Влияние моделируемого микроокружения на функциональные особенности кардиомиоцитов и их аритмогенные свойства в условиях электромеханичексого синцития тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Романова Серафима Артуровна

• Романова Серафима Артуровна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Романова Серафима Артуровна

Содержание

1. Введение

1.1. Актуальность темы исследования

1.2. Цель и задачи работы

1.3. Научная новизна исследования

1.4. Практическая значимость работы

1.5. Положения, выносимые на защиту

1.6. Публикации

1.7. Структура и объем работы

2. Обзор литературы

2.1. Работа сердца

2.1.1. Структура сердца

2.1.2. Потенциал действия

2.1.3. Проведение волны возбуждения

2.2. Аритмии и их модели

2.2.1. Реентри

2.2.2. Бета-адреностимуляция

2.2.3. Гиперкалиемия

2.3. In vivo картирование и работа с лабораторными животными

2.3.1. Понятие боли и этических норм работы с лабораторными животными

2.3.2. Модель Лангендорфа

2.3.3. Трансплантация клеток

2.4. Стволовые клетки и тканево-инженерные модели на их основе

2.4.1. Стволовые клетки

2.4.2. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и процессы их

дифференцировки

2.4.3. Моделирование подложек и микроокружение клеток

2.4.4. Стресс-факторы в тканевой инженерии

3. Материалы и методы

3.1. Создание подложек и микроносителей

3.1.1. Полимерные подложки

3.1.2. Микроносители

3.1.3. Анизотропные подложки

3.1.4. Образцы с геометрическим препятствием

3.2. Культура неонатальных желудочковых кардиомиоцитов крысы

3.2.1. Используемые реагенты и приготовление сред для культивирования крысиных кардиомиоцитов

3.2.2. Подготовка образцов для посадки на них клеточной культуры неонатальных кардиомиоцитов

3.2.3. Протокол выделения неонатальных крысиных кардиомиоцитов

3.3. Культивирование ИПСК и их дифференцировка в кардиомиоциты

3.3.1. Подготовка необходимых реактивов и сред для культивирования ИПСК человека их дифференцировки в кардиомиоциты

3.3.2. Культивирование ИПСК

3.3.3. Протокол направленной дифференцировки ИПСК в желудочковые кардиомиоциты

3.4. Оптическое картирование

3.4.1. Необходимые реактивы для проведения оптического картирования

3.4.2. Подготовка образцов

3.4.3. Экспериментальная установка

3.4.4. Проведение эксперимента

3.5. In vivo картирование

3.5.1. Посадка клеток на микроносители

3.5.2. Установка по перфузии сердца по методу Лангендорфа

3.5.3. Трансплантация микроносителей на сердце

3.5.4. Картирование in vivo

3.6. Иммуноцитохимический анализ

3.6.1. Необходимые реактивы

3.6.2. Протокол покраски клеточных образцов

3.6.3. Подготовка сердечных срезов и их покраска

3.6.4. Протокол исследования на конфокальном микроскопе

4. Результаты

4.1. Исследование влияния модельной анизотропии на инициацию волн реентри в гетерогенной культуре кардиомиоцитов

4.2. Исследование влияния жесткости и анизотропии подложки при конструировании тканево-инженерных моделей на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

4.3. Разработка микрополимерных комплексов для трансплантации одиночных кардиомиоцитов в неонатальном периоде дифференцировки в рамках создания новой клеточной терапии

4.3.1. Полимерные носители трансплантации отдельных кардиомиоцитов

4.3.2. Инъекция клеток с микроносителями в сердце крысы in vivo

4.4. Исследование влияния концентрации ионов в среде на кардиомиоциты, полученные при клеточной дифференцировке из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

4.4.1. Изменение потенциала действия дифференцированных кардиомиоцитов под действием изопреналина

4.4.2. Моделирование гиперкалиемии

5. Выводы и обсуждения

6. Заключение

7. Благодарности

8. Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние моделируемого микроокружения на функциональные особенности кардиомиоцитов и их аритмогенные свойства в условиях электромеханичексого синцития»

1. Введение 1.1. Актуальность темы исследования

По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются самыми частыми патологиями, приводящие к смертельным исходам [1, 2]. При этом 16% от числа всех смертей приходится на ишемическую болезнь сердца (ИБС). Значимая часть сердечных патологий сводится к аритмиям. Наиболее опасные из них вызваны электрическими волнами, которые многократно циркулируют по миокарду с более высокой частотой, чем волны, испускаемые естественным водителем ритма сердца, то есть синоатриальным узлом [3]. Самая распространённая сердечная аритмия - фибрилляция предсердий (ФП). По данным Европейского общества кардиологов ФП поражает около 3 миллионов человек в США и 8 миллионов в Европе [4].

Сердечную ткань можно рассматривать как возбудимую среду, главными характеристиками которой является пороговое возбуждение и последующее рефрактерное состояние. Благодаря пространственно-временному чередованию состояний покоя, возбуждения и рефрактерности осуществляется передача возбуждения по ткани, которая обеспечивает насосную функцию сердца. Мышечные сокращения сердца регулируются синхронным проведением электрических волн по миокарду [5]. Аномальное распространение волн по ткани может образовывать хаотичную электрическую активность, которая десинхронизирует работу всего сердца. После таких нарушений сердце самостоятельно не может восстановить свою нормальную электрическую активность [6].

Миокард неоднороден по проводимости возбуждения, что в критических случаях может приводить к развитию спиральных волн. В свою очередь большое количество циркулирующих волн приводит к фибрилляции отдельных частей сердца, а в дальнейшем и к аритмии. Передача электрического сигнала в большой степени зависит от щелевых контактов (ЩК) [7] и эфаптической межклеточной связи (ЭФС) между возбудимыми клетками [8].

В регенеративной медицине сердца важную роль играют трансплантаты, полученные из культивированных сердечных клеток [9, 10], в особенности при восстановлении проводящей системы сердца [11, 12]. Помимо хирургического вмешательства, в качестве лечения ремоделирования сердечной ткани потенциально может использоваться подход заместительной клеточной терапии.

1.2. Цель и задачи работы

Целью данного исследования была разработка оптимизированных условий микроокружения для конструирования улучшенных тканево-инженерных моделей для исследования особенностей аритмогенности культур кардиомиоцитов. Особое внимание уделялось моделированию микроокружения для клеток животных и человека, включая кардиомиоциты, дифференцированные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи, результаты выполнения которых представлены в соответствующих разделах диссертации:

• Изучение влияния моделируемой анизотропии ткани на инициацию волн реентри в гетерогенной культуре кардиомиоцитов (Раздел 4.1).

• Исследование влияния жесткости и анизотропии подложки на создание тканево-инженерных моделей на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (Раздел 4.2).

• Изучение свойств микрополимерных комплексов и разработка на их основе микроносителей для трансплантации отдельных кардиомиоцитов в неонатальном периоде развития в рамках создания новой клеточной терапии (Раздел 4.3).

о Моделирование полимерных носителей для трансплантации отдельных кардиомиоцитов (Раздел 4.3.1)

о Исследование введения инъекций клеток с микроносителями в сердце крысы in vivo (Раздел 4.3.2).

• Изучение влияния условий культивирования клеток с варьированием концентрации ионов в среде на кардиомиоциты, полученные путём дифференцировки из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (Раздел 4.4).

о Исследование изменений потенциала действия кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПСК, под воздействием изопреналина (Раздел 4.4.1).

о Определение критических условий проведения волны возбуждения в функциональном синцитии, полученном из индуцированных из ИПСК кардиомиоцитов, в условиях гиперкалиемии (Раздел 4.4.2).

1.3. Научная новизна исследования

• В данной работе смоделированы и исследованы условия, при которых на кардиальном монослое образуются спиральные волны реентри вблизи геометрического прямоугольного препятствия при подаче высокочастотного импульса. Впервые был использован негомогенный подход к моделированию анизотропии, как сочетание прямоугольного непроводящего препятствия с глобальным направлением анизотропии, совпадающим с одной из его сторон. Было показано, что в системе с препятствием и такой анизотропией наблюдается процесс устойчивого роста вероятности возникновения реентри в обоих направлениях анизотропии, что было показано экспериментально, но ранее противоречило тривиальной гипотезе из эйконального уравнения. Важной частью данной работы является результат, что при моделировании микроокружения, схожего с нативным, ключевую роль и в стабилизации проведения и в возникновении реентри играет природа межклеточных неоднородностей. Было показано, что

процессы возникновения реентри в таких системах связаны не только с проведением через щелевые контакты, но и с эфаптической связью. По сути в работе впервые продемонстрирована экспериментально граница применения гомогенного подхода к моделированию анизотропии.

• При моделировании монослоёв кардиомиоцитов были исследованы различия влияния внешнего микроокружения на формирование клеток и их функциональные свойства. Была выявлена зависимость сократительной клеточной активности и межклеточного проведения от жёсткости подложки и её степени анизотропии.

• Впервые был представлен метод по трансплантации клеток в сердце с использованием полимерного нановолоконного каркаса. Этот каркас представляет собой ряд изолированных фрагментов полимерных нановолокон, которые способны переносить одиночные клетки. В качестве материала для микроносителей был выбран биосовместимый и биодеградируемый полимер поли^-лактид (PLLA), широко используемый в медицинских целях.

• Была показана возможность исключительно кальциевого проведения в условиях сильной гиперкалиемии на человеческих кардиомиоцитах, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Установлена взаимосвязь повышенного значения концентрации внеклеточного калия со скоростью проведения волны возбуждения в слоях из кардиомиоцитов, полученных дифференцировкой из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека.

1.4. Практическая значимость работы

Данная работа имеет ряд результатов, которые могут лежать в основе некоторых вопросов практической медицины. Для того, чтобы была возможность применять модельные экспериментальные данные для новых кардиологических

разработок, модель должна быть максимально приближена к реальной картине. Моделирование спиральной волны реентри на непроводимом геометрическом препятствии в сочетании с анизотропией в кардиальном монослое приближает к более реальной структуре сердца, имеющего невозбудимые участки, например, вследствие фиброза.

Для создания определённой структуры в тканевой инженерии применяют различные подходы к моделированию внешнего микроокружения, в том числе это клеточные подложки, каркасы и питательные среды с различным ионным составом. Во время дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток особое влияние на формирование взрослого фенотипа оказывают механические свойства подложки. Тестируя их структурные особенности, можно увеличивать процентный выход дифференцированных кардиомиоцитов в лабораторных условиях, что является одной из ключевых задач для создания экспериментальных моделей в тканевой инженерии. В данной работе была подобрана такая оптимальная модель. В дальнейшем ее можно применять для тестирования различных лекарственных препаратов и веществ, например потенциальных антиаритмиков. В работе было продемонстрировано применение веществ-блокаторов в случае исследования гиперкалиемии.

Особое практическое значение имеют результаты по трансплантации клеток в сердце, которые имеют перспективу в заместительной клеточной терапии. Предложенный метод обеспечивает доставку клеток в сердце с помощью полимерных микроносителей, при этом клетки образуют электромеханический синцитий с тканью реципиента, что должно стать основой для снижения аритмий, вызванных приживлением в первые дни после клеточной терапии. Такой подход может служить для создания новых методов трансплантации клеток для решения конкретных задач по лечению сердца с высокой скоростью синхронизации клеток и ткани, с улучшенной механической фиксацией и неинвазивным оптическим контролем, а также выживаемости доставляемых клеток.

1.5. Положения, выносимые на защиту

1. В анизотропной среде с моделируемым препятствием фиксируется рост вероятности возникновения реентри, что подчеркивает важность неоднородностей на уровне межклеточных связей и ограничения гомогенного моделирования анизотропии ткани.

2. Влияние жесткости и анизотропии подложки на дифференцировку кардиомиоцитов позволяет создавать ткани, близкие к нативной сердечной ткани, что актуально для тканевой инженерии.

3. Использование микрополимерных комплексов с одиночными кардиомиоцитами улучшает их выживаемость и интеграцию в монослой, а микроносители ускоряют первичный контакт между кардиомиоцитами и сердечной тканью.

4. В условиях сильной гиперкалиемии (до 14 мМ) возможно существование проведения волн возбуждения, что было показано экспериментально в монослое желудочковых кардиомиоцитов (ИПСК-КМ).

1.6. Публикации

Результаты исследования нашли отражение в следующих публикациях, рецензируемые в научных журналах, индексируемых в базах Scopus и РИНЦ:

1. Romanova, S.A., Berezhnoy, A.K., Ruppel, L.E. et al. Discrete anisotropy model of heterogeneous cardiac tissue predicting the occurrence of symmetry breaking of reentrant activity //JETP Letters. - 2024. - Т. 119. - №. 9. - С. 722-731.

2. Щербина С.А., Шутько А.В., Низамиева А.А., Никитина А.В., Слотвицкий М.М., Цвелая В.А., Агладзе К.И. Исследование формирования тканево-инженерного конструкта на основе кардиомиоцитов и матрикса различной степени анизотропии и жесткости //Альманах клинической медицины. - 2021. - Т. 49. - №. 6. - С. 365-374.

3. Aitova A., Scherbina S., et al. Novel Molecular Vehicle-Based Approach for Cardiac Cell Transplantation Leads to Rapid Electromechanical Graft-Host Coupling //International journal of molecular sciences. - 2023. - Т. 24. - №. 12. -С. 10406.

4. Abrasheva V.O., Kovalenko S.G., Slotvitsky M.M., Romanova S.A., Aitova A.A., Frolova S., Tsvelaya V.A., Syunyaev R.A. Human sodium current voltage-dependence at physiological temperature measured by coupling a patch-clamp experiment to a mathematical model //The Journal of Physiology. -2024. - Т. 602. - №. 4. - С. 633-661.

5. Slotvitsky, M., Berezhnoy, A., Scherbina, S., Rimskaya, B., Tsvelaya, V., Balashov, V., Agladze, K., et al. Polymer kernels as compact carriers for suspended cardiomyocytes //Micromachines. - 2022. - Т. 14. - №. 1. - С. 51.

6. Kalinin A., Naumov V., Kovalenko S., Berezhnoy A., Slotvitsky M., Scherbina S., Aitova A., Syrovnev V., Popov M., Kalemberg A., et al. Modeling the functional heterogeneity and conditions for the occurrence of microreentry in procedurally created atrial fibrous tissue //Journal of Applied Physics. - 2023. -Т. 134. - №. 5.

Помимо публикаций в научных изданиях, результаты исследования были представлены на докладах конференций, а также опубликованы в их сборниках тезисов:

1. Щербина С.А., Слотвицкий М.М., Цвелая В.А. Агладзе К.И. Исследование формирования сердечной ткани при патологических условиях. 63-й Всероссийская научная конференция МФТИ.

2. Щербина С.А., Слотвицкий М.М., Цвелая В.А. Исследование формирования сердечной ткани при патологических условиях. V Всероссийский научный форум "Наука будущего - наука молодых" Финал.

3. Щербина С.А., Слотвицкий М.М., Цвелая В.А., Агладзе К.И., «Исследование формирования сердечной ткани при патологических

условиях». Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2021».

4. Щербина С.А., Слотвицкий М.М., Цвелая В.А. Агладзе К.И. «Study of the formation of cardiac tissue under pathological conditions», Российская конференция с международным участием «Экспериментальная и компьютерная биомедицина».

5. Щербина С.А., Слотвицкий М.М., Цвелая В.А. Агладзе К.И. Исследование формирования спиральной волны на сердечной ткани при различных анизотропных свойствах подложки. 76-я Всероссийская с международным участием школа-конференция молодых учёных «Биосистемы: организация, поведение, управление».

6. Щербина С.А., Слотвицкий М.М., Калинин А.И., Бережной А.К., Цвелая В.А., Агладзе К.И. «Исследование формирования спиральной волны на сердечной ткани при различных анизотропных свойствах подложки», VII Съезд биофизиков России.

Также по результатам работы были зарегистрированы следующие патенты на изобретения:

1) М. М. Слотвицкий, А. К. Бережной, В. А. Цвелая, К. И. Агладзе, А. А. Аитова, С. А. Щербина, С. С. Бакуменко, Т. О. Сергеева, Б. А. Римская, В. Е. Вольгушев «Способ перфузии и устройство перфузионной системы для сохранения донорского сердца» Патент RU 2815290 C1, 2024.

2) А. А. Аитова, В. А. Цвелая, С. А. Щербина, М. М. Слотвицкий, К. И. Агладзе, М. А. Попов «Способ получения и ведения мезенхимальных стволовых клеток из костного материала млекопитающих» Патент RU 2821926 C1, 2024.

1.7. Структура и объем работы

Объём диссертационной работы составляет 133 страницы печатного текста. Содержание глав включает в себя: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, выводы и обсуждения, заключение, благодарности и список литературы. В работу включены 48 рисунков и 1 таблица, список литературы состоит из 148 источников.

2. Обзор литературы 2.1. Работа сердца 2.1.1. Структура сердца

Сердце представляет собой полый мышечный орган живых организмов, организующий работу системы кровообращения. Это насос, который осуществляет упорядоченные сокращения "систолу" и расслабления "диастолу". Во время диастолы кровь накапливается в камере, после чего во время систолы она выбрасывается в кровеносные сосуды (Рисунок 1). Благодаря непрерывной сократительной работе происходит постоянное движение потока крови по организму, а значит и обеспечение обмена веществ и жизнедеятельности человека. Направленное движение крови обусловлено наличием створчатых клапанов в предсердно-желудочковых отверстиях.

Стенка сердца образуется несколькими слоями: эпикард, миокард и эндокард. Эпикард образован висцелярным листком серозной оболочки сердца и покрыт мезотелием. Внутренняя оболочка эндокард состоит из коллагеновых и эластичных волокон и выстилает полость сердца изнутри. Слой миокарда представлен поперечнополосатыми мышечными волокнами, которые составляют основную массу сердечной стенки. Эти волокна образованы соединительной тканью и клетками кардиомиоцитами и имеют лентовидную форму [13].

Нижняя полая вена

Перикард

Рисунок 1. Схема сердца и кровеносных сосудов.

В миокарде выделяют несколько типов кардиомиоцитов: сократительные, проводящие, переходные и секреторные. Последние из них выполняют роль в эндокринной системе и в большинстве находятся в предсердиях. Благодаря переходным кардиомиоцитам осуществляется взаимодействие между другими типами кардиомиоцитов.

Большую часть сердечной ткани занимают рабочие (сократительные) кардиомиоциты, пространственные размеры которых составляют около 5 * 20 * 100 мкм [14, 15]. Значительный объём внутри кардиомиоцита занимают митохондрии. Также, имеются миофибриллы и саркоплазматический ретикулум, который необходим для запасания ионов Са2+ (Рисунок 2). Миофиламенты образованы толстыми нитями миозина и тонкими нитями актина. Благодаря актомиозиновому комплексу осуществляется сократительная работа миокарда.

Рисунок 2. Продольное расположение и поперечность миофибрилл в

кардиомиоцитах [13].

Проводящие кардиомиоциты подразделяют на пейсмейкерные клетки и клетки Пуркинье. Они создают водитель ритма в сердце. Самый высокий ритм биений задаёт синоатриальный узел порядка 60-80 импульсов в минуту, атриовентрикулярный узел - 40-60 импульсов, пучок Гиса и клетки Пуркинье -20-40 импульсов в минуту. При нормальном функционировании сердца ритм

задаёт участок, чья спонтанная активность выше. Соответственно, если нарушается работа ведущего отдела водителя ритма, то генерация импульсов будет задаваться другим отделом. Согласованность механических сокращений осуществляется электрической передачей сигнала от пейсмейкерных клеток, образуя по миокарду волну возбуждения [16, 17].

2.1.2. Потенциал действия

Сокращение сердца осуществляется благодаря правильному проведению возбуждению по ткани. От каждой клетки к следующей передаётся электрический сигнал, обеспечивая последовательную их активацию. Передача сигнала регулируется работой мембранных ионных каналов. Между зарядами на внутренней и внешней стороне мембраны возникает электрический градиент. Благодаря работе ионных каналов мембранный потенциал меняет своё значение примерно от -90 мВ до +15 мВ [18, 19]. В клеточной мембране находятся потенциал-зависимые ионные каналы, а также насосы и ионные обменники. Именно через них осуществляется перенос ионов внутрь или наружу клетки. При попадании в клетку ионов №+ и Са2+ мембрана деполяризуется, при выходе из клетки ионов К+ - реполяризуется. Эти перемещения зарядов образуют ионные токи [20, 19], благодаря которым формируется потенциал действия (ПД). Неправильная работа ионных каналов приводит к изменению ПД, а значит и изменению проведения волны возбуждения по миокарду.

В состоянии потенциала покоя (-70-90 мВ) внутренняя сторона мембраны клетки имеет отрицательный заряд. При вхождении катионов в клетку возникает ПД, кардиомиоцит переходит в возбуждённое состояние. Цикл ПД можно разделить на несколько фаз. Форма ПД отличается в зависимости от типа сердечных клеток из-за различий ионных мембранных токов (Рисунок 3). В начале каждого цикла через быстрые потенциал-зависимые натриевые каналы происходит вброс №+ внутрь клетки (до 20 мВ), тем самым происходит быстрая

деполяризация - фаза 0 [21, 22]. Далее, наступает ранняя реполяризация - фаза 1. Фаза 2 - ионы Са2+ входят через медленные кальциевые каналы и образуется плато. Следующая фаза 3 - поздняя быстрая реполяризация, ионы К+ выходят из кардиомиоцита, и после клетка снова возвращается в состояние покоя - фаза 4. Для восстановления ионного равновесия между циклами проходит около 250 мс [21, 22].

Рисунок 3. Потенциал действия для желудочковых (слева) и предсердных (справа) кардиомиоцитов. Для кардиомиоцитов желудочкового типа фаза плато длиннее,

чем для предсердного [23].

Работа ионных каналов может влиять на свойства мембраны и её проницаемость для ионов. При этом возможно регулировать работу конкретного ионного канала с помощью специальных веществ блокаторов, которые связываются с молекулами канальных белков. Такими блокаторами являются, например, тетродотоксин (блокатор натриевых каналов), тетраэтиламмоний (блокатор калиевых каналов) и нифидипин (блокатор медленных кальциевых каналов) [21, 24]. Также, одним из блокаторов потенциал-зависимого калиевого

канала является вещество E-4031. Это антиаритмический препарат, который снижает ток ^ в клетках миокарда, тем самым удлиняя потенциал действия [25]. Вещество E-4031 является синтезированным токсином и на данный момент используется только в исследовательских целях.

Можно провести соответствие между фазами ПД желудочкового кардиомиоцита и его сокращениями (Рисунок 4). Фаза быстрой деполяризации предшествует сокращению, а само сокращение клетки происходит во время фазы плато. После, наступает состояние рефрактерности, в это время концентрации ионов восстанавливаются перед началом следующего цикла ПД [26, 27].

мЕ} Потенциал Сокращение

I

300

Рисунок 4. Соответствие потенциала действия кардиомиоцита и его сокращения,

по оси ох время, мс [13].

2.1.3. Проведение волны возбуждения

Волну возбуждения, проходящую по миокарду, можно представить в виде автоволны, источником которых является синусовый узел. Распространение последовательных автоволн по сердцу вызывает его мышечное сокращение,

которое необходимо для насосной функции сердца. При неправильном распространении волн по миокарду возможно образование несинхронных сокращений в разных частях сердца, такое состояние называется фибрилляцией или мерцательной аритмией [13]. В критических случаях такое нарушение может приводить к аритмии и остановке сердца.

Для возбудимой среды, по которой распространяются волны, разделяют три состояния: покой, возбуждение и рефрактерность [28]. Изначально, элемент среды находится в состоянии покоя. Под действием внешних факторов его можно перевести в возбуждённое состояние. Далее, следует состояние рефрактерности, в этом состоянии элемент является невозбудимым. Через некоторый промежуток времени состояние элемента снова возвращается в состояние покоя, тем самым восстанавливаясь для последующего возбуждения. Такое возбуждение последовательно передаётся по возбудимой среде от каждого элемента к следующему (Рисунок 5).

Рисунок 5. Цикл смены состояний элементов возбудимой среды: покой, возбуждение, рефрактерность, покой [28].

Состояние рефрактерности также можно разделить на несколько фаз: абсолютная рефрактерность, уязвимый период и относительная рефрактерность. При абсолютной рефрактерности кардиомиоцит не способен формировать ответ на внешний стимул, при относительной - возможен ответ на внешний стимул повышенной амплитуды. Если же приложить стимул в уязвимый период, то волна будет распространяться по возбудимой среде в обратную сторону и наиболее

вероятно возникновение спиральных волн [29, 13]. Рефрактерный период занимает большую часть времени в продолжительности ПД и сокращении кардиомиоцита.

Если волны возбуждения при распространении будут сталкиваться друг с другом, то они исчезают. Аналогично, волна прекращается, если настигает некую границу. Если имеется несколько источников волн, то те, которые испускают волны с большей частотой, подавляют волны от источника с меньшей частотой. Если расположить возбудимые элементы в цепочку и замкнуть в кольцо, то по такой среде будет непрерывно без затухания циркулировать волна. Условно, такая ситуация возможна на отверстии в возбудимой среде или на непроводящем участке (на двумерном пространстве).

2.2. Аритмии и их модели 2.2.1. Реентри

Увеличение рефрактерного периода в некоторой области в возбудимой среде может привести к однонаправленной блокаде проведения. Это происходит если импульс повторно возбуждает тот участок, по которому уже проходил. Тогда нарушается проведение волны по типу повторного входа. Это явление называется реентри или спиральная волна. В большинстве случаев реентри является причиной возникновения экстрасистолы и пароксизмальной тахикардии. При фрагментировании и значительном увеличении количества реентри по миокарду различные его области сокращаются не синхронно, и возбуждение по ткани приобретает хаотичный характер, что приводит к фибрилляции сердца [13].

Такие спиральные волны могут поддерживаться в возбудимой среде вокруг некоторого центра. На реальной сердечной ткани такими центрами могут быть неоднородности, например, фиброзный рубец или отмершие от кислородного голодания клетки, оставшиеся после инфаркта. Если рассматривать двумерную возбудимую среду, имеющую препятствие, то на нём возможна циркуляция волны.

Такое может достигаться при определённых соотношениях скорости проведения волны, периода рефрактерности и радиуса кривизны непроводимого участка (Рисунок 6) [28].

Рисунок 6. Схема циркуляции волны на препятствии. а - проведение волны по замкнутому кольцу (в одномерной модели), б - формирование спиральной волны на отверстии (в двумерной модели) [28].

Сравнивая частоты у волн, исходящих из синоатриального узла, и у циркулирующих волн вокруг препятствия, можно обозначить более быстрые волны. На одном пространстве возбудимой среды более быстрая волна будет подавлять более медленную. Если частота циркуляции больше частоты исходящих волн, то распространение циркулирующих волн прекратится. Известно, что частота вращающейся вокруг препятствия волны обратно пропорциональна радиусу кривизны этого препятствия. Тогда, при малом радиусе частота увеличивается, что приводит к распространению спиральной волны по всей возбудимой поверхности. В случае сердечной ткани нарушается проведение возбуждения по миокарду, а значит нарушается сократительная работа в сердце, устанавливается хаотичное трепетание, приводящее к аритмийному состоянию [30, 31].

На формирование спиралей в возбудимой среде влияют многие факторы. В том числе, если частота волнового потока становится выше некоторого критического значения, то возможно возникновение закрученной волны. Также, наличие границы в виде острого угла приводит к отрыву и возникновению

реентри. В работе [31] был показан механизм возникновения спиральных волн на препятствии при высокочастотной стимуляции в реакции Белоусова-Жаботинского, полученный с помощью моделирования (Рисунок 7). При прекращении внешней стимуляции, в среде остается пара встречных спиральных волн. Если в среде имеется много препятствий, то по ней будет вращаться множество спиралей.

Рисунок 7. Реентри, возникающие в результате высокочастотных воздействий в возбудимой среде с препятствиями [31].

На препятствии в виде прямого угла также возникает закрученная волна в тот момент, когда частота последовательности волн становится критической (Рисунок 8).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Романова Серафима Артуровна, 2025 год

' - к, -

■ $ т

Нш

Рисунок 27. Колонии ИПСК через 24 часа после посадки на подложку из выровненных волокон. Увеличение 10х.

Если на анизотропную подложку пересаживать клетки, которые до этого дифференцировались на пластике, то после восстановления их цитоскелет также выравнивался вдоль волокон. При этом некоторые клетки собирались в отдельные кластеры, расположение которых также формировалось вдоль направления анизотропии (Рисунок 28). При проведении оптического картирования было показано, что в этом случае распространение кальциевой активности проходило быстрее по направлению анизотропии, в сравнении с любым другим направлением.

Рисунок 28. Выравнивание клеточной структуры вдоль направления анизотропии (вдоль волокон) у ИПСК-КМ. Синим цветом окрашены ядра и волокна ^АР1), зелёным - ^актин (цитоскелет). Наверху / внизу - посадка 100 тыс. / 50 тыс. клеток на образец диаметра 15 мм.

В случае проведения дифференцировки сразу на анизотропной подложке также образуются направленные клеточные структуры в направлении нановолокон (Рисунок 29).

А

■ ' Л' . у

"••Ж -'С!

Рисунок 29. Фотографии конфокальной микроскопии для визуализации иммуноцитохимического окрашивания ИПСК-КМ, чьё формирование проходило на анизотропной подложке (слева), изотропной подложке (посередине) и стекле (справа). а-актинин помечен красным цветом, £-актин - зелёным, ядра DAPI -синим. Стрелка показывает анизотропную ориентацию волокон. Шкала размером

100 мкм.

В случае дифференцировки кардиомиоцитов из ИПСК на изотропной подложке (хаотично расположенные волокна) клеточные сокращения по монослою происходили несинхронно. Клетки организовывались в отдельные кластеры, которые сокращались, но были разъединены друг от друга, вытянутые тяжи располагались по всему образцу неоднородно. Также, по сравнению с другими подложками в этом случае клетки начали сокращаться позднее всего. Наиболее активные сокращения кардиомиоцитов были зафиксированы на подложках из культурального пластика (Рисунок 30).

Рисунок 30. Сокращения в монослоях из ИПСК-КМ на анизотропной (А), изотропной (Б) подложках и стекле (В). Локальная скорость сдвига во время сокращения (мкм/с) продемонстрирована цветовой функцией. Белая стрелка показывает направление нановолокон в анизотропной подложке.

После 50 дня дифференцировки для образцов на разных подложках были проведены эксперименты по оптическому картированию. На рисунке 31 представлены активационные карты, показывающие проведение волны возбуждения по кардиомонослою при стимуляции образцов 1 Гц с помощью подведения точечного электрода. В монослое на изотропной подложке возбуждение проходило только в близлежащих к электроду клетках, а дальше по образцу волна возбуждения не проходила. На анизотропной нановолоконной подложке волна распростанялась неравномерно. Распространение возбуждения вдоль направления анизотропии было быстрее, чем в поперечном направлении. При этом, наиболее равномерное распространение волны было на образцах с пластиком и стеклом. Самый однородный монослой кардиомиоцитов был сформирован на культуральном пластике с покрытием матрикса Matrigel.

Рисунок 31. Активационные карты волн возбуждения на образцах с монослоями из дифференцированных кардиомиоцитов, чьё формирование проходило на различных подложках. А, Б / В / Г - анизотропная / изотропная подложка / стекло. Звёздочками показаны места подачи импульса 1 Гц точечным электродом, белыми стрелками - направление анизотропии. Цветовая шкала соответствует временной от красного цвета - 0 мс к синему - 370 мс.

4.3. Разработка микрополимерных комплексов для трансплантации одиночных кардиомиоцитов в неонатальном периоде дифференцировки в рамках создания новой клеточной терапии 4.3.1. Полимерные носители трансплантации отдельных

кардиомиоцитов

В работе была изучена трансплантация кардиомиоцитов в сердце крысы с использованием нановолоконных микроносителей. На рисунке 32 показаны компоненты, входящие в нановолоконный микроноситель, предназначенный для культивирования возбудимых изолированных кардиомиоцитов. Основной компонент - это полимерное нановолокно размерами около 0,85 мкм ± 0,18 мкм.

Для его создания использовался полимер PLLA, который формировался в виде волокна на установке электроспиннинга. В качестве второго компонента являлся белок фибронектина человека HFN. Волокна держались в его растворе в течение суток, за это время белок осаждался на поверхности волокна. Белок необходим для адгезии кардиомиоцитов, тем самым обеспечивая их крепление на волокнах. Третья составляющая - флуоресцентная метка, которая используется для оптического отслеживания. В работе используются следующие обозначения: MPC-образцы (microcarrier, protein, cell) - образцы из всех трёх составляющих, то есть нановолокно, белок, флуоресцентная метка и клетки, МР-образцами (microcarrier, protein) - микроносители без клеток, С-образцы (cell) - одиночные клетки без микроносителей.

Рисунок 32. Компоненты микроносителя и описание эксперимента. Путь из черных стрелок показывает обычный способ доставки клеток или инъекции. Фиолетовыми стрелками показан предлагаемый путь трансплантации клеток с использованием микроносителей. Кружками пронумерованы основные

компоненты микроносителей.

Необходимо было проверить взаимодействие клеток, культивированных на фрагментированных нановолокнах, с поверхностью изолированного сердца. Свежеприготовленную суспензию одиночных неонатальных крысиных кардиомиоцитов сажали на сетку (подвешенную плёнку) из нановолокон, прикрепленных к блокам полидиметилсилоксана PDMS. Через 24 часа культивирования клеточной суспензии, одиночные крысиные кардиомиоциты прикреплялись к поверхности нановолокон и восстанавливали спонтанную активность. Эту активность регистрировали на установке оптического картирования с помощью красителя йио-4 АМ через 24 часа после посева. Механизм адгезии клеток к тонким нановолокнам с восстановлением возбудимости был изучен ранее [128] и проиллюстрирован на рисунке 32 как основа разработанного метода доставки клеток.

Восстановление спонтанных сокращений доказывает клеточную адгезию. Регистрация сигналов спонтанной активности кардиомиоцитов показана на рисунке 33. При обработке результатов кальциевой активности для 16 различных клеток на 4 образцах было определено среднее значение сигнала при значениях частоты спонтанного возбуждения в промежутке 0,5-1,5 Гц. Усреднение считалось по кадру размером 3 на 3 пикселя со скоростью 34 кадра в секунду. Плотность клеток выбиралась так, чтобы клетки не образовывали связи друг с другом и не формировалась проводящая ткань (Рисунок 33А). В противном случае установление связи между клеткой и поверхностью сердца как единственного источника внешнего возбуждения было бы невозможно.

Рисунок 33. А - Спонтанное возбуждение неонатальных крысиных кардиомиоцитов, прикреплённых на микроносители до трансплантации. Б -Сигналы спонтанного возбуждения для 16 клеток в 4 разных образцах, диапазон

частот 0,5-1,5 Гц.

Таким образом, к моменту проведения эксперимента по оптическому картированию предполагалось, что каждая клетка осуществила процесс адгезии благодаря фибронектину ОТК, при этом обволакивая поверхность полимера. На рисунке 34 показано 3D-изображение клеток на волокнах до трансплантации: дно чашки показано здесь синим цветом (слабо заметно в промежутках между волокнами), а плоскость сетки нановолокон с прикрепленными клетками -оттенками красного и желтого. В таком состоянии клетки прикреплены к волокнам (Рисунок 33А, 34), снабжены флуоресцентным маркером йио-4 АМ и готовы к трансплантации.

Рисунок 34. ЗБ-изображение посева неонатальных крысиных кардиомиоцитов

перед трансплантацией.

В качестве ткани-реципиента использовалось изолированное сердце крысы (Рисунок 35). Подготовка к перфузии состояла из следующих этапов: анестезия животного, изоляция сердца и канюлирование его по методу Лангендорфа, промывание раствором Ту1^е и кардиоплегическая остановка раствором Нормакор и оксигенированным Ту1^е в соотношении 1:4. В таких условиях без изменения температурного режима достигалась временная (30 минут) остановка сердца для упрощения приживления трансплантата к неподвижной поверхности сердца. Сразу после остановки сердца клетки на плёнке из волокон переносили на сердечную ткань, а концы волокон отделяли от блоков PDMS. С этого момента кардиомиоциты оставались прикрепленными к фрагментам волокон (уже свободные от блоков PDMS), при этом волокна и обволакивающие клетки находились в непосредственном контакте с поверхностью сердца.

Далее, сердце и прикреплённые к нему кардиомиоциты хранились в жидкой среде при физиологической температуре. Хотя процессы возбуждения клеток останавливались кардиоплегическим раствором, препятствий для адгезии клеток не возникало. В результате наблюдалось прикрепление трансплантата к поверхности сердца: расположение клеток на поверхности фиксировалось и

оставалось неизменным, несмотря на движение перфузата, и сохранялось после восстановления сократительной активности сердца. Правая панель на рисунке 35 показывает расположение клеток (каждое цветовое пятно представляет собой стационарный сигнал йио-4 АМ от одной клетки) на поверхности сердца реципиента. В отличие от аналогичного 3D-изображения на рисунке 34, клетки расположены не в одной плоскости, а в соответствии с кривизной поверхности сердца.

О тт 2.5 тт

Рисунок 35. Место нанесения плёнки из волокон с кардиомиоцитами на поверхность сердца и его псевдо-3D-изображение. Изменение цвета от красного к синему показывает относительное расположение точек поверхности вдоль оси,

перпендикулярной плоскости рисунка.

Через 30 минут после трансплантации неонатальных крысиных кардиомиоцитов на сердце, перфузат заменяли насыщенным кислородом раствором Tyrode при температуре +37°С. В течение следующих 10 минут регистрировали восстановление спонтанной сердечной деятельности. Сначала происходило восстановление спонтанной активности у трансплантированных кардиомиоцитов. Восстановление сердечных сокращений после трансплантации клеток и отмывания кардиоплегии было успешным в 3 из 4 выполненных

повторов (Сердца №2-4), при этом спонтанная активность клеток восстанавливалась во всех случаях.

Ключевым предметом исследования в данном разделе работы была динамика кальциевой активности в неонатальных кардиомиоцитах во время систолы сердца. Электрическое возбуждение сердечной ткани в этом случае рассматривалось как внешний стимул для клеток, трансплантированных к сердцу во время кардиоплегической остановки. Необходимым условием регистрации сигнала Аио-4 АМ во время систолы сердца было смещение пиксельной рамки вслед за перемещением клеток. Процесс перемещения рамки проиллюстрирован на рисунке 36 на нижней правой панели.

На рисунках 36 и 37 приведен пример передачи сигналов йио-4 АМ от нескольких клеток, расположенных на поверхности бьющегося сердца (Сердце № 2). Сигнал каждой клетки показан на рисунке 37 и имеет общую ось времени с нижней панелью, показывающим начало и конец систолы сердца. Для каждой клетки во время диастолы имеется несколько ответов кальция, на рисунке они отмечены красными кружками сверху. Также, для каждой клетки приведен кальциевый ответ, зарегистрированный при смещении рамки вслед за клеткой во время систолического сокращения сердца, на рисунке они отмечены серым пунктиром и имеют ключевое значение. На рисунке 37 представлена интенсивность флуоресценции йио-4 АМ в трёх выбранных клетках, усредненная в пределах кадра размером 3х3 пикселя (результатное соотношение сигнал/шум составило 32 дБ), движущегося вместе с клетками во время фазы систолы. Итого, графики на рисунке 37 показывают, что в систолу все три клетки были синхронизированы друг с другом, а значит и с волной возбуждения в сердце, хотя ритмы спонтанной активности (например, во время диастолы) этих клеток изначально были разными. Значит, три одиночные клетки в систолу были синхронизированы с сердцем реципиента. Таким образом, возбуждение сердца реципиента становилось внешним источником стимуляции для всех трех трансплантированных клеток. Этот пример использован для иллюстрации, поскольку эффект иллюстрируется сразу на нескольких клетках.

Поверхность сердца

Волна возбуждения

Волна возбуждения

0.5 тт

Ортогональная проекция

время, с _

клетка 3 . клетка 2 [Н]

клетка 1 • 4

0.1 тт 3 рх

I- V

диастола систола

траектория

смещения

Рисунок 36. Анализ представлен для 3 клеток из 46 исследованных. Цветное изображение псевдо-3D-поверхности сердца, показывающее три возбудимые

клетки со спонтанной активностью, не связанных друг с другом. Цветовой градиент от красного к синему указывает относительное расположение точек поверхности вдоль вертикальной оси Оz. Систола и диастола показаны в ортогональной проекции области, выделенной желтым прямоугольником. Белые стрелки связывают видеокадр с соответствующим моментом времени в ортогональной проекции (систола и диастола); правая нижняя панель иллюстрирует траекторию смещения пиксельного кадра во время систолы; цветом показан момент времени, в который кадр занимал выбранное место.

О зарождении формирования электрической синхронизации между сердцем реципиента и трансплантатами свидетельствует наличие клеток группы "синхронных" клеток, то есть клеток с синхронным возбуждением с сердцем через определенное время после подсадки. Чтобы разделить кластеры на асинхронные (асинхр) и синхронные (синхр) группы через определенный период времени после подсадки на сердце, был реализован следующий подход: для каждой исследуемой клетки во время систолы записывался сигнал флуоресценции кальция длительностью 20 кадров и представлялся в виде 20-мерного вектора, где каждое измерение - это средняя яркость сигнала в кадре. Сигналы, представленные в этой форме, были подвергнуты анализу главных компонент с уменьшением размерности с 20 до 2, результат кластеризации показан на рисунке 39А. Сигналы с рисунка 33Б также были подвергнуты анализу главных компонент. Результатом анализа РСА была группа управляющих сигналов с синхронными сигналами, что доказывает наличие кальциевого возбуждения синхронных клеток во время систолы. В то же время асинхронные сигналы были за пределами кластера, следовательно, они были артефактом, связанным со сдвигом кадра во время систолы. Сводная статистика по обнаружению синхронных и асинхронных клеток в 4 проведенных экспериментах представлена на рисунке 39Б и в таблице 1.

Рисунок 37. Интенсивность флуоресценции йио-4 АМ в клетках (клетки 1-3), измеренная с помощью рамки, движущейся вместе с клеткой во время систолы. Красные точки обозначают спонтанное возбуждение трансплантатов во время диастолы сердца. На нижней панели показана производная сигнала по времени, построенная на основе ортогональной проекции в рисунке 36. Рост производной указывает на начало систолы, а стационарные значения - на начало диастолы.

Во всех 4 независимых экспериментах, весь зарегистрированный кальциевый сигнал клеток во время систолы можно разделить на две группы: «асинхронный» (асинхронный по отношению к возбуждению сердца) и «синхронный» (синхронный, соответственно). "Асинхронные" сигналы регистрируются у кардиомиоцитов со спонтанной активностью (без синхронного возбуждения с сердцем реципиента), а "синхронные" у кардиомиоцитов,

активность которых была синхронизирована с возбуждением сердца. Оба типа клеток проявляли спонтанную кальциевую активность во время диастолы, но имели различную активность во время систолы. Клеточный кластер принадлежал к синхронной группе, если его сигнал во время систолы имел ту же форму, что и контрольный сигнал, полученный от клеток перед трансплантацией (Рисунок 37). На рисунке 38 слева показаны такие сигналы от 22 клеток, идентифицированных как синхронные: средняя форма кальциевого ответа аналогична контрольному сигналу на рисунке 33Б. Случай с асинхронными кластерами был более сложным: очевидно, что сдвиг кадра, следующий за клеткой во время систолы, может регистрировать не только появление кальциевого ответа, но и случайные изменения в сигнале. Набор таких случайных сигналов показан в правой части рисунка 38 для 24 клеток. Ожидалось, что усреднение всех сигналов между собой будет являться просто шумом, но отдельные случаи усреднения могут иметь обманчивое сходство с контрольными сигналами кальция (два примера показаны на рисунке 38 справа).

100 1.00

0 0.75 / \ о 0.75 i j ;

Я Г Л. Cd

I

л /У' ^

Меап Mi Ц S Меап

ЯП ЦП I

V меап

0.50 1 % Я 0.50^7^

>j

Е

s

0 25 ' V ° 0 25

я 1 к

о -- / \ S

т»

i-^ О 00

0.00 -«--о 00

5 10 15 20 5 10 15 20

кадры кадры

Рисунок 38. Слева показаны примеры сигналов возбуждения fluo-4 AM для 22 «синхронных» клеток во время систолы сердца. Сигнал усреднялся в пределах кадра размером 3х3 пикселя со скоростью 34 кадра в секунду. Справа показаны образцы сигналов для 24 «асинхронных» клеток во время систолы сердца.

Среднее значение выделено синей пунктирной линией. Два примера «асинхронных» клеток выделены красным и оранжевым цветами, чтобы продемонстрировать случайное сходство с формой следа кальция.

Рисунок 39. А - Метод главных компонент для контрольных, «синхронных» и

«асинхронных» клеток. Б - Распределение клеток на «синхронные» и «асинхронные» группы в 4 проведенных экспериментах для сердец №1-№4.

Эксперимент Частота сердечных сокращений после промывания Синхронные (Всего 22/46) Асинхронные (24/46)

Сердце №1 (\Vistar, муж. 248 г) 0 Гц (систолы нет) 0 (систолы нет) 9

Сердце №2 (\Vistar, муж. 310 г) 0,78 - 1,28 Гц 5 2

Сердце №3 (\Vistar, муж. 225 г) 0,34-0,51 Гц 11 7

Сердце №4 (\Vistar, муж. 274 г) 0,51-0,68 Гц 6 6

Таблица 1. Сводная статистика по обнаружению синхронных и асинхронных

клеток в проведенных экспериментах.

4.3.2. Инъекция клеток с микроносителями в сердце крысы in

vivo

В данном разделе представлены результаты неинвазивного внешнего мониторинга приживления клеток, осуществляемого инъекционным способом с использованием полимерных микроносителей. Для упрощения транспорта клеток длину микроносителей уменьшили до размеров 86,2 ± 5,2 мкм (n = 50, точность ограничивалась неидеальным расположением волокон при прядении на

электроспиннинге). Это позволило беспрепятственно переносить суспензию с помощью иглы от инсулинового шприца. Использование более коротких фрагментов волокон не влияло на способность клеток восстанавливать возбудимость и сократимость. На рисунке 40 показано усреднённое оптическое изображение микроносителя с длиной фрагмента волокна около 90 мкм. Культивирование одного неонатального крысиного кардиомиоцита на микроносителе такого размера показало, что клетка также проявляла периодическую возбудимость и механические сокращения.

dF/dF

*ЛУ,Ч*Л 1

0 время, с 8

Рисунок 40. Исследование функциональности изолированных клеток in vitro на коротких фрагментах нановолокон, предназначенных для трансплантации через инсулиновую иглу. Белые стрелки указывают на полимерные волокна. Оптическое изображение микроносителя с длиной сегмента волокна около 90 мкм и сократительной клеткой на нём. В нижней части изображения показаны сокращения одиночной клетки, обёрнутой вокруг волокна, а в верхней половине

показаны характерные размеры волокна. График показывает нормированное изменение сигнала dF/dFmax с течением времени в области, выделенной

квадратной рамкой.

Перед введением коротких микроносителей с клетками (MPC-образцы) в крысиный миокард MPC-образцы тестировали на кардиальном монослое in vitro. На рисунках 41 и 42А изображена адгезия трансплантируемых клеток к монослою кардиомиоцитов с проекцией с цветовой кодировкой (Рисунок 41) и в ортогональных проекциях (Рисунок 42А). Клетки сохраняли способность прикрепляться и сокращаться на волокнах, а клеточный цитоскелет сохранял пластичность без потери адгезии к микроносителю. На рисунке 42Б показаны клетки, посаженные на микроносители перед переносом в инъекционный шприц. Видно, что не все волокна в MPC-образцах были покрыты клетками: расчетная эффективность покрытия составила 45% ± 4% (n = 4).

Рисунок 41. Адгезия клеток к монослою кардиомиоцитов с проекцией с цветовой кодировкой. Цветовая шкала указывает координаты по оси Оz. Белые стрелки

указывают на полимерные волокна.

Рисунок 42. А - Ортогональные проекции изображения, показанного на рисунке 41. Б - Плотность посева клеток на микроносители для получения MPC-образцов.

Все образцы были протестированы in vivo с помощью коротких операций на крысах. Путем инъекции были введены следующие образцы: 10 крысам -С-образцы (клеточная суспензия), 15 крысам - MP-образцы (суспензия из микроносителей, покрытых белком HFN), 15 крысам - MPC-образцы (суспензия из микроносителией, покрытых белком HFN и адгезивные клетки). C-образцы и MPC-образцы были помечены красителем LumiTracker Mito, MP-образцы -красителем BPD (так как эти образцы без клеток). Перед основными экспериментами, в качестве теста окрашивания и работы установки картирования in vivo, также вводили образцы каждого типа в лапы одного-двух животных на группу. Все подобные контроли были видны через 24 часа для всех образцов. Визуализация in vivo показала биение сердца с мечеными образцами для всех групп крыс (Рисунок 43, соотношение сигнал/шум в необработанных видеозаписях составляло 13-19 дБ). Флуоресцентный сигнал подвергали качественному анализу для определения устойчивости красителя в сердце после инъекции.

Визуализация LumiTracker Mito

а

Nb л Y*

и ^Р «

К SS

X ' Г T Д-

Ц w

Сердцебиение ^

o a K

a> _^^^^ _ Л

l V c¿

X

S

Рисунок 43. Визуализация красителя (МРС-образцы: клетки + волокна, покрытые белком ОТК) у живой крысы с бьющимся сердцем. Краситель, используемый в сочетании с полимерными волокнами, позволяет обнаруживать флуоресценцию

без вскрытия животного.

Через сутки после проведения операции флюоресценция в сердце наблюдалась для С-образцов в 90% случаев (у 9 из 10 крыс), для МР-образцов - в 93% (у 14 из 15 крыс), для МРС-образцов - в 80% (у 12 из 15 крыс), сводная статистика показана на рисунке 44А. На третьи сутки после инъекции наблюдалось резкое снижение частоты флуоресценции С-образцов (80%), продолжавшееся до двух недель. Через две недели флуоресценция наблюдалась только у 30% крыс из группы. Гистологический анализ подтвердил наличие трансплантатов в МРС-образцах с наблюдаемой внешней флуоресценцией

(Рисунок 44Б). В течение трёх дней после инъекции флуоресценция MP-образцов регистрировалась у 86% крыс из этой группы, флуоресценция MPC-образцов была аналогичной (80%). Через две недели после операции флуоресценция наблюдалась в размере 80% для группы крыс с MP-образцами и 70% для группы крыс с MPC-образцами. Гистологический контроль срезов сердца крыс после инъекции MPC-образцов показал, что не только волокна были видны и прикреплены, но и часть клеток оказалась внедренной в ткань сердца (поскольку флуоресценция на рисунке 44Б обеспечивается LumiTracker Mito красителем). Таким образом, использование микроносителей улучшило выживаемость клеток in vivo по сравнению с использованием традиционной клеточной суспензии.

Б

3 ■ - МР-образцы - МРС-образцы ■ - С-образцы МРС-образцы С-образцы

i loo i

О I 0.75

Z I 0-50

5 ЕС

п 8 0.25 а

£

Л 0.00

1 день 3 дня 1 неделя 2 недели ■ -LumiTracker Mito

Рисунок 44. Наблюдение за результатами инъекций in vivo. А - Изменения флуоресценции с течением времени: MP-образцы (синий), MPC-образцы (желтый) и C-образцы (красный) . Б - Гистологический контроль среза сердца (60 мкм) после инъекций MPC-образца (слева) и C-образца (справа) через 14 дней после операции. Черные треугольные стрелки указывают на трансплантаты. Перед инъекциями клетки на микроносителях метили красным флуоресцентным красителем LumiTacker Mito.

4.4. Исследование влияния концентрации ионов в среде на кардиомиоциты, полученные при клеточной дифференцировке из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека 4.4.1. Изменение потенциала действия дифференцированных кардиомиоцитов под действием изопреналина

Для направленной дифференцировки в кардиомиоциты использовалась клеточная линия ИПСК m34Sk3. Цитоскелет дифференцированных человеческих кардиомиоцитов представлен на рисунке 45, где с помощью иммуноцитохимического метода были окрашены а-актинин и ядра DAPI. Окрашивание а-актинина показывает четкие бороздки внутри клеток с продольным размером приблизительно 55 ± 14 мкм. При проведении оптического картирования был показан оптический потенциал действия (ПД) в контроле и под действием изопреналина с отчетливой фазой плато (Рисунок 46А). Видно, что под действием изопреналина ПД укорачивается. Длительность потенциала действия (ПД) при 80%-ной реполяризации (APD80) составила 364 ± 21 мс (п = 5), что соответствует как желудочковым кардиомиоцитам, выделенным из человека (372 ± 16 мс; [129]), так и дифференцированным из ИПСК кардиомиоцитам (332 ± 38 мс; [130]).

Ш А .

•V У а-асйшп

Ш'

Рисунок 45. Иммуноцитохимический анализ дифференцированных из ИПСК кардиомиоцитов: а-актинин (красный) и DAPI (синий).

Зрелость дифференцированных кардиомиоцитов из ИПСК, а также их гетерогенность в пределах одного монослоя и между монослоями были дополнительно изучены путем тестирования эффекта в-адренергической стимуляции и селективной блокады 1Кг-канала. Добавление изопреналина (ИЗО) 1 мкМ вызывало сокращение ПД на 27% (с 364 ± 21 до 267 ± 15 мс, п = 5) (Рисунок 46А), в то время как ранее сообщалось о несколько меньшем сокращении на 14% при использовании препаратов с изопреналином (ИЗО) в концентрации 100 нМ [129]. На рисунке 46Б показано распределение APD80 в монослое дифференцированных кардиомиоцитов: контроль обозначен чёрным цветом (APD80 = 315 ± 30 мс), фиолетовым цветом обозначен образец после добавления ИЗО концентрации 1 мкМ (APD80 = 234 ±18 мс). Блокирование тока 1Кг с помощью Е-4031 (0,5 мкМ) увеличило значение APD80 до 416 ± 82 мс (Рисунок 46Б, жёлтый цвет). При этом, ранее сообщалось об увеличении APD90 на 70 мс при добавлении Е-4031 в изолированных желудочковых клетках [131], а в

желудочках человека о увеличении APD80 на 70% [132]. Применение изопреналина вместе с E-4031 привело к удлинению APD (APD80 = 277 ± 51 мс, на рисунке обозначено синим цветом) [129, 131, 133, 134, 135].

Рисунок 46. А - Оптический потенциал действия в контрольном образце (черный) и при добавлении изопреналина (фиолетовый). Б - APD80 в контрольном образце, с добавлением изопреналина, Е-4031 и

изопреналин + Е-4031.

4.4.2. Моделирование гиперкалиемии

Ранее сообщалось о двухфазной зависимости скорости проведения (СУ) волны возбуждения от концентрации К+ у морских свинок [41, 47]. При низких концентрациях калия разница между мембранным потенциалом покоя и порогом активации больше, что приводит к снижению СУ. С другой стороны, в условиях гиперкалиемии СУ снижается из-за частичной инактивации Ка+-канала. Также, СУ зависит от ряда других факторов, наиболее важными из которых являются амплитуда и проводимость ЩК.

Эксперименты оптического картирования с кальций-зависимым красителем (активационная карта приведена на рисунке 47) в монослоях дифференцированных кардиомиоцитов показали, что скорость проведения составляет 5,2 ± 1,8 см/с в условиях нормокалиемии, то есть когда [К+] = 5,4 мМ

(Рисунок 48). Это значение сравнимо с ~ 60 см/с, характерным для человеческого сердца [136, 137], а также аналогично измерениям в монослоях [138] и объясняется отсутствием организованных волокон в кардиальных монослоях. В условиях гипокалиемии изменений в CV не наблюдалось: при концентрации 2,7 мМ внеклеточного калия К+, скорость проведения волны CV составляла 4,9 ± 2,2 см/с. Повышенная концентрация калия К+ приводила к постепенному снижению СУ до 0,9 ± 0,8 см/с при [К+] = 14 мМ. При [К+] > 14 мМ волны возбуждения на монослое не наблюдалось.

£ ^ Ц Я 90 мс ГТ^Г-

В ,Г ^ 0-йимул

0 --50 мс - Распространение волны

1 1тт | Юме

Рисунок 47. Распространение потенциала действия в условиях гиперкалиемии.

Активационная карта оптического картирования показывает распространение волны возбуждения. Скорость проведения волны измеряли в продольном

направлении, отмеченном стрелкой.

[К+], мМ

Рисунок 48. Зависимость скорости проведения волны возбуждения по монослою ИПСК-КМ от концентрации внеклеточного К+.

112

5. Выводы и обсуждения

В работе использовался комплексный подход к изучению формирования кардиального синцития и его электромеханических свойств в зависимости от его внешнего микроокружения. В том числе изучалось влияние анизотропии и жёсткости подложек на формирование кардиомонослоя, влияние глобальной анизотропии на образование спиральной волны реентри на геометрическом непроводящем препятствии, проведение возбуждения в условиях гиперкалиемии, а также моделировались методы клеточной доставки в сердце с помощью нановолоконных микроносителей.

Экспериментально были исследованы условия, при которых циркулирующие спиральные волны могут генерироваться высокочастотным волновым пакетом вблизи прямоугольного геометрического препятствия в сочетании с глобальной анизотропией подложки, совпадающей с одной из его сторон. Такая система позволяет сохранять симметрию вершины препятствия как при направленной анизотропии, так и при изменении анизотропии (отношение скорости проведения вдоль волокон и поперек).

При распространении возбуждения по образцу происходит следующее. Сначала по ткани с равномерно распределенными неоднородностями начинают последовательно распространяться волны. Далее на границе геометрического препятствия создается локальное рассогласование ткани на передачу возбуждения, то есть образуется однонаправленный блок проводимости, тем самым локально «фокусируя» возмущения в её окрестности. После чего, либо волна преодолевает однонаправленный блок, либо однонаправленный блок продолжает расти. Если его размер превышает характерный размер ядра реентри, то само возникновение реентри становится возможным, а преодоление препятствия приведет к образованию спиральной волны. Устойчивый рост однонаправленного блока чаще наблюдался при стимуляции по направлению анизотропии. Это можно объяснить тем, что граница после прохождения препятствия в основном состоит из хорошо выровненных боковых сторон клеток [139], проводимость между которыми в основном обеспечивается ЭФС. При стимуляции поперёк анизотропии рост

однонаправленного блока менее стабилен, поскольку поперечные стороны клеток менее упорядочены и имеют высокую плотность ЩК. Эти рассуждения можно применять впоследствии к ткани предсердий сердца человека из-за схожей структуры выравнивания клеток [140, 141].

Высокочастотная стимуляция образца вдоль направления анизотропии приводит к более широкому набору значений Ткр и максимальной скорости проведения волны возбуждения, а также к более вероятному образованию реентри. При этом значения Ткр смещены в сторону более высоких частот стимуляции. На практике частотный коридор может быть сильно увеличенным, за счет ингибирования тока Na [142], или достаточно широким в общем случае (без блокаторов каналов) [143]. Характерный размер коридора можно оценить как 10% от длительности ПД [141], то есть для подавляющего большинства экспериментальных моделей 20-40 мс. Для эффективного тестирования веществ на ткани кардиомиоцитов необходимо учитывать влияние ЩК на передачу возбуждения. Предполагается, что активное вещество может внедряться в клеточную мембрану и изменять как свойства трансмембранных белков, так и условия для образования ЭФС между мембранами соседних клеток [143, 144].

Помимо непосредственного изучения формирования спиральной волны в работе тестировались различные подложки для культивирования клеток как для неонатальных крысиных кардиомиоцитов, так и для дифференцированных кардиомиоцитов из ИПСК человека. Безусловно свойства микроокружения влияют на формирование ткани и её электромеханические характеристики. При клеточном культивировании в лабораторных условиях подложки играют роль внеклеточного матрикса в реальной ткани. В проведённом исследовании было показано, что изменение свойств жесткости у подложки влияет на скорость проведения волны возбуждения по монослою. В частности, с увеличением жёсткости подложки скорость проведения волны увеличивается. Данный результат может использоваться при создании подложек с оптимальными свойствами для формирования зрелого фенотипа кардиомиоцитов in vitro. Это позволит приблизить фенотип культивируемых клеток к кардиомиоцитам

пациента, что необходимо при исследованиях по кардиотоксичности фармпрепаратов на пациент-специфичных клеточных линиях.

При создании подложек с выровненной структурой был отмечен эффект организации дифференцирующихся клеток в тяжи. Предполагается, что такое преобразование связано со свойством усиления актинового цитоскелета в ответ на внешнюю силу. При натяжении нановолокна возникает внешнее напряжение, под действием которого ремоделируются актиновые нити [145]. При максимальном напряжении актиновые филаменты выравниваются относительно друг друга и происходит межклеточное выравнивание цитоскелетов. Этот процесс можно описать гамильтоновой механикой [146], в которой расписывается сила, под действием которой происходит образование тяжеподобных структур и их стабилизация. Данный результат может быть полезен для регенеративной медицины с точки зрения волоконной архитектуры в тканевой инженерии сердца.

Также, в работе был разработан один из подходов, который потенциально может применяться в заместительной клеточной терапии для лечения и восстановления повреждённой миокардиальной ткани. Для правильной реализации клеточной доставки необходимо, чтобы адгезивные миоциты были жизнеспособны и связаны с электромеханическим синцитием ткани реципиента, что недостижимо без внешнего каркаса-субстрата. При этом, внешний каркас может осложнять доставку клеток, например, затрудняя интрамиокардиальную инъекцию. Принимая во внимание эти проблемы были разработаны микроносители, которые представляют собой полимерный каркас с "окутанными" вокруг него клетками.

Одной из важных и необходимых задач для создания микроносителей является подбор наиболее оптимального состава полимера [147]. В качестве материала для создания нановолокон был выбран поли^-лактид (PLLA) - это биосовместимый и биодеградируемый полимер, широко используемый для медицинских изделий. Получаемые из этого полимера волокна тоньше нативных фиброиновых волокон [128]. Благодаря тому, что отдельная клетка "обхватывает" нановолокно, существенно увеличивается площадь контакта, что способствует

прикреплению к нему клетки [128]. Получается, что каркас находится «внутри» клетки, при этом оставаясь снаружи клеточной мембраны. В результате раствор для инъекции представляет собой суспензию клеток на компактных носителях, вместо суспензии одиночных кардиомиоцитов.

Была подтверждена способность нановолоконных полимерных каркасов механически связывать трансплантированные кардиомиоциты и ткань реципиента. Также, получаемые каркасы являются достаточным субстратом для адгезии клеток. Это свойство позволяет осуществлять клеточною трансплантацию без ферментативной дезагрегации, так как вместо изоляции клеточной культуры можно изолировать фрагментированные полимерные волокна. Благодаря этому, клетки успевают восстановить возбудимость и сократимость до момента трансплантации, что инициирует и ускоряет процесс электрофизиологического связывания с тканью реципиента. При этом полимерное нановолокно (каркас) покрыто белком фибронектином человека [67] и дополнительно может нести в себе флуоресцентные маркеры для неинвазивного контроля нахождения клетки.

В данном исследовании были проработаны два важных вопроса. Во-первых, предлагаемая конструкция обёрнутого нановолокна клеткой является наиболее эффективной в отличие от способа доставки клеток на носителе и инъекции отдельных клеток без носителя. Если при этом минимизировать диаметр волокна, то трансплантат образует плотный контакт с тканью реципиента. Такой метод клеточной доставки может помочь решить имеющиеся проблемы в клеточной терапии миокарда. Во-вторых, важен механизм электромеханического сопряжения клетки-трансплантата и ткани реципиента. Наличие мобильного микроносителя позволяет клетке быть возбудимой к моменту первого контакта с тканью, в отличие от одиночной клетки [67]. Недавние исследования показали эфаптический механизм электромеханической связи (без образования ЩК) как при проведении возбуждения через ткань [148], так и при взаимодействии реципиента и трансплантата [61]. ЭФС возможна тогда, когда оба элемента возбудимы [59]. Ранее было предположено, что обернутый волоконный микроноситель может способствовать быстрому образованию ЭФС до формирования ЩК [67]. В

представленной работе была поставлена задача исследовать возможно ли возникновение ЭФС in vivo. Для этого электромеханическую синхронизацию фиксировали сразу после доставки клеток, а не с дневным интервалом, как в других исследованиях с использованием оптического картирования [57, 65]. Образование ЭФС между трансплантатом и тканью реципиента до образования ЩК может играть важную роль в методологии по устранению острых аритмий приживления.

Также, в работе были получены данные о проведении волн возбуждения по кардиомиоцитам, полученным из ИПСК, в условиях гиперкалиемии. В условиях нормокалиемии при концентрации внеклеточного калия [K+] = 5,4 мМ скорость проведения составляла 5,2 ± 1,8 см/с. Это значение достаточно низкое по сравнению с ~ 60 см/с, типичными для человеческого сердца, но аналогично измерениям в монослоях и объясняется отсутствием организованных волокон в полученных in vitro монослоях. В условиях гипокалиемии изменений в скорости проведения не наблюдалось: при [K+] = 2,7 мМ скорость составляла 4,9 ± 2,2 см/с. Повышение концентрации калия приводило к постепенному снижению скорости до 0,9 ± 0,8 см/с при [K+] = 14 мМ, а при [K+] >14 мМ стимуляция ткани была невозможной. Моделирование таких экспериментов позволяет создать систему для подбора и тестирования лекарственных соединений или клеточной терапии в условиях гиперкалиемии для кардиомиоцитов человека. Состояние гиперкалиемии играет решающую роль в первые минуты развития ишемии, именно поэтому важно и необходимо изучать вызываемые ей эффекты и механизмы в кардиомиоцитах.

117

6. Заключение

В данном исследовании были поставлены и выполнены следующие задачи:

• Смоделированы образцы с монослоями неонатальных крысиных кардиомиоцитов, имеющие глобальную анизотропию и геометрическое непроводящее препятствие в виде прямого угла. При стимуляции такого образца был исследован набор критических частот Ткр вдоль направления анизотропии и поперек, на которых образуется спиральная волна реентри. Было выявлено, что в такой системе возникает устойчивый рост вероятности однонаправленного блока и образования реентри. Особую роль в этом процессе играет не только наличие щелевых контактов между кардиомиоцитами, но также и эфаптическая связь. Существует граница применения гомогенного подхода к моделированию анизотропии.

• Было изучено проведение волн возбуждения и формирование монослоев из кардиомиоцитов, полученных из человеческих ИПСК, в зависимости от внешнего микроокружения с последующим сравнением структурных и функциональных особенностей. Создавались полимерные подложки с разной степенью жёсткости, а также подложки с анизотропными свойствами при помощи метода электроспиннинга. Таким образом было показано, что не всегда подложки, более близкие к нативной структуре по механическим свойствам, являются более оптимальными для формирования монослоя кардиомиоцитов при дифференцировке. Но при этом изменения данных характеристик у культуральной подложки в процессе дифференцировки кардиомиоцитов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) позволяют создавать тканево-инженерные конструкции, которые наиболее близки к нативной ткани желудочков сердца человека.

• Спроектированы методы трансплантации неонатальных кардиомиоцитов в сердце крысы. В работе использовались два подхода: подсадка клеток на микроносителях в виде плёнки, а также инъекция суспензии из микроносителей с посаженными на них кардиомиоцитами. В первом случае выявлялась динамика кальциевой активности в трансплантируемых клетках во время систолы

донорского сердца. Электрическое возбуждение сердечной ткани в этом случае рассматривалось как внешний стимул для трансплантируемых клеток. В случае проведения инъекций в сердце крысы использование микроносителей с одиночными клетками улучшило их выживаемость по сравнению с использованием традиционной клеточной суспензии, а также показало высокую эффективность скорости образования электромеханического контакта между трансплантированными кардиомиоцитами и сердечной тканью реципиента, где время образования связи достигает до 50 минут.

• Выявлено влияние концентраций ионов внеклеточного калия на монослоях дифференцированных кардиомиоцитов из ИПСК. Исследованы изменения потенциала действия под влиянием вещества изопреналина, а также при блокировке калиевых каналов при добавлении вещества Е-4031. Наблюдалось постепенное снижение скорости проведения волны возбуждения по кардиослою в условиях гиперкалиемии. При достижении внеклеточной концентрации калия в 14 мМ дальнейшая стимуляция кардиомиоцитов была невозможна.

Благодаря достигнутым результатам была успешно выполнена цель настоящей работы, а результаты отражены в главах представленной диссертации. Было проведено изучение влияния моделируемого микроокружения при варьировании подложек и сред для клеточного культивирования на функциональные особенности кардиомиоцитов, в том числе их аритмогенные свойства в монослоях. В качестве исследуемых клеточных линий использовались животные и человеческие клетки, включая кардиомиоциты, дифференцированные из ИПСК.

119

7. Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность своему научному руководителю Валерии Александровне Цвелой за обучение, передачу опыта и наставничество, а также профессору Константину Игоревичу Агладзе за мотивацию и научную консультацию.

Автор благодарит своих коллег, Слотвицкого Михаила Михайловича, Коваленко Сандаару Георгиевну, Долгодворову Алерию Альбертовну, Бережного Андрея Константиновича, Сергееву Татьяну Олеговну, Фролову Шейду Рауф Кызы, Низамиеву Айгуль Альфредовну и весь коллектив лаборатории экспериментальной и клеточной медицины МФТИ за продуктивную помощь в проведении исследовании, а также Агапова Игоря Ивановича, Ефимова Антона Евгеньевича за огромную помощь в работе с микроносителями и публикации результатов (НМИЦ трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова). Также автор бесконечно признателен Дементьевой Елене Вячеславовне (ИЦиГ СО РАН) за неоценимую помощь в освоении работы с ИПСК. За неоценимую помощь в подготовке и защите диссертации автор благодарит Малохатку Екатерину Владимировну и Дубровскую Анастасию Григорьевну.

120

8. Список литературы

1. Wang H. et al Global, regional, and national life expectancy, all-cause mortality, and cause-specific mortality for 249 causes of death, 1980-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015 //The lancet. - 2016. - Т. 388. - №. 10053. - С. 1459-1544.

2. Roth G. A. et al. Global and regional patterns in cardiovascular mortality from 1990 to 2013 //Circulation. - 2015. - Т. 132. - №. 17. - С. 1667-1678.

3. Fenton F. H. et al. Multiple mechanisms of spiral wave breakup in a model of cardiac electrical activity //Chaos: An Interdisciplinary Journal of Nonlinear Science. - 2002. - Т. 12. - №. 3. - С. 852-892.

4. Rabinovitch A. et al. A possible new cardiac heterogeneity as an arrhythmogenic driver //Scientific Reports. - 2023. - Т. 13. - №. 1. - С. 7571.

5. Zipes D. P., Jalife J. Cardiac electrophysiology: from cell to bedside e-book: expert consult. - 2009.

6. Majumder R. et al. Self-restoration of cardiac excitation rhythm by anti-arrhythmic ion channel gating //Elife. - 2020. - Т. 9. - С. e55921.

7. Maciunas K. et al. The role of the Cx43/Cx45 gap junction voltage gating on wave propagation and arrhythmogenic activity in cardiac tissue //Scientific Reports. - 2023. - Т. 13. - №. 1. - С. 14863.

8. Weinberg S. H. Ephaptic coupling rescues conduction failure in weakly coupled cardiac tissue with voltage-gated gap junctions //Chaos: An Interdisciplinary Journal of Nonlinear Science. - 2017. - Т. 27. - №. 9.

9. Haneke T., Sahara M. Progress in bioengineering strategies for heart regenerative medicine //International Journal of Molecular Sciences. - 2022. - Т. 23. - №. 7. -С. 3482.

10. Takahashi F. et al. The exciting realities and possibilities of iPS-Derived cardiomyocytes //Bioengineering. - 2023. - Т. 10. - №. 2. - С. 237.

11. Ul Haq A. et al. Intrinsically conductive polymers for striated cardiac muscle repair //International Journal of Molecular Sciences. - 2021. - Т. 22. - №. 16. -С. 8550.

12. Sekine H., Okano T. Capillary networks for bio-artificial three-dimensional tissues fabricated using cell sheet based tissue engineering //International Journal of Molecular Sciences. - 2020. - Т. 22. - №. 1. - С. 92.

13.Евлахов В. И., Пуговкин А. П., Рудакова Т. Л., Шалковская Л. Н. Основы физиологии сердца: учебное пособие //Санкт-Петербург: СпецЛит. - 2015. -С. 335.

14.Камкин А. Г., Каменский А. А. Фундаментальная и клиническая физиология //М.: Академия. - 2004. - С. 521-551.

15. Li R. K., Weisel R. D. (ed.). Cardiac regeneration and repair: Biomaterials and tissue engineering. - Elsevier. - 2014.

16.Zhao Y. et al. A microfluidic system for cell type classification based on cellular size-independent electrical properties //Lab on a Chip. - 2013. - Т. 13. - №. 12. -С. 2272-2277.

17. Williams D. A. et al. Spontaneous and propagated calcium release in isolated cardiac myocytes viewed by confocal microscopy //American Journal of Physiology-Cell Physiology. - 1992. - Т. 262. - №. 3. - С. C731-C742.

18.Kleber A. G., Rudy Y. Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated arrhythmias //Physiological reviews. - 2004. - Т. 84. - №. 2. - С. 431-488.

19.Brandt B. L. et al. Action potentials in the rat chromaffin cell and effects of acetylcholine //The Journal of physiology. - 1976. - Т. 263. - №. 3. - С. 417-439.

20.Heath B., Gingrich K., Kass R. S. Ion Channels in the Heart: Cellular and Molecular Properties of Cardiac Na, Ca, and K Channels //Comprehensive Physiology. - 2011. - С. 548-567.

21. Sunderland M. A. Ion Channels of Excitable Membranes [Электронный ресурс]. Sinauer. - 2001. - Т. 507.

22.Rudy Y. The cardiac ventricular action potential //Comprehensive physiology. -2011. - С. 531-547.

23.Aliev R. R., Panfilov A. V. A simple two-variable model of cardiac excitation //Chaos, Solitons & Fractals. - 1996. - Т. 7. - №. 3. - С. 293-301.

24.Nerbonne J. M., Kass R. S. Molecular physiology of cardiac repolarization //Physiological reviews. - 2005. - Т. 85. - №. 4. - С. 1205

25.Spector P. S. et al. Class III antiarrhythmic drugs block HERG, a human cardiac delayed rectifier K+ channel: open-channel block by methanesulfonanilides //Circulation research. - 1996. - Т. 78. - №. 3. - С. 499-503.

26.Bouchard R. A., Clark R. B., Giles W. R. Effects of action potential duration on excitation-contraction coupling in rat ventricular myocytes: action potential voltage-clamp measurements //Circulation research. - 1995. - Т. 76. - №. 5. - С. 790-801.

27.Sah R., Ramirez R. J., Backx P. H. Modulation of Ca2+ release in cardiac myocytes by changes in repolarization rate: role of phase-1 action potential repolarization in excitation-contraction coupling //Circulation research. - 2002. -Т. 90. - №. 2. - С. 165-173.

28.Михайлов А. А. Волны в сердце. //Квант. - 1987. - №. 9.

29. Starmer C. F. et al. Vulnerability in an excitable medium: analytical and numerical studies of initiating unidirectional propagation //Biophysical journal. -1993. - Т. 65. - №. 5. - С. 1775-1787.

30.Pertsov A. M. et al. Spiral waves of excitation underlie reentrant activity in isolated cardiac muscle //Circulation research. - 1993. - Т. 72. - №. 3. - С. 631-650.

31.Agladze K. et al. Rotating spiral waves created by geometry //Science. - 1994. -Т. 264. - №. 5166. - С. 1746-1748.

32.Efimov I. R., Krinsky V. I., Jalife J. Dynamics of rotating vortices in the Beeler-Reuter model of cardiac tissue //Chaos, Solitons & Fractals. - 1995. - Т. 5. - №. 3-4. - С. 513-526.

33.Weiss J. N. et al. Chaos and the transition to ventricular fibrillation: a new approach to antiarrhythmic drug evaluation //Circulation. - 1999. - Т. 99. - №. 21. - С. 2819-2826.

34.Oliver E., Mayor Jr F., D'Ocon P. Beta-blockers: historical perspective and mechanisms of action //Revista Española de Cardiología (English Edition). -2019. - T. 72. - №. 10. - C. 853-862.

35.Wachter S. B., Gilbert E. M. Beta-adrenergic receptors, from their discovery and characterization through their manipulation to beneficial clinical application //Cardiology. - 2012. - T. 122. - №. 2. - C. 104-112.

36.Jaffe R., Weiss A. T., Rosenheck S. Combined isoproferenol and epinephrine for the resuscitation of patients with cardiac asystole secondary to coronary artery disease //The American journal of cardiology. - 1996. - T. 77. - №. 2. - C. 194-195.

37. Vargas G., Akhtar M., Damato A. N. Electrophysiologic effects of isoproterenol on cardiac conduction system in man //American Heart Journal. - 1975. - T. 90. -№. 1. - C. 25-34.

38.Tsvelaya V. A. et al. Cardiac excitation waves under strong hyperkalemia condition //JETP Letters. - 2018. - T. 108. - C. 548-552.

39. Shaw R. M., Rudy Y. Electrophysiologic effects of acute myocardial ischemia: a theoretical study of altered cell excitability and action potential duration //Cardiovascular research. - 1997. - T. 35. - №. 2. - C. 256-272.

40.Alfonzo A. V. M. et al. Potassium disorders - clinical spectrum and emergency management //Resuscitation. - 2006. - T. 70. - №. 1. - C. 10-25.

41.Weiss J. N., Qu Z., Shivkumar K. Electrophysiology of hypokalemia and hyperkalemia //Circulation: arrhythmia and electrophysiology. - 2017. - T. 10. -№. 3. - C. e004667.

42.Buchanan Jr J. W., Saito T., Gettes L. S. The effects of antiarrhythmic drugs, stimulation frequency, and potassium-induced resting membrane potential changes on conduction velocity and dV/dtmax in guinea pig myocardium //Circulation research. - 1985. - T. 56. - №. 5. - C. 696-703.

43.Bartos D. C., Grandi E., Ripplinger C. M. Ion channels in the heart //Comprehensive physiology. - 2015. - T. 5. - №. 3. - C. 1423.

44.Kagiyama Y., Hill J. L., Gettes L. S. Interaction of acidosis and increased extracellular potassium on action potential characteristics and conduction in guinea pig ventricular muscle //Circulation research. - 1982. - T. 51. - №. 5. - C. 614-623.

45.Kanno T., Matsuda K. The effects of external sodium and potassium concentration on the membrane potential of atrioventricular fibers of the toad //Journal of General Physiology. - 1966. - T. 50. - №. 2. - C. 243-253.

46.Jeevaratnam K. et al. Cardiac potassium channels: physiological insights for targeted therapy //Journal of cardiovascular pharmacology and therapeutics. -2018. - T. 23. - №. 2. - C. 119-129.

47.King D. R. et al. The conduction velocity-potassium relationship in the heart is modulated by sodium and calcium //Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. - 2021. - T. 473. - №. 3. - C. 557-571.

48.Parham W. A. et al. Hyperkalemia revisited //Texas Heart Institute Journal. -2006. - T. 33. - №. 1. - C. 40-47.

49.Rivera-Juárez A. et al. Clinical characteristics and electrophysiological mechanisms underlying Brugada ECG in patients with severe hyperkalemia //Journal of the American Heart Association. - 2019. - T. 8. - №. 3. - C. e010115.

50.Miziara I. D. et al. Research ethics in animal models //Brazilian journal of otorhinolaryngology. - 2012. - T. 78. - №. 2. - C. 128-131.

51.Motayagheni N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: improved heart quality and decreased risk of ischemia //MethodsX. - 2017. - T. 4. - C. 508-512.

52.Bell R. M., Mocanu M. M., Yellon D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion //Journal of molecular and cellular cardiology. - 2011. - T. 50. - №. 6. - C. 940-950.

53.Manning A. S. et al. Myocardial ischaemia: an isolated, globally perfused rat heart model for metabolic and pharmacological studies //European Journal of Cardiology. - 1980. - T. 11. - №. 1. - C. 1-21.

54.Curtis M. J. Characterisation, utilisation and clinical relevance of isolated perfused heart models of ischaemia-induced ventricular fibrillation //Cardiovascular research. - 1998. - T. 39. - №. 1. - C. 194-215.

55.Lux M. et al. In vitro maturation of large-scale cardiac patches based on a perfusable starter matrix by cyclic mechanical stimulation //Acta biomaterialia. -2016. - T. 30. - C. 177-187.

56.Laflamme M. A. et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts //Nature biotechnology. - 2007. - T. 25. - №. 9. - C. 1015-1024.

57. Shiba Y. et al. Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts //Nature. - 2016. - T. 538. - №. 7625. - C. 388-391.

58. Slotvitsky M. M. et al. Formation of an electrical coupling between differentiating cardiomyocytes //Scientific reports. - 2020. - T. 10. - №. 1. - C. 7774.

59.Agladze N. N. et al. Synchronization of excitable cardiac cultures of different origin //Biomaterials science. - 2017. - T. 5. - №. 9. - C. 1777-1785.

60. Gerbin K. A. et al. Enhanced electrical integration of engineered human myocardium via intramyocardial versus epicardial delivery in infarcted rat hearts //PloS one. - 2015. - T. 10. - №. 7. - C. e0131446.

61.Joseph K. Y. et al. Computational modeling of aberrant electrical activity following remuscularization with intramyocardially injected pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes //Journal of molecular and cellular cardiology. -2022. - T. 162. - C. 97-109.

62.Romagnuolo R. et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes regenerate the infarcted pig heart but induce ventricular tachyarrhythmias //Stem cell reports. - 2019. - T. 12. - №. 5. - C. 967-981.

63.Bizy A., Klos M. Optimizing the use of iPSC-CMs for cardiac regeneration in animal models //Animals. - 2020. - T. 10. - №. 9. - C. 1561.

64. Cui H. et al. 4D physiologically adaptable cardiac patch: A 4-month in vivo study for the treatment of myocardial infarction //Science advances. - 2020. - Т. 6. -№. 26. - С. eabb5067.

65. Shadrin I. Y. et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues //Nature communications. - 2017. - Т. 8. - №. 1. - С. 1825.

66.Funakoshi S. et al. Enhanced engraftment, proliferation and therapeutic potential in heart using optimized human iPSC-derived cardiomyocytes //Scientific reports.

- 2016. - Т. 6. - №. 1. - С. 19111.

67. Slotvitsky M. et al. Polymer kernels as compact carriers for suspended cardiomyocytes //Micromachines. - 2022. - Т. 14. - №. 1. - С. 51.

68.Amano Y. et al. Development of vascularized iPSC derived 3D-cardiomyocyte tissues by filtration Layer-by-Layer technique and their application for pharmaceutical assays //Acta biomaterialia. - 2016. - Т. 33. - С. 110-121.

69.Joshi J. et al. Optogenetic control of engrafted human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in live mice: a proof-of-concept study //Cells. -2022. - Т. 11. - №. 6. - С. 951.

70.Егоров В. В., Иванов А. А., Пальцев М. А. Стволовые клетки человека //Молекулярная медицина. - 2003. - №. 2. - С. 3-3.

71. Зуева Е. Е., Куртова А. В., Комарова Л. С. Стволовые клетки. Некоторые биологические особенности и терапевтические возможности //Гематология.

- 2005. - Т. 6. - С. 705.

72.Вермель А. Е. Стволовые клетки: общая характеристика и перспективы применения в клинической практике //Клиническая медицина. - 2004. - Т. 82. - №. 1. - С. 5-12.

73.Квачева З. Б. и др. Клеточные технологии в комбустиологии: успехи, проблемы и перспективы //Военная медицина. - 2008. - №. 3. - С. 52-59.

74.Лищук В. А., Мосткова Е. В. Стволовые клетки: исследования и практика //Валеология. - 2003. - №. 2. - С. 4-16.

75.Мезен Н. И., Квачева З. Б., Сычик Л. М. Стволовые клетки. - 2014.

76.Викторов И. В., Сухих Г. Т. Медико-биологические аспекты применения стволовых клеток //Вестник рАмН. - 2002. - Т. 4. - С. 24-30.

77.Викторов И. В. Стволовые клетки мозга млекопитающих: биология стволовых клеток in vivo и in vitro //Известия РАН. Серия биологическая. -2001. - №. 6. - С. 646-655.

78.Корочкин Л. И. Стволовые клетки-один из путей регенерации нервной ткани //Известия РАН. Серия биологическая. - 2001. - №. 6. - С. 666-671.

79. Сухих Г. Т., Малайцев В. В. Нейральная стволовая клетка: биология и перспективы нейротрансплантации //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - Т. 131. - №. 3. - С. 244-255.

80. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors //cell. - 2006. - Т. 126. - №. 4. - С. 663-676.

81. Takahashi K. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors //cell. - 2007. - Т. 131. - №. 5. - С. 861-872.

82.Nakagawa M. et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts //Nature biotechnology. - 2008. - Т. 26. - №. 1. - С. 101-106.

83.Новосадова Е. В., Гривенников И. А. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки: от получения до применения в биохимических и биомедицинских исследованиях //Успехи биологической химии. - 2014. - Т. 54. - С. 3-38.

84.Spater D. et al. How to make a cardiomyocyte //Development. - 2014. - Т. 141. -№. 23. - С. 4418-4431.

85.Noseda M. et al. Cardiopoietic factors: extracellular signals for cardiac lineage commitment //Circulation research. - 2011. - Т. 108. - №. 1. - С. 129-152.

86.Liu J. et al. Generation, characterization, and potential therapeutic applications of cardiomyocytes from various stem cells //Stem cells and development. - 2012. -Т. 21. - №. 12. - С. 2095-2110.

87.Maddah M. et al. A non-invasive platform for functional characterization of stem-cell-derived cardiomyocytes with applications in cardiotoxicity testing //Stem cell reports. - 2015. - Т. 4. - №. 4. - С. 621-631.

88.Nunes S. S. et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes //Nature methods. - 2013. - Т. 10. - №. 8. - С. 781-787.

89.Ieda M. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors //Nihon rinsho. Japanese journal of clinical medicine. - 2011. - Т. 69. - С. 524-527.

90. Goumans M. J. et al. TGF-ß1 induces efficient differentiation of human cardiomyocyte progenitor cells into functional cardiomyocytes in vitro //Stem cell research. - 2008. - Т. 1. - №. 2. - С. 138-149.

91. Yang X., Pabon L., Murry C. E. Engineering adolescence: maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes //Circulation research. - 2014. - Т. 114. - №. 3. - С. 511-523.

92.Wirth E. K. et al. Neuronal 3', 3, 5-triiodothyronine (T3) uptake and behavioral phenotype of mice deficient in Mct8, the neuronal T3 transporter mutated in Allan-Herndon-Dudley syndrome //Journal of Neuroscience. - 2009. - Т. 29. -№. 30. - С. 9439-9449.

93.Xu L. et al. 3D multifunctional integumentary membranes for spatiotemporal cardiac measurements and stimulation across the entire epicardium //Nature communications. - 2014. - Т. 5. - №. 1. - С. 3329.

94. Sackmann E., Smith A. S. Physics of cell adhesion: some lessons from cell-mimetic systems //Soft matter. - 2014. - Т. 10. - №. 11. - С. 1644-1659.

95.Harunaga J. S., Yamada K. M. Cell-matrix adhesions in 3D //Matrix Biology. -2011. - Т. 30. - №. 7-8. - С. 363-368.

96.Wozniak M. A. et al. Focal adhesion regulation of cell behavior //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. - 2004. - Т. 1692. - №. 2-3. -С. 103-119.

97. Chen C. S. Mechanotransduction - a field pulling together? //Journal of cell science. - 2008. - Т. 121. - №. 20. - С. 3285-3292.

98. Tanaka M., Sackmann E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface //Nature. - 2005. - Т. 437. - №. 7059. - С. 656-663.

99.Ehmsen J., Poon E., Davies K. The dystrophin-associated protein complex //Journal of cell science. - 2002. - Т. 115. - №. 14. - С. 2801-2803.

100. Dabiri B. E., Lee H., Parker K. K. A potential role for integrin signaling in mechanoelectrical feedback //Progress in biophysics and molecular biology. -

2012. - Т. 110. - №. 2-3. - С. 196-203.

101. Takada Y., Ye X., Simon S. The integrins //Genome biology. - 2007. - Т. 8. -№. 5. - С. 1-9.

102. Sheets K. et al. Shape-dependent cell migration and focal adhesion organization on suspended and aligned nanofiber scaffolds //Acta biomaterialia. -

2013. - Т. 9. - №. 7. - С. 7169-7177.

103. Sheets K. et al. Nanonet force microscopy for measuring cell forces //Biophysical Journal. - 2016. - Т. 111. - №. 1. - С. 197-207.

104. Mathur A. et al. The role of feature curvature in contact guidance //Acta biomaterialia. - 2012. - Т. 8. - №. 7. - С. 2595-2601.

105. Jacot J. G., McCulloch A. D., Omens J. H. Substrate stiffness affects the functional maturation of neonatal rat ventricular myocytes //Biophysical journal. - 2008. - Т. 95. - №. 7. - С. 3479-3487.

106. Herron T. J. et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function //Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. -2016. - Т. 9. - №. 4. - С. e003638.

107. Boudreau-Beland J. et al. Spatiotemporal stability of neonatal rat cardiomyocyte monolayers spontaneous activity is dependent on the culture substrate //PloS one. - 2015. - Т. 10. - №. 6. - С. e0127977.

108. Nash M. P., Panfilov A. V. Electromechanical model of excitable tissue to study reentrant cardiac arrhythmias //Progress in biophysics and molecular biology. - 2004. - Т. 85. - №. 2-3. - С. 501-522.

109. Gokhale T. A., Medvescek E., Henriquez C. S. Modeling dynamics in diseased cardiac tissue: Impact of model choice //Chaos: An Interdisciplinary Journal of Nonlinear Science. - 2017. - Т. 27. - №. 9.

110. Aitova A. et al. Biomimetic Cardiac Tissue Models for In Vitro Arrhythmia Studies //Biomimetics. - 2023. - Т. 8. - №. 6. - С. 487.

111. Kadota S. et al. Curvature-dependent excitation propagation in cultured cardiac tissue //JETP letters. - 2012. - Т. 94. - С. 824-830.

112. Orlova Y. et al. Electrospun nanofibers as a tool for architecture control in engineered cardiac tissue //Biomaterials. - 2011. - Т. 32. - №. 24. - С. 5615-5624.

113. Wu Y. et al. Interwoven aligned conductive nanofiber yarn/hydrogel composite scaffolds for engineered 3D cardiac anisotropy //Acs Nano. - 2017. -Т. 11. - №. 6. - С. 5646-5659.

114. Palchesko R. N. et al. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve //PloS one. - 2012. - Т. 7. - №. 12. - С. e51499.

115. Щербина С. А. Исследование формирования сердечной ткани in vitro при различных моделируемых патологиях. Магистерская диссертация. - 2021.

116. Ehler E., Moore-Morris T., Lange S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes //Journal of visualized experiments: JoVE. - 2013. - №. 79. - С. 50154.

117. Brewer G. J. et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27 - supplemented neurobasal™, a new serum-free medium combination //Journal of neuroscience research. - 1993. - Т. 35. - №. 5. - С. 567-576.

118. Chen G. et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture //Nature methods. - 2011. - Т. 8. - №. 5. - С. 424-429.

119. Электронный ресурс. Сайт ThermoFisher, протокол репрограммирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A15960

120. Burridge P. W. et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes //Nature methods. - 2014. - Т. 11. - №. 8. - С. 855-860.

121. Lian X. et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/p-catenin signaling under fully defined conditions //Nature protocols. - 2013. - Т. 8. - №. 1. - С. 162-175.

122. Drozdov A. S. et al. Fluorescent magnetic nanoparticles for bioimaging through biomimetic surface modification //International Journal of Molecular Sciences. - 2023. - Т. 24. - №. 1. - С. 134.

123. Shipunova V. O. et al. Targeted two-step delivery of oncotheranostic nano-PLGA for HER2-positive tumor imaging and therapy in vivo: improved effectiveness compared to one-step strategy //Pharmaceutics. - 2023. - Т. 15. -№. 3. - С. 833.

124. Cole W. C., Picone J. B., Sperelakis N. Gap junction uncoupling and discontinuous propagation in the heart. A comparison of experimental data with computer simulations //Biophysical journal. - 1988. - Т. 53. - №. 5. - С. 809-818.

125. Kachalov V. N. et al. Success of spiral wave unpinning from heterogeneity in a cardiac tissue depends on its boundary conditions //JETP Letters. - 2017. - Т. 106. - С. 608-612.

126. Horning M. et al. Utilizing the eikonal relationship in strategies for reentrant wave termination in excitable media //Physical Review E—Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. - 2010. - Т. 81. - №. 5. - С. 056202.

127. Bruss A. R. The eikonal equation: Some results applicable to computer vision //Journal of Mathematical Physics. - 1982. - Т. 23. - №. 5. - С. 890-896.

128. Balashov V. et al. High resolution 3D microscopy study of cardiomyocytes on polymer scaffold nanofibers reveals formation of unusual sheathed structure //Acta biomaterialia. - 2018. - Т. 68. - С. 214-222.

129. Kang C. et al. ß-adrenergic stimulation augments transmural dispersion of repolarization via modulation of delayed rectifier currents IKs and IKr in the human ventricle //Scientific reports. - 2017. - Т. 7. - №. 1. - С. 15922.

130. Shaheen N. et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiac cell sheets expressing genetically encoded voltage indicator for pharmacological and arrhythmia studies //Stem cell reports. - 2018. - Т. 10. - №. 6. - С. 1879-1894.

131. Jost N. et al. Restricting excessive cardiac action potential and QT prolongation: a vital role for I Ks in human ventricular muscle //Circulation. -2005. - Т. 112. - №. 10. - С. 1392-1399.

132. Holzem K. M. et al. Reduced response to IKr blockade and altered hERG1a/1b stoichiometry in human heart failure //Journal of molecular and cellular cardiology. - 2016. - Т. 96. - С. 82-92.

133. Banyasz T. et al. Beta-adrenergic stimulation reverses the I Kr-I Ks dominant pattern during cardiac action potential //Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. - 2014. - Т. 466. - С. 2067-2076.

134. Szentandrassy N. et al. Role of action potential configuration and the contribution of Ca2+ and K+ currents to isoprenaline-induced changes in canine ventricular cells //British journal of pharmacology. - 2012. - Т. 167. - №. 3. - С. 599-611.

135. Volders P. G. A. et al. Probing the contribution of I Ks to canine ventricular repolarization: key role for ß-adrenergic receptor stimulation //Circulation. -2003. - Т. 107. - №. 21. - С. 2753-2760.

136. Aras K. K. et al. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation //Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. - 2018. -Т. 11. - №. 11. - С. e006692.

137. Glukhov A. V. et al. Conduction remodeling in human end-stage nonischemic left ventricular cardiomyopathy //Circulation. - 2012. - Т. 125. - №. 15. - С. 1835-1847.

138. Zhu H. et al. Two dimensional electrophysiological characterization of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte system //Scientific reports. - 2017. -T. 7. - №. 1. - C. 43210.

139. Erofeev I. S., Agladze K. I. Two models of anisotropic propagation of a cardiac excitation wave //JETP letters. - 2014. - T. 100. - C. 351-354.

140. Camelliti P., Borg T. K., Kohl P. Structural and functional characterisation of cardiac fibroblasts //Cardiovascular research. - 2005. - T. 65. - №. 1. - C. 40-51.

141. Peters M. M. et al. Self-organizing behaviors of cardiovascular cells on synthetic nanofiber scaffolds //APL bioengineering. - 2023. - T. 7. - №. 4.

142. Cabo C. et al. Vortex shedding as a precursor of turbulent electrical activity in cardiac muscle //Biophysical journal. - 1996. - T. 70. - №. 3. - C. 1105-1111.

143. Podgurskaya A. D. et al. Effect of heptanol and ethanol on excitation wave propagation in a neonatal rat ventricular myocyte monolayer //Toxicology in Vitro. - 2018. - T. 51. - C. 136-144.

144. Nizamieva A. A. et al. Conduction of excitation waves and reentry drift on cardiac tissue with simulated photocontrol-varied excitability //Chaos: An Interdisciplinary Journal of Nonlinear Science. - 2023. - T. 33. - №. 2.

145. Schoen I., Pruitt B. L., Vogel V. The Yin-Yang of rigidity sensing: how forces and mechanical properties regulate the cellular response to materials //Annual Review of Materials Research. - 2013. - T. 43. - №. 1. - C. 589-618.

146. Kudryashova N. et al. Self-organization of conducting pathways explains electrical wave propagation in cardiac tissues with high fraction of non-conducting cells //PLoS computational biology. - 2019. - T. 15. - №. 3. - C. e1006597.

147. Putra R. U. et al. Level of activity changes increases the fatigue life of the porous magnesium scaffold, as observed in dynamic immersion tests, over time //Sustainability. - 2023. - T. 15. - №. 1. - C. 823.

148. Lin J. et al. Ephaptic coupling is a mechanism of conduction reserve during reduced gap junction coupling //Frontiers in Physiology. - 2022. - T. 13. - C. 848019.