I. A. Mizrahi, A multicenter study of [-2]pro-prostate specific antigen combined with prostate specific antigen and free prostate specific antigen for prostate cancer detection in the 2.0 to 10.0 ng/ml prostate specific antigen range, J. Urol. 185(2011) 1650-1655, https: doi.org 10. 1016/j.juro.2010.12.032.
[7] H. Wiese, L. Gelis, S. Wiese, C. Reichenbach, N. Jovancevic, M. Osterloh,
H.E. Meyer, E M. Neuhaus, H.H. Hatt, G. Radziwill, B. Warscheid, Quantitative phosp ho proteomics reveals the protein tyrosine kinase Pyk2 as a central effector of olfactory receptor signaling in prostate cancer cells, Biochim. Biophys. Acta -Proteins Proteomics. 2015 (1854) 632-640, https://doi.Org/10.1016/j.bbapap. 2014.09.002.
[8] B P. Crulhas, A.E. Karpik, F.K. Delella, G.R. Castro, VA. Pedrosa, Electrochemical aptamer-based biosensor developed to monitor PSA and VEGF released by prostate cancer cells, Anal. Bioanal. Chem. 409 (2017) 6771-6780, https://doi.org/10. 1007/S00216-017-0630-1.
[9] S.I. Hori, A. Herrera, J.J. Rossi, J. Zhou, Current advances in aptamers for cancer diagnosis and therapy, Cancers (Basel). 10 (2018) 9, https://doi.org/10.3390/ cancetsl0010009.
[10] Y.H. Soung, S. Ford, V. Zhang, J. Chung, Exosomes in cancer diagnostics, Cancers (Basel). 9 (2017), https://doi.org/10.3390/cancer59010008.
[11] X. Gou, P. Huang, С. Мои, Y. Luo, The PCA3 test for guiding repeat biopsy of prostate cancer and its cut-off score: a systematic review and meta-analysis, Asian J. Androl. 16 (2014) 487, https://doi.org/10.4103/1008-682x.125390.
[12] T. Nordstrom, A. Vickers, M. Assel, H. Lilja, H. Gronberg, M. Eklund, Comparison between the four-kallikrein panel and prostate health index for predicting prostate cancer, Eur. Urol. 68 (2015) 139-146, https://doi.org/10.1016/j eururo.2014.08. 010.
[13] W. Wang, M. Wang, L. Wang, T.S. Adams, Y. Tlan, J. Xu, Diagnostic ability of % p2PSA and prostate health index for aggressive prostate cancer: A meta-analysis, Sci. Rep. 4 (2014) 13-18, https://doi.org/10.1038/srep05012.
[14] D. Wu, J. Ni, J. Beretov, P. Cozzi, M. Willcox, V. Wasinger, B. Walsh, P. Graham, Y. LI, Urinary biomarkers in prostate cancer detection and monitoring progression, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 118 (2017) 15-26, https: /doi.org/10.1016 1 critrevonc. 2017.08.002.
[15] B.S. Kramer, P.C. Prorok, D. Chia, D.J. Reding, A.B. Miller, T.R. Church, E.P. Gelmann, B. O'Brien, LA. Yokochi, S.S. Buys, G.L. Andriole, C.D. Berg, T.L. Riley, PA. К vale, M.N. Fouad, E.D. Crawford, J.L. Weissfeld, J.D. Clapp, J.M. Rathmell, J.K. Gohagan, P.F. Pinsky, R.B. Hayes, R.L. Grnbb, G. Izmirlian, Mortality results from a randomized prostate-cancer screening trial, N. Engl. J. Med. 360 (2009) 1310-1319, https://doi.org/10.I056/nejmoa0810696.
[16] M. Truong, B. Yang, D.F. Jarrard, Toward the detection of prostate cancer in urine: A critical analysis, J. Urol. 189 (2013) 422-429, https: /doi.org/10.1016/j.juro. 2012.04.143.
[17] K. Fujita, N. Nonomura, Urinary biomarkers of prostate cancer, Int. J. Urol. 25 (2018) 770-779, https://doi.org/10.llll/iju.13734.
[18] Y. Jiang, X. Cheng, C. Wang, Y. Ma, Quantitative determination of sarcosine and related compounds in urinary samples by liquid chromatography with tandem mass spectrometry, Anal. Chem. 82 (2010) 9022-9027, https://doi.org/10.1021/ acl019914.
[19] R.B.M. Aggio, B. De Lacy Costello, P. White, T. Khalid, N.M. Ratcliffe. R. Persad, C.SJ. Probert, The use of a gas chromatography-sensor system combined with advanced statistical methods, towards the diagnosis of urological malignancies, J. Breath Res. 10 (2016)017106, , https: doi.org/10.1088 1752-7155/10/1/ 017106.
[20] C. Bax, G. Taverna, L. Eusebio, S. Sironi, F. Grizzi, G. Guazzoni, L. Capelli, Innovative diagnostic methods for early prostate cancer detection through urine analysis: a review, Cancers (Basel). 10 (2018) 1-29, https: /doi.org/10.3390/ cancersl 0040123.
[21] Y. Si, L. Li, B, He, J. Li, A novel surface-enhanced Raman scattering-based ratio-metric approach for detection of hyaluronidase in urine, Talanta. 215 (2020) 120915, , https://doi.Org/10.1016/j.talanta.2020.120915.
[22] S. Soleimani, E. Arkan, A.R. Jalalvand, H.C. Goicoechea, Fabrication of a novel electrochemical aptasensor assisted by a novel computerized monitoring system for real-time determination of the prostate specific antigen: A computerized experimental method brought elegancy, Microchem. J. 157 (2020) 104898,, https: /doi. org/10.1016/jjnicroc. 2020.104898.
[23] M. Kim, K. Kim, J.H. Lee, A cost-effective and rapid aptasensor with chemilumi-nescence detection for the early diagnosis of prostate cancer, Microchem. J. 155
(2020) 104763, , https://doi.org/10.1016/j.microc.2020.L04763.
[243 B.J. Trock, Application of metabolomics to prostate cancer, Urol. Oncol. Semin. Orig. Investig. 29 (2011) 572-581, https://doi.Org/10.1016/j.urolonc.2011.08. 002.
[25] J.J. Tosoian, A.E. Ross, L.J. Sokoll, A.W. Partin, C.P. Pavlovich, Urinary biomarkers for prostate cancer, Urol. Clin. NA. 43(2016) 17-38, https://doi.Org/10.1016/j.ucl.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.