Изменение активности липазы из поджелудочной железы свиней и липазы из бактерии Pseudomonas fluorescens в комплексе с полиэлектролитами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Каштиго, Татьяна Викторовна

• Каштиго, Татьяна Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Каштиго, Татьяна Викторовна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

Раздел 1.

1.1 Современные представления о липолитических ферментах

1.2 Липазы

1.3 Структурная организация липаз

1.4 Фермент - субстратный комплекс

1.5 Кинетика липолиза

1.6 Влияние жирных кислот

1.7 Термолабильность ферментов

1.8 Зависимость активности ферментов от рН среды

1.9 Влияние неорганических солей на липолиз

Раздел 2.

2.1 Современные аспекты иммобилизации ферментов

2.2 Иммобилизованные ферменты

2.3 Методы иммобилизации ферментов

Глава 2. Материалы и методы

Раздел 1. Материалы

Раздел 2.Методы

Раздел 3 Статистическая обработка

Глава 3. Результаты собственных исследований

Раздел 3.1 Изучение влияния факторов среды на липазы из различных источников

Раздел 3.2 Исследование влияния заряда полимерного окружения на липазы из различных источников

Раздел 3.3 Изменение активности ферментов в комплексе с одним полиэлектролитом и неорганическими солями

Раздел 3.4 Иммобилизация липазы из Pseudomonas fluorescens в смесь из двух полиэлектролитов

Раздел 3.5 Иммобилизация липазы из Hog pancreas в смесь из двух полиэлектролитов

Выводы

Рекомендации по использованию

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изменение активности липазы из поджелудочной железы свиней и липазы из бактерии Pseudomonas fluorescens в комплексе с полиэлектролитами»

Ферменты и ферментативные системы широко применяются в самых различных областях практической деятельности: в пищевой, фармацевтической, текстильно-кожевенной, косметической и других отраслях промышленности, а также в медицине, сельском хозяйстве, органическом синтезе, биохимическом анализе и т. д. До сих пор развитие прикладной энзимологии сдерживается дороговизной многих ферментов, особенно их чистых препаратов. Возможность применения ферментов также осложнены по ряду причин: ферменты неустойчивы при хранении, при различных воздействиях, особенно тепловых, многократное использование ферментов затруднено из-за сложности их отделения от реагентов и продуктов реакции [4,5,21,30].

К настоящему времени накоплен значительный экспериментальный материал и развиты теоретические представления о методах иммобилизации различных ферментов, позволяющие решить указанные проблемы. Целью иммобилизации является повышение устойчивости ферментов к денатурирующим агентам и придание им заданных технологических свойств, включая возможность повторного использования и легкость выделения из реакционной смеси [21, 45].

Одними из наиболее широко использующихся ферментов являются липазы, которые относятся к третьему классу ферментов (гидролазам) и способны гидролизовать сложноэфирные связи в молекулах ряда липидов (главным образом - триглицеридов). По-нашему мнению, управление липолитической активностью будет играть важную роль в новых методах лечения нарушений жирового обмена и в контроле за сердечно-сосудистыми заболеваниям, поэтому изучение возможности изменения активности липаз является важным и актуальным.

Большой интерес представляет практическое использование липаз в пищевой и других отраслях промышленности. Липазы микроорганизмов в сочетании с другими ферментами применяются для биологической очистки сточных вод. Липазы, гидролизующие триглицериды с образованием глицерина и жирных кислот, входят в состав набора реактивов для определения содержания триглицеридов во всех биологических жидкостях[7,25 - 27, 29]. Возрастающие масштабы использования липаз в биохимии и биотехнологии вызывают необходимость поиска эффективных продуцентов ферментов данной группы, в связи с чем в настоящей работе проводилось сравнение липаз из разных источников: липазы из поджелудочной железы свиньи и бактериальной липазы из Pseudomonas fluorescens [ 25-27,29].

В настоящее время в биохимических лабораториях и научно-исследовательских институтах ведутся исследования, основанные на методах иммобилизации ферментов: сорбция на носителе, ковалентное связывание и включение в структуру гелей-носителей и отдельных полимеров [13,20,24, 47, 56, 57, 106]. Однако данных о регуляции ферментативной активности липаз в комплексах на основе двух противоположно заряженных синтетических полиэлектролитов до наших работ в литературе не было. Такие исследования позволяют глубже понять природу многих важных биохимических процессов, протекающих в живых системах, а также создавать новые материалы для биотехнологии и медицины.

Целью данной работы являлось исследование влияния разнозаряженных полиэлектролитов и условий протекания каталитической реакции на активность липаз из различных источников, а также определение оптимальных условий иммобилизации липаз в полимерное окружение.

Научная новизна. Впервые получены стабильные комплексы на основе липазы и двух противоположно заряженных полиэлектролитов, проявляющие повышенную каталитическую активность. Предложена модель формирования таких двух- и трехкомпонентных комплексов.

Изучено влияние знака заряда полиэлектролита на активность липаз из поджелудочной железы свиней и из бактерии Pseudomonas fluorescens.

Проведено сравнительное изучение влияния полимерно-ионного окружения и др. факторов среды на ферментативную активность липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней.

Впервые подобраны оптимальные условия для иммобилизации различных типов липаз в трехкомпонентные комплексы с полиэлектролитами.

Практическая ценность работы. Полученные экспериментальные данные по иммобилизации липаз в комплексы с различными полиэлектролитами имеют практическую ценность для разработки новейших биохимических тест-систем и биотехнологических методов.

Установленное влияние полимерного окружения на фермент позволяет использовать полиэлектролиты как аллостерические модуляторы активности, а также стабилизаторы ферментов.

Сравнительное исследование активности липаз микробного и животного происхождения даёт возможность выбора подходящего фермента и условий иммобилизации для определённого вида липазы, в целях экономии средств, при производстве и использовании препарата в различных отраслях промышленности.

Результаты и основные научно-методические положения диссертации используются в лекционном курсе и лабораторном практикуме по курсу дисциплин: «Биохимия» (3 курс ВБФ), «Биоэнергетика. Энзимология», «Кинетика и термодинамика ферментативных реакций» и «Биохимия мембран» (4 курс ВБФ) при подготовке специалистов высшей квалификации по специальности 012300 - «Биохимия» в ФГОУ ВПО «МГАВМиБ им. К.И.Скрябина».

Положения выносимые на защиту. данные по влиянию условий среды на каталитическую активность липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней; - данные по влиянию положительно заряженного полиэлектролита (ПАМА - полидиаллилдиметиламмоний галогенид) и отрицательно заряженного полиэлектролита (ПСС -полистиролсульфонат натрия) на каталитическую активность липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней; данные по влиянию неорганических солей на каталитическую активность липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней в комплексе с полиэлектролитами (двухкомпонентные комплексы); оптимальные композиции высокоэффективных препаратов иммобилизованной липазы из Pseudomonas fluorescens и липазы из поджелудочной железы свиней на основе разнозаряженных полиэлектролитов (трехкомпонентные комплексы).

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на Всероссийской научно-производственной конференции по актуальным проблемам ветеринарии и зоотехнии в Казани в 2002 г.; на Всероссийской научно-технической конференции в Мурманске в 2003 г.; на IX Международной конференции «The problems of solvation and complex formation in solutions», Plyos, 2004; на Международной учебно-методической и научно-практической конференции, посвященной 85-летию МГАВМиБ им. К.И.Скрябина, Москва, 2004 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 8 печатных работ, из них 5 статей и 3 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Каштиго, Татьяна Викторовна

Выводы:

1. Детально изучен процесс формирования двух- и трехкомпонентных комплексов полиэлектролитов с липазами из различных источников и предложена модель этого процесса. Показано существенное влияние таких факторов как: соотношение фермент : полиэлектролит, неорганических солей, рН среды, на активность и стабильность фермент-полиэлектролитных комплексов.

2. Показано, что как природа катиона и аниона, так и концентрация солей при приготовлении растворов липаз из Pseudomonas fluorescens и поджелудочной железы свиней существенно влияют на их ферментативную активность. Так, соли неорганических фосфатов оказывают активирующее влияние на все изученные типы липаз (до 22-29 %) по сравнению с NaCl, который не оказывает влияние на активность липаз, но является обязательным компонентом среды электрохимической ячейки.

3. Обнаружено, что соотношение полимер : фермент играет важную роль для проявления каталитической активности обоих типов липаз в комплексе. В большинстве случаев оптимальное соотношение для проявления ферментативной активности обоих типов липаз в двухкомпонентном комплексе является соотношение 10:1.

4. Изучено влияние полимерного окружения (полиэлектролитов ПСС и ПАМА) на ферментативную активность указанных липаз в различных мольных соотношениях. Показано, что присутствие отрицательно заряженного полимера (ПСС) в двухкомпонентном комплексе увеличивает каталитическую активность до 129 % у липазы из поджелудочной железы свиней при соотношении полимер : липаза =10:1 и до 126 % у бактериальной липазы из Pseudomonas fluorescens (полимер : липаза =1:1). Положительно заряженный полимер (ПАМА) при соотношении полимер : липаза =1:1 напротив несколько снижает каталитическую активность липаз до 92 % и 95 % соответственно.

5. Обнаружено влияние солей на ферментативную активность липаз в двухкомпонентных комплексах с полиэлектролитами, при различных мольных соотношениях. Так, каталитическая активность липазы из Hog Pancreas в присутствии ПСС и солей возрастает до 142 % (полимер : липаза = 10 : 1) и до 124 % у липазы из Pseudomonas fluorescens (полимер : липаза =10:1).

6. Найдены оптимальные условия получения трехкомпонентных комплексов (двух полиэлектролитов и липазы из бактерии Pseudomonas fluorescens или липазы из поджелудочной железы свиней) с высокой ферментативной активностью. Так для липаз из Pseudomonas fluorescens и из Hog Pancreas главными условиями являются соотношение полимер : липаза = 100 : 1 и значение рН среды 9,0. Это позволяет получить стабильные комплексы с высокой эффективной активностью (свыше 60 %) и стабильностью при хранении.

Рекомендации по использованию результатов диссертационной работы

Полученные полиэлектролитно-липазные комплексы могут быть использованы как перспективный биокаталитический материал для новейших биохимических тест-систем и биотехнологических методов. Разработанный подход к иммобилизации липаз существенно отличается от других технологий иммобилизации ферментов своей простотой, воспроизводимостью и стабильными параметрами проб.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Каштиго, Татьяна Викторовна, 2004 год

1. Асатиани B.C. Биохимическая фотометрия. М.: Изд. АН СССР, 1957.- с.248-253.

2. Беззубов Л.П. Химия жиров. М. Пищев. Пром-ть, 1975. - 279 с.

3. Белов С.В. Исследование гидролиза в монослоях новых липидоподобных субстратов и трилаурина под действием липазы Pseudomonas fluorescens / Белов С.В., Шнайдер М.П., Иванов А.Е. // Биоорганическая химия, 2000. том 26, №3. - С. 231-237.

4. Березов T.T., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. -3-е изд., испр. и доп. М.: Медицина, 1998. 704 с.

5. Брокерхоф X. Липолитические ферменты./ Брокерхоф X., Дженсен Р.; Под ред. Акад. А.Е.Браунштейна и Е.В.Горяченковой. М.: Мир, 1978. - 396 с.

6. Бургелев О.О., Каплун А.П., Козлов Л.В., Лисакова С.В., Дьяков В.Л.,

7. Швец В.И. Механизм ингибирующего эффекта полианионов и поликатионов. Биоорганическая химия, 2003.- т.29,- №2 -С.139-142.

8. Быковская Г. Использование ферментов в хлебопечении: Хлебопродукты / Быковская Г.- 2000. №5.- С.12.

9. Введение в прикладную энзимологию. Иммобилизованные ферменты. / Под ред. И.В.Березина, К.Мартынека. М.: Изд-во МГУ, 1982.

10. Васильев В.П. Аналитическая химия. Физико-химические методы анализа: Учеб. для студ. Вузов. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Дрофа, 2002. - С.210.

11. Горохова И. В. Увеличение каталитической активности липазы из Pseudomonas fluorescens при соосаждении с суспензией гексан-1, 2-диола / Горохова И. В., Иванов А. Е., Зубов В. П.// Известия Академии наук. Серия хим. Москва, 2001. - №1. - С. 146-148.

12. Горохова И. В. Соосаждение липазы из Pseudomonas fluorescens с гидрофобными соединениями как подход к ее иммобилизации при катализе в неводных средах / Горохова И.

13. B., Иванов А. Е., Зубов В. П. // Биоорганическая химия, 2002. -т. 28. -№1.-С. 56-61.

14. Горохова И. В. Изучение взаимодействия и активации липазы из Pseudomonas fluorescens в монослоях и преципитатах ПАВ / Горохова И. В., Иванов А. Е., Зайцев С. Ю., Зубов В. П. // Известия Академии наук. Серия хим. Москва, 2003. - № 4.1. C. 38-47.

15. Дарст Р., Ионоселективные электроды. М.: Мир, 1972.- 73 с.

16. Диксон М. Ферменты / Диксон М., Уэбб Э., пер.англ.,- М.: Мир, 1982.-т.1.-с. 370-392.

17. Денуэль П. Система липаза-колипаза как модель липолитического биокатализа / Денуэль П. // Физ.-хим. проблемы ферм, катализа. М.: Наука, 1984. - 250с.

18. Зайцев С.Ю. Биохимия животных. Фундаментальные и клинические аспекты: Учебн. Пособие/ Зайцев С.Ю., Конопатов Ю. В. СПб.: Изд-во Лань, 2004. - 384 с.

19. Изумрудов В. А. Успехи химии / Изумрудов В. А., Зезин А. Б., Кабанов В. А. Москва, 1991.-т. 60.-е. 1570-1585.

20. Иммобилизованные ферменты / Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В. и др. М.: Высш. шк., 1987.- 159 с.

21. Иммобилизованные клетки и ферменты // Под редакцией Дж.Вудворда.- М.: Мир, 1988. 215 с.

22. Инфракрасные спектры поглощения полимеров и вспомогательных веществ. Под. ред. Чулановского В.М. // Химия. Ленинград, 1969.

23. Кабанов В. А., Зезин А. Б., Изумрудов В. А. Итоги науки и техники / Серия биотехнология, т. 4. М.: ВИНИТИ, 1987. - С. 159-198.

24. Калунянц К.В. Применение продуктов микробиосинтеза в животноводстве / Калунянц К.В., Ездаков Н.В., Пивняк И.Г. -М.: Колос, 1988.-288 с.

25. Камман К. Работа с ионоселективными электродами / Камман К. М.: Мир, 1980.-25 с.

26. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. -М.: ДеЛи принт, 2002.- 179 с.

27. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии.-Москва, 1989.

28. Котова Г.А. Получение аминокислот с использованием иммобилизованных ферментов / Котова Г.А., Безбородов A.M. // ОНТИТЭИ Микробиопром, Москва, 1978.

29. Кугушева Л.И. Применение ферментсодержащих мембран для определения органических соединений / Кугушева Л.И., Кузнецова Л.П., Никольская Е.Б., Ягодина О.В. И Журн.анал.химии,- 1992.- т.47.- Вып.8. С.1478-1483.

30. Лейтес Ф.Л. Гистохимия липолитических ферментов в норме и припатологии липидного обмена. М.: Медицина, 1967.

31. Логинов А.С. Ингибиторы протеолитических ферментов поджелудочной железы / Логинов А.С., Амиров Н.Ш., Черноярова О.Д. // Вестник академии мед. наук СССР. 1989 -№1 - С.53-61.

32. Марри Р. Биохимия человека / Марри Р., Греннер Д., Мейсес П., Родуэлл В. // Пер. с англ. М.: Мир, 1993. - т. 1. - 384 с. -т.2. -415 с.

33. Мидгли Д., Торренс К. Потенциометрический анализ воды. М.: Мир, 1980.

34. Никольская Е.Б., Кузнецова Л.П., Кострова В.М. // Ж. аналитической химии. 1989. - Т.44. - № 5. - С.936.

35. Никольская Е.Б. Ионный обмен и ионометрия / Никольская Е.Б., Волонт Л.А., Рудаков В.В. Ленинград: ЛГУ, 1982. Вып.З. -С.214.

36. Рахимов М.М. Субстратная специфичность иммобилизованных липаз / Рахимов М.М., Джанбаева Н.Р. // Доклады академии наук СССР, Биохимия, 1976. Том 229. -№6.

37. Трофимова О.Д., Исследование молекулярного механизма реакции ферментативного гидролиза триглицеридов: Автореф. Дис. канд.биол.наук: 3.00.02 / О.Д.Трофимова; Воронежский гос.ун-т. - Воронеж, 2004.-16 с.

38. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. М.: Мир., 1980.-с. 373-388.

39. Халгаш Я. Биокатализаторы в органическом синтезе. М.: Мир, 1991.

40. Химическая энциклопедия. Изд-во Большая Российская энциклопедия, Москва, 1995. Т.4. - С.78-80.

41. Черноярова О.Д. Ингибиторная способность крови по отношению к липазе у больных хроническим панкреатитом. / Черноярова О.Д., Астафьева О.В., Винокурова Л.В.,

42. Кондашова З.Д. // Российский гастроэнтерологический журнал.- 1998. №2. - С.103.

43. Alford J.A. Bacterid. / Alford J.A., Pierce D.A. 1963. v.24. -p.86.

44. Alford J.A., Pierce D.A., Suggs F.G. / J. Lipid Res., 1964. №5 - P. 390.

45. Atsushi Harada. Switching by Pulse Electric Field of the Elevated Enzymatic Reaction in the core of Polyion complex micelles / Atsushi Harada, Kazunori Kataoka // J.Am.Chem.Soc. 2003. -P.125.

46. Baillargeon M.W. Lipase modified for solubility in organic solvents / Baillargeon M.W.,Sonnet P.E. // Ann. NY Acad.Sci, 1988. -v.545. P.244-249.

47. Barros R.J. Effect of Enzyme Loading on Immobilized a-Chymotrypsin Activiti in Organic Medium, sigillum Biotrans'95 / Barros R.,J., Wehtye E., Adlercreutz P, 1995.

48. Benzonana G., Desnuelle., Biochim. Biophys. Acta, 1968. v.164.- p.47.

49. Bernard C. Memoire sur le pancreas et sur la role du sue pancreatiquea dans les phenomenes digestifs, particulierement dans la digestion des matieres grasses neuters / Bernard C. // Bailliere et Fils. Paris, 1856.

50. Bjorklund A. Some Lipolytic Psychrophilic Pseudomonas Bacteria and their Hydrolysis of Edible Fats / State Inst. Tech. Res.// Finland, Julkaisu 156 Publ., Helsiki, 1970.

51. Brokerhoff H., Biochim. Biophis // Asta, 1968. v. 159. - P.296.

52. Bosley Y.A. Blueprint for f lipase support: Use of hydrophobic controlled-pore glasses as model systems / Bosley Y.A., Clauton Y.C. // Biotechnology and Boiengineering, 1994. v. 43. - P. 934938.

53. Coleman M.H., Advan. Lipid Res., 1963. №1.

54. Cygler M. Understanding interfacial properties of lipases / Cygler M., Schrag J.D. // Method in enzymology, 1997. v. 284.

55. Dong L.C. Thermally reversible hydrogels.3.Immobilization of enzymes for feedback reaction control / Dong L.C., Hoffman A.S. // J. Control. Release, 1986. v.4. - P.223 - 227.

56. Dong L.C. Thermally reversible hydrogels swelling characteristics and activities of copoly gels containing immobilized asparaginase in Reversible Polimeric Gels / Dong L.C., Hoffman A.S. // ACS Symposium series. Washington, 1987. - P.236 - 244.

57. Dautzenberg H, Rother G. Macromol. Chem. // Macromol. Symp, 1992.-v.61. -P.94-113.

58. Dautzenberg H, Rother / G. Polym. Sci. Part В // Polym. Phys., 1988.-№26. -P. 353 -366.

59. Dautzenberg H. Immobilization of trypsin in polycation-polyanion complexes / Dautzenberg H., Karibyants N., Zaitsev S.Yu. // Macromol. Rapid Commun, 1997. v.18. - P. 175-182.

60. Entressangles В., Desnuelle P. // Biochim. Biophys. Acta, 1968. -№159.-P. 285.

61. Emilie Passicos. Regioselective acylation of flavonoids catalyzed by immobilized Candida Antarctica lipase under reduced pressure / Emilie Passicos, Santarelli X., Coylon D. // J. Biotechnology Letters, 2004. v.26. - №13. - P. 1073-1076.

62. Erdmann H. Ausgewaehlte Beispile fuer die Anvendung von Lipasen in der organisch praparativen Chemie Jarbuch Biotechnologie / Erdmann H., Fritsche K., Schneider M., 1986/1987.-P.353-379.

63. Finkelstein E., Strawich E.S., Sonnino S // Biochim. Biophis. Acta, 1970. v.206. - P. 380.

64. Fukui A., Tanaka A., Iida T. // FEBS Lett., 1976. P. 66 - 179.

65. Heinrich C.P., Noack K., Wiss O. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000. v. 49. - P. 1427-1432.

66. Hoffman A.S. Application of thermally reversible polymers and hydrogels in therapeutics and diagnostics / Hoffman A.S. // J. Control. Release, 1987. v.7. - P. 297-305.

67. Hokin L.E. Handbook of physiology / Hokin L.E. // Amer. Physiol. Soc. J. Field, ed., Williams and Wilkins, Baltimore, Meryland, 1967.-Sect. 6, -V. II.-P. 935.

68. Huttunen J. K. Fed.Proc. / Huttunen J. K., Ellingboe J., Pittman R. C., Steinberg D. // Fed. Amer. Soc. Exp. Biol., 1970. №29. -P.267.

69. Ivanov A.E. Methods for immobilization of Lipase and their use in ester syntesis / Ivanov A.E., Schneider M.P. // J. Molecular Catalysis B: enzumatic, 1997. №3. - P.303 - 309.

70. Kaetsu I., Kimamura M., Fuyimura Т., Yoshida M., Asano M., Kasai N.,

71. Tamada M. // Radiat. Phys. Chem., 1986. №27. - p. 245.

72. Kirchener G., Scollar M. P., Klibanov A.M. // J. Amer. Chem. Soc., 1985.-№107.-P. 70-72.

73. Koops B.C., Verheij H.M., Slotboom A.J., Egmond M.R. Effect of chemical modification on the activity of lipases in organic solvents. Elsevier // Enzyme and Microbial Technology, 1999. №25. — p.622.631.

74. Klibanov A.M., Samochin G.P., Martinek K., Berezin I.V. // BiotechnologyandBoiengineering, 1977. №19.-p. 1351.

75. Kudryashova E.V. Enzyme Polyelectrolyte Complexes in Water — Ethanol Mixtures: Negatively Charged Groups Artificially1.troducedinto a-Chymotrypsin Provide Additional Activation and Stabilization

76. Effects / Kudryashova E.V.,Gladilin A.K., Vakurov A.V., Frederic1. Heitz,1.vashov A.V., Mozhaev V.V. // J. Biotechnology and Bioengineering,1997. v.55.-№.2.

77. Jensen R.G. Progr. Chem. Fats Other Lipids, 1971. v.l 1 - p.347.

78. J. Xia. Protein-Polyelectrolyte Complexes / J. Xia, P. L. Dubin // P. L. Dubin, J. Bock, R. M. Davies, D. N. Schulz, C. Thies (Eds.).

79. Macromolecular Complexes in Chemistry and Biology, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, 1994. Chap. 15. - P. 247-271.

80. Laboureur P., Labrousse M./ Bull. Soc. Chim. Biol., 1966. №48. -p. 747.

81. Laumen K., Breitgoff D., Schneider M.P. // J. Chem. Soc. Chem. Commun, 1988. v.22. - P. 1459.

82. Laura M.B. Variables that affect immobilization of Mucor Miehei Lipase on Nylon membrane / Laura M.B., Gustavo A.S.P., Heizir F., Jose L., Eduardo H. // J. Kluwer of Microbiology and Biotechnology, 2004. v.20. - №4.- p.371-375.

83. Lawrens R.C., Dairy Sci. Abstr.,1967. №29. - P.l.

84. Lawrens R.C., Fryer T.F., Reiter B. Nature. London, 1967. -v.213. -p.1264.

85. Lipases. Part A Biotechnology / Ed. By Byron Rubin, Edward A.Dennis // Methods in Enzymology, 1999. - vol. 284. - p. 327-347.

86. Lipases / Ed.by Borgstrom B. and Brockman H.L.// Elsevier, Amsterdam, N.Y., Oxford, 1984.

87. Litchfield C. Analysis of Triglycerides / Litchfield C. // Academic Press. New York, 1972.

88. Lu J.Y., Liska B.J., Appl. Microbiol., 1969. №18. - p. 104-108.

89. Margolin L. Dokl. Acad. Nauk. USSR // Margolin L., S. F. Sherstyuk, V. A. Izumrudov, V. K. Svedas, A. B. Zezin, V. A. Kabanov, 1985.-№284. P.997.

90. Martinek К., Klibanov A. M., Goldmacher V. S.,Chernusheva A.V., Mozhaev V.V., Berezin I.V., Glotov V.O., Biochim. Biophys.Acta, 1977.-v.485.-p. 13.

91. Mattson F. H., Volpenhein R.A. // J. Amer. Oil Chem., 1966. Soc. 43-P. 286.

92. Mattson F. H., Volpenhein R.A. // J. Lipid Res., 1966. №7. - P. 356.

93. Mencher J.R., Alford J.A. // Gen. Microbiol., 1967. №48. - P. 317.

94. Metod in enzimology / Enzime // Ed. By K. Mosbash. N.Y.: Academic Press, 1976. - v. 44. - P. 999.

95. Mirrison J.D. Assymmetric synthesis / Mjrrison J.D. // New York, Academic. Press, 1983-85. Vol. 1-5.

96. Mori Т., Tosa Т., Chibata I. // J.Solid-Phase Biochem., 1, 1976. -p.15-26.

97. Nashif S.H., Nelson F.E. // Dairy Sci. Abstr., 36, 1953. p. 481.

98. Nacrae A.R., Hammond R.C. // Biotechnol. Biophys. Acta, 1989. -V.575.-P. 156.

99. Nunez A., Ashby R., Foglia T.A., Solaiman D.K.Y. LC/MS analysis and lipase modification of the sophorolipids produced by Rhodotorula bogoriensis. J. Biotechnology Letters, 2004. v.26. -№13. - p. 1087-1093.

100. Okahata Y., Niikura K., Ijiro K., Enzyme Lipid Complex, 1995. -p.9.

101. Okahata Y., Ijiro K. //Chem. Soc. Chem. Commun, 1992.- v. 65. -p.2411.

102. Okahata Y.,Hatano A., Ijiro K., Enhancing Enantioselectivity of a Lipid coated Lipase via Imprinting Methods for Esterification in Organic

103. Solvents // Azymmetry, 1995. №6. - P.1311-1322. 103.0kumura S., Iwai M., Tsuyisaka Y. // Biochim. Biophys.Acta.-1989.-V.575.-p. 156.

104. Philipp В., H. Dautzenberg, K. J. Linow, J. Koetz, W. Dawydoff, // Progr. Polym. Sci., 1989. №14. - p. 91.

105. Ramachandra Murty V. Hydrolysis of rice bran oil using an immobilized lipase from Candida rugosa in isooctane / Ramachandra Murty V., Jayadev В., Muniswaran P.K.A. // J.Kluwer. Biotechnology Letters, 2004. - v.26. - №7. - p.563-567.

106. Reetz M.T. Efficient Immobilization of Lipase by Entrapment in Hydrophobic Sol-Gel Materials / Reetz M.T., Zonta A., Simpelkamp // J. Biotechnology and Bioengineering, 1996. v.49. -p.527-534 .

107. Retey Y.,Robinson Retey Y., Robinson Y.A., Stereospecificity in organic chemistry and enzymology. Weinheim, Verlag Chemie, 1982.

108. Sangpill Hwang, Jungoh Ahn, Sumin Lee, Tai Gyu Lee, Seungjoo Haam, Kangtaek Lee, Ik-Sung Ahn, Joon-Ki Jung. Evaluation of cellulosebinding domain fused to a lipase for the lipase immobilization // J.Kluwer, 2004. v.26. - №7. - p.603-605.

109. Sarda L. Action de la lipase pancreatique sur les esters en emulsion / Sarda L., Desnuelle P. // Biochim. Biophis. Acta, 1958. Vol. 30.

110. Semeriva M., Benzonana G., Desnuelle P.// Biochim. Biophis. Acta, 1969.-v.191.-p. 598.

111. Semeriva M., Dufour C., Biochim. Biophis. Acta, 1972. v.260. -p. 393.

112. Slotboom A.J., de Haas G.H., Bonsen P.P.M., Burbuch-Westerhuis G.

113. J., van Deenen L.L.M.// Chem. Phys. Lipids, 1970. v.4. - p. 15.

114. Slotta K.H. The Enzymes /P.D. Boyer, H. Lardy and K. Myrback, eds. // 2nd rev. ed, Academic Press, New York, 1960. v. 4. - p. 551.

115. Somkuti G.A., Babel F.J., Appl. Microbiol, 1968. v.16. - p. 617.

116. Somkuti G.A., Babel F.J., Somkuti A.C., Appl. Microbiol, 1969. -v.17. p. 606.

117. S. Dumitriu, E. Chornet, P. F. Vidal, C. Moresoli, Biotechnology Techniques, 1995. v.9. -p.833-836.

118. S. Dumitriu, E. Chornet, Adv. Drug Delivery Reviews, 1998. -v.31. p.223-246.

119. Retey Y. Stereospecificity in organic chemistry and enzymology / Retey Y.,Robinson Retey Y., Robinson Y.A. // Weinheim, Verlag Chemie, 1982.

120. Tischer Immobilisierte Systeme in der Anwendung, Forschung und Entwicklung, 1996. v.54. - p.252-275.

121. Y. Li. Structure and Flow in Surfactant Solution / Y. Li, P. L. Dubin, C. A.Herb, R. K. Prud'homme // Eds., ACS Symposium. -Series 578, Am.Chem.Soc., Washington, DC, 1994. Chap.23. -p. 320.

122. Yamanaka S. Regiospecific interification of triglyceride with celite adsorbed lipase / Yamanaka S., Tanaka T. // Meth. Enzymol, 1987.-v. 136.-p.404-411.

123. Ulbrich R., Schellenberger A., Damerau W., Biotechnology and Boiengineering, 1986. v.28. - p.511.

124. Unen D-J. Studies on the mechanism of crown-ether-induced activation of enzymes in non-aqueous media / Unen D-J., Engbersen F.J., Reinhoudt D.N. // Elsevier. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2001. v.l 3. - p.877-882.

125. Verger R. / Thesis // Faculte des Sciences de Marseille, 1970.

126. Wills E.D. // Biochim. Biophys. Acta, 1960. №40. - p.481.

127. Zaks A., Klibanov A.M. // Science, 1984. v.224. - p. 1249.

128. Zaks A., Klibanov A.M. // Proc. Natl. Sci. USA. v.85.- 1985. -p. 3192.

129. Zhen Yang. Synthesis of Protein-Containing Polymers in Organic Solvents / Zhen Yang, Darrel Williams, Alan J. Russel // Biotechnology and Boiengineering, 10-17, 1995.-p.45.1. АКТ ЗАКЛЮЧЕНЫ1. УТВЕРЖД. Проректо ФГОУ Ц'профес « /.

130. Скрябина, .И. Василевич 2004г.

131. На что и составлен настоящий акт.1. Что и удостоверяется:

132. Председатель учебно—методической комиссии ветеринарно-биологического факультета, доцент кафедры органической и биологической химии, заслуженный работник высшей школы

133. Декан ветеринарно биологического факультета,/ доктор биологических наук, £доцент кафедры радиобиологии ;1. V А

134. Заведующий кафедрой органической и биологической химии, доктор химических наук1. Л.А. Фролова1. Л.В. Рогожина1. С.Ю. Зайцев