Новый подход к повышению селективности взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с нуклеиновыми кислотами тема диссертации и автореферата по ВАК 02.00.10, кандидат химических наук Пышный, Дмитрий Владимирович

Диссертация и автореферат на тему «Новый подход к повышению селективности взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с нуклеиновыми кислотами». disserCat — научная электронная библиотека.
Автореферат
Диссертация
Артикул: 52970
Год: 
1998
Автор научной работы: 
Пышный, Дмитрий Владимирович
Ученая cтепень: 
кандидат химических наук
Место защиты диссертации: 
Новосибирск
Код cпециальности ВАК: 
02.00.10
Специальность: 
Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ
Количество cтраниц: 
152

Оглавление диссертации кандидат химических наук Пышный, Дмитрий Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ б

1. МАЛОБОРОЗДОЧНОЕ И ИНТЕРКАЛЯЦИОННОЕ СВЯЗЫВАНИЕ 8 НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ЛИГАНДОВ С

ДВУХСПИРАЛЬНЫМИ НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ (Обзор литературы)

1.1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.2. ИНТЕРКАЛЯЦИЯ

1.2.1. Типы интеркаляции

1.2.2. Формирование интеркаляционного комплекса

1.2.3. Влияние структуры НК на интеркаляцию

1.2.4. Сайт интеркаляции

1.2.5. Специфичность интеркаляции

1.2.6. Термостабильность интеркаляционных комплексов

1.3. ВНЕШНЕЕ СВЯЗЫВАНИЕ

1.3.1. Специфичность связывания малобороздочных лигандов

1.3.2. Размер сайз?а связывания

1.3.3. Стехиометрия связывания

1.3.4. Влияние структуры лиганда на связывание

1.3.5. Кинетика и термодинамика малобороздочного ком- 33 плексообразования

1.4. ДРУГИЕ ТИПЫ СВЯЗЫВАНИЯ

1.5. КОНЪЮГАТЫ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И ОРГАНИЧЕСКИХ ЛИГАНДОВ

1.5.1. Конъюгаты олигонуклеотидов с малобороздочными ли- 40 гандами

1.5.2. Конъюгаты олигонуклеотидов с интеркалирующими ли- 45 гандами

1.5.3. Феназиниевые производные олигонуклеотидов - эф- 50 фекторы модификации мишени реакционноспособными производными олигонуклеотидов

2. СЕЛЕКТИВНОСТЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ И ИХ 53 АЛКИЛИРУЮЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ С ДНК-МИШЕНЬЮ В СОСТАВЕ

ТАНДЕМНЫХ КОМПЛЕКСОВ (Результаты и обсуждение)

2.1. ЭФФЕКТИВНОСТЬ И СЕЛЕКТИВНОСТЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОЛИГО

НУКЛЕОТИДОВ С ДНК-МИШЕНЬЮ В СОСТАВЕ ТАНДЕМНЫХ КОМПЛЕКСОВ

2.1.1. Термостабильность комплексов олигонуклеотид•ми- 54 шень

2.1.2. Термостабильность комплексов олигонуклео- 55 тид-мишень в тандемных системах

2.1.3. Термостабильность комплексов мишени и тетрамера в 60 составе трехкомпонентных тандемов

2.1.3.1. Влияние эффекторов - нативных октануклеотидов и 60 их дифеназиниевых производных на термостабильность комплекса мишени и тетрануклеотида

2.1.3.2. Влияние расположения остатков феназиния эффек- 63 торов в трехкомпонентном тандеме на термостабильность дуплекса тетрануклеотида с мишенью

2.1.3.3. Термостабильность комплексов стероидсодержащих трехкомпонентных тандемов

2.1.4. Селективность взаимодействия олигонуклеотидов с

ДНК-мишенью в составе тандемных комплексов

2.1.4.1. Влияние эффектора на селективность взаимодейст- 67 вия мишени с олигонуклеотидами в зависимости от их длины

2.1.4.2. Стабильность комплексов мишени с тетрануклеоти- 7 0 дом, содержащим все возможные однобуквенные замены,г в составе трехкомпонентных тандемов

2.2. ЗАКОНОМЕРНОСТИ ВЛИЯНИЯ ЭФФЕКТОРОВ НА СЕЛЕКТИВНОСТЬ 7 4 УЗНАВАНИЯ ДНК-МИШЕНИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ В ТАНДЕМНЫХ КОМПЛЕКСАХ ПО ДАННЫМ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА РАВНОВЕСНОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ФОРМ

2.2.1. Определение термодинамических параметров незави- 7 6 симого комплексообразования

2.2.2. Определение термодинамических параметров коопера- 77 тивного взаимодействия в тандемных комплексах

2.2.3. Зависимость температуры плавления и степени ассо- 78 циации комплекса мишень•олигонуклеотид от стехио-метрического соотношения его компонентов

2.2.4. Независимое и тандемное комплексообразование

2.2.4.1. Независимое и тандемное комплексообразование в 83 составе тандемных систем

2.2.4.2. Специфичность связывания олигонуклеотидов в со- 85 ставе тандема

2.2.5. Селективность взаимодействия олигонуклеотидов 88 разной длины с ДНК-мишенью в тандемных комплексах

2.3. ЭФФЕКТИВНОСТЬ И СЕЛЕКТИВНОСТЬ МОДИФИКАЦИИ ДНК-МИШЕНИ 94 АЛКИЛИРУЮЩИМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ В СОСТАВЕ ТАНДЕМНЫХ КОМПЛЕКСОВ

2.3.1. Влияние комплексообразующей способности олигонук- 94 леотидных реагентов на эффективность модификации мишени в независимых и тандемных комплексах при постоянной температуре

2.3.1.1. Влияние комплексообразующей способности олиго- 96 нуклеотидных реагентов на эффективность модификации мишени в независимых комплексах

2.3.1.2. Влияние комплексообразующей способности олиго- 97 нуклеотидных реагентов на эффективность модификации мишени в тандемных комплексах

2.3.2. Зависимость эффективности модификации мишени ал- 98 килирующими производными олигонуклеотидов в независимых и тандемных комплексах от температуры

2.3.2.1. Модификация мишени додекануклеотидным реагентом 98 в независимом и тандемных комплексах

2.3.2.2. Модификация мишени октануклеотидным реагентом в 101 независимом и тандемных комплексах

2.3.3. Зависимость эффективности модификации мишени тет- 103 рануклеотидным реагентом в тандемных комплексах от типа используемых эффекторов

2.3.3.1. Модификация мишени тетрануклеотидным реагентом в составе комплексов двухкомпонентных тандемов

2.3.3.2. Модификация мишени тетрануклеотидным реагентом 105 в составе комплексов трехкомпонентных тандемов

2.3.3.3. Зависимость эффективности модификации мишени 107 тетрануклеотидным реагентом от локализации фе-назиниевых остатков эффекторов в структуре тандемных комплексах

2.3.3.4. Влияние остатков стероидов, введенных в компо- 108 ненты тандема, на модификацию мишени алкилирующим реагентом на основе тетрануклеотида и его гидрофобных производных

2.3.4. Зависимость фактора дискриминации мисматча при 111 модификации мишени в тандемных комплексах от гиб-ридизационной способности олигонуклеотидных реагентов

2.3.5. Зависимость эффективности модификации мишени в 114 тандемных комплексах от конформационных особенностей дуплексов мишень-реагент

2.3.6. Параллельные пути расходования реагента при моди- 117 фикации мишени

2.3.7. Селективность модификации мишени тетрануклеотид- 121 ным реагентом в составе тандемных систем

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. ИСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

3.2. ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ РАБОТЫ 129 ВЫВОДЫ 134 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 136 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

В настоящей работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного Союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и Международного Союза биохимиков (IUB), а также следующие сокращения:

НК нуклеиновая кислота

РНК рибонуклеиновая кислота

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

N нуклеотидное звено

Ри пуриновый нуклеозид

Ру пиримидиновый нуклеозид pNn 5'-фосфорилированный олигонуклеотид poly(N) полирибонуклеотид poly(dN) полидезоксирибонуклеотид

Acr 2-метокси, б-хлоро, 9-аминоакридин

Phn остаток N-(2-гидроксиэтил)феназиния

Chs остаток холестерина

Est остаток эстрона

RC1 остаток 4-(Ы-2-хлорэтил-Ы-метиламино)бензилметиламина

Ах оптическое поглощение раствора на длине волны X

Sx молярный коэффициент поглощения

Ст суммарная концентрация олигонуклеотидов в растворе а степень ассоциации олигонуклеотидов в дуплексной форме

Тт температура, при которой степень ассоциации комплекса олигонуклеотидов равна 0.5 Ттах температура максимума первой производной зависимости Ах от температуры раствора АН0, AS0 энтальпия, энтропия образования комплекса олигонуклеотидов, рассчитанные по уравнению Вант-Гоффа

Префикс «с1» при написании структуры олигодезоксирибонуклеотидов, нуклеотидных пар и мономерных звеньев дезоксирибо-ряда для краткости написания опущен.

Введение диссертации (часть автореферата) На тему "Новый подход к повышению селективности взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с нуклеиновыми кислотами"

Олигонуклеотиды, их производные и аналоги находят широкое применение для создания на их основе молекулярных инструментов исследования НК-зависимых процессов, терапевтических препаратов для подавления экспрессии определенных генов, диагностики вирусных и наследственных заболеваний и т.д. Однако с тех пор как было показано, что олигонуклеотиды, благодаря своему уникальному и универсальному сродству к нуклеиновым кислотам, могут служить адресующей частью реагентов для направленной модификации НК [1], конструирование олигонуклеотидных производных остается одной из основных проблем биоорганической химии из-за того, что требования предъявляемые к таким олигонуклеотидным конструкциям - одновременное сайт-специфичное, селективное и эффективное взаимодействие их с нуклеиновыми кислотами - являются частично взаимоисключающими друг друга.

Эффективность узнавания олигонуклеотидами определенных последовательностей в НК напрямую зависит от их комплексообразующей способности - чем больше нуклеотидных пар образуется при взаимодействии олигонук-леотидов с НК, тем эффективнее их связывание. Сайт-специфичность -взаимодействие только с заранее заданной и уникальной последовательностью - также определяется числом образуемых комплементарных пар, поскольку вероятность встречаемости в протяженных НК конкретных последовательностей убывает с увеличением их длины. Селективность взаимодействия определяется как способность олигонуклеотидов образовывать только правильные комплексы с мишенью, дискриминируя последовательности, отличающиеся от сайта связывания хотя бы одним нуклеотидом. Если для усиления сайт-специфичности и эффективности взаимодействия с НК необходимо использовать олигонуклеотиды с протяженностью сайтов узнавания примерно в 20 мономеров, которые обладают высокой комплексообразующей способностью, то для повышения селективности при физиологических температурах необходимо, напротив, использовать олигонуклеотиды, обладающие слабой гибридизационной способностью, для которых появление одного нуклеотидного несоответствия в сайте связывания должно приводить к резкому падению их сродства к НК.

Компромиссным вариантом решения этой комплексной проблемы могут быть тандемные системы, т.е. наборы коротких олигонуклеотидов, имеющих в последовательности НК прилегающие сайты связывания, суммарная протяженность которых обеспечивает сайт-специфичное связывание с НК. Тандемы, предложенные для направленной модификации нуклеиновых кислот, содержат реакционноспособное производное короткого олигонуклеотида (реагент), эффективность модификации НК которым повышается в присутствии олигонуклеотидных эффекторов благодаря возникновению в тандемном комплексе кооперативных взаимодействий между дуплексными участками эффектора и олигонуклеотидного реагента [2,3]. Действие эффекторов, фланкирующими реагент при их совместном связывании с НК, усиливается введением в них Ы-(2-гидрокси-этил)феназиниевых группировок, повышающих комплексообразующую способность олигонуклеотида [4] . В присутствии дифеназиниевых эффекторов даже реагент на основе такого короткого олигонуклеотида как тетрамер [5-8] способен модифицировать ДНК-мишень сайт-специфично [5-8], т.е. только в пределах того участка, который представляет один непрерывный сайт связывания полного тандема [5].

Поскольку короткие олигонуклеотиды неспособны образовывать прочные несовершенные комплексы с мишенью, можно предполагать, что узнавание сайта связывания реагента на основе короткого олигонуклеотида в составе тандема может быть не только сайт-специфично и относительно эффективно, но также и высокоселективно, что позволит дискриминировать в НК-мишени сайты связывания, содержащие однонуклеотидные несоответствия .

Цель данной работы состояла в исследовании возможности повышения селективности взаимодействия олигонуклеотидов с ДНК мишенью при физиологических условиях путем замены протяженных олигомеров на тандемы коротких олигонуклеотидов. Для ответа на вопрос, возможно ли селективное взаимодействие НК мишеней с короткими олигонуклеотидами или их производными в составе тандемов, необходимо выяснить а) как влияют эффекторы на комплексообразование олигонуклеотида в составе тандема при снижении гибридизационной способности олигомера за счет сокращения его длины или введения в его структуру однонуклеотидного несоответствия с сайтом связывания в НК-мишени и б) какими должны быть компоненты тандема для осуществления селективного воздействия на НК в условиях, приближенных к физиологическим. Для решения поставленной задачи было проведено сравнительное исследование взаимодействия олигонуклеотидов с ДНК-мишенью в тандемных комплексах различного состава путем установления закономерности влияния эффекторов на термостабильность олигонукле-отидных комплексов и особенности алкилирования мишени олигонуклеотид-ными реагентами в правильных и несовершенных комплексах олигонуклео-тид■ДНК-мишень. as usual, the simplicity or complexity depends on the point of view of observer and the methods used for observation» Dietmar Porschke. Biochemistry. 1993.

1. МАЛ0Б0Р03Д0ЧН0Е И ИНТЕРКАЛЯЦИОННОЕ СВЯЗЫВАНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ ЛИГАНДОВ С ДВУХСПИРАЛЬНЫМИ НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ

Обзор литературы) Процессы, связанные с взаимодействием низкомолекулярных органических лигандов с нуклеиновыми кислотами, представляют одно из наиболее интенсивно исследуемых направлений в современной биоорганической химии. Существует много причин, определяющих повышенный интерес к этой области, основными из которых являются, во-первых, выявление фундаментальных принципов, обеспечивающих специфическое связывание лигандов с биомолекулами и, во-вторых, создание соединений, обладающих направленной биологической активностью, с целью получения новых эффективных терапевтических препаратов. Кроме того, накапливающаяся в результате исследований информация расширяет представления о принципах структурной организации природных и синтетических биополимеров. В данном обзоре рассмотрены работы, направленные на изучение взаимодействия различных органических соединений с двухцепочечными нуклеиновыми кислотами.

К настоящему времени изучено взаимодействие нуклеиновых кислот с чрезвычайно широким спектром низкомолекулярных органических лигандов. Эти соединения можно условно разделить на два основных класса по типу их связывания с двухцепочечными НК. К первому классу относятся соединения, взаимодействие которых с биополимером происходит при полном или частичном встраивании между парами оснований внутри двойной спирали НК. Такие соединения характеризуются внутренним типом связывания и их принято называть интеркаляторами. Во втором классе объединяются соединения с внешним типом связывания, молекулы которых локализуются на поверхности двухцепочечной НК и эффективно взаимодействуют с элементами структуры полимера, экспонированными в среду. Как тип связывания, так и специфичность последнего зависят от структуры лиганда, которая определяет возможные варианты взаимодействия и относительную их эффективность в составе межмолекулярного комплекса, при этом наиболее эффективно взаимодействие в комплексе достигается при реализации принципа структурной комплементарное™ между молекулами «гостя» и «хозяина». В связи с этим очевидно, что нуклеотидная последовательность НК и связанные с ней принципиальные особенности строения биомолекулы также играют важную роль в процессах межмолекулярного узнавания.

Заключение диссертации по теме "Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ", Пышный, Дмитрий Владимирович

ВЫВОДЫ

Предложен новый подход к повышению селективности взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с ДНК-мишенью, основанный на использовании тандемов коротких олигонуклеотидов состава октануклетид+тетранук-леотид+октануклеотид, где тетрануклеотид и октамеры-эффекторы могут содержать, в зависимости от требований и условий, различные функциональные группировки.

I.Проведено сравнительное исследование влияния эффекторов - октануклеоти-дов и их производных - на стабильность (температуру плавления) правильных и несовершенных комплексов 20-звенной ДНК-мишени с додека-, окта- и тетрануклеотидом в тандемных комплексах мишень-олигонуклеотид+эффек-тор (ы) в одинаковых буферных условиях при концентрации компонентов комплекса 13 мкМ каждого. Показано, что:

1) влияние эффекторов (октануклеотида и его 5',3'-ди-Ы-(2-гидрокси-этил)феназиниевого производного) на стабильность дуплекса мишень-олигонуклеотид увеличивается с сокращением длины олигонуклеотида или при введении в его структуру однонуклеотидной замены, причем стабилизирующее влияние эффекторов тем выше, чем ниже собственная гибридиза-ционная способность олигонуклеотидов;

2) максимальная стабилизация дуплекса мишень-тетрануклеотид, неформирую-щегося в отсутствие эффекторов, может быть достигнута в присутствии пары фланкирующих эффекторов, которые обеспечивают реализацию в тандемных комплексах двух кооперативных контактов: а) в случае нативного тетрануклеотида - с парой феназиний-содержа-щих эффекторов, обеспечивающих локализацию феназиниевых группировок на стыках дуплексов мишень-тетрануклеотид и мишень-эффектор; б) в случае производного тетрануклеотида, несущего на 3'-конце остаток стероида (холестерина или эстрона) - с парой 5' -холес-терил,3'-феназиний-содержаидах эффекторов, обеспечивающих создание гидрофобной «скрепки» между 3'-концевым остатком стероида в структуре тетрануклеотида и 5'-концевым - в структуре эффектора;

3) из всех рассмотренных олигонуклеотидов максимальной селективностью связывания с мишенью в тандемных комплексах при 37°С обладает тетрануклеотид в составе тандема эффектор+тетрануклеотид+эффектор.

II.Исследовано влияние эффекторов на модификацию 20-звенной ДНК-мишени в правильных и несовершенных комплексах алкилирующими 5'-(Ы-2-хлорэтил-Ы-метиламино)бензилметилфосфамидными производными олигонуклеотидов с различной гибридизационной способностью (додека-, окта- и тетрануклеотидов и их производных) в присутствии эффекторов, локализующихся в тандемном комплексе мишень•эффектор+реагент вблизи реакционной группировки олигонуклеотидного реагента (в одинаковых буферных условиях при концентрации мишени 5-КГ7 М, реагента и эффектора (ов) - по 1-Ю"5 М каждого) .

Показано, что:

1) усиление гибридизационной способности олигонуклеотидного реагента может приводить не только к повышению степени модификации мишени благодаря увеличению степени ассоциации мишени с реагентом, но и к понижению эффективности алкилирования мишени, вследствие затруднений локальных перестроек жесткой структуры дуплекса вблизи реакционного центра, определяющих направленность химического превращения в составе комплекса мишень ■ реагент;

2) эффектор снижает эффективность модификации мишени олигонуклеотидным реагентом, образующим прочный дуплекс с жесткой структурой (например, додекануклеотидный реагент), и всегда способствует увеличению степени алкилирования мишени реагентом, обладающим низкой гибридизационной способностью и образующим слабые рыхлые комплексы с мишенью;

3) в тандемных комплексах алкилирующие производные окта- и додекануклео-тидов малоэффективно дискриминируют комплексы с мисматчем, поскольку модификация мишени в составе их неправильных комплексов более эффективна благодаря нарушению регулярной структуры дуплекса, вызываемой наличием мисматча;

4)реагент на основе тетрануклеотида в присутствии пары дифеназиние-вых октануклеотидных эффекторов высокоселективно модифицирует мишень, дискриминируя все возможные однонуклеотидные несоответствия в сайте связывания тетрануклеотидного реагента.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Пышный, Дмитрий Владимирович, 1998 год

1. Belikova AM, Zarytova VF, Grineva N1. Synthesis of ribonucleotides and diribonucleotides phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues. Tetrahedron Lett. 1967. № 37. P. 35573562.

2. Кутявин ИВ, Мамаев СВ, Подыминогин МА. Сайт-направленная химическая рестрикция одноцепочечного фрагмента ДНК алкилирующим производным тетрануклеотида d (pApGpCpA) в присутствии тетрануклеотидных эффекторов. Биоорган, химия. 1992. Т. 18. С. 895-900.

3. Воробьев ПЕ, Маркушин ЮЯ, Сергеев ДС, Зарытова ВФ. Повышение эффективности сайт-специфического расщепления ДНК-мишени блеомицино-вым производным тетрануклеотида с помощью олигонуклеотидов-эффекторов. Биоорган, химия. 1996. Т. 22. С. 111-116.

4. Meyer-Aimer FG, Porschke D. Mehanism of intercalation into the double helix by ethidium. Biochemistry. 1993. V. 32. P. 4246-4253.

5. Tanious FA, Veal JM, Buczak H, Ratmeyer LS, Wilson WD. DAPI (4',6-diamido -2 -phenyl indole) binds differently to DNA and RNA: minor-groove binding at AT site and intercalation at AU site. Biochemistry. 1992. V. 31. P. 3103-3112.

6. Marky LA, Macgregor RB Jr. Hydration of dA-dT polymers: Role of water in the termodynamics of ethidium and propidium intercalation. Biochemistry. 1990. V. 29. P. 4805-4811.

7. Pilch DS, Kirolos MA, Breslauer KJ. Berenil binding to higher ordered nucleic acid structures: complexation with a DNA and RNA triple helix. Biochemistry. 1995. V. 34. P. 16107-16124.

8. Remeta DP, Mudd CP, Berger RL, Breslauer KJ. Thermodynamic characterization of Daunomycin-DNA interactions: comparison of14

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания.
В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.

Автореферат
200 руб.
Диссертация
500 руб.
Артикул: 52970