Химико-токсикологическое исследование пиридостигмина бромида и неостигмина метилсульфата тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Алёхина Мария Игоревна

• Алёхина Мария Игоревна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Алёхина Мария Игоревна

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Физические свойства пиридостигмина бромида и неостигмина метилсульфата

1.2. Применение в медицине пиридостигмина бромида и неостигмина метилсульфата

1.3. Токсикологическая характеристика пиридостигмина бромида и неостигмина метилсульфата

1.4. Идентификация и количественное определение пиридостигмина бромида и неостигмина метилсульфата

1.5. Изолирование и очистка пиридостигмина бромида и неостигмина метилсульфата

1.6. Метаболизм и распределение в организме теплокровных животных

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, РЕАКТИВЫ, ПРИБОРЫ И ОБОРУДОВАНИЕ, ПОСУДА, МАТЕРИАЛЫ

2.1. Объекты исследования

2.2. Реактивы

2.3. Приборы и оборудование

2.4. Посуда

2.5. Материалы

2.6. Характеристика лабораторных животных и правила работы с ними

2.7. Правила обработки результатов экспериментов и валидации разрабатываемых методик

ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЯ ПИРИДОСТИГМИНА БРОМИДА И ЕГО ОСНОВНОГО МЕТАБОЛИТА 3-ГИДРОКСИ-1-МЕТИЛПИРИДИНИЯ

3.1. Идентификация пиридостигмина бромида и 3-гидрокси-1-метилпиридиния

3.2. Количественное определение пиридостигмина бромида и 3-гидрокси-1 -метилпиридиния

3.3. Изолирование пиридостигмина и 3-гидрокси-1-метилпиридиния бромида из биологического материала

3.4. Моделирование очистки извлечений пиридостигмина бромида и 3-гидрокси-1-метилпиридиния из биологического материала

3.5. Оценка степени очистки извлечений в контрольных опытах

3.6. Очистка извлечений пиридостигмина бромида из биологического материала при помощи твердофазной экстракции

3.7. Разработка методик определения пиридостигмина гидробромида и 3-гидрокси-1-метилпиридипия в различных видах биологического материала на основе использования метода ВЭЖХ

3.8. Валидация методик определения пиридостигмина гидробромида и его метаболита в различных видах биологического материала на основе использования метода ВЭЖХ

3.9. Сохраняемость пиридостигмина бромида в биологическом материале и его распределение в организме теплокровных животных

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЯ НЕОСТИГМИНА МЕТИЛСУЛЬФАТА И ЕГО ОСНОВНОГО МЕТАБОЛИТА 3-ДИМЕТИЛАМИНОФЕНОЛА

4.1. Идентификация неостигмина метилсульфата и 3-диметиламино фенола

4.2. Количественное определение неостигмина метилсульфата и 3-диметиламинофенола

4.3. Изолирование неостигмина метилсульфата и

3

диметиламинофенола из биологического материала

4.4. Моделирование очистки извлечений неостигмина метилсульфата и 3-диметиламинофенола из биологического материала

4.5. Оценка степени очистки извлечений в контрольных опытах

4.6. Разработка методик определения неостигмина метилсульфата и 3-диметиламинофенола в различных видах биологического материала на основе использования метода ВЭЖХ

4.7. Валидация методик определения неостигмина метилсульфата и его метаболита в различных видах биологического материала на основе использования метода ВЭЖХ

4.8. Сохраняемость неостигмина метилсульфата в биологическом материале и его распределение в организме теплокровных животных

ГЛАВА 5. ОБЩАЯ СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ПРИ ОТРАВЛЕНИИ ПИРИДОСТИГМИНА БРОМИДОМ ИЛИ НЕОСТИГМИНА МЕТИЛСУЛЬФАТОМ

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 3-ОН-1-МП - 3-гидрокси-1-метилпиридиния бромида 3-ДМАФ - 3-диметиламинофенол

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

УФ - ультрафиолетовый свет

ИК - инфракрасный свет

ПФ - подвижная фаза

НФ - неподвижная фаза

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТФЭ - твердофазная экстракция

ЖЖЭ - жидкость-жидкостная экстракция

НД - нормативный документ

ОФС - общая фармакопейная статья

ФС - фармакопейная статья

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ПО - предел обнаружения

ПКО - предел количественного определения

CAS - Chemical Abstracts Service (Химическая реферативная служба) LD50 - полулетальная доза

FDA - Food and Drug Administration (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Химико-токсикологическое исследование пиридостигмина бромида и неостигмина метилсульфата»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Отдельные производные карбаминовой кислоты - пиридостигмина бромид (3-[[(Диметиламино)карбонил]окси]-1 -метилпиридиния бромид), неостигмина метилсульфат (3-[[(Диметиламино)карбонил]окси]-Ы^,№триметилбензол-аминия метилсульфат) - широко применяются в медицинской практике для оказания лечебного эффекта при лечении миастении гравис, деменции, паралича, атонии ЖКТ и мочевого пузыря, атеросклерозе. Данные вещества обладают значительной токсичностью. Их LD50 при пероральном введении крысам колеблется в интервале 7,5 - 37,5 мг/кг.

Известны многочисленные смертельные отравления людей данными веществами. О причинах и случаях тяжёлых отравлений пиридостигмином, неостигмином и близкими структурами, в том числе приводящих к летальным исходам, сообщают Thanvi B.R., Lo T.C.N. (2004), Zhao B. et al. (2006), Гехт Б.М. и др. (2008), Агафонов Б.В. и др. (2013). Сведения о смертельных отравлениях неостигмином в СССР и Российской Федерации содержатся в публикациях Анохина В.Т. и др. (1975), Прозоровского В.Б. и Саватеева Н.В. (1976), Муравьёвой Г.М. (2005). За рубежом описаны летальные отравления неостигмином в сочетании с другими веществами в результате внезапной остановки сердца и вследствие отёка лёгких при операциях под общим наркозом (Raiger L.K. et al., 2010).

Все это обуславливает необходимость проводить систематические химико-токсикологические исследования в отношении производных карбаминовой кислоты, в особенности неостигмина метилсульфата и пиридостигмина бромида.

На настоящий момент проблема изолирования этих соединений из объектов биологического происхождения с минимальным количеством балластных веществ, а также вопрос их последующей идентификации и количественного определения остаются актуальными. Сохраняемость данных веществ в трупном материале также мало изучена.

Степень разработанности темы исследования. Вопросами изолирования пиридостигмина бромида и неостигмина метилсульфата из

биологического материала, а также их идентификации занимались отечественные и зарубежные ученые, такие как Прозоровский В.Б. (1976), Зимнухов В.В. (1971), Муравьева Г.М. (2005), Somani S.M. (1970), Abu-Qare A.W. (2001), Bin Zhao (2006) и другие. Исследования в области химико-токсикологического анализа данных соединений в основном касаются неостигмина и в целом носят отрывочный и несистематический характер. Недостаточно проработаны вопросы определения рассматриваемых производных карбаминовой кислоты, в особенности, пиридостигмина, в трупном материале, стабильности аналитов в гнилостно разлагающихся биологических матрицах, характера распределения исследуемых соединений в органах и биожидкостях теплокровных при летальных отравлениях. Практически отсутствуют валидированные методики химико-токсикологического анализа неостигмина и пиридостигмина.

Все это обусловливает актуальность проведения химико-токсикологических исследований рассматриваемых соединений.

Цель исследования. Разработка методик химико-токсикологического исследования пиридостигмина бромида, неостигмина метилсульфата и их основных метаболитов.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности поглощения исследуемыми соединениями электромагнитного излучения в УФ- и видимой области спектра в зависимости от растворяющей среды.

2. Определить характер хроматографической подвижности исследуемых соединений при проведении ТСХ, аналитической и препаративной колоночной хроматографии.

3. Изучить возможность использования хромогенных реакций нитрования и получения ионных ассоциатов для идентификации изучаемых соединений.

4. Выявить оптимальные условия и разработать методики количественного определения рассматриваемых аналитов методами УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ.

5. Изучить особенности извлечения исследуемых соединений из биологического материала методом настаивания с различными изолирующими агентами, а также разработать оптимальную схему изолирования и очистки полученных экстрактов.

6. Исследовать характер распределения изучаемых производных карбаминовой кислоты в органах и крови теплокровного животного (крысы).

7. Определить продолжительность сохранения исследуемых веществ в гнилостно разлагающемся трупном материале при различных температурах.

Научная новизна. Изучена хроматографическая подвижность изучаемых соединений в широком ряду индивидуальных растворителей и их смесей в процессе хроматографирования в тонких слоях нормально- и обращённофазовых сорбентов.

Впервые определены оптимальные условия и разработана схема изолирования пиридостигмина бромида, неостигмина метилсульфата и их основных метаболитов из биологического материала ацетоном с последующей идентификацией и количественным определением методом ВЭЖХ в колонке сорбента С18 Luna 5^ C18(2) 100A при элюировании смесью 0,02 % раствор дигидрофосфата калия с рН 3,0-ацетонитрил-метанол (92,5:5,0:2,5 по объёму).

Разработаны и оптимизированы варианты очистки извлечений из биологического материала с помощью тонкослойной и препаративной колоночной хроматографии, а также твердофазной экстракции.

Впервые разработаны методики количественного фотометрического определения пиридостигмина бромида и неостигмина метилсульфата в извлечениях из биологического материала на основе реакции нитрования и получения аци-нитросолей.

Разработана унифицированная методика определения рассматриваемых аналитов в извлечениях их биологических объектов. Проведена валидация разработанной методики.

Впервые изучены особенности распределения пиридостигмина бромида и неостигмина метилсульфата в организме теплокровного

животного (крысы) при летальных отравлениях, а также сохраняемость изучаемых соединений в разлагающемся трупном материале в зависимости от времени и температуры (0-2 °С, 8-10 °С, 18-22 °С) сохранения.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработанные методики изолирования, очистки, идентификации и количественного определения пиридостигмина бромида, неостигмина метилсульфата, 3-гидрокси-1-метилпиридиния бромида, 3-диметиламинофенола позволяют повысить вероятность и достоверность определения изучаемых соединений после извлечения их из биологических объектов, а также сократить время проведения анализа в силу использования высокотехнологичного оборудования.

Показано соответствие разработанных методик химико-токсикологического определения исследуемых соединений валидационным критериям, таким как: правильность, прецизионность, линейность, стабильность. Все это позволяет рекомендовать разработанные методики для работы в химико-токсикологических лабораториях и судебно-химических отделениях Бюро судебно-медицинской экспертизы (СХО БСМЭ).

Разработанные методики успешно прошли апробацию в ОГБУЗ «Белгородское бюро судебно-медицинской экспертизы» (акт от 17.01.2017), на кафедре фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России (акт от 14.02.2017), в ООО «Армавирская межрайонная аптечная база» (ООО «МРАБ») Краснодарского края (акт от 27.03.2019), в «Информационно-методическом центре по экспертизе, учету и анализу обращения средств медицинского применения» Росздравнадзора (Курский филиал) (акт от 25.03.2019).

Методология и методы исследования. Исследование проводили в период с 2011 по 2018 год. В работе использовали современные физико-химические методы исследования с последующей статистической обработкой результатов. Обзор литературы включает в себя работы российских и зарубежных ученых, и касаются методов изолирования, очистки и определения исследуемых соединений после их извлечения из биологического материала.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Особенности поглощения рассматриваемыми аналитами электромагнитного излучения в УФ- и видимой областях спектра.

• Результаты изучения хроматографической подвижности основных объектов исследования и их метаболитов в режиме тонкослойной и колоночной хроматографии.

• Разработанные методики идентификации и количественного определения аналитов методами ТСХ, ВЭЖХ, УФ-спектрофотометрии, с использованием цветных реакций.

• Оптимальные условия изолирования по времени настаивания, по количеству внесенного вещества, по соотношению количества вещества и объема изолирующего агента, от кратности настаивания из объектов биологического происхождения путем настаивания с изолирующим агентом.

• Результаты исследования вариантов очистки объектов исследования от балластных веществ в тонких слоях и колонках сорбентов.

• Характер распределения изучаемых производных карбаминовой кислоты в организме теплокровного животного (крысы).

• Сохраняемость пиридостигмина бромида и неостигмина метилсульфата в гнилостно разлагающемся трупном материале во времени при различных температурах.

Достоверность научных положений и выводов. Высокий уровень достоверности результатов подтверждается большим объемом выполненных экспериментов и применением современных и высокотехнологичных методов исследования. О достоверности разработанных методик определения исследуемых веществ можно судить по результатам их валидации и статистической обработки данных по требованиям ГФ XIV с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2013».

Апробация результатов исследования. Основные результаты работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 45-летию фармацевтического факультета КГМУ (Курск, 2011), VII Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2013), IV Всероссийской научной

конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2014), XIV Конференции «Физико-химические основы ионообменных и хроматографических процессов (Иониты-2014)» и Третьего Всерос. симпозиума с межд. участием «Кинетика и динамика обменных процессов» (Воронеж, 2014), XVI Международной научно-практической конференции «Современная наука: актуальные вопросы, достижения и инновации» (Пенза, 2020).

Личный вклад автора. Автором лично проведен литературный обзор по теме диссертации на базе работ отечественных и зарубежных ученых, оставлен план выполнения диссертационноой работы, в процессе реализации которого проведены экспериментальные исследования, осуществлен анализ полученных данных, включая статистическую обработку, и выполнены валидационные мероприятия. На основе этого автором сделаны выводы и заключения теоретического и прикладного характера.

Внедрение результатов исследования:

- методика очистки, последующей идентификации и количественного определения пиридостигмина бромида в виде его метаболита 1-метил-3-пиридона сочетанием методов твердофазной экстракции и УФ-спектрофотометрии в биологических жидкостях: внедрена в ОГБУЗ «Белгородском бюро судебно-медицинской экспертизы» (акт от 17.01.2017);

- методика экстракционно-фотометрического определения метаболита пиридостигмина бромида в модельных смесях в виде ионного ассоциата с красителем тропеолин 00: внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России (акт от 14.02.2017);

- методика определения пиридостигмина бромида (Калимин 60 Н) в виде субстанции и в лекарственной форме (таблетки по 60 мг) методом обращеннофазовой ВЭЖХ: внедрена в ООО «Армавирская межрайонная аптечная база» (ООО «МРАБ») Краснодарского края (акт от 27.03.2019);

- методика определения неостигмина метилсульфата (прозерин) в виде субстанции и в лекарственной форме (таблетки по 15 мг) методом

обращеннофазовой ВЭЖХ: внедрена в ООО «Армавирская межрайонная аптечная база» (ООО «МРАБ») Краснодарского края (акт от 27.03.2019);

- методика идентификации и количественного определения пиридостигмина бромида методом ВЭЖХ при извлечении препарата из биологического материала: внедрена в «Информационно-методическом центре по экспертизе, учету и анализу обращения средств медицинского применения» Росздравнадзора (Курский филиал) (акт от 25.03.2019);

- методика идентификации и количественного определения неостигмина метилсульфата методом ВЭЖХ при извлечении препарата из биологического материала: внедрена в «Информационно-методическом центре по экспертизе, учету и анализу обращения средств медицинского применения» Росздравнадзора (Курский филиал) (акт от 25.03.2019).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения соответствуют паспорту специальности 14.04.02 -фармацевтическая химия, фармакогнозия, а именно: пункту 4 - разработка методов анализа лекарственных веществ и их метаболитов в биологических объектах для фармакокинетических исследований, эколого-фармацевтического мониторинга, судебно-химической и наркологической экспертизы.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета № 36 РАМН и научной проблеме 35.04 «Научные проблемы судебно-медицинской токсикологии,

токсикологической и судебной химии» по специальности «Судебная медицина» при РАМН. Номер государственной регистрации 01201250552.

Публикации. Основные результаты работы отражены в 14 публикациях, 5 из которых в журналах, входящих в перечень рекомендуемых ВАК для опубликования основных результатов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 259 страницах машинописного текста (180 страниц основного текста и 79 страниц приложения), иллюстрирована 30 рисунками и 90 таблицами, состоит из введения, обзора литературы (Глава 1), экспериментальной части (Главы 2-5) и общих выводов, списка литературы, включающего 150 наименований, в том числе 82 источника зарубежной литературы.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Физические свойства пиридостигмина бромида и неостигмина

метилсульфата

Калимин (Пиридостигмина бромид)

CAS: 101-26-8. Брутто-формула препарата имеет вид C9H^BrN2O2,

молекулярный вес составляет 261,1. следующую структурную формулу:

Пиридостигмина бромид имеет

НзС

,N

Br -

Белый или почти белый кристаллический порошок с характерным приятным запахом, гигроскопичен. Температура плавления — 152-154 °С, Log Pow (коэффициент Ханша, коэффициент разделения в октаноле-воде) составляет 3,73 при 20 °С. Очень легко растворим в воде и 96 % этаноле, легко растворим в хлороформе, практически нерастворим в эфире, ацетоне, бензоле [29, 51, 97].

Прозерин (Неостигмина метилсульфат)

CAS: 51-60-5. Брутто-формула имеет вид C12H19N2O2CH3O4S, молекулярный вес составляет 334,39. Представляет собой метилсульфат диметилкарбаминового сложного эфира оксифенилтриметиламмония. Неостигмина метилсульфат имеет формулу:

Это белый или слегка желтоватый кристаллический порошок без запаха, горького вкуса. Гигроскопичен, на свету приобретает розоватый

+

з

оттенок. Температура плавления — 141-149 °С, Log Pow (коэффициент Ханша, коэффициент разделения в октаноле-воде) вставляет 2,25 при 20 °С. pH водного раствора 5,9-7,5. Очень легко растворим в воде, умеренно растворим в 96 % этаноле и хлороформе, практически нерастворим в эфире и гексане. [78, 119]. Неустойчив к воздействию сильных окислителей и сильных кислот.

1.2. Применение в медицине пиридостигмина бромида и неостигмина метилсульфата

Пиридостигмина бромид и неостигмина метилсульфат относятся к группе лекарственных веществ, обладающих антихолинэстеразной активностью. Данная группа препаратов действует путем ингибирования ацетилхолинэстеразы и, таким образом, увеличивает возможность ацетилхолина взаимодействовать с ацетилхолиновыми рецепторами [1, 15, 98, 118, 140, 145].

Лекарственные препараты назначают при лечении миастении гравис, паралича, атонии желудочно-кишечного тракта, в офтальмологической практике, при ряде других заболеваний, связанных с нарушением нейромышечной передачи, а также для постановки диагноза миастении по результатам фармакологического теста [80, 82, 86, 111, 145, 148].

Пиридостигмина бромид является наиболее часто применяемым препаратом этой группы. Начальной дозой препарата является 30 мг три раза в сутки, и доза может быть увеличена до 60-90 мг 4 раза в сутки, а порой и больше, в зависимости от реакции организма и переносимости пациентом препарата. Превышение ежедневной дозы препарата более 600 мг возможно лишь в исключительных случаях. Главным преимуществом препарата является быстрота достижения эффекта (около 15-30 минут). Продолжительность действия составляет около 6-8 часов.

Ряд врачей отдают предпочтение прозерину, который оказывает, по их мнению, наиболее быстрое действие, но продолжительность эффекта в таком случае не превышает 4 часов [28, 69, 104, 110, 130, 134, 139].

Прозерин (неостигмина метилсульфат) применяют в виде двух лекарственных форм: таблетки по 15 мг и раствор в ампулах 0,05 % по 1 мл. Продолжительность действия препарата составляет 2-3 часа [39, 50, 78, 85, 113, 114, 141].

Антихолинэстеразные препараты (неостигмин, пиридостигмин) также традиционно применяют для осуществления декураризации — снятия нейромышечного блока в послеоперационный период [83, 137, 147], а также используют для пролонгирования анальгетического эффекта местных анестетиков [75, 123].

Известны случаи применения неостигмина в качестве антидота при отравлениях тетродотоксином [108]. Описано также применение пиридостигмина бромида в качестве профилактического (предупреждающего) средства против воздействия нервнопаралитического яда зомана (химическое оружие) [93, 101, 131, 132, 135, 136].

1.3. Токсикологическая характеристика пиридостигмина бромида и неостигмина метилсульфата

Неостигмина метилсульфат — высокотоксичное вещество для теплокровных животных [8, 42]. При пероральном приеме возможен летальный исход. LD50 неостигмина при пероральном введении крысам составляет 7,5-14,4 мг/кг, при внутривенном - 0,315 мг/кг, при подкожном -0,445 мг/кг, при внутримышечном - 0,423 мг/кг; при внутривенном введении кошкам - 0,25-0,40 мг/кг; при внутрижелудочном введении мышам - 7,5 мг/кг [119, 120].

Пиридостигмин менее токсичен для теплокровных животных в сравнении с неостигмином, однако, при попадании внутрь возможен летальный исход. LD50 пиридостигмина при пероральном введении крысам составляет 37,5 мг/кг, при введении мышам внутривенно 1400-1500 мкг/кг, подкожно - 2700 мкг/кг, внутрибрюшино - 5500 мкг/кг, внутрижелудочно -32000 мкг/кг. Оценка острой токсичности - 5,100 мг/кг [52].

При приеме препаратов данной группы возможно развитие целого комплекса побочных эффектов, таких как абдоминальные (брюшинные) боли, диарея, чрезмерная соливация, отек легких, слабость дыхательной мускулатуры вплоть до остановки дыхания, общая мышечная слабость, судороги, страх, бессонница, затемнение сознания с риском развития комы [1, 15, 134, 145]. Кроме того, при передозировке препаратов возможно развитие холинергического криза.

Данное состояние характеризуется патологической слабостью, фасцикулярными подергиваниями, судорогами, гиперсаливацией, гипергидрозом, тошнотой, рвотой, диареей, усилением перистальтики, брадикардией, абдоминальными болями, нарушением сознания вплоть до комы, психомоторным возбуждением, а также возможны эпилептические припадки [39, 78, 102, 119]. Зачастую пациенты стремятся достичь полной компенсации двигательного дефекта и поэтому иногда могут самостоятельно увеличивать дозу назначенного препарата, что может привести к летальному исходу [1, 15, 49].

В судебно-медицинской практике описаны многочисленные случаи смертельных отравлений прозерином. На территории СССР и Российской Федерации с подобными случаями можно ознакомиться в работах Прозоровского В. Б. и Саватеева Н. В. [52], Рубцова А.Ф. [55], Анохина В.Т., Зимнухова В.В. и Иванова В.А. [7], Муравьевой Г.М. [42].

Известны случаи сочетанного отравления c другими препаратами с летальным исходом [30, 121, 128].

Согласно литературным данным минимальная смертельная доза неостигмина для человека при подкожном введении составляет 1,4-10 мг, а при приеме внутрь - 4,2-60 мг [52].

Существуют сведения, что в высоких концентрациях пиридостигмина бромид обладает генотоксичностью, вызывая изменения в SH-SY5Y клетках, что может стать причиной развития нейробластомы [82].

1.4. Идентификация и количественное определение пиридостигмина бромида и неостигмина метилсульфата

1.4.1. Идентификация и количественное определение пиридостигмина бромида и его метаболита

Идентификация хромогенными реакциями

Пиридостигмина бромид дает качественную реакцию с 1 н раствором натрия гидроксида, в результате которой образуется оранжевое окрашивание, переходящее в желтое при последующем нагревании. Еще одним признаком реакции является голубое окрашивание влажной красной лакмусовой бумажки, поднесенной к пробирке [38, 64].

При добавлении к раствору препарата раствора серебра нитрата выпадает бледно-желтый оплесцирующий осадок серебра бромида [29, 38, 51, 64].

Идентификация и количественное определение с применением физико-

химических методов анализа

Для подтверждения подлинности препарата, а также количественной оценки содержания действующего вещества широко используются физико -химические методы анализа, такие как спектроскопия, тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография.

Спектрофотометрия. Известно, что пиридостигмина бромид поглощает при 270 нм в среде 0,1н хлористоводородной кислоты. Удельные показатели поглощения при 269-270 нм в пересчете на сухое вещество различаются не более чем на 3 % [38, 51, 64].

Abdelaleem E.A. et а1. [92] разработали три методики идентификации пиридостигмина бромида и его метаболита - 3-гидрокси-Ы-метилпиридиния бромида, основанные на расчётах первых производных и ряда вариантов спектральных отношений. Методики позволяют проводить идентификацию соединений в смеси без предварительного разделения компонентов.

Тонкослойная хроматография. Пиридостигмина бромид предварительно растворяют в метаноле. В качестве подвижной фазы выступает по разным источникам литературы смесь метанола-хлороформа-раствора хлорида аммония в соотношении 50:40:6 [51], либо смесь воды очищенной-метанола-диэтиламина в соотношении 67:30:3 [38], а в качестве неподвижной фазы используют силикагель GF254R или силикагель R1 соответственно. Камеру хроматографическую выкладывают фильтровальной бумагой, наполняют достаточным количеством мобильной фазы и оставляют насыщаться парами при температуре 20-25 °С в течение одного часа. Длина пробега составляет 12 см. Хроматографирование проводят с последующим детектированием в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм.

Ali N.W. et al. [91] разработали методику высокоэффективной тонкослойной хроматографии с целью идентификации пиридостигмина бромида и его метаболита - 3-гидрокси-Ы-метилпиридиния бромида - в смеси. В качестве неподвижной фазы использовали алюминиевые пластины с нанесенным на них тонким слоем силикагеля 60 F254, а в качестве подвижной фазы смесь растворителей метанол - этилацетат - триэтиламин - ледяная уксусная кислота (9,0:1,0:0,5:0,05 по объему). Последующая идентификация проводилась при помощи УФ-детектора при длине волны 270 нм.

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Для идентификации пиридостигмина и его метаболитов описано применение колонок с обращённофазовыми сорбентами. Размер таких колонок колеблется от 150 до 300 мм в длину и 3,2 - 4,6 мм по внутреннему диаметру. Размер частиц сорбента в этих колонках в большинстве случаев составляет 5 или 10 цт. Большинство исследователей никак не поясняли свой выбор колонок. Элюентами часто являются смеси, состоящие из водных подкисленных полярных растворителей и/или буферных растворов, таких как водные растворы уксусной кислоты, фосфорной кислоты, серной кислоты (растворитель А) и менее полярного органического растворителя, такого как метанол или ацетонитрил, также подкисленных (растворитель Б) [89].

В качестве неподвижной фазы рекомендуют использовать сорбент октадецилсилил силикагель с диаметром частиц 5 мкм (Inertsil ODS-3 или

аналогичная), в качестве подвижной фазы - смесь ацетонитрила с раствором калия дигидрофосфата в соотношении 30:970. Размер колонки - 125*4,0 мм. Скорость потока - 1,5 мл/мин. Объем пробы - 5 мкл. Детектирование проводят при 270 нм. Время удерживания пиридостигмина - около 2 мин [29].

Помимо вышеуказанного метода, для идентификации и количественного определения пиридостигмина бромида используют метод ВЭЖХ, в котором в качестве подвижной фазы выступает смесь ацетонитрил - лаурилсульфат натрия (30:70) рН 2,0 (раствор фосфорной кислоты). Колонка длиной 250 мм и диаметром 4 мм, неподвижная фаза -октадецилсилил силикагель деактивированный для хроматографии с размером частиц 5-10 мкм. Скорость потока - 1,1 мл/мин, проба - 20 мкл. Детектирование на спектрофотометре при 220 нм.

Для количественного анализа пиридостигмина бромида в таблетках в качестве подвижной фазы была также предложена смесь раствора 1 -гептасульфоната натрия с триэтиламином и ацетонитрилом с доведение до рН 1,0 фосфорной кислотой [29, 64, 97].

Для оценки уровней содержания в плазме примеси основного метаболита пиридостигмина Ригат Б.К et а1. [133] была предложена методика оценки концентрации 3-гидрокси-1-метилпиридиния с использованием жидкостной хроматографии в сочетании с методом масс-спектрометрии с ионизацией распылением электронов. В качестве внутреннего стандарта использовали ламивудин. Контролировали множественные реакции при 109,9/95,2 (метаболит пиридостигмина) и 230,2/112,2 (ламивудин). Отбор образцов для последующего хроматографирования осуществляли при помощи твердофазной экстракции с использованием катионообменных картриджей смешанного режима. Хроматографировали на аналитической колонке 1пег1ш1 С18, 150 мм*4,6 мм, 5 мкм с использованием в качестве мобильной фазы смесь ацетонитрила с буферным раствором (10 М ацетат аммония) в соотношении 85:15. Линейная зависимость соблюдалась в диапазоне концентраций от 1,434 нг/мл до 39,637 нг/мл.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Алёхина Мария Игоревна, 2021 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Агафонов, Б. В. Миастения и врожденные миастенические синдромы / Б.В. Агафонов, С.В. Котов, О.П. Сидорова. - М.: Медицинское информационное агентство, 2013. - 224 с.

2. Аксенова, Э.Н. Руководство к лабораторным занятиям по фармацевтической химии / Э.Н. Аксенова, О.П. Андрианова, А.П. Арзамасцев. - М.: Медицина, 2000. - 376 с.

3. Алексеев, Н.А. Ион-парная тонкослойная хроматография лекарственных препаратов, производных четвертичных аммониевых соединений / Н.А. Алексеев, А.И. Жебентяев // Фармация. - 1998. - Т. 47, № 1. - С. 21-27.

4. Алехина, М.И. Изучение возможности изолирования и очистки извлечений из модельных смесей продукта метаболизма Калимина 60 Н / М.И. Алехина // Материалы VII Международной научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 1-2 марта 2013 г.). - Курск, 2013. - С. 53 -57.

5. Алехина, М.И. Изучение условий экстрагирования 1-метил-3-пиридона из биологического материала (печени) диоксаном // Сборник материалов конференции «Молодая фармация - потенциал будущего». -Журнал «Фармация», специальный выпуск. - СПХФА Санкт-Петербург, 2014. - С. 392-395.

6. Алехина, М.И. Экстракционно-фотометрическое определение пиридостигмина бромида в виде метаболита в модельных смесях / М.И. Алехина, Т.Н. Никитина, В.К. Шорманов // Вестник ВолгГМУ. - 2017. - Вып. 3(63). - С. 23-25.

7. Анохин, В.Т. Два смертельных отравления прозерином / В.Т. Анохин, В.В. Зимнухов, В.А. Иванов // Судебно-медицинская экспертиза. -1975. - Т. 18, № 3. - С. 52.

8. Бадюгин И.С. Экстремальная токсикология / Практическое руководство- 2006. - 415 с.

9. Барам Г.И. Хроматограф «Милихром А-02». Определение веществ с применением баз данных «ВЭЖХ-УФ». Новосибирск: ЗАО Институт хроматографии «ЭкоНова», 2005. - 64 с.

10. Беликов, В.Г. Анализ лекарственных веществ фотометрическими методами. Опыт работы отечественных специалистов / В.Г. Беликов // Российский химический журнал (Журнал Российского химического общества им. Д.И. Менделеева). - 2002. - Т. 46, № 4. - С. 52-56.

11. Беляев, А.В. Исследование наркотических средств с предварительной пробоподготовкой методом твердофазной экстракции: Методические рекомендации / А.В. Беляев, К.В. Понкратов, В.И. Сорокин. -М.: ЭКЦ МВД России, 1996. - 16 с.

12. Береговых, Г.В. Исследование клофелина в химико-токсикологическом анализе экстракционно-спектрофотометрическим методом / Г.В. Береговых, Г.В. Вавин, Н.Б. Мартыненко // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины, медицинской науки и образования. Медицина в Кузбассе. - 2005. - № 4. - С. 24 - 25.

13. Васильев, В.П. Аналитическая химия. В 2 ч. Ч.1. Гравиметрический и титриметрический методы анализа / В.П. Васильев. - М.: Высшая Школа, 1989. - 320 с.

14. Вергейчик, Т.Х. Токсикологическая химия / Т.Х. Вергейчик; под ред. проф. Е.Н. Вергейчик. - М.: МЕДпресс-информ, 2009. - 400 с.

15. Гехт, Б.М. Миастения: диагностика и лечение / Б.М. Гехт, А.Г. Санадзе // Неврологический журнал. - 2003. - Приложение 1. - C. 8 - 12.

16. Государственная Фармакопея Российской Федерации. Издание XIII. Режим доступа: https://pharmacopoeia.ru/gosudarstvennaya-farmakopeya-xiii-online-gf-13-online/, свободный.

17. Государственная Фармакопея Российской Федерации. Издание XIV. Режим доступа: http: //resource. rucml. ru/feml/pharmacopia/14_1/HTML/897/index. html, свободный.

18. Жебентяев, А.И. Методы выделения четвертичных аммониевых соединений / А.И. Жебентяев, Н.А. Алексеев // Судебно-медицинская экспертиза. - 1998. - Т. 41, № 1. - С. 40-43.

19. Закржевская, Т.Н. Технология получения и исследования таблеток прозерина с высокомолекулярными соединениями / Т.Н. Закржевская, Г.И. Лукьянчикова // Фармация. - 1987. - Т. 36, № 6. - С. 22-23.

20. Зимнухов, В.В. Изолирование, обнаружение и определение прозерина в трупном материале / В.В. Зимнухов // Судебно-медицинская экспертиза. - 1967. - Т. 10, № 4. - С. 35-40.

21. Зимнухов, В.В. Общая схема пробоподготовки трупного материала при определении малолетучих органических токсикантов / В.В. Зимнухов // Перспективы развития и совершенствования судебно-медицинской науки и практики: матер. VI Всерос. съезда судебных медиков (Тюмень. 7-9 сентября, 2005 г.). - М.-Тюмень, 2005. - С. 107.

22. Зимнухов, В.В. Химико-токсикологическое исследование прозерина / В.В. Зимнухов // Фармация. - 1971. - Т. 20, № 2. - С. 45-50.

23. Изучение распределения неостигмина метилсульфата в организме теплокровных животных после внутрижелудочного введения / М.И. Алехина, В.К. Шорманов, Т.Н. Никитина, А.М. Маркелова // Судебно-медицинская экспертиза. - 2019. - Т. 62, № 2. - С. 40-47.

24. Изучение спектральных характеристик, способности к окислению и хроматографической подвижности в тонких слоях обращенно-фазового сорбента продукта метаболизма Калимина 60 Н / В.К. Шорманов, Е.П. Дурицын, Т.Н. Илюшина, М.И. Алехина // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2012. - № 2. - С. 133 - 137.

25. Изучение спектральных характеристик, способности к окислению и хроматографической подвижности в тонких слоях обращеннофазового сорбента продукта метаболизма экселона / Е.П. Дурицын, Т.Н. Илюшина, М.И. Алехина [и др.] // Украинский медицинский альманах. - 2012. - Т. 15, № 5. - С. 104 - 106.

26. Инструкция по применению лекарственного препарата Калимин 60 Н. Утв. Департаментом Государственного контроля лекарственных средств и

медицинской техники МЗ РФ 03.09.2003. Одобрено Фармакологическим комитетом МЗ РФ, протокол № 5б 10.06.2003.

27. Калетина, Н.И. Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов / Н. И. Калетина. - М.: ГЕОТАР-Медиа, 2008. - 1016 с.

28. Калимин 60 Н. Инструкция по применению, противопоказания, состав и цена. Энциклопедия лекарств RLSNET [Электронный ресурс]. -Режим доступа: http://www.rlsnet.ru/tn_index_id_8107.htm, свободный.

29. Калимин® 60 Н. НД П N015236/01-240510 от 06.10.2008. Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации. - М., 2008. - 8 с.

30. Кандибур, Р.И. Случай отравления прозерином / Р.И. Кандибур // Судебно-медицинская экспертиза. - 1958. - Т. 1, № 4. - С. 52-53.

31. Карташов, В.А. Некоторые вопросы выделения из биологических объектов метаболитов токсических веществ / В.А. Карташов, Л.В. Чернова // Новые технологии. - 2010. - № 1. - С. 135-139.

32. Кривой, И.И. Нервно-мышечный синапс и антихолинэстеразные вещества / И.И. Кривой, В.И. Кулешов, Д.П. Матюшкин; под ред. Д.П. Матюшкина. - Л.: Издательство Ленинградского университета. - 1987. - 235 с.

33. Лакин, К.М. Биотрансформация лекарственных веществ / К.М. Лакин, Крылов М.: Медицина, 1981. - 342 с.

34. Лукьянчикова, Г.И. Использование экстракционной фотометрии в анализе производных хинуклидина, бензимидазола, тропана, пирролидина / Г.И. Лукьянчикова, И.Я. Багдасарова, Т.И. Блинова // Фармация. - 1984. - Т. 33, № 6. - С. 73-76.

35. Лутцева, Т.Ю. Методы анализа и стандартизации лекарственных четвертичных аммониевых оснований / Т.Ю. Лутцева, Н.П. Садчикова, А.П. Арзамасцев // Вопросы биологич., мед. и фармац. химии. - 2002. - № 3. С. 17-20.

36. Маркова, И.В. Клиническая токсикология детей и подростков / И.В. Маркова, В.В. Афанасьев, Э.К. Цыбулькин. - С-Пб.: «Интермедика», 1999. -Том 2. - 400 с.

37. Медведев, Ю.В. ВЭЖХ и СВЭЖХ как методы для определения лекарственных веществ в крови / Ю.В. Медведев, Г.В. Раменская, И.Е. Шохин // Химико-фармацевтический журнал. - 2013. - Т. 47, № 4. - С. 45-51.

38. Международная фармакопея. 6 издание. - Женева: ВОЗ, 2016.

39. Меркулова, Д.М. Алгоритмы диагностики и лечения кризовых состояний у больных миастенией гравис / Д.М. Меркулова, С.С. Никитин, Ю.А. Меркулов // Атмосфера. Нервные болезни. - 2008. - № 2. - С. 7-12.

40. Методические рекомендации по валидации аналитических методик, используемых в судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе биологического материала. - М.: ЭсПэХа, 2014. - 76 с.

41. Могош, Г. Острые отравления / Г. Могош. - Бухарест: Медицинское издательство, 1984. - 580 с.

42. Муравьева, Г.М. Обнаружение мапротилина и прозерина при судебно-химическом исследовании трупного материала / Г.М. Муравьева // Судебно-медицинская экспертиза. - 2005. - Том 48, № 2. - С. 42-43.

43. Найссен, В. Твердофазная экстракция и жидкостная хроматография в комбинации с тандемной масс-спектрометрией / В. Найссен, А. Хагенбум, Ю. Бринкман // Химическая и биологическая безопасность. - 2002. - № 3. - С 47-51.

44. Особенности извлечения 1-метил-3-пиридона из биологического материала (печени) диоксаном / Т.Н. Никитина, М.И. Алехина, М.В. Токарева [и др.] // Молодежный инновационный вестник. - 2014. - Т. 3, № 2. - С. 522-523.

45. Особенности распределения пиридостигмина бромида в организме теплокровных животных при внутрижелудочном введении / В.К. Шорманов, М.И. Алехина, Е.А. Коваленко Д.В. Астафьев // Фармация. - 2020. - Т. 69, № 2. - С. 50-56.

46. Пат. 2548742 Российская Федерация; МПК G01N33/52 (2006.01); Способ определения О-(2,3-дигидро-2,2-диметил-7-бензофуранил)-Ы-метилкарбамата в биологическом материале / Шорманов В.К., Галушкин С.Г., Терских А.П., Алехина М.И.; заявитель и патентообладатель Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего

профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации» (RU). - № 2014109737; заявл.03.12.2014; опубл.20.04.2015, Бюл. № 11. - 12 с.

47. Пат. 2597796 Российская Федерация; МПК G01N 33/15 (2006.01) G01N 33/52 (2006.01); Способ количественного определения групп стигминов / Калашников В.П., Сливкин А.И., Дьякова Н.А.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ») (RU). -№ 2014154607; заявл. 31.12.2014; опубл. 20.09.2016, Бюл. № 26. - 9 с.

48. Пиняжко, Р.М. Методы УФ-спектрофотометрии в фармацевтическом анализе / Р.М. Пиняжко, Т.Г. Каленюк. - Киев: Здоров'я, 1976. - 89 с.

49. Пономарева, Е.Н. Миастения гравис (эпидемиология, клинические формы, современный взгляд на патогенез) / Е.Н. Пономарева, О.И. Кузьменок, П.А. Синевич // Медицинские новости. - 1998. - № 9. - C. 3-7.

50. Прозерин. Инструкция по применению, противопоказания, состав и цена. Энциклопедия лекарств RLSNET [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.rlsnet.ru/tn index id 5024.htm, свободный.

51. Прозерин. НД 42-7088-03 от 18.06.2003. Фармакопейный государственный комитет МЗ РФ. - М., 2003. - 6 с. 52.

52. Прозоровский, В.Б. Неантихолинэстеразные механизмы действия антихолинэстеразных средств / В.Б. Прозоровский, Н.В. Саватеев. Л.: Медицина, 1976. - 160 с.

53. Прозоровский, В.Б. Феномен гормезиса в возрастной токсикологии: антидотный эффект атропина у мышей / В.Б. Прозоровский, Т.В. Шефер // Токсикологический вестник: научно-практический журнал. - 2005. - № 5. -С. 10-13.

54. Разработка методики йодометрического определения Калимина 60 Н / Е.П. Дурицын, Т.Н. Илюшина, М.И. Алехина, Е.Н. Ветрова // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным

участием, посвященной 45-летию фармацевтического факультета КГМУ (Курск, 27 октября 2011 г.). - Курск, 2011. - С. 271-273.

55. Рубцов, А.Ф. Смертельные отравления в 1970-1971 годах / А.Ф. Рубцов // Судебно-медицинская экспертиза. - 1974. - Том 17, № 4. - С. 36-39.

56. Руководство по инструментальным методам исследований при разработке и экспертизе качества лекарственных препаратов / С.Н. Быковский, И.А. Василенко, М.И. Харченко [и др.]; под. ред. С.Н. Быковского- М.: Изд-во «Перо», 2014. - 656 с.

57. Скрипниченко, Д.Ф. Диагностика и лечение миастении / Д.Ф. Скрипниченко, М.М. Шевнюк. - Киев: Здоров'я, 1991. - 152 с.

58. Смусин, Я.С. Судебно-медицинская экспертиза отравлений антихолинэстеразными веществами / Я.С. Смусин. - М.: Медицина, 1968. -192 с.

59. Современные подходы к анализу наркотических веществ в биологических объектах / А.Е. Коваленко, Д.А. Кардонский, А.А. Еганов [и др.] // Судебно-медицинская экспертиза. - 2007. - Т. 50, № 2. - С. 28-32.

60. Спектрофотометрическое определение прозерина в лекарственных формах / С.И. Куликов, Т.Н. Боковикова, Л.К. Карпова, В.Е. Чичиро // Фармация. - 1987. - Т. 36, № 3. - С. 43-45.

61. Старостина, В.К. Холинэстераза: Методы анализа и диагностическое значение: информационно-методическое пособие / В.К. Старостина, С.А. Дегтева. - Новосибирск: «Вектор-Бест», 2008. - 35 с.

62. Столяров, Б. В. Практическая газовая и жидкостная хроматография / Б.В. Столяров, И.М. Савинов, А.Г. Витенберг. - СПб.: Изд-во С.-Петербург. ун-та, 2002. - 616 с.

63. Уколов, А.И. Систематический токсиколого-аналитический скрининг биологических образцов методом хромато-масс-спектрометрии. Примеры обнаружения диазепама, трамадола и прозерина / А.И. Уколов, Г.В. Каракашев, Е.С. Уколова // Масс-спектрометрия. - 2013. - Т. 10, № 2. - С. 120-128.

64. Фармакопея США. USP 29. Национальный формуляр. NF 24: в 2 томах / пер. с англ. Абрикосова Ю.Е. и др. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - Т. 1. - 1624 с.

65. Хирц, Ж. Аналитические методы исследования метаболизма лекарственных веществ / Ж. Хирц. - М.: Медицина, 1975. - 271 с.

66. Цветометрическое определение метаболита Калимина в тонком слое нормально-фазового сорбента / Л.В. Рудакова, Т.Н. Никитина, М.И. Алехина [и др.] // Сборник материалов XIV Конференции и Третьего Всероссийского симпозиума с международным участием (Воронеж, 9-14 октября 2014 г.). - Воронеж, 2014. - С. 264-266.

67. Чмиль, В.Д. Тонкослойная хроматография производных карбаминовой кислоты / В.Д. Чмиль, Р.Д. Васягина // Журн. аналит. химии. -1989. - Т. 44, № 4. - С. 757-759.

68. Шорманов, В.К. Особенности изолирования прозерина из биологического материала / В.К. Шорманов, Д.В. Астафьев, М.И. Алехина // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2016. - № 1. - С. 170176.

69. A comparative in vitro assay of drug release performance of pyridostigmine bromide tablets / N.L.G. Vidal, P.D. Zubata, L.D. Simionato ^t al.] // Dissolution Technologies. - 2007. - N 11 (ноябрь). - P. 33-36.

70. A pharmacokinetic study of neostigmine in man using gas chromatography-masspectrometry / S. Aquilonius, S. Eckernas, P. Hartvig ^t al.] // European Journal of Clinical Pharmacology. - 1979. - Vol. 15, N 5. - P. 367371.

71. A quantitative gas-liquid chromatographic method for the determination of neostigmine and pyridostigmine in human plasma / K. Chan, N.E. Williams, J.D. Baty, T.N Calvey // J Chromatography. - 1976. - Vol. 120. - P. 349-358.

72. A radioimmunoassay for pyridostigmine / H.G. Meyer, B.J. Lukey, R.T. Gepp [et al.] // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 1988. - Vol. 247. - P. 432-438.

73. Abu-Qare, A.W. Determination of depleted uranium, pyridostigmine bromide and its metabolite in plasma and urine following combined administration

in rats / A.W. Abu-Qare, M.B. Abou-Donia // J Pharm Biomed Anal. - 2001. -Vol. 26, N 20. - P. 281-289.

74. Abu-Qare, A.W. High-Performance Liquid chromatographic determination of pyridostigmine bromide, nicotine, and their metabolites in rat plasma and urine / A.W. Abu-Qare, M.B. Abou-Donia // Journal of Chromatographic Science. - 2001. - Vol. 39, N 7. - P. 287-292.

75. Akinwale, M.O. Analgesic effect of intrathecal neostigmine combined with bupivacaine and fentanyl / M.O. Akinwale, P.T. Sotunmbi, O.A. Akinyemi // Afr. J. Med. Sci. - 2012. - Vol. 41, N 2. - Р. 231-237.

76. Alekseev, N.A. Extraction of proserine from biological tissues using unmodified silicas / N.A. Alekseev, A.I. Zhebentyaev // J Anal Chem. - 2001. -Vol. 56, N 6. - P. 515-518.

77. Analysis of pyridostigmine bromide in human plasma and its application in bioequivalence studies / S. Agarwal, K.V. Gowda, U. Mandal [et al.] // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. - 2007. - Vol. 30, N 17. - P. 2605-2615.

78. Analytical Profile of Neostigmine [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://www.researchgate.net/publication/231351262 49-Analytical_Profile _of_Neostigmine, свободный.

79. Aquilonius, S-M. Clinical pharmacokinetics of cholinesterase inhibitors / S-M. Aquilonius, P. Hartvig // Clin Pharmacokinetics. - 1986. - Vol. 11. - P. 236249.

80. Beneficial effect of crotamine in the treatment of myasthenic rats / S. Hernandez-Oliveira-e-Silva, S. Rostelato-Ferreira, T.A.A. Rocha-e-Silva [et al.] // Muscle Nerve. - 2013. - Vol. 47, N 4. - Р. 591-593.

81. Breyer-Pfaff, U. Pyridostigmine kinetics in healthy subjects and patients with myasthenia gravis / U. Breyer-Pfaff, A.M. Brinkmann // Clinical Pharmacology and Therapeutics. - 1985. - Vol. 37, N 5. - P. 495-501.

82. Buzello, W. Hazards of neostigmine in parients with neuromuscular disorders / W. Buzello, N. Krieg, A. Schlickewei // British Journal of Anesthesia. -1982. - Vol. 54. - P. 529-534.

83. Caldwell, J.E. Reversal of residual neuromuscular block with neostigmine at one to four hours after a single intubating dose of vecuronium / J.E. Caldwell // Anesth Analg. - 1995. - Vol. 80. - P. 1168-1174.

84. Chan, K. The isolation and determination of neostigmine, pyridostigmine and their metabolites in human biological fluids / K. Chan, A. Dehghan // Journal of Pharmacological Methods. - 1978. - Vol. 1, N 4. - P. 311-320.

85. Clinical features, pathogenesis, and treatment of myasthenia gravis: a supplement to the Guidelines of the German Neurological Society / N. Melzer, T. Ruck, P. Fuhr [et al.] // J Neurol. - 2016. - Vol. 263. - P. 1473-1494.

86. Clinical pharmacology of pyridostigmine and neostigmine in patients with myasthenia gravis / S.M. Aquilonius, S.A. Eckernas, P. Hartvig [et al.] // Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. - 1983. - Vol. 46. - P. 929935.

87. De Ruyter, M.G.M. Reversed-phase, ion-pair liquid chromatography of quaternary ammonium compounds: Determination of pyridostigmine, neostigmine and edrophonium in biological fluids / M.G.M. De Ruyter, R.J. Cronnelly // Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. - 1980. -Vol. 183, N 2. - P. 193-201.

88. Determination of Neostigmine Methylsulfate in Injection by RP-HPLC / L. Su, X.-B. Liao, Y.-G. He, Y.-L. Hu // Chinese Journal of Veterinary Drug. Pages. - 2014. - Vol. 30, N 7. - P. 727-729.

89. Determination of pyridostigmine bromide and its metabolites in biological samples / Z. Bin, M.M. Shabbir, L. Jia [et al.] // J Pharm Pharmaceut Sci. - 2006. - Vol. 9, N 1. - P. 71-81.

90. Development and validation of a rapid and high-sensitivity liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for the determination of neostigmine in small-volume beagle dog plasma and its application to a pharmacokinetic study / D. Cao, W. Li, X. Zhao [et al.] // Biomed Chromatogr. 2014. - Vol. 28, N 3. - P. 354-361.

91. Development and validation of a stability-indicating high-performance thin-layer chromatographic method for determination of pyridostigmine bromide in the presence of its alkaline-induced degradation product / N.W. Ali, E.A.

Abdelaleem, I.A. Naguib, F.F. Abdallah // Journal of Planar Chromatography. -2015. - Vol. 28, N 4. - P. 316-322.

92. Development and validation of three spectrophotometric methods for determination of pyridostigmine bromide in the presence of its alkaline-induced degradation product / E.A. Abdelaleem, I.A. Naguib, F.F. Abdallah, N.W. Ali // European Journal of Chemistry. - 2015. - Vol. 6, N 3. - P. 350-356.

93. Development of small bisquaternary cholinesterase inhibitors as drugs for pretreatment of nerve agent poisoning / K. Kuca, J. Zdarova Karasova, O. Soukup [et al.] / Drug Design, Development and Therapy. - 2018. - Vol. 12. - P. 505-512.

94. Effects of Pyridostigmine bromide on SH-SY5Y cells: An in vitro neuroblastoma neurotoxicity model / V.F. Azzolin, F. Barbisan, L.S. Lenz [et al.] // Mutation Research. - 2017. - Vol. 823. - P. 1-10.

95. Electroporation-delivered transdermal neostigmine in rats: equivalent action to intravenous administration / S. Berko, K.F. Szücs, B. Balazs [et al.] // Drug Design, Development and Therapy. - 2016. - Vol. 10. - P. 1695-1701.

96. Ellin, R.I. Method for isolation and determination of pyridostigmine and metabolites in urine and blood / R.I. Ellin, P. Zvirblis, M.R. Wilson // J. Chromatogr. - 1982. - Vol. 228. - P. 235-244.

97. European Pharmacopoeia 8th Edition. - Strasbourg, 2013. - 3513 p.

98. Flow-through enzyme immobilized amperometric detector for the rapid screening of acetylcholinesterase inhibitors by flow injectio analysis / M. Vandeput, C. Parsajoo, J. Vanheuverzwijn [et al.] // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2015. - Vol. 102. - P. 267-275.

99. Ghous, T. Flow injection determination of neostigmine and galanthamine by immobilised acetylcholinesterase inhibition / T. Ghous, A. Townshend // Analytica Chimica Acta. - 1998. - Vol. 372. - P. 379-386.

100. Guideline on validation of bioanalytical methods (draft). - London: EMEA/CHMP/EWP, 2015. - 23 p.

101. Gulf War agents pyridostigmine bromide and permethrin cause hypersensitive nociception that is restored after vagus nerve stimulation / D.

Nizamutdinov, S. Mukherjee, C. Deng [et al.] // NeuroToxicology. - 2018. - Vol. 69. - P. 93-96.

102. Herrmann, C. Jr. Myasthenia Gravis: brief guide to diagnosis and management / C. Herrmann Jr. // California Medicine. - 1967. - Vol. 106, N 4. -P. 275-281.

103. High-performance liquid chromatographic determination of pyridostigmine in plasma / H. Matsunaga, T. Suehiro, T. Saita [et al.] // J Chromatogr. - 1987. - Vol. 422. - P. 353-355.

104. How effective is Pyridostigmine Bromide for Myasthenia Gravis? [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.ehealthme.com/cd/myasthenia-gravis/pyridostigmine-bromide/, свободный.

105. Huck, C.W. Recent Developments in Solid-Phase Extraction for near and attenuated total reflection infrared spectroscopic analysis / C.W. Huck // Molecules. - 2016. - Vol. 633, N 21 [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27187347 09.03.2019, свободный.

106. Isolation and characterization og metabolites of neostigmine from rat urine / S.M. Somani, J.B. Roberts, B.H. Thomas, A. Wilson // Europ. J. Pharm. -1970. - Vol. 12, N 1. - P.114-119.

107. Khorshid, A.F. Novel Coated Wires Sensors with Flow-Injection for Potentiometric Determination of Neostigmine in Bulk, Amostigmine and Human Urine / A.F. Khorshid, Y.M. Issa // UK Journal of Pharmaceutical and Biosciences. - 2015. - Vol. 3, N 3. - P. 30-39.

108. Liu, S.H. Is neostigmine effective in severe pufferfish-associated tetrodotoxin poisoning? / S.H. Liu, C.Y. Tseng, C.C. Lin // Clin. Toxicol. (Phila). -2015. - Vol. 53, N 1. - Р. 13-21.

109. Lukaszewski, T. The extraction and analysis of quaternary ammonium compounds in biological material by GC and GC/MS / T. Lukaszewski // J Analit Tox. - 1985. - Vol. 9, N 3. - P. 101-108.

110. Maggi, L. Treatment of myasthenia gravis: focus on pyridostigmine / L. Maggi, R. Mantegazza // Clin Drug Investig. - 2011. - Vol. 31, N 10. - P. 691701.

111. Mak, G. Use of neostigmine in apecitabine-induced paralytic ileus / G. Mak // Tumori. - 2013. - Vol. 99, N 5. - Р. 225-228.

112. Malcolm, S.L. Thermospray mass spectrometer as a quantitative specific, sensitive, detector for liquid chromatography. Its application to the analysis of pyridostigmine in human plasma / S.L. Malcolm, M.J. Madigan, N.L. Taylor // J Pharm Biomed Anal. - 1990. - Vol. 8. - P. 771-776.

113. Mantegazza, R. Current and emerging therapies for the treatment of myasthenia gravis / R. Mantegazza, S. Bonanno, G. Camera, C. Antozzi // Neuropsychiatr Dis Treat. - 2011. - Vol. 7. - P. 151-160.

114. Merriggioli, M.N. Autoimmune myasthenia gravis: emerging clinical and biological heterogeneity / M.N. Merriggioli, D.B. Sanders // Lancet Neurol. -2009. - Vol. 8, N 5. - P. 475-490.

115. Metabolism and excretion of 3-hydroxyphenyltrimethylammonium and neostigmine / M.A. Husain, J.B. Roberts, B.H. Thomas, A. Wilson // Br J Pharmacol. - 1969. - Vol. 35, N 2. - P. 344-350.

116. Metabolites of neostigmine and pyridostigmine do not contribute to antagonism of neuromuscular blockade in the dog / P.J. Hennis, R. Cronnelly, M. Sharma [et al.] // Anesthesiology. - 1984. - Vol. 61, N 5. - P. 534-539.

117. Miller, R.L. Radioimmunoassay of pyridostigmine in plasma and tissues / R.L. Miller, P. Verma // Pharmacol Res. - 1989. - Vol 21. - P. 359-368.

118. Myasthenia gravis requiring pyridostigmine treatment in a national population cohort / J.B. Andersen, A. Engeland, J.F. Owe, N.E. Gilhus // Eur J Neurol. - 2010. - Vol. 17. - P. 1445-1450.

119. Neostigmine Methylsulfate [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.cymitquimica.com/uploads /products/45/pdf/1460000-msds.pdf,

свободный.

120. Neostigmine Methylsulfate. Omega Laboratories, Ltd. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.omegalaboratory.com/index.php/download file/-/view/360/, свободный.

121. Non-cardiogenic pulmonary oedema after neostigmine given for reversal: A report of two cases / L.K. Raiger, U. Naithani, B.S. Vijay [et al.] // Indian J Anaesth. - 2010. - Vol. 54, N 4. - P. 338-341.

122. Nowel, P.T. Determination of neostigmine and pyridostigmine in the urine of patients with myasthenia gravis / P.T. Nowel, C.A. Scott, A. Wilson // Brit J Pharmacol. - 1962. - Vol. 18. - P. 617-624.

123. Payne, J.P. Neuromuscular blockade by neostigmine in anaesthetized man / J.P. Payne, R. Hughes, S. Al Azawi // British Journal of Anaesthesia. -1980. - Vol. 52. - P. 69-76.

124. Pellegrini, J.E. The effect of oral pyridostigmine bromide nerve agent prophylaxis on return of twitch height in persons receiving succinylcholine / J.E. Pellegrini // Milit. Med. - 2000. - Vol. 165. - P. 252-255.

125. Pharmacokinetics and oral bioavailability of pyridostigmine in man / S.M. Aquilonius, S.A. Eckernas, P. Hartvig [et al.] // European Journal of Clinical Pharmacology. - 1980. - Vol. 18. - P. 423-428.

126. Pharmacokinetics of pyridostigmine in dogs / T. Taylor, D.R. Hawkins, T.J. Forrest, H. Chung // J Pharm Sci. - 1991. - Vol. 80. - P. 353-356.

127. Plasma clearance of neostigmine and pyridostigmine in the dog / P.R. Baker, T.N. Calvey, K. Chan [et al.] // Br J Pharmacol. - 1978. - Vol. 63. - P. 509512.

128. Pooler, H.E. Atropine, neostigmine and sudden deaths / H.E. Pooler // Anaesthesia. - 1957. - Vol. 12, N 2. - P. 198-202.

129. Population pharmacokinetics and pharmacodynamics of pyridostigmine bromide for prophylaxis against nerve agents in humans / M.T. Marino, B.G. Schuster, RP. Brueckner [et al.] // J. Clin. Pharmacol. - 1998. - Vol. 38. - P. 227235.

130. Prescription profile of pyridostigmine use in a population of patients with myasthenia gravis / J.E. Machado- Alba, L.F. Calvo- Torres, A. Gaviria- Mendoza, C.A. MejiA- Velez // Muscle & Nerve. - 2017. - Vol. 56, N 6. - P. 1041-1046.

131. Prophylactic potential of memantine against soman poisoning in rats / M.P. Stojiljkovic, R. Skrbic, M. Jokanovic [et al.] // Toxicology. - 2019. - Vol. 416. - P. 62-74.

132. Protection of human muscle acetylcholinesterase from soman by pyridostigmine bromide / R.A. Maselli, J.D. Henderson, J. Ng [et al.] // Muscle Nerve. - 2011. - Vol. 43. - P. 591-595.

133. Puram, S.R. Highly sensitive and rapid evaluation of pyridostigmine impurity b in human plasma by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometer after administration of pyridostigmine to healthy volunteers in a pharmacokinetic study / S.R. Puram, R. Batheja, G. Nithya // Asian Journal of Pharmaceutical and clinical Reaserch. - 2018. - Vol. 11, N 6. - P. 353-357.

134. Pyridostigmine [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.drugs.com/mtm/pyridostigmine.html, свободный.

135. Pyridostigmine bromide tablets, USP. Package Insert [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.fda.gov/downloads/drugs/emergencypreparedness/bioterrorismanddru gpreparedness/ucm133154.pdf, свободный.

136. Pyridostigmine Bromide use in the Persian Gulf War [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.rand.org/content/dam/rand/pubs/monograph reports/MR1018z2/MR1 018.2.chap4.pdf, свободный.

137. Residual paralysis induced by either vecuronium or rocuronium after reversal with pyridostigmine / K.S. Kim, S.H. Lew, H.Y. Cho, M.A. Cheong // Anesth Analg. - 2002. - Vol. 95. - P. 1656-1660.

138. Roberts, J.B. Metabolism of neostigmine in vitro / J.B. Roberts, B.H. Thomas, A. Wilson // Biochemical Pharmacology. - 1968. - Vol. 17, N 1. - P. 912.

139. Role of a novel pyridostigmine bromide-phospholipid nanocomplex in improving oral bioavailability / Q. Tan, N. Hu, G. Liu ^t al.] // Arch Pharm Res. -2012. - Vol. 35. - P. 499-508.

140. Sato, T. Anticholinesterases: peripheral and central effects / T. Sato, H. Nakatsuka // Masui. - 2013. - Vol. 62, N 1. - P. 19-26.

141. Sieb, J.P. Myasthenia gravis: an update for the clinician / J.P. Sieb // Clin Exp Immunol. 2014. - Vol. 175, N 3. - P. 408-418.

142. Solid-phase extraction of quaternary ammonium herbicides / Y. Pico, G. Font, J.C. Molto, J. Manes // Journal of chromatography A. - 2000. - Vol. 885. - P. 251-271.

143. Somani, S.M. Pyridostigmine metabolism in man / S.M. Somani, A. Wilson, J.B. Roberts // Clinical Pharmacology and Therapeutics. - 1972. - Vol. 13, N 3. - P. 393-399.

144. Steady state kinetics of pyridostigmine in myasthenia gravis / P.S. Sorensen, H. Flachs, M.L. Friis [et al.] // Neurology. - 1984. - Vol. 34. - P. 10201024.

145. Thanvi, B.R. Update on myasthenia gravis / B.R. Thanvi, T.C.N. Lo // Postgrad Med J. - 2004. - Vol. 80. - P. 690-700.

146. The simultaneous monitoring of plasma levels of neostigmine and pyridostigmine in man / S.C. Davison, N. Hyman, R.A. Prentis [et al.] // Methods Find Exp Clin Pharmacol. - 1980. - Vol. 2. - P. 77-82.

147. Tramer, M.R. Omitting antagonism of neuromuscular block: effect on postoperative nausea and vomiting and risk of residual paralysis. A systematic review / M.R. Tramer, T. Fuchs-Buder // Br J Anaesth. - 1999. - Vol. 82. - P. 379386.

148. Update on ocular myasthenia gravis in Taiwan / C.-W. Lin, T.-C. Chen, J.-R. Jou, L.-C. Woung // Taiwan J Ophthalmol. - 2018. - Vol. 8, N 2. - P. 67-73.

149. White, M.C. Plasma pyridostigmine levels in myasthenia gravis / M.C. White, P. De Silva, C.W. Havard // Neurology. - 1981. - Vol. 31. - P. 145-150.

150. Yue, C.-L. Study on RP-HPLC Determination of Content of Neostigmine Methylsulfate for Injection / C.-L. Yue, L.-J. Mao, Z. Guo // Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis. 2005. Vol. 25, N 10. P. 1264-1265.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 11 - Результаты количественного определения пиридостигмина бромида и 3-гидрокси-1-метилпиридиния

после хроматографирования в колонке и тонком слое сорбента (п=6; Р=0,95)

Сорбент Вид хроматографии Подвижная фаза Метод количественного определения Растворяющая среда при определении Найдено аналита, %

х Б Б х Ах £

Исследование пиридостигмина бромида

Сепарон С18 30 мкм колоночная Вода -ацетон (9,5:0,5) ВЭЖХ 0,02 % раствор дигидрофосфата калия (рН 3,0) -ацетонитрил -метанол (92,5:5,0:2,5) 99,60 1,32 0,54 1,38 1,39

спектрофотометрия этанол 99,42 1,14 0,46 1,19 1,20

силикагель СТХ-1А на пластинах «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ, ТСХ буферный раствор с рН 1,98 -ацетон (8:2) спектрофотометрия этанол 98,65 1,19 0,48 1,24 1,26

обработанный вазелиновым маслом

Исследование 3-гидрокси-1 -метилпиридиния

Сепарон С18 30 мкм колоночная Вода -ацетон (9,5:0,5) ВЭЖХ Вода - ацетон (9,5:0,5) 99,54 1,27 0,52 1,33 1,34

спектрофотометрия этанол -буферный раствор с рН 3 (1:1) 99,31 1,18 0,48 1,24 1,25

силикагель СТХ-1А на пластинах «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ, обработанный вазелиновым маслом ТСХ буферный раствор с рН 1,98 -ацетон (8:2) спектрофотометрия этанол -буферный раствор с рН 3 (1:1) 98,26 1,21 0,49 1,27 1,29

Таблица 12 - Результаты измерения оптических плотностей, соответствующих фоновому поглощению, при моделировании очистки извлечений из биоматериала (ткани печени) (п=5)

Вид очистки Сорбент Подвижна я фаза Растворяющая среда при определении (УФ- спектрофотометрия) Масса биоматериала, соэкстрактивные вещества из которой после очистки присутствуют в 1 мл фотометрируемого раствора, г Длина волны для измерения оптической плотности Оптическа я плотность полученны х растворов ( 1 = 1 см )

Колоноч ная хроматография Сепарон С18 30 мкм Вода- ацетон (9,5:0,5) 0,02 % раствор дигидрофосфата калия (рН 3,0) -ацетонитрил -метанол (92,5:5:2,5) 0,5 215 0,123

этанол 0,5 270 0,054

Этанол - буферный раствор с рН 3 (1:1) 0,5 290 0,046

ТСХ силикагель СТХ- буферный этанол 0,5 270 0,068

1А на пластинах раствор с Этанол - буферный 0,5 290 0,055

«Сорбфил» ПТСХ- рН 1,98 - раствор с рН 3 (1:1)

АФ-А-УФ, ацетон

обработанный (8:2)

вазелиновым

маслом

Таблица 13 - Результаты количественного определения аналитов в ткани органа (печени) на основе изолирования

ацетоном и очистки путем смены растворителя и в колонке сорбента (п=5, Р=0,95)

Внесено аналита, мг в 25 г ткани печени Найдено, %

пиридостигмина бромида 3-гидрокси-1 -метилпиридиния

х Б Бх- Ах х Б Б х Ах

50,0 73,61 1,86 0,83 2,31 79,59 2,20 0,98 2,73

25,0 73,48 1,90 0,85 2,36 79,34 2,34 1,05 2,91

10,0 73,13 1,97 0,88 2,45 79,03 2,46 1,10 3,06

5,0 72,74 2,07 0,93 2,57 78,61 2,51 1,12 3,12

2,5 72,39 2,22 0,99 2,76 78,21 2,63 1,18 3,27

Таблица 14 - Результаты количественного определения аналитов в крови на основе изолирования ацетоном и очистки

путем смены растворителя и в колонке сорбента (п=5, Р=0,95)

Внесено аналита, мг в 25 г крови Найдено, %

пиридостигмина бромида 3 -гидрокси-1 -метилпиридиния

X Б Б х Дх X Б Б х Дх

50,0 82,93 1,77 0,79 2,20 89,75 2,09 0,94 2,60

25,0 82,74 1,81 0,81 2,25 89,68 2,20 0,98 2,73

10,0 82,45 1,84 0,82 2,29 89,32 2,31 1,03 2,87

5,0 82,21 1,96 0,88 2,44 89,02 2,38 1,07 2,96

2,5 81,89 2,07 0,92 2,57 88,79 2,51 1,12в 3,12

Таблица 15 - Результаты количественного определения аналитов в моче на основе изолирования ацетоном и очистки

путем смены растворителя и в колонке сорбента (п=5, Р=0,95)

Внесено аналита, мг в 25 г мочи Найдено, %

пиридостигмина бромида 3-гидрокси-1 -метилпиридиния

X Б Б х Дх х Б Бх Дх

50,0 90,46 1,38 0,62 1,72 90,77 1,56 0,70 1,94

25,0 90,38 1,42 0,63 1,76 90,64 1,64 0,73 2,04

10,0 90,17 1,47 0,66 1,83 90,38 1,75 0,78 2,18

5,0 89,86 1,57 0,70 1,95 90,14 1,84 0,82 2,29

2,5 89,72 1,69 0,76 2,10 89,93 1,95 0,87 2,42

Таблица 16 - Характеристики градуировочных графиков для определения пиридостигмина бромида и 3-гидрокси-1-

метилпиридиния в биологических матрицах методом ВЭЖХ

Биоматрица Тангенс угла наклона к Свободный член Ь Коэффициент корреляции г Концентрационный диапазон линейности, мкг/г

Пиридостигмина бромид

Ткань органа (печени) 1338781 4702 0,99789 0,08-16,00

Кровь 1554062 10757 0,99846 0,08-16,00

Моча 1750864 -7391 0,999659 0,08-16,00

3 -гидрокси-1 -метилпиридиний

Ткань органа (печени) 40306 -222 0,99656 0,08-16,00

Кровь 43931 960 0,99776 0,08-16,00

Моча 49785 -99 0,99908 0,08-16,00

Таблица 17 - Отклонения найденных концентраций градуировочных смесей с тканью печени от истинного

содержания в них пиридостигмина (п=5)

Истинное содержание пиридостигмина, мкг/г 0,08 0,16 0,32 0,8 3,20 6,40 9,60 12,80 16,00

Найденное содержание пиридостигмина, мкг/г 0,0837 0,1810 0,3368 0,8211 2,9673 6,3480 10,3646 12,0524 16,2050

Относительная погрешность, % 4,65 13,14 5,24 2,64 -7,27 -0,81 7,96 -5,84 1,28

Таблица 18 - Отклонения найденных концентраций градуировочных смесей с тканью печени от истинного

содержания в них метаболита пиридостигмина (п=5)

Истинное содержание метаболита пиридостигмина, мкг/г 0,08 0,16 0,32 0,8 3,20 6,40 9,60 12,80 16,00

Найденное содержание метаболита пиридостигмина, мкг/г 0,0816 0,1667 0,3263 0,8596 3,0489 6,7087 8,7545 13,81 15,60

Относительная погрешность, % 2,03 4,17 1,96 7,45 -4,72 4,82 -8,81 7,93 -2,51

Таблица 19 - Отклонения найденных концентраций градуировочных смесей с кровью от истинного содержания в них

пиридостигмина (п=5)

Истинное содержание пиридостигмина, мкг/г 0,08 0,16 0,32 0,8 3,2 6,4 9,6 12,8 16,0

Найденное содержание пиридостигмина, мкг/г 0,0927 0,1759 0,3412 0,8840 3,1513 6,4617 8,9498 13,4667 15,8370

Относительная погрешность, % 15,85 9,80 6,62 10,51 -1,52 0,96 -6,77 5,21 -1,02

Таблица 20 - Отклонения найденных концентраций градуировочных смесей с кровью от истинного содержания в них

метаболита пиридостигмина (п=5)

Истинное содержание метаболита пиридостигмина, мкг/г 0,08 0,16 0,32 0,80 3,20 6,40 9,60 12,80 16,00

Найденное содержание метаболита пиридостигмина, мкг/г 0,0878 0,1599 0,3419 0,7978 2,8354 6,9459 9,0979 13,4893 15,6038

Относительная погрешность, % 9,75 -0,06 6,83 -0,28 -11,39 8,53 -5,23 5,39 -2,48

Таблица 21 - Отклонения найденных концентраций градуировочных смесей с мочой от истинного содержания в них

пиридостигмина (п=5)

Истинное содержание пиридостигмина, мкг/г 0,08 0,16 0,32 0,8 3,2 6,4 9,6 12,8 16,0

Найденное содержание пиридостигмина, мкг/г 0,0858 0,1791 0,3238 0,8173 3,2100 6,2662 9,8588 12,4935 16,1440

Относительная погрешность, % 7,23 11,91 1,19 2,16 0,31 -2,09 2,70 -2,45 0,90

Таблица 22 - Отклонения найденных концентраций градуировочных смесей с мочой от истинного содержания в них

метаболита пиридостигмина (п=5)

Истинное содержание метаболита пиридостигмина, мкг/г 0,08 0,16 0,32 0,80 3,20 6,40 9,60 12,80 16,00

Найденное содержание метаболита пиридостигмина, мкг/г 0,0902 0,1704 0,3017 0,8390 3,2662 6,1911 9,9494 12,2663 16,2862

Относительная погрешность, % 12,71 6,48 -5,72 4,88 2,07 -3,26 3,64 -4,16 1,79

Таблица 23 - Валидация по признаку стабильности пиридостигмина, находящегося в биологических образцах, в

режиме замораживания и размораживания

Время проведения определения Образцы печени Образцы крови Образцы мочи

Площадь пика аналита на хроматограмме Б, см3 (п=3) Площадь пика аналита на хроматограмме Б, см3 (п=3) Площадь пика аналита на хроматограмме Б, см3 (п=3)

Низкий (0,32 мкг/г) уровень содержания аналита Высокий (12,8 мкг/г) уровень содержания аналита Низкий (0,32 мкг/г) уровень содержания аналита Высокий (12,8 мкг/г) уровень содержания аналита Низкий (0,32 мкг/г) уровень содержания аналита Высокий (12,8 мкг/г) уровень содержания аналита

Перед началом исследования 462565 17813167 475422 20880269 545882 21764603

395626 17040690 539138 18939244 516117 21923932

458549 16396737 517382 20075264 579148 23068997

Б ср. = 438913 С=101,35 % Б ср. = 17083531 С=99,66 % Б ср. = 510647 С=100,52 % Б ср. 19964926 С=100,31 % Б ср. = 547049 С=98,96 % Б ср. = 22252510 С-99,33 %

Спустя 10 суток исследования 413030 17677950 529814 18934582 526623 23287855

457210 16627007 476976 20818107 565142 21500222

430434 18054147 469206 20505740 587903 21722582

Б ср. = 433558 С=100,10 % Б ср. = 17453035 С=101,82 % Б ср. = 491999 С=96,77 % Б ср. 20086143 Б ср. = 559889 С=101,25 % Б ср. = 22170220 С=98,96 %

С=100,92%

Спустя 20 суток сохранения 441145 16206630 532922 20748174 573896 21596520

469259 18096988 487854 19941615 552886 22951689

430434 16478402 522044 18988974 531875 22748588

Б ср. = 446946 С=103,23 % Б ср. = 16927340 С=98,75 % Б ср. = 514273 С=101,25 % Б ср. 19892921 С=99,95 % Б ср. = 552886 С=100,01 % Б ср. = 22432266 С=100,13 %

Спустя 30 суток исследования 403659 16505178 467652 18920596 559889 21916928

418385 17813167 494071 20842972 633425 21787364

449177 17412871 539138 19149043 514367 23061993

Б ср. = 423741 С=97,81 % Б ср. = 17243739 С=100,60 % Б ср. = 500287 С=98,44 % Б ср. = 19637537 С=98,67 % Б ср. = 569227 С=102,92 % Б ср. = 22255428 С=99,34 %

Условные обозначения: Бср. - среднее значение площади пика (п=3); С - содержание аналита в образце биоматрицы

Таблица 24 - Валидация по признаку стабильности 3-гидрокси-1-метилпиридиния, находящегося в биологических образцах, в режиме замораживания и размораживания

Время проведения определения Образцы печени Образцы крови Образцы мочи

Площадь пика аналита на хроматограмме Б, см3 (п=3) Площадь пика аналита на хроматограмме Б, см3 (п=3) Площадь пика аналита на хроматограмме Б, см3 (п=3)

Низкий (0,32 мкг/г) уровень содержания аналита Высокий (12,8 мкг/г) уровень содержания аналита Низкий (0,32 мкг/г) уровень содержания аналита Высокий (12,8 мкг/г) уровень содержания аналита Низкий (0,32 мкг/г) уровень содержания аналита Высокий (12,8 мкг/г) уровень содержания аналита

Перед началом исследования 12998 487722 14710 552338 16081 663535

13281 541491 16468 588933 14787 656864

11830 519806 15809 533755 15235 610016

Б ср. = 12703 С=100,21 % Б ср. = 516340 С=100,13 % Б ср. = 15662 С=104,58 % Б ср. = 558342 С=99,12 % Б ср. = 15368 С=97,08 % Б ср. = 643472 С=100,99 %

Спустя 10 суток исследования 12595 516904 14359 537226 17226 611261

13482 492599 13568 548736 15384 664332

13925 548262 15941 593282 16031 623807

Б ср. = 13334 С=105,10 % Б ср. = 519255 С=100,69 % Б ср. = 14623 С=97,19 % Б ср. = 559748 С=99,37 % Б ср. = 16214 С=102,40 % Б ср. = 633133 С=99,37 %

Спустя 20 11507 486271 14315 578653 14239 663436

суток сохранения 127567 536896 16424 543991 16977 610912

12112 503361 14842 570745 16728 639688

Б ср. = 12125 С=95,73 % Б ср. = 508843 С=98,67 % Б ср. = 15194 С=101,25 % Б ср. = 564463 С=99,95 % Б ср. = 15982 С=100,94 % Б ср. = 638012 С=100,14 %

Спустя 30 суток исследования 12636 530729 15809 582826 15782 610464

13522 495743 14754 534370 14488 659005

12837 520572 15413 580981 16280 619724

Б ср. = 12998 С=102,50 % Б ср. = 515681 С=99,99 % Б ср. = 15325 С=101,67 % Б ср. = 566059 С=100,50 % Б ср. = 15517 С=98,02 % Б ср. = 629731 С=98,84 %

Условные обозначения: Бср. - среднее значение площади пика (п=3); С - содержание аналита в образце биоматрицы

Таблица 25 - Валидация по признаку стабильности пиридостигмина, находящегося в подготовленных к

хроматографированию пробах

Время проведения определени я Образцы печени Образцы крови Образцы мочи

Площадь пика аналита на хроматограмме Б, см3 (п=3) Площадь пика аналита на хроматограмме Б, см3 (п=3) Площадь пика аналита на хроматограмме Б, см3 (п=3)

Низкий (0,32 мкг/г) уровень содержания аналита Высокий (12,8 мкг/г) уровень содержания аналита Низкий (0,32 мкг/г) уровень содержания аналита Высокий (12,8 мкг/г) уровень содержания аналита Низкий (0,32 мкг/г) уровень содержания аналита Высокий (12,8 мкг/г) уровень содержания аналита

Перед началом исследован ия 441145 16264197 503395 19232962 542380 22869398

398304 17058094 486300 20592767 568643 21619281

458549 17774342 543801 19910534 586152 22585758

Б ср. =432665 С=99,90 % Б ср. =17032211 С=99,36 % Б ср. =511165 С=100,63 % Б ср. =19912088 С=100,05 % Б ср. =565725 С=102,29 % Б ср. = 22358146 С=99,80 %

Спустя 7 суток исследован ия 467920 17220087 473868 20852296 514367 22233834

417047 16379332 508057 19026272 579148 22582256

422402 17955078 534476 19268706 533626 23307114

Б ср. = 435790 С=100,63 % Б ср. =17184832 С=100,26 % Б ср. =505467 С=99,48 % Б ср. =19715758 С=99,06 % Б ср. =542380 С=98,13 % Б ср. =22707735 С=101,36 %

Условные обозначения: Бср. - среднее значение площади пика (п=3); С - содержание аналита в образце биоматрицы

Таблица 26 - Валидация по признаку стабильности 3-гидрокси-1-метилпиридиния, находящегося в подготовленных к

хроматографированию пробах

Время проведения определения Образцы печени Образцы крови Образцы мочи

Площадь пика аналита на хроматограмме Б, см3 Площадь пика аналита на хроматограмме Б, см3 Площадь пика аналита на хроматограмме Б, см3

Низкий (0,32 мкг/г) уровень содержания аналита Высокий (12,8 мкг/г) уровень содержания аналита Низкий (0,32 мкг/г) уровень содержания аналита Высокий (12,8 мкг/г) уровень содержания аналита Низкий (0,32 мкг/г) уровень содержания аналита Высокий (12,8 мкг/г) уровень содержания аналита

Перед началом исследования 11467 542821 15282 533799 15036 610215

13119 515856 13832 557214 17226 652682

12797 488367 14798 592183 15782 657362

Б ср. = 12461 С=98,33 % Б ср. = 515681 С=100,02 % Б ср. = 14637 С=97,29 % Б ср. = 561066 С=99,61 % Б ср. = 16015 С=101,15 % Б ср. = 640086 С=100,46 %

Спустя 7 суток исследования 12111,636 544392,672 15457,23 537137,855 16479,405 653329,125

12676 489456 14183 593326 15185 634660

11709 527787 16072 544958 14438 625250

Б ср. = 12165 С=96,04 % Б ср. = 520545 С=100,94 % Б ср. = 15238 С=101,56 % Б ср. = 558474 С=99,15 % Б ср. = 15368 С=97,08 % Б ср. = 637746 С=100,09 %

Условные обозначения: Бср. - среднее значение площади пика (п=3); С - содержание аналита в образце биоматрицы

Таблица 27 - Оценка правильности и прецизионности методики определения пиридостигмина в ткани печени с

использованием обращеннофазовой ВЭЖХ

Внесено аналита Исследование в первый день Исследование в последующий день

мкг в 25 г биоматрицы мкг в 1 г биоматрицы Найдено, мкг в 1 г биоматрицы Относительная погрешность, % Метрологические характеристики Найдено, мкг в 1 г биоматрицы Относительная погрешность, % Метрологические характеристики

8 0,32 0,3593 * =0,359; Б=0,022389; Б * =0,010012; Ах = 0,027835; £ = 7,75; = 6,24 % 0,3103 * =0,33578;Б=0,020469; Б * =0,009154; А* = 0,025448; £ = 7,58; = 6,096 %

8 0,32 0,3875 0,3228

8 0,32 0,3278 12,19 0,3610 4,94

8 0,32 0,3706 0,3342

8 0,32 0,3498 0,3506

160 6,4 6,6301 * =6,2503;Б=0,294418; Б * =0,131668; Ах = 0,366037; £ = 5,86; = 4,71 % 6,5387 * =6,96574;Б=0,334433; Б ** =0,149563; А* =0,415786; £ = 5,97; = 4,80 %

160 6,4 5,8778 7,1809

160 6,4 6,0725 6,7581 8,84

160 6,4 6,2419 -2,34 7,3848

160 6,4 6,4293 6,9662

320 12,8 11,6518

320 12,8 10,8451

320 12,8 11,4652 -10,17

320 12,8 12,1453

320 12,8 11,3834

X=11,4982;S=0,469877; S ,=0,210136;

Дх= 0,584177; S = 5,08; Sr= 4,09 %

11,6134

12,2766

12,5993

-4,14

12,9139

11,9472

x=12,2701 ;S=0,514396; S-=0,2300445;

Ax= 0,639525; S = 5,21; Sr= 4,19 %

Таблица 28 - Оценка правильности и прецизионности методики определения пиридостигмина в крови с

использованием обращеннофазовой ВЭЖХ

Внесено аналита Исследование в первый день Исследование в последующий день

мкг в 25 г биоматрицы мкг в 1 г биоматрицы Найдено, мкг в 1 г биоматрицы Относительная погрешность, % Метрологические характеристики Найдено, мкг в 1 г биоматрицы Относительная погрешность, % Метрологические характеристики

8 0,32 0,3675 10,48 * =0,35352;Б=0,019289; Б - =0,008626; Ах = 0,023981; ё = 6,78; = 5,46 % 0,332 4,51 - =0,33448;Б=0,018627; Б * =0,008330; Ах = 0,023158; ё = 6,92; = 5,57 %

8 0,32 0,3770 0,3098

8 0,32 0,3411 0,3261

8 0,32 0,3527 0,3582

8 0,32 0,3293 0,3463

160 6,4 6,0702 -9,18 - =5,81248;Б=0,247894; Б * =0,110862; А- = 0,308195261; ё = 5,30; = 4,26 % 6,2497 3,35 - =6,6144; Б=0,290939; Б - =0,130112; А- = 0,361711; ё = 5,47; = 4,40 %

160 6,4 5,4053 6,6125

160 6,4 5,9262 6,4288

160 6,4 5,8272 6,9871

160 6,4 5,8335 6,7939

320 12,8 12,1612 -2,58 -=12,4697;Б=0,488216; 11,4568 -7,46 -=11,84512;Б=0,458130;

320 12,8 11,8527

320 \2ß 12,7739

320 12^8 13,0902

320 12^8 12,4703

S ; =0,218337; 12,3569 S г =0,204882;

Лх= 0,606976; S = 11,3145 Ах =0,569572; S =

4,87; Sr= 3,92 % 11,8721 4,81; Sr= 3,87 %

12,2253

Таблица 29 - Оценка правильности и прецизионности методики определения пиридостигмина в моче с

использованием обращеннофазовой ВЭЖХ

Внесено аналита Исследование в первый день Исследование в последующий день

мкг в 25 г биоматри цы мкг в 1 г биоматри цы Найдено, мкг в 1 г биоматрицы Относительная погрешн ость, % Метрологические характеристики Найдено, мкг в 1 г биоматри цы Относительная погреш ность, % Метрологические характеристики

8 0,32 0,3415 1,16 * =0,3237; 8=0,01401; Б * =0,006265; А* = 0,017417; £ = 5,38; = 4,33 % 0,3716 9,2 * =0,34944; Б=0,015245; Б * =0,006818; А* = 0,018954; £ = 5,42; = 4,36 %

8 0,32 0,3327 0,3522

8 0,32 0,3228 0,3421

8 0,32 0,3057 0,3301

8 0,32 0,3158 0,3512

160 6,4 6,9602 8,68 * =6,9555; Б=0,252036; Б ** =0,112714; А* = 0,313345; £ = 4,51; = 3,62 % 6,3852 4,45 * =6,68484; Б=0,232577; Б * =0,104012; А* = 0,289152; £ = 4,33; = 3,48 %

160 6,4 6,7973 6,8301

160 6,4 7,2733 6,6938

160 6,4 6,634 6,9753

160 6,4 7,1126 6,5398

320 12,8 12,7606 -3,92 *=12,2982;Б=0,36662 13,8852 6,46 *=13,6268;Б=0,42773;

320 12,8 11,8315

320 12,8 12,0704

320 12,8 12,5309

320 12,8 12,2977

? 14,1624 S ,=0,191289;

S ^ =0,163961; 13,6148 Ax= 0,531782; S =