Теоретические и экспериментальные основы разработки активной фармацевтической субстанции и лекарственной формы на основе рекомбинантного белка тритикаин -альфа для лечения целиакии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.01, доктор наук Тарасов Вадим Владимирович

• Тарасов Вадим Владимирович
• доктор наук
• 2021

Оглавление диссертации доктор наук Тарасов Вадим Владимирович

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Концепция конструирования и разработки ЛП на основе 18 рекомбинантного белка тритикаин-альфа

1.2. Современные подходы к экспериментальному 22 моделированию целиакии

1.2.1. Роль эндопептидаз в протеолизе глютена

1.2.2. Патоморфогенез целиакии

1.2.3. Иммунопатогенез целиакии

1.2.4. Токсичные и иммуногенные глиалиновые пептиды

1.2.5. Роль интерлейкина 15 в реализации эффектов глиадиновых 33 пептидов при целиакии

1.2.6. Хемокиновый рецептор СХСЯ3 — посредник 38 внутриклеточного транспорта глиадиновых пептидов

1.2.7. Современные подходы к экспериментальному 40 моделированию целиакии

1.2.7.1. Животные модели целиакии (модели in vivo)

1.2.7.2. Клеточные модели целиакии (модели in vitro) 44 Выводы к главе 1 51 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы и реактивы

211 Фармацевтическая субстанция

2.1.2. Вспомогательные вещества

2.2. Методы исследования фармацевтической субстанции

2.2.1. Идентификация субстанции тритикаин-альфа

2.2.2. Специфическая ферментативная (протеолитическая) 66 активность in vitro

2.2.3. Определение количества белка методом ВСА

2.2.4. Посторонние примеси

2.3. Изучение физико-химических и технологических 82 характеристик субстанции тритикаин-альфа и вспомогательных веществ

2.3.1. Метод прямой микроскопии в проходящем свете

2.3.2. Расчет индекса прессуемости (индекс Carr's, USP)

2.3.3. Расчет индекса Hausner (H)

2.3.4. Потеря в массе при высушивании

2.3.5. Изучение содержания влаги

2.3.6. Изучение гигроскопичности

2.4. Методики оценки технологических показателей качества 85 твердых капсул

2.5. Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА СОСТАВА И ТЕХНОЛОГИИ 87 ПОЛУЧЕНИЯ СУБСТАНЦИИ ТРИТИКАИН-АЛЬФА

3.1. Получение рекомбинантного белка тритикаин-альфа

3.2. Выбор криопротекторов для процесса лиофилизации рекомбинантного белка тритикаин-альфа

3.3. Изучение физико-химических и технологических свойств 104 субстанции

3.4. Технологическая схема получения субстанции рекомбинантного белка тритикаин-альфа

3.5. Определение показателей качества субстанции тритикаин- 118 альфа

3.6. Изучение условий хранения и стабильности лекарственного 126 препарата

Выводы к главе

ГЛАВА 4. ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 140 РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ТРИТИКАИН-АЛЬФА

4.1. Оценка специфической фармакологической активности 150 рекомбинантного белка тритикаин-альфа в модели in vitro

4.2. Оценка специфической фармакологической активности

тритикаина-альфа на модели целиакии in vivo

4.2.1. Разработка in vivo модели целиакии

4.2.2. Изучение специфической активности тритикаина-альфа 178 модели целиакии in vivo

4.3. Изучение фармакокинетических параметров 186 рекомбинантного белка тритикаин-альфа

4.4. Изучение общетоксического действия тритикаина-альфа

4.4.1. Изучение аллергезирующего действия тритикаина-альфа

4.4.2. Исследование репродуктивной и эмбриональной 206 токсичности тритикаина-альфа

4.4.3. Исследование мутагенных и канцерогенных свойств 207 субстанции тритикаин-альфа

Выводы к главе

ГЛАВА

РАЗРАБОТКА СОСТАВА И ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТВЕРДЫХ КАПСУЛ С РЕКОМБИНАНТНЫМ БЕЛКОМ ТРИТИКАИН-АЛЬФА

5.1. Программа исследований по разработке твердой 223 лекарственной формы с тритикаином-альфа

5.2. Изучение совместимости субстанции тритикаин-альфа со 227 вспомогательными веществами

5.3. Разработка оптимального состава твердых капсул с 233 рекомбинантным белком тритикаин-альфа

5.4. Изучение показателя «Растворение» разработанной 239 лекарственной формы

5.5. Разработка технологии получения капсул с рекомбинантным 241 белком

5.6. Технологическая схема получения капсул с тритикаином- 248 альфа

5.7. Определение показателей качества капсул с 256 рекомбинантным белком тритикаин-альфа

5.8. Изучение условий хранения и стабильности лекарственного

препарата

Выводы к главе

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Теоретические и экспериментальные основы разработки активной фармацевтической субстанции и лекарственной формы на основе рекомбинантного белка тритикаин -альфа для лечения целиакии»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Фармацевтическая разработка (ФР) является важнейшим этапом жизненного цикла ЛП. Сфера фармацевтической разработки предусматривает соблюдение требований Федерального закона от 12.04.2010 № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», общепринятых международных требований ICH Q8 «Фармацевтическая разработка» (Pharmaceutical development), ICH Q9 «Управление рисками для качества» (Quality Risk Management), ICH Q10 «Фармацевтическая система качества» (Pharmaceutical Quality System), а также решения Совета Евразийской экономической комиссии от 03.11.2016 № 78 (ред. от 30.01.2020) «О Правилах регистрации и экспертизы лекарственных средств для медицинского применения»». Текущий уровень развития науки и технологий способствует постоянному росту значения ФР в цикле разработки лекарственных средств, при этом повышается роль поисковых и прикладных исследований, способствующих развитию данного направления [9; 18; 72; 73].

Развитие междисциплинарного подхода в создании новых лекарственных средств ведет к объединению компетенций исследователей из различных областей науки, таких как биология, химия, физика, математика, медицина и фармация. На стыке наук появились новые направления: молекулярная биология, геномика, биоинформатика, медицинская химия и др., которые легли в основу комплексного подхода к созданию оригинальных лекарственных средств — «драг-дизайну» (от англ. drug — лекарственное средство, design — проектирование, конструирование). В основе данного подхода лежит рациональное применение различного научного инструментария для максимально быстрой и эффективной разработки лекарств. При этом отправной точкой в исследованиях в первую очередь служит анализ потребности: наличие неизлечимых заболеваний, отсутствие эффективных лекарств, высокая частота нежелательных лекарственных реакций при применении существующих вариантов лекарственной терапии и др. Важным стимулом для создания новых

препаратов может стать открытие новых молекулярных мишеней или новые данные по патогенезу заболевания.

Таким образом, новая разработка лекарственного средства начинается с определения нозологической группы и возможных путей фармакологической коррекции. В ходе работы выявляются наиболее перспективные молекулярные мишени, детально изучается патогенез заболевания, чтобы определить потенциальные характеристики фармакологически активных веществ и сформировать техническое задание для последующей разработки — «драг-дизайна». Далее применяются методы молекулярного моделирования для расчета наиболее перспективных соединений, которые на следующем этапе синтезируются или получаются биотехнологическими методами. Зачастую отправной точкой служат соединения с уже изученной активностью, и исследователи идут путем создания модифицированных молекул (так называемые next-in-class — препараты, следующие в классе), но при открытии оригинальных мишеней могут разрабатываться совершенно оригинальные молекулы — первые в классе (first-m-class). После проведения скрининговых исследований и подтверждения активности субстанции происходит переход к фармацевтической разработке и комплексу клинических исследований, где в соответствии с требованиями регуляторных органов необходимо доказать безопасность и эффективность создаваемого лекарственного препарата.

Следует отметить, что современные подходы к ФР направлены на реализацию принципов спланированного качества, или «качества, запланированного при разработке» (Quality-by-Design, QbD). Данные принципы основаны на обязательном проведении масштабных исследований, которые экспериментально подтверждают, позволяют установить или разработать:

• целевой профиль качества препарата;

• профиль качества ЛП;

• критические показатели качества ЛП;

• пространство проектных параметров;

• оценку рисков;

• стратегию контроля.

Соблюдение данных принципов позволяет выстроить эффективную работу на данной стадии жизненного цикла препарата и добиваться постоянного повышения качества продукта.

Степень разработанности темы исследования. Данные о заболеваемости целиакией обусловливают актуальность разработки лекарственных средств для терапии [6—8; 17; 24; 47; 51; 55; 62]. В настоящее время на фармацевтическом рынке в мире и в России не представлены препараты, обладающие глютеиназной активностью. Однако разрабатывается ряд средств на основе протеаз рекомбинантного и микробиологического происхождения [134; 210; 216]. За рубежом проводятся клинические исследования следующих препаратов:

• ALV003, Alvine Pharmaceuticals Inc., NCT00959114, Phase 2b;

• Aspergillus Niger Prolyl Endoprotease (AN-PEP), VU University Medical

Center, NCT00810654, Phase

• STAN1, Heim Pal Children's Hospital, NCT00962182, Phase

Наиболее изученным и эффективным из перечисленных выше является препарат ALV003 (Alvine Pharmaceuticals, США) на основе рекомбинантного аналога глютеназы ячменя EP-B2, на примере которого впервые была продемонстрирована эффективность ферментативной терапии для лечения целиакии [165]. В настоящее время препарат ALV003 успешно прошел вторую стадию клинических испытаний. В связи с недостаточной глютеназной активностью основного действующего вещества (фермент EP-B2) в состав ALV003 дополнительно введена пролилэндопептидаза бактериального происхождения (источник — Sphingomona scapsulate), однако интегральная глютеназная активность препарата остается сравнительно невысокой.

Недостатком этих препаратов является низкая скорость ферментативного расщепления глютена и иммунотоксичных проламинов в желудочно-кишечном

тракте, что определяет их сравнительно высокие рекомендуемые дозы и, соответственно, высокую стоимость терапии.

Под руководством А.А. Замятнина исследовательская группа Института молекулярной медицины ФГАО ВО Первый МГМУ им И.М. Сеченова (Сеченовский университет) биотехнологическими методами из зародышей пшеницы получила фермент тритикаин-альфа, обладающий глютеиназной активностью. По экспериментальным данным, активность рекомбинантного тритикаина-альфа in vitro, как минимум, в два раза превышает активность прототипа ALV003 (смеси из цистеиновой протеазы ячменя ЕР-В2 и пролиловой эндопептидазы).

Целью исследования являются теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение методологии проектирования и разработки инновационного лекарственного препарата на основе рекомбинатного белка тритикаин-альфа для лечения целиакии с учетом исследований по формированию целевого профиля качества готовой ЛФ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести теоретическое обоснование и экспериментально подтвердить методологию проектирования и фармацевтической разработки инновационного препарата на основе рекомбинантного белка тритикаин-альфа для лечения целиакии.

2. Изучить современные подходы к экспериментальному моделированию целиакии, на основании которых разработать in vivo и in vitro модели целиакии для изучения специфической активности субстанции.

3. Разработать схему получения субстанции тритикаин-альфа и экспериментально обосновать выбор оптимальных вспомогательных веществ для процесса лиофилизации, а также технологических параметров процесса получения субстанции.

4. Разработать унифицированные и валидированные методики оценки качества субстанции тритикаин-альфа, пригодные для оценки качества, в том числе при процессе производства субстанции и готовой ЛФ.

5. Провести доклинические исследования рекомбинантного белка тритикаин-альфа, включающие изучение токсичности (безопасности) и фармакокинетики. Определить основные фармакокинетические параметры тритикаина-альфа: максимальной концентрации вещества в сыворотке крови (Стра), времени полувыведения, площади под фармакокинетической кривой до момента последнего измерения и до бесконечности, расчета скорости всасывания.

6. Научно обосновать выбор ЛФ, экспериментально произвести подбор оптимальных вспомогательных веществ для создания твердых капсул с тритикаином-альфа, провести изучение физико-химических и технологических характеристик действующего и вспомогательных веществ, их влияние на показатели качества ЛП.

7. Установить оптимальный состав и технологию получения с определением пространства проектных параметров для выделения условий процесса производства инновационного лекарственного препарата на основе рекомбинантного белка тритикаин-альфа — твердых капсул.

8. Определить целевой профиль качества (ЦПК) и потенциальные критические показатели качества (КПК) полученной твердой ЛФ.

9. Разработать на основании полученных экспериментальных данных проекты нормативной документации (НД, лабораторный регламент, опытно -промышленный регламент) на готовую лекарственную форму тритикаина-альфа — твердые капсулы.

Научная новизна исследования. На основании комплекса проведенных теоретических и экспериментальных исследований впервые предложены подходы к проектированию и разработке инновационного лекарственного препарата на основе рекомбинантного белка тритикаин-альфа, связанные с определением пространства проектных параметров для установления условий процесса при

разработке технологии получения и исследования по формированию целевого профиля качества готовой лекарственной формы.

Впервые разработаны методики для изучения специфической фармакологической активности субстанции и лекарственного препарата при целиакии in vitro: определена модельная система, представленная монослоем дифференцированных клеток Сасо-2, оптимизирован протокол их культивирования с целью сокращения сроков исследования и повышения достоверности получаемых результатов, подтверждено структурно -функциональное соответствие модельных клеток эпителиоцитам кишечника человека. Определены наиболее показательные и информативные параметры для регистрации его действия на модельную систему.

В результате экспериментов in vitro и in vivo доказана специфическая активность рекомбинантного белка тритикаин-альфа. На основании этих данных можно сделать вывод, что рекомбинантный белок тритикаин-альфа является потенциально эффективной фармацевтической субстанцией для создания ЛП для лечения целиакии. Определены основные фармакокинетические параметры тритикаина-альфа (максимальная концентрация вещества в сыворотке крови (Cipa), время полувыведения, площадь под фармакокинетической кривой до момента последнего измерения и до бесконечности, расчет скорости всасывания).

В ходе исследования был изучен ряд потенциально возможных вспомогательных веществ для проведения процесса сублимации рекомбинантного белка тритикаина-альфа с целью получения стабильной субстанции, определены основные технологические параменты процесса получения субстанции и ЛФ.

Исходя из структуры субстанции — рекомбинантного белка — впервые разработаны методики анализа ЛП, а именно: методика качественного определения рекомбинантного белка тритикаин-альфа в капсулах с помощью ВЭЖХ и методика количественного определения рекомбинантного белка тритикаин-альфа в капсулах с помощью ВСА-реагента (Bicinchoninic Acid Protein

Assay). В отношении разработанных аналитических методик была проведена предварительная валидация, что подтвердило корректность их использования для оценки качества ЛП.

Разработанный в рамках данного исследования ЛП — капсулы с тритикаином-альфа — является инновационным и не имеет аналогов, разрешенных для клинического применения на территории РФ.

Научная новизна работы подтверждена получением двух патентов на изобретения РФ (№ 2674763, 2576322), поданы две приоритетные заявки на международное изобретение (PCT/RU2018/050123 от 05.10.2018, PCT/RU2018/050071 от 25.06.2018).

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость заключается в формировании направления использования методологии проектирования в качестве перспективного инструмента фармацевтической разработки. Существенно расширены теоретические представления проектирования препаратов на основе рекомбинантных белков.

Разработанные научно-методологические подходы к созданию препаратов на основе рекомбинантных белков позволяют осуществить эффективный подбор оптимального состава ЛФ, снижая при этом сроки проведения исследований и иные издержки, сформировать нормативную и технологическую документацию на ЛП, соответствующую требованиям регуляторных органов, а также разработать программы подготовки специалистов в данной области.

Практическая значимость данного исследования заключается:

• в разработанной in vivo и in vitro модели целиакии для изучения специфической ЛП для лечения целиакии;

• в проведении стандартизации полученной ЛФ по выбранным показателям качества, разработке проектов НД на субтанцию тритикаин-альфа и готовую лекарственную форму — твердые капсулы с тритикаином-альфа 20 мг;

• в осуществлении технологического трансфера лабораторных разработок

для этапа масштабирования на опытно -производственный участок ООО

«АЛЬФА-Т».

Определен целевой профиль качества (ЦПК) (quality target product profile — QTPP) ЛП, использование которого гарантирует методологически правильный подход при разработке ЛП.

Показано, что применение подхода QbD в производстве препарата позволяет установить оптимальные критерии приемлемости (с возможностью постоянного улучшения), получать ЛП с прогнозируемым качеством при сниженных рисках, влияющих на качество продукции.

Методология и методы исследования. В ходе проведения исследований применены различные методы молекулярно-биологических,

патоморфологических и иммуногистохимических, физико-химических, фармакологических, фармацевтических и технологических испытаний; проведен сравнительный анализ, в том числе документальной базы, использованы математические и статистические методы анализа для обработки результатов.

Методология исследования заключалась в комплексном изучении всех этапов фармацевтической разработки: от выбора мишени и получения субстанции (рекомбинантного белка тритикаин-альфа) до создания готовой лекарственной формы — твердых капсул, а также изучения влияния фармацевтических факторов на биологическую доступность и качество лекарственных препаратов, разработки обобщений, заключений и рекомендаций по их использованию.

Основные положения, выносимые на защиту:

• теоретические основы методологии проектирования и фармацевтической разработки инновационного препарата на основе рекомбинантного белка тритикаин-альфа для лечения целиакии;

• результаты экпериментального исследования обоснования выбора оптимальных вспомогательных веществ для процесса лиофилизации, а также

технологических параметров процесса получения субстанции с применением подхода QbD;

• подходы к экспериментальному моделированию целиакии, на основании которых разработаны in vivo и in vitro модели целиакии для изучения специфической активности субстанции;

• результаты доклинических исследований рекомбинантного белка тритикаин-альфа, включающие изучение токсичности (безопасности) и фармакокинетики;

• обобщенные экспериментальные данные по определению оптимального состава и технологии получения с определением пространства проектных параметров для выделения условий процесса производства инновационного лекарственного препарата на основе рекомбинантного белка тритикаин-альфа — твердых капсул.

Достоверность научных положений и выводов

Достоверность полученных результатов подтверждается многократной повторностью экспериментов с применением адекватных методических подходов, отвечающих поставленным задачам исследования. Метрологическое обеспечение использованного в работе лабораторного оборудования подтверждено квалификацией соответствующего уровня. Применимость разработанных методик подтверждена валидационными исследованиями. Результаты экспериментальных исследований статистически обработаны и сопоставлены с данными научной литературы.

Апробация результатов исследования

Основные положения теоретических и экспериментальных исследований представлены и обсуждены на VI International scientific conference (Karlovy Vary — Russia, Moscow, 2019, December 24—25); IX Ежегодном международном партнеринг-форуме «Life Sciences Invest. Partnering Russia» (Санкт-Петербург 7— 8 ноября 2019 г.); III Сеченовском Международном Биомедицинском Саммите (SIBS, 2019) (Москва, 2019 г.); III Научной конференции BiotechClub (Москва,

ноябрь 2019 г.); XLIII Международной научно-практической конференции «WORLD SCIENCE: PROBLEMS AND INNOVATIONS», 2020 г.

Апробация диссертационной работы проведена на объединенном заседании кафедр фармацевтической технологии и фармакологии Института фармации им. А.П. Нелюбина ФГАОУ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет).

Личный вклад автора. Автором самостоятельно выбрана тема исследования, сформулированы цель и задачи данной работы; сформирован и реализован план проведения экспериментальных исследований; проведены обработка и анализ экспериментальных данных, на основании которых подготовлены научные публикации и доклады, разработана нормативная документация на ЛП, сформулированы общие выводы; осуществлено внедрение результатов исследований.

Внедрение результатов исследования

Осуществлен трансфер технологии ЛП «Тритикаин-альфа, твердые капсулы» на ООО «АЛЬФА-Т» по результатам технологического трансфера лабораторных разработок с утверждением проектов НД на ЛП (Акт внедрений 2019-1В от 15.11.2019). На основании Лицензионного договора от 26.12.2018 № 26/12.18 права на проведение исследований в целях коммерциализации кандидатного лекарственного средства тритикаин-альфа были предоставлены обществу с ограниченной ответственностью «Альфа-Тритикаин» (ОГРН: 5177746024100, ИНН: 9729150138) — резиденту Инновационного центра Сколково (ОРН участника 1122319).

Разработаны и внедрены учебные пособия: • кафедры фармакологии Института фармации им. А.П. Нелюбина ФГАОУ

ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский

Университет) (акт внедрения от 01.10.2019);

• кафедры биотехнологии Института трансляционной медицины и биотехнологии ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) (акт внедрения от 04.10.2019);

• Института молекулярной медицины ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет) (акт внедрения от 22.10.2019);

• кафедры фармацевтической технологии Института фармации им. А.П. Нелюбина ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) (акт внедрения от 20.11.2019). Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертационной работы соответствуют

специальности 14.04.01 «Технология получения лекарств».

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии темой государственного задания и планом научно-исследовательской работы ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), Государственным контрактом от 28.08.2015 № 14.N08.11.1037 в рамках ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу», грантом Российского научного фонда № 16-15-10410, грантом Фонда содействия инновациям (Соглашение от 21.03.2019 № 2851ГС1/45385), исследовательской работой общества с ограниченной ответственностью «Альфа-Тритикаин».

Публикации. По теме диссертации опубликованы две монографии, 15 научных работ, в том числе 2 патента на изобретения Российской Федерации; 2 заявки на международное изобретение; 10 статей — в изданиях, включенных в Перечень российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы научные результаты диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 338 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 67 таблицами и 53 рисунками. Список литературы включает 244 источника, в том числе 78 — на иностранных языках.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Концепция конструирования и разработки ЛП на основе рекомбинантного белка тритикаин-альфа

Разработка инновационных лекарственных средств — комплексный многостадийный процесс, который может начинаться как с открытия новых мишеней или более глубокого изучения патогенеза заболевания, так и с поиска или моделирования новых соединений, способных оказать фармакологически активное воздействие на уже известные механизмы. На этапе планирования исследований крайне важно учитывать все доступные знания о механизме возникновения и развития заболевания, симптоматике, существующих лекарственных препаратах и медицинских технологиях для патогенетической, симптоматической и этиотропной терапии, а также учитывать возможные нежелательные лекарственные реакции и ограничения у имеющихся и разрабатываемых в данный момент средств.

Классический процесс поиска новых фармакологически активных веществ и дальнейшего создания нового ЛП можно представить схематически как совокупность экспериментальных и теоретических процедур (Рисунок 1.1).

Данная схема представляет собой мультидисциплинарный процесс поиска и разработки ЛП и включает множество разноплановых задач, решаемых специалистами в различных областях науки и технологий. После выбора заболевания и возможных механизмов для фармакологического воздействия начинается процесс моделирования и синтеза или биотехнологического получения соединений-кандидатов с потенциальной активностью. Для их изучения разрабатываются новые или применяются существующие модели определения специфической активности. Как правило, сначала используют модели in vitro для предварительного скрининга и отбора наиболее перспективных молекул — лидеров, при необходимости проводится оптимизация структуры молекулы для повышения ее активности или снижения токсических свойств. Отобранные

соединения переходят на этап доклинических исследований специфической активности и безопасности соединения (в части общетоксического действия), при необходимости структура молекулы дорабатывается. В ходе изучения специфической активности выясняют степень воздействия в отношении целевого заболевания (мишени, патологического процесса), а также устанавливают и (или) подтверждают механизм действия лекарственного вещества (ЛВ). При проведении доклинических токсикологических исследований устанавливают характер и выраженность повреждающих действий на организм лабораторных животных, в том числе определяют переносимые и токсичные дозы ЛВ, смертельную дозу (ЛД50), выявляют подверженные наибольшему воздействию со стороны ЛВ органы и системы организма с детальной оценкой произошедших патологических процессов, а также изучают зависимость доза / токсический эффект. Изучение безопасности происходит в два этапа:

• исследование «острой токсичности» — однократное или дробное введение вещества (продолжительностью до 6 ч);

• исследование «хронической токсичности» — повторное или длительное введение ЛВ, сроки которого устанавливаются исходя из прогнозируемой длительности применения препарата в клинической практике [4; 18; 73]. Далее происходят отбор одной или нескольких молекул для наиболее

полного изучения и характеризации (осуществляется переход от наименования ЛВ к термину «активная фармацевтическая субстанция» (АФС; в контексте данной работы - фармацевтическая субстанция (ФС)) — веществу, предназначенному для производства ЛП и являющемуся его активным компонентом), выбор наиболее подходящей лекарственной формы и переход к этапу фармацевтической разработки (ФР) препарата. Для повышения эффективности и ускорения процесса ФР, а также снижения материальных и временных издержек на последующих этапах в сфере разработки лекарственных средств была внедрена концепция «качества, запланированного при разработке» (Quality-by-Design; далее — ОЬБ). Основной принцип QbD заключается в формировании требований к качеству ЛП

на стадии ФР с последующим строгим соответствием на стадии трансфера технологий, масштабирования и серийного производства.

Выбор заболевания

Рисунок 1.1 — Схема разработки инновационного лекарственного средства

Требования формируются в результате получения достоверных теоретических и экспериментальных данных, прошедших статистическую обработку и анализ. В результате обеспечивается организация серийного производства ЛП с надлежащим качеством, утвержденным при государственной

регистрации препарата. При этом на основе полученных данных происходит реализация задачи по снижению рисков для качества препарата и постоянному совершенствованию критериев приемлимости. С учетом приоритетного значения экспериментальных данных для реализации вышеуказанных задач план проведения исследований должен включать этап скрининга, этап определения параметров (количественной оценки эффектов переменных и возможностей их взаимного влияния и (или) взаимодействия) и разработку оптимальных методик для наиболее важных процессов. Ключевую роль в данной работе играют фиксация и анализ полученных экспериментальных данных, необходимых для осуществления контроля ЛП на все стадиях технологического процесса.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Тарасов Вадим Владимирович, 2021 год

Литература:

1. Smith P, Krohn R, Hermanson G, Mallia A, Gartner F, Provenzano M, et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 1985;150:76-85.

2. Walker J. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 1994;32:5-8.

3. Waterborg J, Matthews H. The lowry method for protein quantitation. Methods Mol Biol. 1984;1:1-3.

4. Olson B, Markwell J. Assays for determination of protein concentration. Curr Protoc Protein Sci. 2007;0:Unit 3.4.

5. Friedenauer S, Berlet H. Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents. Anal Biochem. 1989;178:263-8

6. Определение белка, ОФС, Взамен ст. ГФ XII, ч.1, ОФС 42-0053-07

Приложение 4 Министерство здравоохранения Российской Федерации

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ И.М.СЕЧЕНОВА

УТВЕРЖДАЮ

I I ср и и и ирорс ктор прорс ктор ЦО МШКЖЛШ'.ОННОИ политике и мсжя> народной дея цельности

» >У £31.10 Первый,МГМУ им. ИЛЬС.Г'мтмы Мин здрава России, д* И-. профсчсЛр

__ ЛЛ.Свисту нов

_:_-0' Г

МЕТОДИКА ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ ПО ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ

Москва 2015

Методика разработана:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова

Составители: Л.В. Савватеева, Е.Ю. Зерний

Методика разработана в рамках Государственного контракта № 14.N08.11.1037 от «28» августа 2015 г «Доклинические исследования лекарственного средства на основе рекомбинантного белка тритикаина-а для лечения целиакии» в рамках федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу».

Оглавление

1.0 НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДИКИ....................................................................................................................4

2.0 ТЕСТОВАЯ СИСТЕМА.............................................................................................................................4

3.0 ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................................................................................................4

4.0 ПРОЦЕДУРА ТЕСТИРОВАНИЯ...............................................................................................................5

4.1 Материалы........................................................................................................................................5

4.1.1 Оборудование...........................................................................................................................5

4.1.2 Химические вещества...............................................................................................................6

4.2 Подготовка растворов:.....................................................................................................................6

4.3 Описание эксперимента..................................................................................................................6

4.3.1 Подготовка тестируемого вещества........................................................................................6

4.3.2 Концентрации тестируемого вещества...................................................................................7

4.3.3 Общие требования к дизайну эксперимента..........................................................................7

4.4 Методика исследования..................................................................................................................7

4.4.1 Характеристика метода.............................................................................................................7

4.3.2 Подготовка к анализу................................................................................................................7

4.3.2 Проведение анализа...............................................................................................................10

5.0 ДАННЫЕ И ИХ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ................................................Ошибка! Закладка не определена.

6.0 ВЫВОДЫ..............................................................................................................................................12

1.0 НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДИКИ

Настоящая методика предназначена для изучения удельной протеолитической активности лекарственных средств для ферментативной заместительной терапии целиакии. В частности, для изучения удельной протеолитической активности фармацевтической субстанции на основе рекомбинантного белка тритикаина-альфа. Механизм его действия заключается в способности гидролизовать синтетический модельный пептидный субстрат, конъюгированный с 7-Амино-4-метилкумарином (АМК), с определением продуктов гидролиза по интенсивности флуоресценции свободного АМК.

Данные об удельной протеолитической активности тестируемого вещества характеризуются количественно.

2.0 ТЕСТОВАЯ СИСТЕМА

Тестовая система основана на реакции гидролиза фармацевтической субстанцией на основе рекомбинантного белка тритикаина-альфа синтетического модельного пептидного субстрата, конъюгированного с 7-Амино-4-метилкумарином (АМК), представленного пептидом валин-лейцин-пролин-глутамин-АМК (УЬРО-АМК), который, по предварительным данным, обладает структурой, являющейся оптимальной для связывания и гидролиза тритикаином-альфа. Продукт реакции гидролиза (свободный АМК) подлежит количественной регистрации. Удельная протеолитическая активность тестируемого лекарственного средства оценивается по его способности гидролизовать модельный пептидный субстрат, конъюгированный с 7-Амино-4-метилкумарином (АМК).

3.0 ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сделать заключение о наличии у тестируемого лекарственного средства протеолитической активности, позволяющей прогнозировать его специфическую фармакологическую активность и эффективность при лечении целиакии. Для этого необходимо определить количественное значение удельной протеолитической активности тестируемого лекарственного средства. Удельная протеолитическая активность

тестируемого лекарственного средства оценивается по его способности гидролизовать синтетический модельный пептидный субстрат, конъюгированного с 7-Амино-4-метилкумарином (АМК), c определением продуктов гидролиза по интенсивности флуоресценции свободного AMK.

Данная методика предназначена для выявления способности фармакологических субстанций гидролизовать синтетический модельный пептидный субстрат, конъюгированный с 7-Амино-4-метилкумарином (АМК).

Показателем протеолитической активности фармакологической субстанции является удельная активность тритикаина-альфа в результате реакции гидролиза модельного пептидного субстрата, конъюгированного с 7-Амино-4-метилкумарином (АМК), а именно, пептида валин-лейцин-пролин-глутамин-АМК (VLPQ-AMK).

4.0 ПРОЦЕДУРА ТЕСТИРОВАНИЯ

Все работы проводятся по правилам лабораторной практики, утвержденным федеральным органом исполнительной власти, в компетенцию которого входит осуществление функций по выработке государственной политики и нормативно-правовому регулированию в сфере обращения лекарственных средств. (ФЗ от 8 ноября 2013 г. N 2067).

Все методы и процедуры должны быть отмечены в лабораторном журнале; лабораторные процедуры должны проводиться в равных условиях (например, при подготовке среды, тестируемого вещества, при эксплуатации инкубатора); и сохранены в электронном и бумажном форматах; все данные должны архивироваться.

4.1 Материалы 4.1.1 Оборудование

- Спектрофотометр любого типа, который обеспечивает измерение оптической плотности растворов при длине световой волны, равной 342 нм и 562 нм, с погрешностью измерения не более 1%;

- весы лабораторные высокого класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г с пределом допускаемой погрешности ±0,1 мг,

- многорежимный автоматический спектрофлуориметр с возможностью измерения флуоресценции в одиночных пробирках или спектрофлуориметр любого другого типа, которые обеспечивают измерение интенсивности флуоресценции анализируемых растворов при длине волны возбуждения флуоресценции, равной 360 нм,

и длине волны испускания флуоресценции, равной 460 нм, с погрешностью измерения не более 1%,

- рН-метр любого типа для измерения рН в диапазоне от 0 до 14 с пределом допускаемой погрешности ±0,1 единицы рН,

- ультратермостат с точностью регулирования температуры ±1°С,

- встряхиватель типа Вортекс или аналогичный для перемешивания жидкостей,

- пипетки автоматические переменного объема с наконечниками,

- пластиковые пробирки,

- мерные цилиндры,

- персональный компьютер с установленными программами для анализа экспериментальных данных.

4.1.2 Химические вещества

Примечание: все реактивы, используемые для измерений, должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х.ч.) или 3 (ч.д.а.).

- 7-Амино-4-метилкумарин (АМК),

- синтезированный пептид с последовательностью валин-лейцин-пролин-глутамин, конъюгированный с АМК (VLPQ-АМК),

- диметилсульфоксид,

- натрия ацетат,

- кислота уксусная ледяная,

- натрия хлорид.

4.2 Подготовка растворов:

Примечание: этот протокол основан на использовании 0,2 М натрий-ацетатного буфера с pH 4.6, содержащем 100 мM №0.

Все методы и процедуры, должны быть в соответствующем порядке зафиксированы в лабораторном журнале.

Готовые к применению буферные растворы должны храниться при температуре 2-8°С не более четырех недель. Готовые к применению рабочие растворы (белка и субстрата) должны храниться при температуре -30°С не более четырех недель.

4.3 Описание эксперимента

4.3.1 Подготовка тестируемого вещества

Подготовка исследуемой фармацевтической субстанции проводится в соответствии с рекомендациями разработчика.

6

4.3.2 Концентрации тестируемого вещества

Для исследования используется рекомендованная разработчиком концентрация фармацевтической субстанции.

4.3.3 Общие требования к дизайну эксперимента

Для воспроизведения данной методики должно быть выполнено не менее 2 независимых экспериментов, каждый - в 3х повторностях. Активность фармацевтической субстанции определятся по значению удельной активности фермента в результате гидролиза модельного флуоресцентного субстрата.

4.4 Методика исследования

(подготовлена на основе ГОСТ 20264.2-88 Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности (с Изменением N 1) и ГОСТ Р 53974-2010 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения протеолитической активности). Нормативные ссылки:

- ГОСТ 20264.2-88 Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности (с Изменением N 1);

- ГОСТ Р 53974-2010 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения протеолитической активности);

- ГОСТ Р ИСО 5725-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Ч. 1-6;

- ГОСТ Р 50779.21-2004. Статистические методы. Правила определения и методы расчета статистических характеристик по выборочным данным;

- Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств /Под ред. Н.В. Юргеля, А.Л. Младенцева, А.В. Бурдейна и др. Разработчики: В.Л. Багирова, А.И. Гризодуб, Т.Х. Чибиляев и др. - М., 2007. - 48 с;

- Валидация аналитических методик для производителей лекарств/ Под ред. В.В. Береговых, пер. Ж.И. Аладышевой, О.Р. Спицкого. -М., "Литтерра", 2008. - 132 с.

4.4.1. Характеристика метода

Качество получаемых образцов субстанции тритикаин-альфа/рекомбинантного белка тритикаина-альфа контролируется путем измерения удельной протеолитической активности фермента. Метод определения протеолитической активности тритикаина-альфа основан на гидролизе исследуемым ферментным препаратом, находящимся в растворе, модельного пептидного субстрата, конъюгированного с 7-Амино-4-

7

метилкумарином (АМК), c определением продуктов гидролиза по интенсивности флуоресценции свободного AMK. В качестве модельного субстрата используется пептид валин-лейцин-пролин-глутамин-АМК (VLPQ-AMK), который, по предварительным данным, обладает структурой, являющейся оптимальной для связывания и гидролиза тритикаином-альфа. За единицу общей протеолитической активности (ПА) принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 25°С гидролизует VLPQ-AMK в количестве, соответствующем 1 мкмоль свободного АМК (1 мкмоль AMK равен 0,17519 мг); удельная протеолитическая активность (ПАуд.) выражается в ед.ПА/мг испытуемого препарата. Количество гидролизованного субстрата VLPQ-AMK определяют по интенсивности флуоресценции свободного AMK на спектрофлуориметре при длине волны возбуждения флуоресценции, равной 360 нм, и длине волны испускания флуоресценции, равной 460 нм. Определение протеолитической активности тритикаина-альфа осуществляют при 25оС и при значении рН реакционной смеси 4,6, т.е. при соблюдении условий, оптимальных для действия фермента [Savvateeva et al., Int J Biochem Cell Biol. 2015;62:115-24].

4.4.2 Подготовка к анализу

Примечание: все эксперименты по определению протеолитической активности рекомбинантного тритикаина-альфа проводятся в 0,2 M натрий-ацетатном буфере, pH 4.6, содержащем 100 hM NaCl (буфер А).

Приготовление буфера A Раствор 0,2 М уксусной кислоты объемом 51 мл помещают в мерный цилиндр вместимостью 100 мл и добавляют 0,2 М раствор уксуснокислого натрия объемом 49 мл, тщательно перемешивают. Навеску 0,0585 г натрия хлорида растворяют в полученном 0,2 M натрий-ацетатном буферном растворе, рН 4,6 до конечного объема 10 мл и тщательно перемешивают.

Приготовление градуировочого раствора AMK В пробирку вместимостью 1,7 мл помещают навеску чистого AMK (молекулярная масса 175,19 г/моль) массой 6±0,1 мг, растворяют в 342 мкл 100% диметилсульфоксида (ДМСО) и тщательно перемешивают. Аликвоты раствора равного объема разводят в 3200, 6400 или 12800 раз буфером А и измеряют поглощение при 342 нм. Концентрацию AMK в исходном растворе рассчитывают как среднее арифметическое полученных значений поглощения, с учетом коэффициента разведения и коэффициента молярного поглощения АМК, равного 16000 cm-1M-1.

Измерение интенсивности флуоресценции АМК

Рабочие пробы AMK объемом 100 мкл c концентрациями 1, 3 и 5 мкмоль/л готовят на основе полученного градуировочного раствора с помощью его разбавления буфером А с доведением концентрации ДМСО до 0,5%. Концентрацию AMK в полученных пробах верифицируют по поглощению при 342 нм. Интенсивность флуоресценции AMK в полученных пробах измеряют в пластиковых пробирках объемом 0,5 мл с использованием многорежимного автоматического спектрофлуориметра при длине волны возбуждения флуоресценции, равной 360 нм, и длине волны испускания флуоресценции, равной 460. 4.4. Определение уравнения зависимости флуоресценции от количества вещества АМК По результатам измерения флуоресценции рабочих проб АМК (п. 3.3.) строят градуировочный график зависимости интенсивности флуоресценции от количества вещества AMK в этих пробах. Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднеарифметическое значение флуоресценции для трех параллельных измерений. На основе полученного градуировочного графика с использованием метода линейной регрессии определяют уравнение зависимости интенсивности флуоресценции от количества вещества (моль) свободного AMK. Указанную зависимость необходимо рассчитывать для каждой новой партии приготовленного AMK и при смене прибора.

Приготовление основного раствора модельного субстрата VLPQ-AMK В пробирку вместимостью 1,7 мл помещают навеску VLPQ-AMK массой 1,7±0,1 мг и растворяют в 25 мкл 100% ДМСО. Аликвоты раствора равного объема разводят в 1600, 3200 или 6400 раз буфером А и измеряют поглощение при 342 нм. Концентрацию VLPQ-AMK в полученном растворе рассчитывают как среднее арифметическое полученных значений поглощения, с учетом коэффициента разведения и коэффициента молярного поглощения АМК, равного 16000 cm-1M-1. Приготовленный раствор VLPQ-AMK разделяют на аликвоты и хранят при -20°С в течение четырех недель.

Приготовление основного раствора анализируемого образца рекомбинантного

тритикаина-альфа

В тару для взвешивания помещают сухой анализируемый образец ферментного препарата массой 10±0,1 мг и суспендируют в небольшом количестве буфера А, содержащего 0,5% ДМСО. Суспензию количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем до метки буфером А, содержащим 0,5% ДМСО, при температуре 20°С и тщательно перемешивают. Концентрацию тритикаина-альфа в полученном растворе верифицируют по поглощению при 562 нм с помощью набора BCA (BCA-1 Sigma) аликвоты раствора, разведенной в 2 раза буфером А, содержащим 0,5% ДМСО. Приготовленный раствор ферментного препарата разделяют на аликвоты и хранят при -20°С в течение четырех недель.

4.4.3 Проведение анализа

Приготовление рабочих проб для анализа образцарекомбинантного тритикаина-альфа Рабочий раствор анализируемого образца ферментного препарата готовят из основного раствора путем его разведения в буфере А, содержащем 0,5% ДМСО. Количество фермента, взятого на анализ, должно быть рассчитано так, чтобы в реакционной смеси присутствовал избыток субстрата. Рабочий раствор модельного субстрата VLPQ-AMK готовят из основного раствора путем его разведения в буфере А с доведением концентрации ДМСО до 0,5%. Состав рабочих проб объемом 100 мкл рассчитывается таким образом, чтобы конечная концентрация VLPQ-AMK составляла 50 мкмоль/л, поскольку указанная концентрация близка к значению константы Михаэлиса, определенной для данного субстрата, и, как следствие, является оптимальной. Свободный объем пробы заполняют буфером А, содержащим 0,5% ДМСО. Каждое разведение испытуемого раствора анализируют в двух повторностях. Для испытания берут две параллельные навески ферментного препарата. Рабочий раствор ферментного препарата готовят непосредственно перед определением.

Проведение испытания образца рекомбинантного тритикаина-альфа Протеолитическую активность исследуемого образца тритикаина-альфа вычисляют по количеству вещества АМК, который высвобождается в процессе гидролиза модельного субстрата, катализируемого этим ферментом. В две опытные пробирки, объемом 0,5 мл, вносят рассчитанные объемы рабочего раствора рекомбинантного тритикаин-альфа и буфера А, содержащего 0,5 % ДМСО, помещают их в ультратермостат при температуре 25,0±1,0°С и выдерживают в течение 5 мин. Пробирки помещают в адаптер спектрофлуориметра и добавляют рассчитанные объемы рабочего раствора субстрата VLPQ-AMK, предварительно термостатированного при температуре 25,0±1,0°С в течение 3-4 мин. Пробы перемешивают в течение 20 с, и немедленно измеряют накопление продукта гидролиза по флуоресценции высвобождающегося АМК (длина волны возбуждения флуоресценции равна 360 нм, длина волны испускания флуоресценции - 460 нм) в течение 200 с с частотой измерений, равной 1 раз/10 сек (120 измерений).

5.0 ДАННЫЕ И ИХ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ

Удельную протеолитическую активность, ед. ПА/мг испытуемого препарата (ПАуд.),

определяют следующим образом. На основании результатов проведенных измерений с

использованием уравнения (следует из п. 4.4) рассчитывают количество вещества

продукта реакции протеолиза модельного субстрата VLPQ-AMK тритикаином-альфа и

строят график зависимости накопления этого продукта (выраженного в мкмоль) от

10

времени гидролиза (мин). Проводят линейную регрессию полученных данных и из уравнения линейной регрессии у = Ьх + а находят коэффициент Ь, численно равный активности исследуемого препарата, выраженной в ед. ПА (мкмоль субстрата/мин). Удельную протеолитическую активность конкретных образцов рекомбинантного тритикаин-альфа в ед. ПА/мг испытуемого препарата (мкмоль субстрата (мкмоль свободного АМК)/мин/мг) определяют путем деления полученной величины на массу образца в пробе, выраженную в мг. За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости.

Границы относительной погрешности = ±7% (соответствуют значению относительной расширенной неопределенности и0,95 при коэффициенте охвата к = 2). Результат анализа представляют в виде: Х±Д при Р=0,95,

где X. - среднеарифметическое значение двух параллельных измерений, признанных приемлемыми, ед. ПА/мг;

Д - границы абсолютной погрешности измерений, ед. ПА/мг, вычисляют по формуле: Д= Х*6*0,01 или Д= 0,07*Х.

Наименьшие разряды числовых значений результата измерения и числовых показателей точности должны быть одинаковы. Значащих цифр числовых показателей точности измерений должно быть не более двух.

Сходимость, воспроизводимость и правильность результатов Сходимость измерений является приемлемой, если относительное стандартное отклонение измерения активности тритикаина-альфа в одном опыте не превышает 5 %.

Результаты измерений, полученные в условиях воспроизводимости, признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости:

СБ0,95 < ЯМБ = ( | Худ.3- Худ.4 I / Худ)*100, где ЯМБ - относительное среднее отклонение удельной активности тритикаина-альфа; Худ.з и Худ4 - результаты двух определений удельной актиности рекомбинантного тритикаина-альфа, полученные в условиях воспроизводимости, ед. ПА/мг испытуемого препарата;

Худ. - среднеарифметическое значение определений удельной активности рекомбинантного тритикаина-альфа, выполненных в разное время в условиях воспроизводимости, ед. ПА/мг испытуемого препарата; 100 - коэффициент для пересчета в проценты;

СБ0,95 - критическая разность при доверительной вероятности 0,95, равная 21%.

11

Правильность метода определяют по степени соответствия результатов определения удельной активности тритикаина-альфа при каждом отдельном разведении их среднему значению. Рассчитывают значение относительной ошибки измерений (5, %) в сравнении со средней величиной ^ср.) по формуле:

5 (%) = (KX-Хср.) ^ср.) 100, где Х - значение измеренной удельной активности в пробах (ед. ПА/мг); Xср. - средняя удельная активность (ед. ПА/мг).

Результаты вносятся в соответствующие таблицы (см. протокол валидации).

6.0 ВЫВОДЫ

Тестируемое лекарственное средство признаётся обладающим ферментативной активностью, если при реакции гидролиза субстрата можно рассчитать удельную протеолитическую активность (ПАуд, мкмоль субстрата (мкмоль свободного АМК)/мин/мг), равную или большую значению ПАуд, определенную для модельного субстрата VLPQ.

Приложение 5 Министерство здравоохранения Российской Федерации

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ И.М.СЕЧЕНОВА

УТВЕРЖДАЮ

Первый проректор - прорек/ор по инновационной политике и межлуцу^лнил депсльиости ГБОУ ВПО Псрныи МГМУ им. И.М Ссчсн<»ки Мин 1рава России, д.ц,м профессор

__'АА.Свистунов

л_1_•_2015г.

МЕТОДИКА ИДЕНТИФИКАЦИИ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ

С ПОМОЩЬЮ ВЭЖХ

Москва 2015

Методика разработана:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова

Составители: Л.В. Савватеева, Е.Ю. Зерний

Методика разработана в рамках Государственного контракта № 14.N08.11.1037 от «28» августа 2015 г «Доклинические исследования лекарственного средства на основе рекомбинантного белка тритикаина-а для лечения целиакии» в рамках федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу».

Оглавление

1.0 НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДИКИ....................................................................................................................4

2.0 ТЕСТОВАЯ СИСТЕМА.............................................................................................................................4

3.0 ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................................................................................................4

4.0 ПРОЦЕДУРА ТЕСТИРОВАНИЯ...............................................................................................................4

4.2 Подготовка растворов:.....................................................................................................................5

4.3 Проведение анализа........................................................................................................................6

5.0 ВЫВОДЫ................................................................................................................................................6

1.0 НАЗНАЧЕНИЕ МЕТОДИКИ

Настоящая методика на основе метод ВЭЖХ на обращённой фазе С18 предназначена для идентификации фармацевтического препарата «субстанция Тритикаин-альфа». Данная методика применяется для качественного анализа.

2.0 ТЕСТОВАЯ СИСТЕМА

Тестовая система основана на определении продуктов частичного автопротеолиза тритикаина-альфа, в ходе которого образуются фрагменты со временем удерживания, которое очень характерно для данной субстанции. Сравнение хроматограмм, полученных с помощью метода ВЭЖХ, позволяет применить этот метод для идентификации подлинности белка тритикаин-альфа в субстанции.

3.0 ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сделать заключение о подлинности тестируемой партии «субстанции Тритикаин-альфа».

4.0 ПРОЦЕДУРА ТЕСТИРОВАНИЯ

Все работы проводятся по правилам лабораторной практики, утвержденным федеральным органом исполнительной власти, в компетенцию которого входит осуществление функций по выработке государственной политики и нормативно-правовому регулированию в сфере обращения лекарственных средств. (ФЗ от 8 ноября 2013 г. N 2067).

Все методы и процедуры должны быть отмечены в лабораторном журнале; лабораторные процедуры должны проводиться в равных условиях (например, при подготовке среды, тестируемого вещества, при эксплуатации инкубатора); и сохранены в электронном и бумажном форматах; все данные должны архивироваться.

4.1 Материалы

4.1.1 Оборудование

- жидкостной хроматограф Breeze (детектор Waters 2487, длина волны 280нм). (Waters, США). Система 0,1%ТФУ-ацетонитрил, градиент от 0 до 60% ацетонитрила за 15 минут, скорость протока 1 мл/мин. Петля инжектора 200мкл.

- колонка Symmetry 300C18 (3,9х150mm) (Waters, США, серийный номер: T22941A05).

- настольная мини-центрифуга Eppendorf, имеющая скорость 13400 об/мин ( Eppendorf, Германия, серийный номер: 5452 06034).

- персональный компьютер.

- пипетки автоматические переменного объема с наконечниками,

- пластиковые пробирки,

- мерные цилиндры,

- шприц для хроматографии,

- персональный компьютер с установленными программами для анализа экспериментальных данных.

4.1.2 Химические вещества

- партии лифилизовоанного фармацевтического препарата «Субстанция тритикаин-альфа»,

- деионизированная вода,

- ацетонитрил,

- трифторуксусная кислота.

4.2 Подготовка растворов:

4.2.1. Приготовление фазы А: В чистую стеклянную бутыль объёмом 1л добавить 1л деионизованной воды , 1 мл трифторуксусной кислоты из ампулы (категория чистоты «для хроматографии») и перемешать. Фаза А может храниться при комнатной температуре не менее 30 дней. Фаза Б представляет собой ацетонитрил с категорией чистоты «для хроматографии».

4.2.2. Приготовление рабочей пробы фармацевтического препарата «Субстанция тритикаин-альфа» для анализа: К 1 мг партии лиофилизированного фармацевтического препарата «Субстанция тритикаин-альфа» добавить 2 мл воды, раствор поместить в пластиковую пробирку объёмом 2мл и центрифугировать на центрифуге Eppendorf при максимальной скорости 5 мин. Надосадочную жидкость отобрать и анализировать ВЭЖХ.

4.3 Проведение анализа

В петлю хроматографа Breeze ввести 200 мкл рабочей пробы испытуемого раствора фармацевтического препарата «Субстанция тритикаин-альфа». Детектор хроматографа установить на 280 нм, скорость протока 1 мл/мин. Включить градиентный режим: фаза А - 100% - 1 мин; градиент от 0% фазы Б до 60% фазы Б за 15 мин; 60% фазы Б - 1 мин; градиент от 60% до 0% фазы Б за 1 мин. Данные анализа обсчитывать с помощью встроенной программы. На основании данных таблицы рассчитать усреднённое время удерживания Тср для каждого пика и сумму площадей пиков Sni для каждой группы пиков в каждом опыте:

Sn(a-d) =сумма Sni для 1-й группы пиков и

Sn(e-g) =сумма Sni для 1-й группы пиков? где i - пик (a-d в 1-й группе и e-g во 2-й группе)

Т1(ср)=сумма Tn(a-g)/m,

где n - номер опыта,

m - число используемых значений времени удерживания в расчёте для каждого опыта (здесь от 2-х до 7).

5.0 ВЫВОДЫ

Тестируемое лекарственное средство признаётся подлинным при соблюдении следующих условий:

- сумма площадей 1-й группы пиков Sn(a-d) (время удерживания 11,66-12,22 мин) при анализе ВЭЖХ не должна превышать 10,5%; В этой группе должны присутствовать пики с усреднённым временем удерживания: 11,709; 11,856; 11,990; 12,156.

- сумма площадей 2-й группы пиков Sn(e-g) (13,31-13,79 мин) должна находиться в диапазоне 75-96%. В этой группе должны присутствовать пики с усреднённым временем удерживания: 13,338; 13,550; 13,749.

При соблюдении этих условий партия препарата «Субстанция тритикаин-альфа» считается подлинной.

ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России

Протокол валндации флуоресцентного метода определения удельной активности препарата «Субстанция тритикаин-альфа» Стр. 1 из 15

Дата составления: 22.10.15 ПВ - 003 Копия №

ПРОТОКОЛ ВАЛИДАЦИИ

Флуоресцентного метода определения удельной активности препарата «Субстанция тритикаин-альфа» ПВ-003

Составил Утвердил

С.н.с. НИИ молекулярной медицины Директор НИИ молекулярной медицины

Л В. Савватеева A.A. Замятнин

Подпись: А Подпись:

Дата: Z . г С\ ! С Дата: /С. /1,

Протокол валидации флуоресцентного метода Стр. 2

определения удельной активности препарата ПВ - 003 ИЗ 13

«Субстанция тритикамн-альфа»

I. Цель

1.1. Дать оценку соответствия валидируемых параметров установленным критериям приемлемости.

1.2. Подтвердить обоснованность выбора метода определения протеолитической активности тритикаина-альфа по флуоресценции продуктов гидролиза модельного пепетидного субстрата валин-лейцин-пролин-глутамин, конъюгированного с 7-Амино-4-метилкумарином (УЬР()-АМК) для количественного определения тритикаина-альфа в растворах рекомбинантного белка тритикаина-альфа как основного компонента лекарственного средства для лечения целиакии и соответствия данного метода предназначенным целям.

2. Содержание

1. Цель

2. Содержание

3. Ответственность

4. Используемая литература.

5. Оборудование

6. Материалы, реагенты и стандарты

7. Описание метода

8. Вспомогательные процедуры

9. Методология валидации

10. Процедура валидации

11. Выводы

12. Критерии ре валидации

13. Утверждение отчета.

3. Ответственность

Должность Ф.И.О. Ответственность Дата Подпись

С.н.с. Савватеева Л. В. Взвешивание образцов. Приготовление растворов. 22.10.2015 ./ > "

С н.с. Савватеева Л. В Оператор флуориметра 22.10.2015

В.н.с. Зерний Е.Ю. Обработка данных, написание протокола валидации 22.10.2015 Ж/.

4. Используемая литература

- ГОСТ 20264.2-88 Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности (с Изменением N I);

- ГОСТ Р 53974-2010 Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения протеолитической активности);

- ГОСТ Р ИСО 5725-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Ч. 1-6;

- ГОСТ Р 50779.21-2004. Статистические методы. Правила определения и методы расчета статистических характеристик по выборочным данным;

Протокол валидации флуоресцентного метода Стр. 3

определения удельной активности препарата ПВ - 003 из 15

«Субстанция тритикаин-альфа»

- Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств /Под ред. Н.В. Юргеля, А.Л. Младенцева, А.В. Бурдейна и др. Разработчики: В.Л. Багирова, А.И. Гризодуб, Т.Х. Чибиляев и др. - М., 2007. - 48 с;

- Валидация аналитических методик для производителей лекарств/ Под ред. В.В. Береговых, пер. Ж.И. Аладышевой, О.Р. Спицкого. -М., "Литтерра", 2008. - 132 с.

5. Оборудование

5.1. Многорежимный автоматический спектрофлуориметр с возможностью измерения флуоресценции в одиночных пробирках GloMax-Multi Jr в комплекте с GloMax-Multi Jr PCR Tube Adapter (Promega, S/N 518580648)

5.2. Весы аналитические электронные AX205 Delta Range (Mettler Toledo, SNR 1120481962)

5.3. Спектрофотометр SmartSpec 3000 (Bio-Rad, Serial No 269BR04664)

5.4. рН-метр MP 220 ( Mettler Toledo,Serial No 204419M)

5.5. Ультратермостат Гном (ДНК-Технология, ТУ 9452-003-46482062-2002)

5.6. Встряхиватель типа Вортекс Biosan SIA (No. 010201-1311-1015)

5.4. Персональный компьютер с установленной программой Sigma Plot (версия 7.0), Microsoft Excel (версия 2007).

6. Материалы, реагенты и стандарты

Партия лиофилизованного фармацевтического

препарата «Субстанция тритикаин-альфа») Ttc#338

7-Амино-4-метилкумарин (АМК)

(C10H9NO2, CAS: 26093-31-2): (Purity TLC>99.7%, Sigma-

Aldrich)

Пептид валин-лейцин-пролин-глутамин,

конъюгированный с АМК (VLPQ-АМК): #50272202 (Purity 95%, LifeTein LLC)

Вода (H2O, CAS 7732-18-5): Millipore Direct-Q PLUS (R>18,2 MОм•cм)

Диметилсульфоксид ((CHs)2SO, CAS: 67-68-5): Hybri-Max™ (>99.7%, Sigma-Aldrich)

Натрия ацетат (C2№O2Na, CAS: 127-09-3): ACS reagent (>99.0%, Sigma-

Aldrich)

Кислота уксусная ледяная (С2Н4О2, CAS: 64-19-7): ACS reagent (>99.0%, Sigma-Aldrich)

Натрия хлорид (NaCl, CAS: 7647-14-5): ACS reagent (>99.0%, Sigma-Aldrich)

Мерные цилиндры (10, 100 мл): ГОСТ 1770-74

Автоматические пипетки одноканальные переменного объема:

(0,5-10 мкл) EN ISO 8655 (Eppendorf Varipette)

(2-20, 10-100, 100-1000 мкл): EN ISO 8655 (Eppendorf Research)

Пластиковые пробирки (0,5 и 1,7 мл) Eppendorf Quality (Eppendorf)

7. Описание метода

7.1. Подготовительные процедуры

7.1.1. Приготовление 0,2 M натрий-ацетатного буфера, pH 4.6 (согласно ГОСТ 4919.2-77), содержащего 100 мМ хлорид натрия (буфера A):

Протокол валидации флуоресцентного метода Стр. 4

определения удельной активности препарата ПВ - 003 из 15

«Субстанция тритикаин-альфа»

Приготовить 0,2 М уксусную кислоту путем разведения водой 1,15 мл ледяной уксусной кислоты до конечного объема 100 мл и 0,2 М раствор уксуснокислого натрия путем растворения навески ацетата натрия массой 1,64 г в 100 мл воды. Раствор 0,2 М уксусной кислоты объемом 51 мл помещают в мерный цилиндр вместимостью 100 мл и добавляют 0,2 М раствор уксуснокислого натрия объемом 49 мл, тщательно перемешивают. Навеску 0.0585 г натрия хлорида растворяют в полученном 0,2 M натрий-ацетатном буферном растворе, рН 4.6 до конечного объема 10 мл и тщательно перемешивают.

7.1.2. Приготовление градуировочого раствора AMK

В пластиковую пробирку вместимостью 1,7 мл поместить навеску чистого AMK массой 6 мг и растворить в 342 мкл 100% ДМСО. Аликвоту полученного раствора развести в 3200, 6400 или 12800 раз буфером А, доводя концентрацию ДМСО до 0,5 %, и измерить оптическую плотность полученных растворов на спектрофотометре SmartSpec 3000 (Bio-Rad, Serial No 269BR04664) при длине волны 342 нм. Рассчитать концентрацию AMK в полученном растворе как среднее арифметическое полученных значений с учетом соответствующего коэффициента разведения и коэффициента молярного поглощения АМК, равного 16000 cm-1M-1.

7.1.3. Приготовление рабочих проб АМК и измерение интенсивности флуоресценции

Градуировочный раствор AMK объемом 10 мкл поместить в пластиковую пробирку вместимостью 1,7 мл, развести в 10000 раз буфером А и довести концентрацию ДМСО до 0,5%. В пластиковые пробирки объемом 0,5 мл поместить объемы разведенного градуировочного раствора АМК и буфера А, содержащего 0,5% ДМСО, рассчитанные для получения конечных концентраций АМК, равных 1, 3 и 5 мкмоль/л. Измерить оптическую плотность полученных растворов на спектрофотометре SmartSpec 3000 (Bio-Rad, Serial No 269BR04664) при длине волны 342 нм и рассчитать концентрацию AMK в полученных растворах с использованием коэффициента молярного поглощения АМК, равного 16000 cm-1M-1. Измерить интенсивность флуоресценции AMK в полученных пробах с использованием многорежимного автоматического спектрофлуориметра GloMax-Multi Jr (Promega, S/N 518580648) при длине волны возбуждения флуоресценции, равной 360 нм, и длине волны испускания флуоресценции, равной 460.

7.1.4. Определение уравнения зависимости флуоресценции от количества вещества АМК

Построить градуировочный график зависимости интенсивности флуоресценции от количества вещества AMK в пробах. Для построения каждой точки градуировочного графика использовать среднеарифметическое значение флуоресценции для трех параллельных измерений. На основе полученного градуировочного графика с использованием метода линейной регрессии определить значения коэффициентов а и b в уравнении:

IF460AMK = а + b* Vamk (1),

где IF460AMK - интенсивность флуоресценции свободного AMK; V amk - количество вещества (моль) свободного AMK.

7.1.5. Приготовление основного раствора модельного субстрата VLPQ-AMK

Протокол валидации флуоресцентного метода Стр. 5

определения удельной активности препарата ПВ - 003 из 15

«Субстанция тритикаин-альфа»

В пробирку вместимостью 1,7 мл поместить навеску VLPQ-AMK массой 1,7 мг и растворить в 25 мкл 100% ДМСО. Аликвоты полученного раствора равного объема развести в 1600, 3200 или 6400 раз буфером А, довести концентрацию ДМСО до 0,5% и измерить оптическую плотность полученных проб при длине волны 342 нм с использованием спектрофотометра SmartSpec 3000 (Bio-Rad, Serial No 269BR04664). Рассчитать концентрацию VLPQ-AMK в полученном растворе как среднее арифметическое полученных значений с учетом соответствующего коэффициента разведения и коэффициента молярного поглощения АМК, равного 16000 cm-1*M-1.

7.1.6. Приготовление основного раствора анализируемого образца рекомбинантного белка тритикаин-альфа (Ttc#338)

Точную навеску сухого анализируемого образца Ttc#338 массой 30 мг поместить в стакан для взвешивания и суспендировать в небольшом количестве буфера А, содержащего 0,5% ДМСО. Суспензию количественно перенести в мерную колбу вместимостью 100 мл, довести объем до метки буфером А, содержащим 0,5% ДМСО при температуре 20°С и тщательно перемешать. Аликвоты раствора равного объема развести в 2 раза буфером А, содержащим 0,5% ДМСО, и измерить концентрацию полученных проб при 562 нм c помощью набора BCA (BCA-1 Sigma), используя спектрофотометр SmartSpec 3000 (Bio-Rad, Serial No 269BR04664), учитывая соответствующий коэффициент разведения.

7.1.7. Приготовление рабочих проб для анализа образца Ttc#338 (приведенные далее объемы рабочих проб рассчитаны, исходя из концентрации раствора Ttc#338, равной 0,8 мкмоль/л и концентрации раствора субстрата VLPQ-AMK, равной 275 мкмоль/л, полученных из основных растворов (п.п. 7.1.5., 7.1.6.) путем разведения буфером А с доведением объемной доли ДМСО до 0,5%).

В две опытные пробирки объемом 0,5 мл поместить 60 мкл раствора анализируемого образца Ttc#338 и 20 мкл буфера А, содержащего 0,5% ДМСО. Пробирки поместить в ультратермостат Гном (ДНК-Технология, ТУ 9452-003-46482062-2002) и выдержать при температуре 25,0±1,0°С в течение 5 мин. Непосредственно перед измерением флуоресценции добавить в пробу 20 мкл раствора субстрата VLPQ-AMK, термостатированного при температуре 25,0±1,0°С в течение 3-4 мин, после чего пробу тщательно перемешать в течение 20 сек.

7.2. Проведение испытания

Немедленно после приготовления рабочих проб (раздел 7.1.7) измерить интенсивность флуоресценции свободного АМК, накапливающегося в реакционной смеси, в следующих условиях:

- прибор: Многорежимный автоматический

спектрофлуориметр GloMax-Multi Jr (Promega, S/N 518580648) с возможностью измерения флуоресценции в одиночных пробирках

- длина волны возбуждения флуоресценции: 360 нм

- длина волны испускания флуоресценции: 460 нм

- температура: 25оС

- количество измерений: 120

Протокол валидации флуоресцентного метода Стр. 6

определения удельной активности препарата ПВ - 003 из 15

«Субстанция тритикаин-альфа»

- частота регистрации измерений: 1/10 сек

7.3. Расчет активности тритикаина-альфа в испытуемом препарате

7.3.1. Рассчитать количество вещества продукта реакции протеолиза модельного субстрата VLPQ-AMK ферментом ТХс#338 по формуле:

VVLPQ-AMK = (^460 - а)/Ь (2),

где V VLPQ-AMK - количество вещества продукта гидролиза модельного субстрата VLPQ-АМК, моль;

Ш460™-амк - измеренные значения интенсивности флуоресценции свободного АМК, образующегося в результате гидролиза VLPQ-AMK; а и Ь - численные коэффициенты из уравнения (1), раздел 7.1.3.

7.3.2. Построить график зависимости VVLPQ-AMK (моль) от времени гидролиза X (мин). Произвести обработку полученных данных с применением метода линейной регрессиии и определить коэффициенты с и с1 уравнения линейной регрессии:

V VLPQ-AMK = d*X + с (3),

где V AMK - количество вещества продукта гидролиза VLPQ-AMK, моль; X - время реакции.

7.3.3. Рассчитать удельную протеолитическую активность ТХс#338 по следующей формуле:

ПА = ё*106 (4),

где ПА - протеолитическая активность ТХс#338, мкмоль субстрата/мин или ед. ПА; d - коэффициент из уравнения (3).

7.3.4. Рассчитать удельную протеолитическую активность ТХс#338 по следующей формуле:

ПАуд. = d*106/m (5),

где ПАуд - удельная протеолитическая активность ТХс#338, мкмоль субстрата /мин/мг испытуемого препарата или ед. ПА/мг испытуемого препарата; d - коэффициент из уравнения (3); т - масса испытуемого препарата, мг.

8. Вспомогательные процедуры

8.1. Приготовить рабочие пробы с различной концентрацией ТХс#338. Для этого в две опытные пробирки объемом 0,5 мл поместить указанные в Таблице 1 объемы раствора анализируемого образца ТХс#338 (0,8 мкмоль/л), буфера А, содержащего 0,5% ДМСО, и 275 мкМ VLPQ-АМК в порядке, указанном в п. 7.1.7.

Протокол валидации флуоресцентного метода Стр. 7

определения удельной активности препарата ПВ - 003 из 15

«Субстанция тритикаин-альфа»

Таблица 1.

№ пробы Концентрация Тс#338, нМ Объем Тс#338 (0,8 мкмоль/л, в буфере А, содержащем 0,5% ДМСО), мкл Объем VLPQ-AMK (275 мкмоль/л, в буфере А, содержащем 0,5% ДМСО), мкл Объем буфера А, содержащего 0,5% ДМСО, мкл

1 40 5 20 75

2 80 10 20 70

3 250 30 20 50

4 500 60 20 20

9. Методология валидации

9.1. Подготовка метода

Процедура

9.1.1. Приготовить стандартные пробы АМК, определить концентрацию АМК в полученных пробах и измерить интенсивность флуоресценции, как описано в 7.1.3. Результаты внести в таблицы 2 и 3.

9.1.2. Построить график зависимость флуоресценции от количества вещества для АМК и определить соответствующее уравнение, как описано в 7.1.4. Результаты представить в виде рисунка 1.

9.1.3. Приготовить основной раствор модельного субстрата VLPQ-AMK и измерить концентрацию VLPQ-AMK в полученном растворе как описано в 7.1.5. Результаты внести в таблицу 4.

9.1.4. Приготовить основной раствор анализируемого образца 1Чс#338 и измерить концентрацию белка, как описано в 7.1.6. Результаты внести в таблицу 5.

9.2. Определение сходимости, линейности и диапазона метода

Процедура

Приготовить рабочие пробы как описано в п. 7.1.7. и 8.1.

9.2.1. Измерить флуоресценцию растворов, полученных согласно п. 9.1.1., как описано в п. 7.2.

9.2.2. Рассчитать количество вещества продукта реакции протеолиза модельного субстрата VLPQ-AMK тритикаином-альфа для проб № 1-4 как описано в 7.3.1.

9.2.3. Построить зависимость количества вещества продукта реакции протеолиза VVLPQ-амк (мкмоль) от времени гидролиза 1 (мин) для проб № 1-4. Провести линейную регрессию полученных данных и в каждом случае определить коэффициент ё и рассчитать протеолитическую активность Т1с#338 (ПА) для каждого разведения испытуемого препарата (пробы № 1-4) описано в 7.3.2. Результаты внести в таблицу 6.

9.2.4. Рассчитать стандартное отклонение а и относительное стандартное отклонение sг (%) измерения активности Т1с#338 для проб № 1-4. Определить коэффициент корреляции линейной регрессии Я для проб № 1-4. Результаты внести в таблицу 6.

Протокол валидации флуоресцентного метода Стр. 8

определения удельной активности препарата ПВ - 003 из 15

«Субстанция тритикаин-альфа»

9.2.5. Рассчитать удельную активность Т1с#338 (ПАуд.) для каждого разведения испытуемого препарата (пробы № 1-4), в соответствии с процедурой, описанной в п. 7.3. Результаты внести в таблицу 6.

Критерий приемлемости

• Сходимость

Сходимость измерений является приемлемой, если относительное стандартное отклонение измерения активности Т1с#338 в одном опыте не превышает 5 %.

• Линейность

Метод является линейным, если коэффициент корреляции линейной регрессии Я для проб № 1-4 не менее 0,99.

• Диапазон метода

Диапазон метода соответствует активности Т1с#338 0,01-0,05 ед. ПА/мг, если выполняются требования сходимости и линейности для проб №1-4.

9.3. Определение правильности и воспроизводимости метода

9.3.1. Правильность метода определяют по степени соответствия результатов определения удельной активности рекомбинантного тритикаина-альфа при каждом отдельном разведении их среднему значению.

9.3.2. Воспроизводимость метода определяют по степени соответствия результатов определения удельной активности рекомбинантного тритикаина-альфа при измерениях ПАуд, выполненных в различное время.

Процедура

9.3.3. Рассчитать значение относительной ошибки измерений (3, %) удельной активности тритикаина-альфа в модельных образцах №1-4 в сравнении со средней величиной (ПАср.) по формуле:

3 (%) = (|(ПА-ПАср.)| /ПАср.) х100,

где ПА - значение измеренной активности тритикаина-альфа в пробах 1-4 (ед. ПА/мг); ПАср. - средняя активность тритикаина-альфа в модельном растворе (ед. ПА/мг). Результаты внести в таблицу 7.

9.3.4. Рассчитать относительное среднее отклонение (ЯМО) удельной активности тритикаина-альфа по формуле:

ЯМО = (| ПАуд.з- ПАуд.4 |/ ПАуд.)*100,

где ЯМО - относительное среднее отклонение удельной активности тритикаина-альфа; ПАуд.з и ПАуд.4 - результаты двух определений, полученные в условиях воспроизводимости (т.е. в различное время), ед. ПА/мг испытуемого препарата; ПАуд. - среднеарифметическое значение определений, выполненных в разных лабораториях в условиях воспроизводимости, ед. ПА/мг испытуемого препарата; 100 - коэффициент для пересчета в проценты;

Протокол валидации флуоресцентного метода Стр. 9

определения удельной активности препарата ПВ - 003 из 15

«Субстанция тритикаин-альфа»

Критерий приемлемости

• Правильность

Метод является правильным, если относительная ошибка измерений удельной активности Т1с#338 (3) в пробах №1-4 в сравнении со средней величиной не превышает 15,0 %.

• Воспроизводимость

Результаты измерений, полученные в условиях воспроизводимости, признаются удовлетворительными, если выполняется следующее условие:

СБ0,95 < ЯМБ,

где ЯМБ - относительное среднее отклонение удельной активности тритикаина-альфа; СБ 0,95 - критическая разность при доверительной вероятности 0,95, равная 21%.

9.4. Определение специфичности метода

Метод определения протеолитической активности рекомбинантного белка тритикаина-альфа основан на гидролизе исследуемым ферментным препаратом Т1с#338, находящимся в растворе, модельного пепетидного субстрата, конъюгированного с АМК. В качестве модельного субстрата используется пептид валин-лейцин-пролин-глутамин-АМК (УЬРО-АМК), который по предварительным данным обладает структурой, являющейся оптимальной для связывания и гидролиза именно тритикаином-альфа. Исходя из этого, специфичность метода следует признать весьма высокой.

Протокол валидации флуоресцентного метода Стр. 10

определения удельной активности препарата ПВ - 003 из 15

«Субстанция тритикаин-альфа»

10. Процедура валидации

Валидация проводится Зернием Е.Ю. 10.1. Подготовка метода

Таблица 2.

Разведение Поглощение при длине волны 342 нм Концентрация АМК, мМ

0,602

3200 0,607 121

0,605

0,328

6400 0,329 132

0,331

0,176

12800 0,177 141

0,176

Среднее значение 131

Таблица 3.

Расчетная концентрация АМК, мкмоль/л Объем раствора АМК, мкл Объем буфера А, содержащий 0,5% ДМСО Количество вещества АМК в пробе, моль Интенсивность флуоресценции

1 7,6 92,4 1*10-10 186244,25 183771,78 183344,40

3 15,2 54,8 3*10-10 542804,56 533967,43 531742,50

5 22,8 77,2 5*10-10 801744,43 815956,81 805404,87

Протокол валидации флуоресцентного метода Стр. 11

определения удельной активности препарата ПВ - 003 из 15