Исследование оптимальных условий культивирования бактерий рода Pseudomonas-продуцентов биологически активных веществ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Асабина, Елена Антоновна

• Асабина, Елена Антоновна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Асабина, Елена Антоновна

Введение.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бактерии рода Pseudomonas - PGPR.

1.1.1. Антагонистическая активность PGPR Pseudomonas.

1.1.2. Синтез фитогормонов PGPR Pseudomonas.

1.1.3. Биопрепараты на основе бактерий рода Pseudomonas.

1.2. Оптимизация культивирования бактерий рода Pseudomonas.

1.2.1.Условия культивирования, питательные среды для бактерий рода Pseudomonas — продуцентов метаболитов с антигрибной активностью.

1.2.2. Математическое моделирование в оптимизации условий культивирования микроорганизмов.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Условия хранения бактерий р. Pseudomonas.

2.3. Условия хранения и культивирования фитопатогенных грибов.

2.4. Условия культивирования бактерий р. Pseudomonas.

2.5. Оптимизация условий культивирования бактерий р. Pseudomonas

2.6. Определение антигрибной активности метаболитов Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью.

2.7. Определение спектра антагонистического действия культур Pseudomonas.

2.8. Определение фитогормональной активности метаболитов Pseudomonas.

2.9. Приготовление автолизата пивных дрожжей.

2.10. Приготовление автолизата пекарских дрожжей.

2.11. Определение содержание белка в дрожжевом автолизате.

2.12. Определение массовой доли азота аминогрупп аминокислот и низших пептидов в дрожжевом автолизате.

2.13. Определение массовой доли общего азота в дрожжевом автолизате.

2.14. Статистическая обработка результатов.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Оптимизация питательных сред при культивировании бактерий рода Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью.

3.1.1. Дрожжевой автолизат — компонент питательной среды.

3.1.2. Получение математических моделей для трёх штаммов Pseudomonas.

3.1.3. Определение оптимального состава питательных сред для культивирования бактерий Pseudomonas.

3.2. Штамм Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 — продуцент цитокининов.

3.3. Культивирование бактерий рода Pseudomonas, обладающих фунгицидной активностью.

3.3.1. Оптимизация условий культивирования трех штаммов Pseudomonas.

3.3.2. Оценка антигрибной активности штаммов Pseudomonas, выращенных в оптимальных условиях.

3.3.3. Изучение параметров культивирования штамма Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 в периодических и непрерывных условиях.

3.4. Питательные среды для промышленного культивирования псевдомонад и экономический эффект от использования новых сред.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование оптимальных условий культивирования бактерий рода Pseudomonas-продуцентов биологически активных веществ»

Актуальность проблемы. Бактерии рода Psendomonas - одна из наиболее изученных групп микроорганизмов с точки зрения объектов биологического контроля почвенных фитопатогенов (Рубан, 1986; Смирнов, Киприанова, 1990; Воронин, 1998; Логинов, 2005; Weller, 1989; Dowling & O'Gara, 1994; Whipps, 2001; Garg et al., 2005) и обладающих совокупностью полезных для растений свойств. В настоящее время такие бактерии принято обозначать PGPR - Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (ризобактерии, способствующие росту растений).

Следует также отметить, что PGPR Pseudomonas являются потенциальными объектами агробиотехнологий для разработки на их основе биологических средств защиты растений от фитопатогенов.

Актуальность выбранного направления исследований обусловлена необходимостью разработки новых биопестицидов и создания соответствующих новых технологий их производства. Известные до сих пор среды для культивирования ризосферных бактерий рода Pseudomonas слишком дорогостоящие. Для производства же средств защиты растений необходимо разработать более простые и дешевые технологии. Одним из путей снижения себестоимости целевого продукта является уменьшение производственных затрат на питательные среды при сохранении продуктивности и антагонистической активности штаммов-продуцентов.

При подборе питательных сред и условий культивирования с целью повышения выхода биомассы или накопления определенных продуктов обмена веществ микроорганизмов, таких как антибиотики или ростстимулирующие вещества, широкое применение нашли методы математического планирования эксперимента (Максимов, Фёдоров, 1969; Егорова, 1976; Бойченко и др., 2002; Автономова и др., 2006; Flavia et al., 2006; Mandal et al., 2007; Narajana et al., 2008; Sharma et al., 2009). Которые позволяют не только одновременно изучить действие нескольких факторов на интересующий исследователей процесс, но и количественно оценить степень этого влияния.

Цель исследования. Целью исследований являлось оптимизировать питательные среды и условия культивирования штаммов бактерий Pseudomonas chlororaphis ИБ 51 (Патент РФ № 2203945, 2003) - основы биопрепарата «Елена», Pseudomonas putida ИБ 17 (Патент РФ № 2213774, 2003), Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 (Патент РФ № 2260951, 2005) продуцирующих антибиотики и ростстимулирующие вещества.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить степень влияния компонентов питательной среды на накопление биомассы и антигрибной активности при культивировании штаммов Pseudomonas chlororaphis ИБ 51, Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 и Pseudomonas putida ИБ 17.

2. Определить оптимальный состав ферментационных сред для культивирования штаммов Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17, с максимальной антигрибной активностью и высоким титром клеток.

3. Изучить закономерности синтеза цитокининов штаммом бактерий Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 в зависимости от состава питательной среды.

4. Оптимизировать условия периодического и непрерывного промышленного культивирования штаммов Pseudomonas.

Научная новизна. Разработаны технологии промышленного культивирования бактерий рода Pseudomonas для производства биопрепаратов сельскохозяйственного назначения с высокой антигрибной и ростстимулирующей активностью.

Практическая значимость. Разработаны новые, экономичные питательные среды и подобраны оптимальные условия для промышленной наработки биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas, что может быть использовано при производстве биопрепарата "Елена", предназначенного для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на IV Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био-и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2005), XIX Международной научно-технической конференции «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии Реактив-2006» (Уфа, 2006), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 2007), II съезде микологов России «Современная микология в России» (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации. По материалам работы опубликовано 11 научных работ, в том числе шесть статей в рецензируемых журналах, входящих в Перечень ВАК, рекомендованных для соискателей учёной степени и 1 патент Российской Федерации.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследований, экспериментальную часть (4 главы), заключение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий 139 ссылок. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста и содержит 14 рисунков и 12 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Асабина, Елена Антоновна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что антигрибная активность и накопление биомассы при культивировании штаммов Р. chlororaphis ИБ 51, Р. chlororaphis ИБ 6 и Р. putida ИБ 17 главным образом зависят от содержания дрожжевого автолизата и фосфатов в ферментационной среде.

2. Разработаны новые экономичные ферментационные среды на основе автолизатов отработанных пивных дрожжей, пекарских дрожжей для промышленной наработки биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas для защиты сельскохозяйственных растений от грибных фитопатогенов с максимальной антигрибной активностью и высоким титром клеток.

3. Выявлены условия максимальной продукции штаммом Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 веществ цитокининовой природы, позволяющие получать культуральную жидкость этих бактерий с концентрацией цитокининов свыше 1100 нг/мл.

4. Подобраны оптимальные условия периодического и непрерывного промышленного культивирования биопрепарата «Елена» и аналогичных биопестицидов на основе бактерий рода Pseudomonas.

5. Показано, что антигрибная активность штамма Р. putida ИБ 17, выращенного в оптимальных условиях, максимальна среди исследуемых штаммов псевдомонад.

Заключение

Современное сельское хозяйство характеризуется высокой степенью использования пестицидов. На сегодняшний день экологические нарушения, вызванные применением химических средств защиты растений, настолько велики, что все более острым становится вопрос о снижении количества используемых синтетических пестицидов. В качестве альтернативы или дополнения к химическим препаратам выступают биологические методы борьбы с фитопатогенными организмами. Одним из направлений биологической защиты растений, является использование микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности в качестве биопестицидов.

Наиболее подробно изученными бактериями-антагонистами фитопатогенных грибов являются представители рода Pseudomonas, что относит их к числу наиболее перспективных объектов для использования в сельскохозяйственной практике. Так как они обладают различными механизмами положительного влияния на растения, одними из которых являются синтез антифунгальных антибиотиков и ростстимулирующих веществ.

Одним из ключевых этапов внедрения новых биопрепаратов является разработка технологий их производства. Одной из проблемы промышленного производства биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas, предназначенных для использования в растениеводстве, является высокая стоимость питательной среды, которая неизбежно приводит к удорожанию целевого продукта.

В ходе работы были разработаны новые экономически приемлемые ферментационные среды на основе отработанных пивных дрожжей, на основе автолизата пекарских дрожжей и самих пекарских дрожжей, обеспечивающие высокие титр клеток и антигрибную активность. Полученные среды вполне успешно могут применяться при промышленном производстве биопрепаратов - фунгицидов на основе бактерий рода Pseudomonas.

Разработаны технологии периодического и непрерывного промышленного культивирования штаммов Pseudomonas для производства биопрепаратов сельскохозяйственного назначения с высокой антигрибной и ростстимулирующей активностью.

Один из исследуемых штаммов, а именно, Р. chlororaphis ИБ 51, является основой биопрепарата «Елена», прошедшего Государственную регистрацию биопестицида и (или) агрохимиката в Министерстве сельского хозяйства РФ. Испытания биопрепарата «Елена» в лабораторных и полевых условиях показали его эффективность для защиты пшеницы от корневых гнилей, альтернариоза. Кроме того, данный препарат в вегетационных опытах показал возможность его применения для защиты пшеницы от поражения твердой головней. Также он может быть использован для подавления развития бактериоза огурцов, корневых гнилей фасоли, некоторых болезней картофеля, моркови, сои и др.

В результате проведенных экспериментов с использованием метода математического планирования были выявлены условия максимальной продукции штаммом Pseudomonas chlororaphis ИБ 6 веществ цитокининовой природы, позволяющие получать культуральную жидкость этих бактерий с концентрацией цитокининов свыше 1100 нг/мл.

Установлено, что антигрибная активность в отношении почти всех исследуемых тест-грибов штамма Pseudomonas putida ИБ 17, выращенного на оптимизированной среде, превышает активность двух других штаммов, выращенных также на оптимизированных средах. Таким образом, штамм -антагонист Pseudomonas putida ИБ 17 имеют полное право для создания и на его основе микробиологического препарата нового поколения, обладающего высокой антагонистической активности в отношении широкого спектра фитопатогенных грибов р. Fusarium, Alternaria и Helminthosporium.

Экономический эффект от использования разработанной среды на основе автолизата пивных дрожжей по сравнению с Кинг В составил 146275 руб за один цикл наработки целевого продукта в объёме 10 т. Что значительно сократило себестоимость биопрепарата «Елена» с 760000 руб. до 619975 руб. за 10 т. Таким образом, использование оптимизированной среды на основе автолизата пивных дрожжей значительно сокращает долю технологических затрат на питательную среду в себестоимости готового продукта с 22% до 3,6%.

85

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Асабина, Елена Антоновна, 2009 год

1. Автономова А. В., Краснопольская Л. М., Максимов В. Н. Оптимизация состава питательной среды для погруженного культивирования Canoderma lucidum II Микробиология. — 2006 — том 75, №2 — С. 186-192.

2. Багдасарян З.Н., Алексанян Г. А., Гукасян Г. С., Мирзоян А. М. Оптимизация среды и условий культивирования продуцента фумаразы и аспартазы Erwinia sp // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. - том 36, №5.- С. 545-548.

3. Воронин А.М. Ризосферные бактерии рода Pseudomonas, способствующие росту и развитию растений // Соросовский образовательный журнал.-1998.-№ Ю.-С. 25-31.

4. Ветрова А.,А., Нечаева И., А., Игнатова А., А., Пунтус И.,Ф., и др. Влияние катаболических плазмид на физиологические параметры бактерий рода Pseudomonas и эффективность биодеструкции нефти // Микробиология. 2007.-№3,-С. 354-360.

5. Волчатова И. В., Медведева С. А., Бабкин В. А. Оптимизация состава питательной среды как способ регуляции синтеза лигниназы грибом Coriolus villosus II Прикладная биохимия и микробиология. — 1997- том 33, №1 — С.94-97.

6. Гущина Ю.А., Евдокимов E.B. Формальдегидрезистентные бактерии рода Pseudomonas как агенты биоконтроля и биостимуляции льна // Экология сегодня. 2001.- № 1.- С.65-67.

7. Додзин М. Е., Виноградова К. А., Котова И. Б. Новые продуценты L-глутаматоксидазы Streptomyces litmocidini и Streptomyces cremeus II Антибиотики и химиотерапия. - 1998 - №4.- С.7-13.

8. Долгова Е.М., Манько О.П., Зубко И .Я. и др. Препараты псевдобактерин-2 и псевдобактерин-3 против болезней пшеницы // Химия в сельском хозяйстве. 1997- №1.- С. 13-14.

9. Дурынина Е. П., Пахненко О. А., Злотников А. К., Злотников К. М. Влияние биопрепарата альбит на продуктивность ячменя и содержание биофильных элементов в урожае // Агрохимия. 2006 - №1- С. 49-54.

10. Егорова Н.С. Практикум по микробиологии Учебное пособие. М, 1976. 307с.

11. Ермакова H.H., Штерншис М.В. Новый биопрепарат РИЦ против болезней растений // Защита растений. 1994- № 12.- С. 18.

12. Квасников Е. И., Айзенман Б.Е., Соломко Э.Ф. и др. Рост и образование антибиотиков бактериями рода Pseudomonas на средах с низкомолекулярными н-алканами // Микробиология. 1975- Т. 44, № 1- С. 55-60.

13. Кравченко JI.B., Шапошников А.И., Макарова Н.М. и др. Динамика численности антифугальных штаммов Pseudomonas в ризосфере огурцов, выращиваемых в условиях гидропоники на минеральном тепличном субстрате // Микробиология. 2006. - Т.75, №3. - С.404-409.

14. Климова В. А. Основные микрометоды анализа органических соединений. М.: Химия, 1967. - 208 с.

15. Кондратьева Т. Ф., Лобачёва Н. А. Оптимизация состава питательной среды методом математического планирования с целью увеличенияколичества синтезируемого Pitlliilaria pulliilans пуллулана // Микробиология. 1990. - Т. 59, Вып 6. - С. 1004-1009.

16. Королёва О.В., Степанова Е. В., Гаврилова В. П. и др. Оптимизация условий глубинного культивирования базидиомицета Coriolus hirsutus -продуцента внеклеточной лакказы // Прикладная биохимия и микробиология . 2000. - том 36, №1. - С. 30-36.

17. Коршунова Л.Ю., Силищев H.H., Галимзянова Н.Ф., Логинов О.Н. Биофунгицид Елена для протравливания семян ячменя ярового и его влияние на урожайность и устойчивость к болезням // Башкирский химический журнал. 2007. - Т. 14, № 4. - С. 92-94.

18. Кочетков В.В., Чигалейчик А.Г., Петрикевич С.Б. и др. Биопрепарат псевдобактерин-2 для защиты растений от широкого спектра фитопатогенов // Химия в сельском хозяйстве. 1997. - №1. - С. 15-16.

19. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Каровайко Н.И. и др. Иммуноферментная система для определения цитокининов // Физиология растений. 1990. - Т. 37, вып. 1. - С. 193-199.

20. Кудоярова Г.Р., Веселов С.Ю., Еркеев М.И. и др. Иммуноферментное определение содержания индолилуксусной кислоты в семенах кукурузы с использованием меченых антител // Физиология растений. 1986. - Т. 33, вып. 6.-С. 1221-1227.

21. Кузнецова М.А., Филиппов A.B. Ризоплан и фитофтороз картофеля // Защита растений. -1995. -№ 8. С. 19-20.

22. Кузнецов Л. Е., Ховрычев М. П. Оптимизация синтетической среды для культивирования Bacillus thuringiensis II Микробиология. — 1984. — Т.53 вып.1 С. у54-57.

23. Кулаева О.Н. Как регулируется жизнь растений // Соросовский образовательный журнал. — 1995. — № 1. — С. 20-27.

24. Куликов С.Н., Алимова Ф.К., Захарова Н.Г., Немцев C.B., Варламов В. П. Биопрепараты с разным механизмом действия для борьбы с грибнымиболезнями картофеля // Прикладная биохимия и микробиология. — 2006. №1 - С. 86-92.

25. Логинов О.Н., Свешникова Е.В., Исаев Р.Ф., Силищев H.H., Галимзянова Н.Ф., Бойко Т.Ф. Биопрепараты против твердой головни пшеницы // Защита и карантин растений. 2002. - № 9. - С. 39.

26. Логинов О.Н., Пугачева Е.Г., Исаев Р.Ф., Силищев H.H., Бойко Т.Ф., Галимзянова Н.Ф. Биологические средства защиты картофеля от болезней // Аграрная наука. 2003. - № 7. - С. 24.

27. Логинов О.Н., Четвериков С.П. Биосинтез низкомолекулярных метаболитов бактериями Pseudomonas aureofaciens ИБ 51// Биотехнология. — 2003.-№5.-С. 22-25.

28. Логинов О.Н., Силищев H.H., Погосова C.B. Технологические аспекты опытно-промышленного производства биопрепарата на основе бактерий рода Pseudomonas II Башкирский химический журнал.-2003.-Т. 10, № 4.-С. 73-75.

29. Логинов О.Н. Бактерии Pseudomonas и Azotobacter как объекты сельскохозяйственной биотехнологии.- М.: Наука. — 2005. 166 с.

30. Максимов В.Н., Федоров В.Д. Применение методов математического планирования эксперимента при отыскании оптимальных условий культивирования микроорганизмов. М, 1969; — 126 с.

31. Максимов В. Н., Федоров В. Д., О математическом планировании биологических экспериментов // Известия АН СССР, сер. биол. 1966. - №6, С. 864-877.

32. Межераупе В. А. Использование картофельного сока для выращивания микроорганизмов. В кн.: Продуценты аминокислот и ферментов. Рига: Зинатие, 1987, С. 124-177.

33. Мелентьев А. И. Аэробные спорообразующие бактерии Bacillus Cohn в агроэкосистемах. — M.: Наука, 2007. — 147 с.

34. Методы общей бактериологии. Под ред. Ф. Герхард Т. 2. — М: Мир,1984. С. 293-295, 356-358.

35. Мишке И. В. Микробные фитогормоны в растениеводстве. — Рига: Зинатне, 1988.- 151 с.

36. Мишке И. В., Тевелева М. К., Миклашевиче Э. П. Некоторые свойства микробных цитокининов из Pseudomonas stützen II Микробиология. 1985.-вып.5-С. 774-777.

37. Монахова О. Ф. и Чернядьев И.И. Протекторное влияние цитокининовых препаратов на фотосинтетический аппарат растений пшеницы при водном дефиците // Прикладная биохимия и микробиология. -2007. -Т. 43, №6. -С. 720-729.

38. МордуховаЕ. А., Скворцова Н. П., Кочетков В. В., Дубейковский А. Н., Воронин А. М. Синтез фитогормона Индол-3- уксусной кислоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas // Микробиология. 1991. -выпЗ.-С. 494-499.

39. Мордухова Е.А., Кочетков В.В., Поликарпова Ф.Я. и др. Синтез индолил-3-уксусной кислоты ризосферными псевдомонадами: Влияние плазмид биодеградации нафталина // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т.34, № 3. - С.287-292.

40. Назарова J1.H., Наговицин В.А., Черемисина В.Г. Против комплекса болезней озимой ржи // Защита растений. 1995. — № 8. — С. 18-19.

41. Назарова JI.H. Агат-25К на зерновых культурах // Защита и карантин растений.-2002.-№ 1.-С. 21-22.

42. Нетрусова А. И., Егорова М.А., Захарчук JI.M. и др. Практикум по микробиологии.-М.: Издательский центр «Академия», 2005. — 608 с.

43. Олюнина J1.H., Шабаев В.П. Продуцирование индолил-3-уксусной кислоты ризосферными бактериями рода Pseudomonas в процессе роста // Микробиология. 1996. - Т.6, №6. - С.813-817.

44. Патент РФ № 2260951, Б.И. № 27, 2005. Штамм бактерий Pseudomonas aureofaciens ИБ 6 продуцент цитокининов / Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Свешникова Е.В., Кузьмина Л.Ю., Четвериков С.П., Васильева Н.С., Силищев H.H.

45. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978.-С. 331.

46. Рубан Е.Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. -М.: Наука, 1986.-200 с.

47. Сидоренко О.Д., Стороженко В., Кухаренкова О. Применение бактериальных препаратов при выращивании картофеля // Междунар. с-х. ж. 1996. — № 6. -С.36-38.

48. Силищев H.H., Коршунова Т.Ю., Логинов О.Н. Биопрепарат Елена для защиты тепличных овощей от грибных фитопатогенов и повышения урожайности // Картофель и овощи. 2008. - № 2. — С. 28-30.

49. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наук, думка, 1990. - 264 с.

50. Струнникова О. К., Шахназарова В., Ю., Вишневская Н., А., Чеботарь В., К., Тихонович И. А. Развитие и взаимоотношения Fusarium culmorum и Pseudomonas fluorescens в почве // Микробиология. 2007 - №5. - С. 675-681.

51. Сторожук С.В., Сидоров И.А., Соколов М.С. Высокое качество биопрепарата — залог успеха // Защита растений. 1995. - № 8. - С. 17.

52. Титаренко Л.Н., Вяткина Г.Г., Алещенко М.Н. Применение ризоплана на Северном Кавказе // Защита растений. 1995. - № 8. - С. 17.

53. Холмецкая М.О., Лобанок Е.В., Чернин Л.С. Синтез индолилуксусной кислоты некоторыми фитопатогенными и непатогенными бактериями // Докл. АН Беларуси. 1996. - Т.40, № 2. - С. 80-83.

54. Цевкелова Е. А., Климова С. Ю., Чердынцева Т. А., Нетрусов А. И. Микроорганизмы продуценты стимуляторов роста растений и их практическое применение (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - том 42, №2. - С. 133-143.

55. Цевкелова Е. А., Климова С. Ю., Чердынцева Т. А., Нетрусов А. И. Гормоны и гормоноподобные соединения мокроорганизмов (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - том 42, №3. - С.261-268.

56. Четвериков С.П., Логинов О.Н. Триглицеридпептиды псевдомонад — новые агенты биологического контроля фитопатогенных грибов // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - том 41,№1. - С.90-94.

57. Шабаев В.П., Олюнина Л.Н., Смолин В.Ю. Функциональная активность корней кукурузы при инокуляции стимулирующими рост растений ризосферными бактериями рода Pseudomonas II Изв. РАН.Сер. биол.- 1999.-№1.-С.39-46.

58. Шабаев В. П. Влияние инокуляции сахарной свеклы ростстимулирующими ризосферными бактериями рода Pseudomonas на урожай и качество растений // Агрохимия. 2008. - №4. - С. 35-42.

59. Широков A.B., Логинов О.Н., Мелентьев А.И., Актуганов Г.Э. Белковые и пептидные факторы Bacillus sp. 739 — ингибиторы ростафитопатогенных грибов // Прикладная биохимия и микробиология. — 2002. — Т. 38,№2.-С. 161-165.

60. АН Siddiqui I, S.Ehetshamul-Haque, S. Shahid Shaukat. Use of rhizobacteria in the control of root rot-root knot disease complex of mungbean // J.Phytopathol. 2001. -N 6. - P.337-346.

61. Becker J.O., Cook R.J. Role of siderophores in suppression of Pythium species and production of increased growth response of wheat by fluorescent pseudomonas // Phytopathology. 1988. - V. 78. - P. 778-782.

62. Becker J.O., Hepfer C.A., Yuen G.V. et al. Effect of rhizobacteria and metham-sodium on growth root microflora of celery cultivars // Phytopathology — 1990. Vol. 80, N 2. - P. 206-211.

63. Box G. E. P., Wilson К. B. On the experimental attainment of optimum conditions // J. Roy. Stat.Soc., ser.B. 13.1951, N1

64. Box G. E. P., Hunter J. S. Multifactor experimental designs for exploring response surfaces // Ann. Math. Stat., 28, 1957, N1, 195

65. Budzikiewicz H. Secondary metabolites from fluorescent pseudomonads // FEMS Microbiol. Rev. 1993. - V. 104. - P. 209-228.

66. Budzikiewicz H. Siderophores of fluorescent pseudomonads // Z. Naturforsch. 1997.-V. 52,-P. 713-720.

67. Canesan P., Gnanamanickam S.S. Biological control of Sclerotium rolfsii Sacc. in peanut by inoculation with Pseudomonas fluorescens II Soil Biol. Biochem.- 1987.-Vol. 19, N l.-P. 35-38.

68. Chin-A-Woeng T.F.C., Bloemberg G.V., Lugtenberg B.J.J. Phenazines and their role in biocontrol by Pseudomonas bacteria // New Phytologist. 2003. - V. 157. - P. 503-523.

69. Clarke P., Ornston N. Metabolic pathways and regulation. Pt 1. In: Geneties and biochemistry of Pseudomonas N. Y.;L., — 1975. - P.366.

70. Cornells P., Matthiis S. Diversity of siderophore-mediated iron uptake systems in fluorescent pseudomonads: not only pyoverdines // Environ. Microbiol. 2002. - V. 12. - P. 787-798.

71. Dowling D.N., O'Gara F. Metabolites of Pseudomonas involved in the biocontrol of plant disease // Trends Biotechnol. 1994. - V. 12. - P. 133-141.

72. Elsherif M., Grossmann F. Versuche zur biologischen Bekämpfung einiger phytopathogener Pilze durch fluoreszierende Pseudomonaden unter Anwendung verschiedener Applikationsverfahren HZ. Pflanzenkrankh. und Pflanzenschutz-1991.- Bd. 98, N 3. S. 236-249.

73. Flavia P. D., Franga F.P., Lopes M. A.Optimization of culture conditions for exopolysacharides production in Rhizobium sp. using the response surface method // Electronic Journal of biotechnology. 2006. - Vol. 9, N4, July 15. - P. 391-399.

74. Garg S. K., Kumar Y.N., Kumar J. Gold-tolerant fluorescent Pseudomonas isolates from Garhwal Himalayas as potential plant growth promoting and boicontrol agents in pea // Current science. 2005. - Vol. 89, N12, 25, December. -P. 2151-2156.

75. Guo Ying, Pu Wang et al. Medium optimization for enzymatic production of 1-Cysteine by Pseudomonas sp.Zjwp-14 using response surface methodology // Food Technology Biotechnology. 2008.- 46(4). -P. 395-401.

76. Gordon-Lennox G., Walther D., Gindral D. Utilisation d'antagonistes pour l'enrobage des semences: efficacité et mode d'action contre les agents de la fonte des semis//Bull. OEPP. Oxford etc. 1987.- Vol.17, N 4.-P. 631-637.

77. Gould W.D., Hagedorn C., Bardinelli T.R., Zablotowicz R.M. New selective media for enumeration and recovery of fluorescent pseudomonads from various habitats // Appl. Environ. Microbiol. 1985. - V. 49. - P. 28-32.

78. Hader R. J., Harward H. E., Mason D. D., Moore D. P. An investigation of some of relationships between copper, iron and molybdenum in the growth and nutrition of lettuce // Proceeding of Am. Soil Sei. Soc.21. 1957.- N 1,59.

79. Hasegawa S., Kodama F., Kaneshima H. et al. Biological control of Fusarium diseases, isolation of antagonistic microorganisms and seed bacterization on the control for Fusarium wilt of adzuki-bean // J. Pharmacobic-Dyn. 1987. -Vol. 10, N3.-P. 57.

80. He Li, Xu Y., Zhang X.H. Medium factor optimization and fermentation kinetics for phenazine-l-carboxylic acid production by Pseudomonas sp. M-18GII Biotechnol. Bioeng. 2008. - 100. - P.250-259.

81. James D.W., Gutterson N. I. Multiple antibiotics produced by Pseudomonas fluorescens HV37a and their differential regulation by glucose // Appl. Environ. Microbiol. 1986,-V. 52.-P. 1183-1189.

82. Joseph B., Patra R.R., Lawrence R. Characterization of plant growth promoting rhozobacteria associated with chickpea (Cicer arietinum L.) // International Journal of Plant Production. 2007. - 1(2), September. - P. 141-152.

83. Karakos S., Aksoz N. Some optimal cultural parameters for gibberilic acid biosyntesis by Pseudomonas sp. II Turkey Journal Biology. 2006. - 30. - P. 8185.

84. Katoh K., Itoh K. New selective media for Pseudomonas strains producing fluorescent pigment // Soil Science and Plant Nutrition. 1983. - V. 29. - P. 525532.

85. MacDonald J.C. Pyocyanine. Antibiotics. V. 2. Biosynthesis. London; New York: Springer Verl., 1967. - P. 52-65.

86. Martin J. Control of antibiotic synthesis by phosphate // Adv. Biochem. Eng. 1977. - V. 6, N 1. - P. 105-127.

87. Mao G.H., Cappellini R.A. Postharvest biocontrol of gray mold of pear by Pseudomonas gladioli: Abstr. Present. 1989 Annu. Meet. Amer. Phytopathol. Soc., Richmond, Va, Aug. 20-24, 1989 //Phytopathology.-1989.-Vol. 79, N 10.-P. 1153.

88. Mc Laughlin R.J., Sequeira L., Weingartner D.P. Biocontrol of bacterial wilt of potato with an avirulent strain of Pseudomonas solanacearum: Interactions with root-knot nematodes // Am. Potato J. 1989. - Vol. 67, N 2. - P. 93-107.

89. Mc Laughlin R.J., Sequeira L. Evaluation of an avirulent strain of Pseudomonas solanacearum for biological control of bacterial wilt of potato // Am. Potato J. 1988. - Vol. 65, N 5. - P. 255-268.

90. Mew T.W. Bacterization of rice plants for control of sheath blight caused by Rhizoctonia solani / T.W Mew., A.M.Rosales //Phytopathology. 1986. - Vol. 76, N 11.-P. 1260-1264.

91. Narajana K. J., Vijayalakshmi M. Optimization of antimicrobial metabolites production by Streptomyces albidoflavus I I Research Journal of Pharmacology — 2008.-2(1).-P.4-7.

92. Neilands J.B., Leong S.A. Siderophores in relation to plant growth and disease // Ann. Rev. Plant Physiol. 1986. - V 37. - P. 187-208.

93. Neilands J.B. Siderophores: structure and function of microbial iron transport compounds // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 26723-26726.

94. Novotnä J. Antagonisticky vliv bakteric Pseudomonas fluorescens na nektere patogenni i saprofyticke druhy hub fepky a Tnu // Ochr. rostl. 1990. -Vol.26, N 2. - P. 113-122.

95. Osburn R.M., Schroth M.N., Hancook J.G. et al. Dynamics of sugar beet colonization by Pythium ultimum and Pseudomonas species: effects on seed rot and damping-off// Phytopathology. 1989. -Vol. 79, N 6. - P. 709-716.

96. Paulitz T., Nowak-Thompson B., Gamard P., Tsang E., Loper J. A novel antifungal furanone from Pseudomonas aureofaciens, a biocontrol agent of fungal plant patogens //J. Chem. Ecol. 2000. - V. 26. - P. 1515-1524.

97. Pietr S.J., Kempa R.Cucumber rhizosphere pseudomonads as antagonists of Fusarium // Interrelationships Between Microorganisms and Plants Soil: Proc. Int. Symp., June 22-27, 1987. -Praha, 1989. P. 411-417.

98. Raaijmakers J.M., Weller D. M., Thomashow L. S. Frequency of antibiotic-producing Pseudomonas spp. in natural environments // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63.-P. 881-887.

99. Renato de Freitas J., Germida J.J. Pseudomonas cepacia and Pseudomonas putida as winter wheat inoculants for biocontrol of Rhizoctonia solani II Can. J. Microbiol. 1991. -Vol. 37, N 10. - P. 780-784.

100. Rhodes D.J., Logan C. Effects of fluorescent pseudomonads on the potato blacked syndrome // Ann. Appl. Biol. 1986. - Vol. 108, N 3. - P. 511-518.

101. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. New York: Cold Spring Harbor Press; 1989. p. A1-A2.

102. Savithiry S., Gnanamanickam S.S. Bacterization of peanut with Pseudomonas fluorescent for biological control of Rhizoctonia solani and for enhanced yield //Plant and Soil.- 1987. -Vol. 102,N1.-P. 11-15.

103. Sharma A., Bardham D., Patel R. Optimization of physical parameters for lipase production from Arthrobacter sp. BGCC# 490 // Indian Journal of Biochemistry and Biophysics.- 2009. -Vol. 46, April-P. 178-183.

104. Sobiczewski Piotr., Bryk Hanna Mozliwosci i ograniczenia biologicznej ochronny jablek bakteriami Pantoea agglomerans i Pseudomonas sp. przed szara plesnia i mokra zgnilizna // Post. ochr. rosl. 1999. -NI. - P. 139-147.

105. Sorensen D., Nielsen T.H., Christophersen C., Sorensen J., Gajhede M. Cyclic lipoundecapeptide amphisin from Pseudomonas sp. strain DSS73 // Acta Crystallographica. 2001. - Section C: Crystal Structure Communications C57. -P. 1123-1124.

106. Sugimoto E.E., Hoitink H.A.J., Tuovinen O.H. Oligotro phic pseudomonads in the rhizosphere: Suppressiveness to Pythium damping-off of cucumber seedlings (Cucumis sativus L.) // Biol, and Fert. Soils -1990. Vol. 9, N 3. - P. 231-234.

107. Tosi L., Zazzerini A. Evaluation of some and bacteria for potential control of safflower rust // J. Phytopathol. 1994. -N 2. -P.131-140.

108. Tsuyumu S., Tsuchida S., Nakano T. et al. Antifungal activiti in cell-free culture fluid of Pseudomonas solanacearum II Ann. Phytopathol. Soc. Japan. — 1989.-Vol. 55, N l.-P. 9-15.

109. Yan Wang DAG, Peigen Zhou PhD, Jianxing Yu MS, Xiaorong Pan MS, et al. Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by chitosanase from Pseudomonas CUY // Asia Pac J Clin Nutr -2007.-16 (Suppl 1). C. 174-177.

110. Yuan LL, Li YQ, Wang Y., Zhang XH, Xu YQ. Optimization of critical medium components using response surface methodology for phenazine-1-carboxylic acid production by Pseudomonas sp. M-18Q II Journal Biosci. Bioeng. -2008. March. 105(3). - P. 232-237.

111. Weller D.M., Thomashow L.S. Antibiotics: Evidence for their operation and sites where they might by produced // J. Cell. Biochem. 1989. - Suppl. 13A. -P. 154.

112. Wilson C.L., Chalutz E. Postharvest biological control of Pénicillium rots of citrus with antagonistic yeasts and bacteria // Sc. hortic. 1989. - Vol. 40, N 2. — P. 105-112.

113. Whipps J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere // J. Exp. Bot. 2001. - V. 52. - P. 487-511.

114. Zaspel J. Isolierung und Selektion fluoreszierender Pseudomonas-Arten als Antagonisten gegen Gaeumannomyces graminis (Sacc.) Arx et Olivier II Arch. Phytopathol. Pflzschutz. 1989. - Bd. 25, H. 2. - S. 123-130.

115. Zheng Y., Yanful E., Bassi A. Investigation of effects of culture medium components on polyurethane (Impranil DLM) biodégradation by Pseudomonas chlororaphis II GPEC. 2004. - Paper Abstract #31.

116. Утверждаю Зам. генерального директора по развитию и экономике ГУИхЮпытныйзавод» Академий Наук РБа*1. Е. В. Кислина1. АКТиспытания оптимизированной среды на основе автолизата пивных дрожжей.

117. Произвели испытания оптимизированной среды на основе автолизата пивных дрожжей для наработки биопрепарата «Елена».

118. ОП-1 1*Ю10 КОЕ/мл ОП-2 2*1010 КОЕ/мл ОП-3 1,5* Ю10 КОЕ/мл ОП-4 9*109 КОЕ/мл ОП-5 1,2* Ю10 КОЕ/мл

119. Зам. директора по качеству Начальник цеха Инженер-микробиолог

120. Пигильцова С. А. Каттахужаев А.Т. Асабина Е.А.