Теоретические и практические аспекты геномики тутового шелкопряда тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук в форме науч. доклада Севастьянова, Галина Андреевна

• Севастьянова, Галина Андреевна
• доктор биологических наук в форме науч. доклада
• 2006

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Севастьянова, Галина Андреевна

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что блочная организация пиримидиновых нуклеотидов в ДНК фены тутового шелкопряда в период ее постдиапаузного развития изменяется: происходит постепенное возрастание степени сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в ДНК, обусловленное накоплением длинных пиримидиновых последовательностей, содержащих от 5-ти до 10-ти нуклеотидных остатков. Этот процесс заканчивается к моменту завершения органогенеза зародыша. На всех этапах постдиапаузного развития фены и особенно на последней стадии ее развития общее содержание олиготимидиловых и обогащенных тимидином фрагментов ДНК значительно превышает таковое олигоцигидиловых и обогащенных цитидином последовательностей. К моменту завершения процесса органогенеза зародыша тутового шелкопряда степень сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в ДНК грены становится численно равной таковой в ДНК личинки.

2. Показано, что степень сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в ДНК тутового шелкопряда двух пород и полученных на их основе двух гетерозисных гибридов в начале постдиапаузного развития грены различна; к концу постдиапаузного развития она увеличивается, причем скорость ее увеличения выше у гетерозисных гибридов по сравнению с породами, но остается индивидуальной для каждой породы и гибрида. Отмечено достоверное обогащение к концу постдиапаузного развития фены пиримидиновых блоков ДНК тимидиловой кислотой. Характеристика степени сблоченности пиримидиновых нуклеотидов в грене может быть использована в качестве биохимического теста для раннего прогнозирования эффекта гетерозиса у гибридов тутового шелкопряда.

3. Установлено, что доза рибосомных. генов в геноме пород и гибридов тутового шелкопряда одинакова и не меняется в процессе эмбрионального развития. В геноме пород и гибридов тутового шелкопряда присутствуют гетерогенные по длине повторы рДНК, что обусловлено наличием в структурной части 28Б рДНК элементов ИВш и К2Вш. У разных пород и гибридов тутового шелкопряда содержание повторяющихся единиц р-генов со вставкой ШВт существенно различно (от 3% до 25%), со вставкой 112Вт пйчти одинаково и составляет от 9 до 10%. Рибосомные гены тутового шелкопряда не сцеплены с половыми хромосомами, а локализованы на одной из аутосом. Количественное содержание повторов со вставкой ШВт наследуется по материнскому генотипу.

Полиморфизм р-генов у пород и гибридов тутового шелкопряда является следствием вариантного содержания повторов со вставкой ШВт, что в определенной мере характеризует молекулярно-генетические механизмы, лежащие в основе продуктивности насекомого.

4. Разработан вариант геномной дактилоскопии с использованием рестрикционной зндонуклеазы Мэр! и меченой ДНК фага М13 для изучения полиморфизма ДНК тутового шелкопряда.

5. Впервые проведено маркирование генома тутового шелкопряда на уровне отдельных особей, семей и пород, партеногенетических клонов Выявлены характерные молекулярные маркеры для генома тутового шелкопряда. Особенности в наборе гибридизационных полос, свойственных породе, проявляются как в семьях, так и на уровне индивидуальных организмов, а индивидуальные особенности геномов утрачиваются в семьях и породе. Все родительские особи, полученные амейотическим партеногенезом (самки), несмотря на гетерозиготность по многим аллелям имеют идентичные фингерпринтные спектры, которые наследуются потомками (самки) при таком же типе партеногенеза, У потомков, полученных мейотическим типом партеногенеза (самцы), происходит расщепление по аллелям, »по дает высокий индивидуальный полиморфизм, позволяющий выявить генотипическую изменчивость. Метод геномной дактилоскопии позволяет детектировать отдельные локусы различной копийности при анализе гибридных организмов.

6. На разных фазах развития тутового шелкопряда выявлено наличие ДНК с деспирализованной вторичной структурой. Образование такого типа ДНК в онтогенезе тутового шелкопряда происходит циклически, соответствуя основным фазам и этапам развития насекомого, оно максимально в фене через 12 часов после кладки, в начале (стадия Б)) и конце (стадия Ез) постдиапаузного развития, в начале каждого личиночного возраста, в 1-й день завивки кокона (в большей степени у самцов) и на 4-й день развития куколки (в большей степени у самок). Динамика дезоксирибонуклеазной активности (кислая, рН 5,2; нейтральная, рН 7,0) растворимых белков тутового шелкопряда, выявленная спектрофотометрическим методом на разных стадиях его развития, в целом не повторяет таковую для ДНК с деспирализованной вторичной структурой, что указывает на отсутствие деградирующего влияния ДНКаз на ДНК как в клетке, так и в момент ее выделения.

Интенсивность включения меченых предшественников нуклеиновых кислот (3Н-уридина и 3Н-тимидина) в кислотонерастворимую фракцию грены тутового шелкопряда коррелирует с периодами наибольшего содержания ДНК с деспирализованной вторичной структурой. Низкая устойчивость хроматина, выделенного из грены на стадиях Di и Е3, к ультразвуковой обработке, более лабильная связь ДНК с пистонами в его составе, обогащенность хроматина негистоновыми белками свидетельствуют, что содержание ДНК с деспирализованной вторичной структурой является одним из реальных показателей активности генома и позволяет считать такую ДНК как метаболически активную.

7. Характеристика структурного состояния ДНК у различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда показала наличие корреляции между продуктивностью пород, выраженностью гетерозиса у гибридов и содержанием метаболически активной ДНК у них.

8. Данные о структурной организации пиримидиновых нуклеотидов в ДНК пород и гибридов тутового шелкопряда, о межпородном полиморфизме р-генов, об активности генома у пород и гетерозисных гибридов на ранней стадии эмбрионального развития в определенной мере способствуют расшифровке молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе продуктивности этого хозяйственно-полезного насекомого; с другой стороны, возможность маркировать геном особей, семей, пород, гибридов, потомков партеногенетических линий методом геномной дактилоскопии - все это свидетельствует о создании предпосылок для научно-обоснованной селекции тутового шелкопряда по исследованным параметрам структурной организации и активности его генома.

Соискатель имеет 99 печатных работ по теме диссертации, объемом 95 п.л., включая 56 наиболее значимых публикаций, отражающих основное содержание работы (личное участие 54,0% или 51,2 п.л.).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе обобщены результаты многолетнего изучения структуры генома тутового шелкопряда на уровне суммарной ДНК, отдельной группы генов (р-генов) и минисателлитных последовательностей, а также активности генома насекомого в процессе онтогенеза. Благодаря экономическому значению тутового шелкопряда молекулярные основы его высокой продуктивности издавне привлекали внимание исследователей. В практике селекционных работ с тутовым шелкопрядом на биохимическом уровне внимание уделяется, в основном, изучению тех энзимов, активность которых обеспечивает создание фонда структурных единиц для синтеза специфических белков шелка (Егорова, 1983; Коничев, 1991; Клунова, 2005). Исследования генома в плане изучения проявлений продуктивности и гетерозиса у тутового шелкопряда особенно на ранних стадиях его развития очень ограничены. Проведенный нами анализ сблоченности пиримидиновых нуклеотйдов в ДНК пород и гибридов тутового шелкопряда на разных стадиях постдиапаузного развития выявляет индивидуальный характер организации пиримидиновых нуклеотйдов в ДНК пород и гибридов, тестирующий породу ПС5 и гетерозисные гибриды по степени обогащенное™ их ДНК длинными пиримидиновыми изоплитами. Увеличение степени сблоченности пиримидиновых изошштов в ДНК сопровождается и обогащением длинных олигонуклеотидных последовательностей (от 5-ти до 10-ти нуклеотидных остатков) тимидиловой кислотой. Высокогетерозисный гибрид ПС5хСК2, характеризующийся наибольшей степенью сблоченности ДНК, содержит в ДНК и больше олиготимидиловых и обогащенных тимидином нуклеотидных последовательностей.

Обнаружение межпородного полиморфизма рибосомных генов тутового шелкопряда по содержанию повторов со вставкой I, равномерное распределение их в обеих половых хромосомах Ъ и и характер наследования количественного содержания этих повторов через материнский генотип, наличие определенной корреляции между содержанием в геноме пород и гибридов повторов вставки типа I и массой кокона открывает возможность использования этой характеристики структуры рибосомных генов в селекции тутового шелкопряда.

Для маркирования генома пород, гибридов, клонов тутового шелкопряда и выявление генотипической изменчивости партеногенетических линий, полученных с помощью различных типов партеногенеза подходит предложенный вариант метода геномной дактилоскопии.

С целью дальнейшей интенсификации селекционной работы с тутовым шелкопрядом желательно включить в «Основные положения методики селекции тутового шелкопряда», утвержденные Министерством сельского хозяйства РФ определение отработанных в данном исследовании параметров структурной организации генома и его активности у насекомого на стадии грены (яйца).

В соответствующие разделы учебных пособий по селекции тутового шелкопряда целесообразно включить новые данные об особенностях структурной организации и активности генома у различных по продуктивности пород и гибридов тутового шелкопряда, в том числе о структуре р-генов, наличии минисателлитов в геноме, о сблоченности пиримидиновых изоплитов и об активности генома в онтогенезе тутового шелкопряда.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук в форме науч. доклада Севастьянова, Галина Андреевна, 2006 год

1. Севастьянова Г. А. Структура генома тутового шелкопряда (теоретический и практические аспекты). М.: Прометей, 2001.- 99с. (6,2 п.л., авторский вклад 100%).

2. Статьи в рекомендованных ВАК изданиях

3. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Видуга О.Д. Характеристика структурного состояния ДНК в онтогенезе тутового шелкопряда//Доклады АН СССР. 1974. Г.216. №5. С.1192-1194. (0.2 п.л.,авторский вклад 70%).

4. Коничев A.C., Водолеев A.C., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Выделение, очистка и свойства кислой рибонуклеазы лизосомальной фракции грены тутового шелкопряда//Биохимия.-1980. Т.4-5. Вьш.5. С.821-828. (0.5 п.л., авторский вклад 30%).

5. Севастьянова Г.А., Смолин А.Н. Свободные нуклеотиды и их производные в организме насекомых//Успехи соврем. биол.-1966. Т.61. №3. С.321-337. (1,0 п.л., авторский вклад 80%).

6. Севастьянова Г.А., Смолин А.Н. Свободные нуклеотиды и их производные в жировом геле личинок дубового шелкопряда Antheraea pernyi G.M.//Bhoxhmhh.-1 967. Т.32. №3. С.548-557. (0,6 пл., авторский вклад 80%).

7. Севастьянова Г.А. Свободные нуклеотиды и их производные в шелкоотделительной железе дубового шелкопряда//Биохимия -1967. Т.32. №6. С. 1260-1270. (0,7 п.л., авторский вклад 100%).

8. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А, Видута О.Д., Ганиева М.Р., Акименко Л.М., Тищенко Т.Н. Структурное состояние ДНК как тест для прогнозирования гетерозиса у тутового шелкопрядаУ/Шелк 1976. №3. С.15-17. (0,2 пл., авторский вклад 50%).

9. Водолеев A.C., Коничев A.C., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Рибонуклеазная активность в субклеточных фракциях развивающейся грены тутового шелкопрядаУ/ Научные доклады высшей школы, биол. науки,-1977. №11. С.139. (0,06 п.л., авторский вклад 30%).

10. Филиппович Ю.Б., Севастьянгова Г.А. Структура и обмен РНК у насекомых//Успехи соврем, биол. -1988. Т. 106. Вып.2 (5). С.208-225. (1,1 пл., авторский вклад 80%).

11. Тихомирова Т.П., Тимофеева М.Я., Куприянова Н.С., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма рибосомных генов тутового шелкопряда//Генетика.-1992. Т. 28. №8. С.13-28. (1,0 пл., авторский вклад 40%).

12. Третяк А.П., Рысков А.П., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б., Струнников В.А. Геномная дактилоскопия Bombyx mori L.: выявление генотипической изменчивости партеногенегических клонов//Генетика 1992. Т.28. №5. С.171-175. (0,3 п.л., 30%).

13. Третяк А.П., Рысков А.П., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Геномная дактилоскопия Bombyx mori L. ¡проблема идентификации особей, семей и пород// Генетика 1992. Т.28. №2. С.52-62. (0,8 пл., авторский вклад 40%).

14. Коничев A.C., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология.- М.: Академия, 2003. 400 с. (25 п.л., авторский вклад 50%, 1-ое издание), 2005.- 400 с. (25 п.л., авторский вклад 50%, 2-ое издание).1. Учебное пособие

15. Филиппович Ю.Б., Коничев A.C., Севастьянова Г.А., Кутузова Н.М. Биохимические основы жизнедеятельности человека. М.:Владос, 2005 - 407 с. (33 п.л, авторский вклад 25%).1. Статьи в сборниках

16. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Коничев A.C., Водолеев A.C. Рибонуклеазная активность в митохондриальной фракции грены тутового шелкопряда в процессе весенней инкубации/УБиохимия митохондрий. Наука, 1976. с.74. (0,06 пл., авторский вклад 30%).

17. Видута О.Д., Севастьянова Г.А. Метаболически активная ДНК в жировом теле тутового и дубового шелкопрядов. В. сб. «Биохимия насекомых», М.: МГПИ им. В .И.Ленина, 1979, вып. XXI, с.121-127. (0,45 п.л., авторский вклад 50%).

18. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Родина Е.Ю., "Урванцева Г.А. Содержание нуклеиновых кислот в грене пород и гибридов тутового шелкопряда в период постдиапаузного развития. Межвузовский сборн. научн. трудов

19. Биохимия насекомых», М.: «Прометей», 1989, с.3-12. (0,6 п.л., авторский вклад 60%).

20. Филиппович Ю.Б., Севастьянова Г.А., Водолеев A.C., Рибонуклеазная активность белков развивающейся грены тутового шелкопряда.// В сб. «Биохимия насекомых», вып XVIII. М., МГПИ им. В.И. Ленина, 1975, С. 190-196 (0,45 п.л., авторский вклад 70%).

21. Севастьянова Г.А., Коничев A.C., Филиппович Ю.Б. Биосинтез РНК в эмбриогенезе тутового шелкопряда. Сб. «Биохимия насекомых», М. МГПИ им. В.И.Ленина, 1974, вып. 17, с.75-84 (0,6 п.л., авторский вклад 60%).

22. Видута О.Д., Оболенкова Л.А., Адо Н.Ю., Севастьянова Г.А., Филиппович Ю.Б. Выделение ДНК из грены тутового шелкопряда.// Сб. «Биохимия насекомых», вып. XX. М„ МГПИ им. В.И. Ленина, 1978, С. 11-15 (0,3 пл., авторский вклад 50%).

23. Водолеев A.C., Севастьянова Г.А. Фосфодиэстеразная активность растворимых белков в тканях личинок и куколок тутового шелкопряда.// Сб. «Биохимия насекомых», вып XXII. М., МГПИ им. В.И. Ленина, 1980, С. 105-110 (0,4п.л., авторский вклад 80%)

24. Филиппович Ю.Б., Адо Н.Ю., Алцыбеева Т.И., Банников В.М., Горленко В.А., Грошева М.П., Егорова Т.А., Клунова С.М., Налетова Е.А., Севастьянова