Изучение молекулярных механизмов GNAO1-энцефалопатии и разработка генной терапии с использованием рекомбинантных аденоассоциированных вирусов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Лунев Евгений Андреевич

• Лунев Евгений Андреевич
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Лунев Евгений Андреевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость исследования

Методология и методы исследования

Положения выносимые на защиту

Апробация результатов

Личное участие автора в проведении исследования

Структура и объем диссертации

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ген GNAO1 и функции белка Gao в норме

1.2. GNAO1-энцефалопатия: общие сведения

1.3. Молекулярные нарушения при GNAO1-энцефалопатии

1.4. Мутация GNAO1 c.607G>A (p.G203R)

1.4.1. Существующие модели GNAO1-энцефалопатии c.607G>A (p.G203R)

1.4.2. Молекулярные механизмы GNAO1-энцефалопатии c.607G>A (p.G203R)

1.5. Аденоассоциированные вирусные векторы

1.5.1. Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы для создания моделей генетических заболеваний

1.5.2. Рекомбинантные аденоассоциированные вирусы для генной терапии

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Филогенетический анализ

2.2. Клонирование плазмидных векторов

2.3. Выделение первичной нейрональной культуры

2.4. Культура ГАМКергических нейронов

2.5. Культивирование эукариотических клеток

2.6. Трансфекция

2.7. Продукция рекомбинантных аденоассоциированных вирусов

2.8. Вирусная трансдукция

2.9. Анализ цАМФ

2.10. Визуализация колебаний внутриклеточного кальция

2.11. Анализ цитотоксичности

2.12. Выделение РНК и получение кДНК

2.13. Количественная ПЦР

2.14. RNAseq анализ

2.15. Секвенирование нецелевых сайтов разрезания CRISPR/Cas9

2.16. Секвенирование Gnaol транскрипта и анализ вариантов сплайсинга

2.17. Анализ биораспределения AAV

2.18. Вестерн-блоттинг

2.19. Иммунофлуоресцентный анализ

2.20. Лабораторные животные

2.21. Статистический анализ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Влияние мутации GNAO1 c.607G>A (p.G203R) на способность Gao к суперактивации аденилатциклазы

3.2. Создание in vitro модели GNAO1-энцефалопатии для изучения доминантно-негативного проявления мутантного белка Gao-G203R

3.3. Эффект оверэкспрессии мутантного белка Gao-G203R на функционирование нейронов

3.4. Влияние препарата на основе аденоассоциированного вируса, предназначенного для аллель-селективного подавления патогенного варианта GNAO1 c.607G>A, на транскриптом пациент-специфических нейронов in vitro

3.5. Характеризация линии мышей Gnao1em1Mvb с гуманизированным участком гена Gnaol в области мутации c.607G>A

3.6. Влияние препарата на основе аденоассоциированного вируса, предназначенного для аллель-селективного подавления патогенного варианта GNAO1 c.607G>A, на экспрессию гуманизированного Gnaol в мышиной модели

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AAV - аденоассоциированные вирусы

Cas - CRISPR-ассоциированный белок (CRISPR-associated protein) CDS - белок кодирующая последовательность

CRISPR - регулярно расположенные группами короткие палиндромные DGE - дифференциально экспрессирующиеся гены

dMSN - средние шипиковые нейроны прямого пути (direct-pathway Medium spiny neurons)

FDA - управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration) GFP - зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein) GIRK - калиевый канал внутреннего выпрямления сопряженный с G-белками (G protein-coupled inwardly rectifying potassium channel) GPCR - рецептор сопряженный с G-белками (G protein-coupled receptor) iMSN - средние шипиковые нейроны непрямого пути (indirect-pathway мedium spiny neurons)

ITR - инвертированные концевые повторы (inverted terminal repeats) miRNA - микроРНК

OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man, онлайн-база данных наследственных заболеваний человека

PAM - мотив, прилегающий к протоспейсеру (protospacer adjacent motif)

PBS - фосфатно-солевой буфер (phosphate-buffered saline)

PCA - анализ главных компонент (principal component analysis)

rAAV - рекомбинантные аденоассоциированные вирусы

RGS - регуляторы сигнализации G-белков (Regulator of G protein signaling)

RNAi - РНК-интерференция

ROI - область интереса (region of interest)

shRNA - короткая шпиличная РНК

shSCR - контрольная короткая шпилечная РНК не имеющая таргета в транскриптоме

VP - вирусные белки капсида AAV

АТФ - аденозинтрифосфат

АЦ - аденилатциклаза

ГАМК - гамма-аминомасляная кислота

ГДФ - гуанозиндифосфат

ГК - геномные копии

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ИПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки кПЦР - количественная полимеразная цепная реакция НТО - нетранслируемая область

ОТ-ПЦР - количественная полимеразная цепная реакция с обратной

транскрипцией

п.н. - пары нуклеотидов

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЦНС - центральная нервная система

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение молекулярных механизмов GNAO1-энцефалопатии и разработка генной терапии с использованием рекомбинантных аденоассоциированных вирусов»

Актуальность темы исследования

Ген GNAO1 экспрессируется преимущественно в нейрональных клетках и кодирует белок Gao, который относится к семейству G-белков (Gi/o) [1]. На долю этого белка приходится до 1% всех мембранных белков головного мозга [2]. Несмотря на широкое распространение, его молекулярные функции долгое время оставались слабо изученными. Всплеск интереса к этому белку произошел в 2013 году, когда была установлена связь между мутациями в гене GNAO1 и орфанным неврологическим расстройством. Данное генетическое заболевание, получившее название GNAO1-энцефалопатии, проявляется в младенчестве и характеризуется эпилептической энцефалопатией (OMIM 615473) и/или нарушением развития мозга с непроизвольными движениями (OMIM 617493) [3]. В настоящее время описано 89 клинически значимых мутаций гена GNAO1, все они проявляются в гетерозиготном состоянии и возникают у пациентов de novo [4]. На сегодняшний день в России зарегистрировано уже как минимум 9 таких пациентов [5]. Лечения для GNAO1-энцефалопатии не существует, а симптоматическая терапия, включающая назначение антиконвульсантов, препаратов для снятия гиперкинеза и глубокую стимуляцию мозга, эффективна не для всех пациентов. Ситуация осложняется фенотипической гетерогенностью заболевания, вызванной разным влиянием конкретных мутаций на функцию Gao и опосредованную им нейрональную передачу [6, 7]. Разработка генной терапии для ультраредких заболеваний, таких как GNAO1 -энцефалопатия, осложняется слабым пониманием молекулярных механизмов ее развития. За последнее время клинически значимые мутации GNAO1 были классифицированы как мутации с потерей функции [8], с усилением функции [9], доминантно-

негативные [10] и неоморфные [11], что указывает на различный молекулярный патогенез и подчеркивает необходимость персонализированной медицины. Одна из наиболее тяжелых и распространенных форм GNAO1-энцефалопатии вызывается мутацией GNAO1 c.607G>A (p.G203R). Эта замена встречается у ~10% пациентов и вызывает комплексный фенотип включающий как раннюю младенческую эпилепсию, так и нарушение развития мозга сопровождающееся двигательным расстройством, что в конечном итоге приводит к летальному исходу [6, 7]. Проблема расшифровки патомеханизма мутации GNAO1 c.607G>A (p.G203R) заключается в отсутствии подходящей модели. Линия мышей, несущая гетерозиготную мутацию c.607G>A, демонстрирует тяжелую неонатальную летальность [12]. Частично фенотипическое проявление мутации было изучено на моделях Caenorhabditis elegans [13] и Drosophila melanogaster [14]. Нейроны, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) пациента, демонстрировали аберрантную дифференцировку и сниженную чувствительность к нейромедиаторам [15]. Однако прямая связь экспрессии Gao-G203R с развитием патогенеза была показана преимущественно в моделях на клетках HEK293T [8, 9] и лишь одно исследование продемонстрировало доминантно-негативный эффект Gao-G203R на нейронах стриатума мыши [10].

Новые модели GNAO1-энцефалопатии позволят глубже понять молекулярный механизм заболевания и расширить представление о функции белка Gao, что поможет усовершенствовать симптоматическое лечение и в перспективе разработать генную терапию данного заболевания.

Для доминантно-негативных мутаций, неоморфных и мутаций с усилением функции потенциально может быть применим подход связанный с супрессией мутантного транскрипта. Ранее в нашей лаборатории был разработан подход аллель-селективного подавления

экспрессии патогенного варианта GNAO1 c.607G>A (p.G203R) на основе механизма РНК-интереференции [16, 17]. В качестве вектора для доставки РНК-эффектора в нейроны пациента могут быть использованы рекомбинантные аденоассоциированные вирусы. Однако потенциальные нецелевые эффекты прототипа препарата генной терапии требуют тщательного изучения в in vitro и in vivo моделях.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы является исследовать молекулярные механизмы GNAO1-энцефалопатии, вызванной мутацией GNAO1 c.607G>A (p.G203R), и разработать прототип препарата генной терапии для этого заболевания.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Оценить влияние мутации GNAO1 c.607G>A (p.G203R) на способность Gao к суперактивации аденилатциклазы в клетках HEK293T.

2. Разработать in vitro модель GNAO1-энцефалопатии на основе первичной нейрональной культуры мыши.

3. Изучить влияние мутантного белка Gao-G203R на функционирование нейронов первичной культуры мыши.

4. Выявить нецелевое воздействие прототипа препарата генной терапии на основе аденоассоциированного вируса на пациент-специфические нейроны in vitro.

5. Охарактеризовать линию мышей Gnao1em1Mvb с гуманизированным участком Gnaol .

6. Оценить нецелевое воздействие прототипа препарата генной терапии на экспрессию аллели дикого типа в мышиной модели с гуманизированным участком Gnaol.

Научная новизна и практическая значимость исследования

В данной работе мы применили рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (rAAV) для исследования GNAO1-энцефалопатии в двух направлениях. Во-первых, с их помощью была создана in vitro модель данного заболевания, основанная на оверэкспрессии мутантного белка Gao-G203R в здоровых первичных нейронах мыши. Это позволило подтвердить доминантно-негативное проявление мутации и установить прямую связь между экспрессией мутантного белка и нарушением функциональной активности нейронов. Во-вторых, на основе rAAV был разработан прототип препарата, направленный на специфическое подавление мутантного транскрипта в клетках головного мозга пациентов. До настоящего времени не сообщалось об исследовании аналогичного подхода генной терапии для GNAOl-энцефалопатии. Таким образом, полученные результаты закладывают основу для разработки терапии с использованием rAAV для лечения этой патологии, а также могут быть адаптированы для других орфанных заболеваний, связанных с доминантно-негативными мутациями.

Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием методов молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологии, клеточной биологии и биоинформатики. Генетические конструкции, использованные в исследовании, были получены методом молекулярного клонирования. Для определения целевых нуклеотидных последовательностей использовали метод секвенирования по Сэнгеру. Анализ синтеза цАМФ выполнен с помощью молекулярного внутриклеточного сенсора. Для доставки генетических конструкций в клетки и ткани использовали трансфекцию и AAV-трансдукцию. Для анализа транскриптов использовали полимеразную

цепную реакцию с обратной транскрипцией. Для анализа экспрессии белков и их локализации использовали вестерн-блоттинг и иммунофлуоресцентное окрашивание клеточных культур и тканей. Для оценки функциональной активности нейронов использовали метод визуализации внутриклеточного кальция. Для изучения нецелевых эффектов AAV-препаратов in vitro использовался биоинформатический анализ результатов высокопроизводительного секвенирования. Достоверность результатов диссертации обеспечивается корректным проведением экспериментов и статистической обработки данных.

Положения выносимые на защиту

1. Мутация GNAO1 c.607G>A (p.G203R) приводит к потере способности Gao суперактивировать аденилатциклазу.

2. C использованием аденоассоциированных вирусов серотипа DJ получена in vitro модель GNAO1-энцефалопатии на первичной культуре здоровых нейронов мыши.

3. Белок Gao с мутацией G203R проявляет доминатно-негативный эффект, нарушая нейрональную активность.

4. Прототип препарата генной терапии, направленный на супрессию варианта GNAO1 c.607G>A, вызывает непреднамеренные изменения в транскриптоме пациент-специфических нейронов, связанные с нецелевой активностью РНК-эффектора, запуском РНК-интерференции и вирусной трансдукцией.

5. Гуманизация участка гена Gnaol у мышей линии Gnao1em1Mvb не влияет на экспрессию отредактированной аллели, что делает модель пригодной для тестирования безопасности сиквенс-специфической терапии.

6. Прототип препарата генной терапии, направленный на подавление патогенного варианта GNAOl c.607G>A, не влияет на экспрессию

аллели дикого типа в линии мышей GnaoF™11^ гуманизированным участком Gnaol.

Апробация результатов

Основные положения и выводы исследования изложены в 5 статьях в международных рецензируемых научных изданиях, индексируемых в базах данных WoS, Scopus, РИНЦ и входящих в Белый список. Материалы работы представлены на 6 российских и международных научных конференциях. С использованием результатов исследования, было зарегистрировано 2 патента.

Публикации:

1. Лунев Е.А., Шмидт А.А., Васильева С.Г., Савченко И.М., Логинов В.А., Марина В.И., Егорова Т.В., Бардина М.В. Эффективная вирусная доставка в нейрональную культуру генетических конструкций для моделирования и генной терапии GNAOl-энцефалопатии // Молекулярная биология. — 2022. — т. 56. № 4. с. 604-618.

2. Lunev E., Karan A., Egorova T., Bardina M. Adeno-Associated Viruses for Modeling Neurological Diseases in Animals: Achievements and Prospects // Biomedicines. — 2022. — Vol. 10. — Adeno-Associated Viruses for Modeling Neurological Diseases in Animals. — No. 5. — P. 1140.

3. Polikarpova A.V., Egorova T.V., Lunev E.A., Tsitrina A.A., Vassilieva S.G., Savchenko I.M., Silaeva Y.Y., Deykin A.V., Bardina M.V. CRISPR/Cas9-generated mouse model with humanizing single-base substitution in the Gnao1 for safety studies of RNA therapeutics // Frontiers in Genome Editing. — 2023. — Vol. 5. — P. 1034720.

4. Klementieva N.V., Lunev E.A., Shmidt A.A., Loseva E.M., Savchenko I.M., Svetlova E.A., Galkin I.I., Polikarpova A.V., Usachev E.V., Vassilieva S.G., Marina V.I., Dzhenkova M.A., Romanova A.D., Agutin A.V., Timakova A.A.,

Reshetov D.A., Egorova T.V., Bardina M.V. RNA Interference Effectors Selectively Silence the Pathogenic Variant GNAO1 c.607 G>A In Vitro // Nucleic Acid Therapeutics. — 2024. — Vol. 34. — No. 2. — P. 90-99. 5. Lunev E.A., Klementieva N.V., Vassilieva S.G., Volovikov E.A., Jappy D., Savchenko I.M., Svetlova E.A., Polikarpova A.V., Shubina M.Y., Spirin D.M., Anufrieva K.S., Lebedev P.R., Pokrovsky V.M., Utkina M.V., Krut' V.G., Sintsov M., Popov S., Deykin A.V., Rozov A., Egorova T.V., Bardina M.V. Development of an AAV-RNAi strategy to silence the dominant variant GNAO1 c.607G>A linked to encephalopathy // Gene Therapy. — 2025. Apr 14.

Выступления на конференциях:

1. Lunev E, Vassilieva S, Shlyk V, Shmidt A, Egorova T, Bardina M Development of adeno-associated virus vectors as a tool for the GNAOl-related encephalopathy modeling // Neurogenetics (Nature Conferences). — Нью-Йорк, США, 29 июля, 2020 (онлайн), С. 10.

2. Lunev E.A., Luchkina E.A., Savchenko I.M., Velyaev O.A., Loginov V.A., Polikarpova A.V., Vassilieva S.G., Egorova T.V., Bardina M.V. In vitro GNAOl-encephalopathy model development using recombinant adeno-associated viruses // BIO Tech World 2020. Biotechnology: state of the art and perspectives. — Москва, Россия, 28-30 октября, 2020, C.99.

3. Lunev E.A., Vassilieva S.G, Shmidt A.A., Egorova T. V., Bardina M. V. Comparative analysis of adeno-associated virus serotypes for in vitro assessment of GNAO1 encephalopathy gene therapy // OpenBIO 2021. — Новосибирск, Россия, 5-8 октября, 2021, С. 32.

4. Лунев Е.А., Клементьева Н.В., Савченко И.М., Карань А.А., Дженкова М.А., Егорова Т.В., Бардина М.В. Генная терапия на основе микроРНК для GNAO1-энцефалопатии с доминантнонегативным вариантом с.607 G>A // V Национальный конгресс по регенеративной медицине. — Москва, Россия, 23-25 ноября, 2022, С. 137.

5. Лунев Е.А., Клементьева Н.В., Васильева С.Г., Поликарпова А.В., Шмидт А.А., Воловиков Е.А., Егорова Т.В., Дейкин А.В., Бардина М.В Генная терапия на основе AAV-RNAi для GNAOl-энцефалопатии вызванной доминантной мутацией c.607 G>A // НЕЙРОКАМПУС 2023: ЭВОЛЮЦИЯ. НЕЙРОТЕХНОЛОГИИ БУДУЩЕГО. — Иркутск, Россия, 19-24 августа, 2023, С. 55.

6. Лунев Е.А., Воловиков Е.А., Попов С.В., Егорова Т.В., Бардина М.В. Инвертированные концевые повторы аденоассоциированного вируса демонстрируют промоторную активностью в ГАМКергических нейронах in vitro // OpenBio 2024. — Новосибирск, Россия, 24-27 сентября, 2024, С. 175.

Патенты:

1. Патент № RU2777663C1. Количественный метод определения экспрессии аллелей GNAO1 здоровой формы и с мутацией c.607 G>A: : опубл. 08.08.2022 / Лунев Е.А., Савченко И.М., Бардина М.В, Поликарпова А.В.

2. Патент № RU2816137C1. Двухцепочечная РНК, способная снижать экспрессию мутантного аллеля ^607G>A гена GNAO1 человека: : опубл. 26.03.2024 / Бардина М.В, Клементьева Н.В., Светлова Е.А., Лунев Е.А.

Личное участие автора в проведении исследования

Автор внес основной вклад в получение и анализ представленных в работе результатов. Личный вклад соискателя включает анализ литературных источников, планирование и проведение экспериментов, обработку и интерпретацию полученных данных, подготовку публикаций, а также представление результатов на российских и международных конференциях. Анализ экспрессии методом кПЦР был выполнен совместно с Савченко Ириной Михайловной (ООО "Марлин Биотех"). Культуры пациент-специфических ГАМКергических нейронов были предоставлены

Воловиковым Егором Алексеевичем (ФНКЦ физико-химической медицины им. Ю.М. Лопухина). Изображения субмембранной локализации оверэкспрессированного Gao в клетках HEK293T были подготовлены Галкиным Иваном Ильичем (ИБГ РАН). Иммунофлуоресцентное окрашивание первичной нейрональной культуры и срезов головного мозга было выполнено совместно с Васильевой Светланой Геннадьевной (ИБГ РАН). Очищенные препараты рекомбинантных аденоассоциированных вирусов были предоставлены компанией ООО "Марлин Биотех". Внутривенное введение вирусных препаратов выполнены Поликарповой Анной Владимировной (ИБГ РАН). Имена соавторов, участвовавших в проведении экспериментов, указаны в соответствующих опубликованных работах.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает разделы: список сокращений, введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, заключение, список литературы из 137 источников, 2 приложения. Работа состоит из 140 страниц машинописного текста, содержит 30 рисунков, 1 таблицу.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

GNAOl-энцефалопатия была впервые описана в 2013 году, когда с помощью высокопроизводительного секвенирования у пациентов с тяжелыми неврологическими синдромами были выявлены гетерозиготные de novo мутации в гене GNAO1 [3]. Это заболевание проявляется уже в младенчестве и сопровождается эпилептической энцефалопатией и/или нарушением развития с непроизвольными движениями. Механизмы патогенеза остаются слабо изученными, и на сегодняшний день не существует эффективного лечения этой патологии. Настоящее исследование посвящено одной из наиболее частых мутаций GNAO1 c.607G>A (p.G203R).

1.1. Ген GNAO1 и функции белка Gao в норме

Ген GNAO1 расположен на 16 хромосоме (16q13) и кодирует гуанин-нуклеотид-связывающую субъединицу Gao, которая совместно с GP и Gy субъединицами формирует гетеротримерный G-белок. GNAO1 экспрессируется преимущественно в мозге, где доля белка Gao может составлять до 1% от всех мембранных белков [2]. Gao широко представлен в коре головного мозга, полосатом теле, таламусе, черной субстанции и в клетках Пуркинье мозжечка [18]. В белке Gao выделяют две ключевые области: P-loop и switch-регионы (Рис. 1). P-loop, или фосфат-связывающая петля, представляет собой консервативную область, которая участвует в связывании и гидролизе гуанозинтрифосфата (ГТФ), являясь важным элементом в активации G-белка. В свою очередь, switch-регионы представляют собой подвижные участки белка, роль которых заключается в изменении конформации в зависимости от состояния связанного нуклеотида [19, 20].

Рисунок 1. Схема структуры белка Gao на примере его вторичной последовательности. Черными рамками обозначены домены белка: P-loop является консервативной областью связывания гуанин-нуклеотида, а switch-регионы представляют собой подвижные участки, изменяющие конформацию в зависимости от состояния связанного нуклеотида. Фиолетовым треугольниками отмечены аминокислотные остатки, участвующие в связывании гуанин-нуклеотида. Желтыми рамками выделены аминокислотные остатки, обладающие каталитической активностью. Функциональная аннотация аминокислотных остатков основана на информации из базы данных PDBsum [21], полученной для структуры белка Gao с идентификатором PDB 3C7K.

Белок Gao принадлежит к классу Gai/o, который является одним из четырех основных классов Ga субъединиц у млекопитающих, наряду с классами Gaq/11, Gas и Ga12/13. Классификация основывается на различиях в аминокислотной последовательности, функциональных свойствах и взаимодействиях с эффекторами. Классически считается, что белки класса Gai/o способны ингибировать аденилатциклазу (АЦ), что приводит к снижению уровня циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) в клетке. В отличие от них, субъединицы класса Gas активируют АЦ, приводя к увеличению концентрации этого вторичного мессенджера. Белки класса Gaq/11 регулируют активность фосфолипазы C, что способствует расщеплению фосфатидилинозитолдифосфата и образованию инозитолтрифосфата и диацилглицерола, которые играют важную роль во внутриклеточном сигналинге. Субъединицы класса Ga12/13 активируют Rho ГТФазы и влияют на реорганизацию цитоскелета и процессы клеточной миграции [1].

Белок Gao взаимодействует с дофаминовым D2, a2A-адренергическим, мускариновым M2, аденозиновым А1, ^-опиоидным и GABAb GPCR-рецепторами [22]. Подобно другим G-субъединицам, в неактивном состоянии Gao связан с ГДФ и образует комплекс с субъединицами Gßy и с GPCR (Рис. 2). Активация GPCR нейромедиатором индуцирует обмен ГДФ на ГТФ в активном сайте Gao, что приводит к изменению конформации белка и диссоциации гетеротримерного комплекса. Активированный Gao и димер Gßy передают сигнал от рецептора к первичным эффекторам. Гидролиз ГТФ возвращает субъединицу Gao в неактивную форму и приводит к реассоциации гетеротримерного комплекса, который вновь взаимодействует с GPCR. Процесс гидролиза ГТФ контролируется белками регуляторами сигнализации G-белков (RGS). G-белок остается неактивным до тех пор, пока цикл не инициируется снова [20].

Прямые функции Gao плохо изучены, однако известно, что этот белок задействован в регуляции ионных каналов, АЦ и ГТФаз в комплексе Гольджи (Рис. 2).

Gao участвует в регуляции уровня цАМФ, однако установлено, что Gao не взаимодействует напрямую с АЦ, ферментом, катализирующим синтез цАМФ, а опосредованно контролирует этот процесс, регулируя доступность Gßy субъединиц для связывания с этим ферментом. Тем самым, Gao модулирует синтез цАМФ двумя основными путями. Во-первых, связывание Gßy с АЦ усиливает стимуляцию фермента, опосредованную белками класса Gas. Это позволяет нейронам регулировать чувствительность к стимулирующим воздействиям, которые запускают выработку цАМФ. Во-вторых, комплекс Gßy с АЦ снижает ингибирующий эффект Gai-субъединицы, что способствует более гибкой регуляции синтеза цАМФ в нейронах. Таким образом, хотя Gao и не регулирует напрямую активность АЦ, его функция заключается в контроле синтеза цАМФ, обеспечивая тонкую настройку обработки сигналов от ингибирующих белков класса Gai и стимулирующих белков класса Gas [10]. Было обнаружено, что стимуляция рецепторов, сопряженных с Gai/o, продолжительностью от нескольких часов до суток приводит к значительному усилению активности АЦ, что вызывает увеличение синтеза цАМФ. Такой адаптивный клеточный ответ получил название гетерологичная сенсибилизация аденилатциклазы. В научной литературе для обозначения этого эффекта также используются термины суперактивация, сенсибилизация и суперсенсибилизация аденилатциклазы. Этот эффект наиболее выраженно наблюдается при активации Gai/o-ассоциированных рецепторов с последующей прямой активацией АЦ форсколином, фармакологическим активатором, стимулирующим АЦ независимо от рецепторного сигнала [23]. Впервые о гетерологичной сенсибилизации посредством дельта-опиоидного рецептора было сообщено

в 1975 году [24]. С тех пор это свойство было продемонстрировано для ряда GPCR и считается сигнальным событием, общим для большинства Gai/o-связанных рецепторов [23]. Однако, несмотря на многочисленные исследования, молекулярные механизмы и биологическое значение сенсибилизации аденилатциклазы остаются не раскрытыми.

Было показано, что субъединицы G^y, высвобождаемые Gao, активируют управляемые G-белком калиевые каналы внутреннего выпрямления и ингибируют потенциалзависимые кальциевые каналы (Cav2), тем самым контролируя возбудимость нейронов и регулируя высвобождение нейромедиаторов в синаптическую щель [25, 26].

Было обнаружено, что Gao локализуется в клетке как на плазматической мембране, так и в комплексе Гольджи, где этот белок связывается в мономерной форме с GPCR-подобным рецептором KDEL. Активация этого рецептора приводит к высвобождению Gao, который, в свою очередь, активирует малые ГТФазы Rabí и Rab3. Было показано, что Gao локализованный на плазматической мембране инициирует образование аксона, в то время как пул Gao в комплексе Гольджи обеспечивает везикулярный транспорт для его роста. Таким образом, согласованная активность этих двух пулов Gao играет важную роль в нейрогенезе [27, 28] Исследование интерактома выявило более 250 потенциальных молекулярных партнеров для белка Gao. Анализ идентифицированных молекулярных путей предполагает участие Gao в таких процессах как: образование синапсов, асимметричное клеточное деление, регуляция эндоцитоза, организация цитоскелета и клеточная адгезия [27]

Рисунок 2. Общая схема молекулярных каскадов в нейронах в которых задействован Gao. GIRK - калиевый канал внутреннего выпрямления, сопряженный с G-белками; Cav - потенциалзависимый кальциевый канал; АЦ - аденилатциклаза; RGS - регулятор сигнализации G-белков.

1.2. GNAOl-энцефалопатия: общие сведения

GNAO1 ассоциированная энцефалопатия является моногенным орфанным неврологическим заболеванием, вызванным гетерозиготными de novo мутациями с доминантным проявлением в гене GNAO1. Первые четыре пациента с мутациями в гене GNAO1 и тяжелой эпилептической энцефалопатией развития были описаны в 2013 году. У троих детей был диагностирован синдром Отахара, который характеризуется эпилепсией с ранним началом, тоническими спазмами и характерным паттерном «вспышка-подавление» на электроэнцефалографии, при котором периоды высокой электрической активности чередуются с фазами подавления. У

двух пациентов были выявлены нарушения движения. У одного отмечалась дистония, которая проявляется непроизвольными мышечными сокращениями и приводит к аномальным позам и движениям. У другого наблюдалась хорея, которая характеризуется хаотичными, неритмичными подергиваниями, сочетающаяся с атетозом, при котором возникают медленные, извивающиеся движения конечностей [3].

На 2025 год описано 89 патогенных мутаций в гене GNAO1 [4] (Рис. 3), а число описанных в научных публикациях пациентов с GNAO1-энцефалопатией превышает 250 [6]. При этом около 50% всех зарегистрированных случаев приходится на замены аминокислотных остатков р^203, р^209 и р.Е246, а также на интронную мутацию с.724-8G>A [7]. В России диагностировано девять пациентов, у шести из которых была обнаружена мутация p.G203R и по одному пациенту с мутациями p.Q52R, p.R162Q и p.D238Q [5]. В настоящее время ген GNAO1 вошел в диагностические панели для наследственных эпилепсий и двигательных расстройств как в России [29], так и за рубежом [30]. Поэтому число зарегистрированных пациентов продолжает стремительно расти. GNAO1-энцефалопатия проявляется уже в младенчестве и характеризуется спектром тяжелых неврологических синдромов, таких как задержка развития, эпилепсия с ранним дебютом и гиперкинезы [6, 7, 31]. Изначально считалось, что одна группа мутаций проявляется в виде эпилептической энцефалопатии (Е1ЕЕ17, ОМ1М 615473), вторая группа мутаций приводит к нарушениям развития мозга с непроизвольными движениями (ОМ1М 617493), в то время как третья группа мутаций вызывает комбинированный фенотип [32]. Однако с увеличением числа зарегистрированных случаев эта классификация утратила актуальность, и в настоящее время корреляция между генотипом и неврологическим фенотипом остается неопределенной [33]. У 56% пациентов с GNAO1-энцефалопатией наблюдались только гиперкинезы, у 32% пациентов наблюдался комплексный фенотип,

включающий как гиперкинезы, так и раннюю детскую эпилепсию, у 10% проявлялись только эпилептические приступы и 2% пациентов имели неуточненное нарушение нервного развития и/или другие фенотипические проявления. Помимо неврологических синдромов, у нескольких пациентов наблюдались аномалии почек и глаз, а также психические расстройства, такие как синдром дефицита внимания с гиперактивностью, обсессивно-компульсивное расстройство, тревога. Во время обострения двигательных дисфункций у части пациентов наблюдалось нарушение терморегуляции с интенсивным потоотделением. GNAO1-энцефалопатия характеризуется высокой смертностью. К настоящему времени около 9% пациентов умерли вследствие различных осложнений, включая неврологические нарушения, обострение гиперкинезов, дыхательную недостаточность или по неустановленным причинам. Средний возраст наступления смерти составляет около 2-3 лет. У выживших пациентов с возрастом наблюдаются регресс моторных навыков и прогрессирование тяжести двигательных нарушений [5-7, 31, 34].

200

300

-г~

400

500

I

600

I

700

т

900

-1-

1,000

100

IQ52P/R |T48I/N (S47N |K46N |К46Е |G45R/* |S44P

|G42R |Y74D |c.H9-2_119-ldel |S6I II19M |G40R/A/W/E/V |G2R|L13P |L39_G40insV

I

|E217K |S207F/Y

|R206L |N242T

|R206G |c.724-8G>A |L284S

IQ205P IY231C |S282P

|G203R/E |S229R |K278del

|G184R |R209C/G/H/L |D273G/V

|D174G |D201V |L228P |K271N G352S |

|T171fs |D201Y |A227V |l254fs |I279N |D328G

|P170R |L199P |A221D |E246K/Q/G/V |D328Y

|Y168D HT191_F197del |M244K |N270K F336fs |

Iс.464+1G>A/+2T>C |K211Q |c.723+lG>A/+lG>T/+2T>A/+4089del ID151N |L176Q |c.593+lG>A |E237K |N270H |Y291N I344del I |S135fs |L157P |T182I |G204R |V226fs |F251I |D273Y D341del |

GNA01 CDS

P-loop

Switch I Switch II Switch I

Рисунок 3. Белок-кодирующая последовательность гена GNAO1 с отмеченными патогенными мутациями, зарегистрированными в базе данных ClinVar на 2025 год. Горячие точки мутаций выделены розовым цветом. Внизу схемы обозначены домены белка Gao.

Лечение GNAO1-энцефалопатии является симптоматическим и поддерживающим, поскольку в настоящее время еще не разработан подход, воздействующий на молекулярные механизмы этого заболевания. Терапия может включать назначение противоэпилептических препаратов для контроля судорог. При этом выбор лекарства зависит от типа судорог и индивидуальной реакции пациента на лечение [6, 7, 31, 35]. Противоэпилептические препараты, как правило, снижают возбудимость нейронов. Они действуют через различные механизмы, такие как блокада натриевых или кальциевых каналов, усиление активности тормозных ГАМКергических путей или снижение глутаматергической передачи. Для купирования двигательных расстройств наиболее часто применяют тетрабеназин, который снижает уровень дофамина в синаптической щели за счет подавления транспорта моноаминов в везикулы. В некоторых случаях дополнительно назначают тригексифенидил, обладающий антихолинергическим действием, поскольку он блокирует мускариновые ацетилхолиновые рецепторы. Также могут использоваться бензодиазепины, которые усиливают тормозную активность нейронов путем повышения чувствительности ГАМК-рецепторов к гамма-аминомасляной кислоте. Выбор конкретного препарата или их комбинации зависит от выраженности симптомов и клинического ответа [6, 7, 31, 35]. В некоторых тяжелых случаях применяется глубокая стимуляция мозга путем имплантации устройства, которое посылает электрические импульсы в определенные области мозга [36]. Физиотерапия может помочь улучшить двигательные навыки, силу и координацию. Занятия с логопедом направлены на исправление проблем с речью и общением. Также пациентам назначают специальные диеты [6, 7, 31, 35]. Сообщается, что ежедневный пероральный прием ацетата цинка привел к существенному улучшению состояния пациента с мутацией c.607G>A (p.G203R) [37]. Предполагаемый

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лунев Евгений Андреевич, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Krishnan A., Mustafa A., Almén M.S., Fredriksson R., Williams M.J., Schiöth H.B. Evolutionary hierarchy of vertebrate-like heterotrimeric G protein families // Molecular Phylogenetics and Evolution. — 2015. — Vol. 91. — P. 27-40.

2. Sternweis P.C., Robishaw J.D. Isolation of two proteins with high affinity for guanine nucleotides from membranes of bovine brain // The Journal of Biological Chemistry. — 1984. — Vol. 259. — No. 22. — P. 13806-13813.

3. Nakamura K., Kodera H., Akita T., Shiina M., Kato M., Hoshino H., Terashima H., Osaka H., Nakamura S., Tohyama J., Kumada T., Furukawa T., Iwata S., Shiihara T., Kubota M., Miyatake S., Koshimizu E., Nishiyama K., Nakashima M., Tsurusaki Y., Miyake N., Hayasaka K., Ogata K., Fukuda A., Matsumoto N., Saitsu H. De Novo mutations in GNAO1, encoding a Gao subunit of heterotrimeric G proteins, cause epileptic encephalopathy // American Journal of Human Genetics. — 2013. — Vol. 93. — No. 3. — P. 496-505.

4. gnao1[gene] - ClinVar - NCBI. — URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/?term=gnao1%5Bgene%5D&redir=gene (дата обращения: 11.02.2025).

5. Bobylova M.Y., Volkov I.V., Gumennik E.V., Rachmanina O.A., Abramov M.O., Volkova O.K., Bayborina T.S., Petrukhin A.S. [Encephalopathy GNAO1] // Zhurnal Nevrologii I Psikhiatrii Imeni S.S. Korsakova. — 2023. — Vol. 123.

— No. 1. — P. 122-130.

6. Lasa-Aranzasti A., Larasati Y.A., da Silva Cardoso J., Solis G.P., Koval A., Cazurro-Gutiérrez A., Ortigoza-Escobar J.D., Miranda M.C., De la Casa-Fages B., Moreno-Galdó A., Tizzano E.F., Gómez-Andrés D., Verdura E., Katanaev V.L., Pérez-Dueñas B., Study Group of GNAO1 patients from Spain Clinical and Molecular Profiling in GNAO1 Permits Phenotype-Genotype Correlation // Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society.

— 2024. — Vol. 39. — No. 9. — P. 1578-1591.

7. Novelli M., Galosi S., Zorzi G., Martinelli S., Capuano A., Nardecchia F., Granata T., Pollini L., Di Rocco M., Marras C.E., Nardocci N., Leuzzi V. GNAOl-related movement disorder: An update on phenomenology, clinical course, and response to treatments // Parkinsonism & Related Disorders.

— 2023. — Vol. 111. — GNAOl-related movement disorder. — P. 105405.

8. Knight K.M., Obarow E.G., Wei W., Mani S., Esteller M.I., Cui M., Ma N., Martin S.A., Brinson E., Hewitt N., Soden G.M., Logothetis D.E., Vaidehi N., Dohlman H.G. Molecular annotation of G protein variants in a neurological disorder // Cell Reports. — 2023. — Vol. 42. — No. 12. — P. 113462.

9. Feng H., Sjögren B., Karaj B., Shaw V., Gezer A., Neubig R.R. Movement disorder in GNAO1 encephalopathy associated with gain-of-function mutations // Neurology. — 2017. — Vol. 89. — No. 8. — P. 762-770.

10. Muntean B.S., Masuho I., Dao M., Sutton L.P., Zucca S., Iwamoto H., Patil D.N., Wang D., Birnbaumer L., Blakely R.D., Grill B., Martemyanov K.A. Gao is a major determinant of cAMP signaling in the pathophysiology of movement disorders // Cell Reports. — 2021. — Vol. 34. — No. 5. — P. 108718.

11. Katanaev V.L., Valnohova J. Molecular biomarkers in GNAO1 encephalopathies // Neural Regeneration Research. — P. 10.4103/NRR.NRR.

12. Silachev D., Koval A., Savitsky M., Padmasola G., Quairiaux C., Thorel F., Katanaev V.L. Mouse models characterize GNAO1 encephalopathy as a neurodevelopmental disorder leading to motor anomalies: from a severe G203R to a milder C215Y mutation // Acta Neuropathologica Communications.

— 2022. — Vol. 10. — Mouse models characterize GNAO1 encephalopathy as a neurodevelopmental disorder leading to motor anomalies. — No. 1.

— P. 9.

13. Wang D., Dao M., Muntean B.S., Giles A.C., Martemyanov K.A., Grill B. Genetic modeling of GNAO1 disorder delineates mechanisms of Gao dysfunction // Human Molecular Genetics. — 2022. — Vol. 31. — No. 4.

— P. 510-522.

14. Larasati Y.A., Savitsky M., Koval A., Solis G.P., Valnohova J., Katanaev V.L. Restoration of the GTPase activity and cellular interactions of Gao mutants by Zn2+ in GNAO1 encephalopathy models // Science Advances. — 2022.

— Vol. 8. — No. 40. — P. eabn9350.

15. Benedetti M.C., D'andrea T., Colantoni A., Silachev D., de Turris V., Boussadia Z., Babenko V.A., Volovikov E.A., Belikova L., Bogomazova A.N., Pepponi R., Whye D., Buttermore E.D., Tartaglia G.G., Lagarkova M.A., Katanaev V.L., Musayev I., Martinelli S., Fucile S., Rosa A. Cortical neurons obtained from patient-derived iPSCs with GNAO1 p.G203R variant show altered differentiation and functional properties // Heliyon. — 2024. — Vol. 10.

— No. 5. — P. e26656.

16. Klementieva N.V., Lunev E.A., Shmidt A.A., Loseva E.M., Savchenko I.M., Svetlova E.A., Galkin I.I., Polikarpova A.V., Usachev E.V., Vassilieva S.G., Marina V.I., Dzhenkova M.A., Romanova A.D., Agutin A.V., Timakova A.A., Reshetov D.A., Egorova T.V., Bardina M.V. RNA Interference Effectors Selectively Silence the Pathogenic Variant GNAO1 c.607 G>A In Vitro // Nucleic Acid Therapeutics. — 2024. — Vol. 34. — No. 2. — P. 90-99.

17. Lunev E.A., Klementieva N.V., Vassilieva S.G., Volovikov E.A., Jappy D., Savchenko I.M., Svetlova E.A., Polikarpova A.V., Shubina M.Y., Spirin D.M., Anufrieva K.S., Lebedev P.R., Pokrovsky V.M., Utkina M.V., Krut' V.G., Sintsov M., Popov S., Deykin A.V., Rozov A., Egorova T.V., Bardina M.V. Development of an AAV-RNAi strategy to silence the dominant variant GNAO1 c.607G>A linked to encephalopathy // Gene Therapy. — 2025.

18. Polikarpova A.V., Egorova T.V., Lunev E.A., Tsitrina A.A., Vassilieva S.G., Savchenko I.M., Silaeva Y.Y., Deykin A.V., Bardina M.V. CRISPR/Cas9-generated mouse model with humanizing single-base substitution in the Gnao1 for safety studies of RNA therapeutics // Frontiers in Genome Editing. — 2023.

— Vol. 5. — P. 1034720.

19. Bosch D.E., Willard F.S., Ramanujam R., Kimple A.J., Willard M.D., Naqvi

N.I., Siderovski D.P. A P-loop Mutation in Ga Subunits Prevents Transition to the Active State: Implications for G-protein Signaling in Fungal Pathogenesis // PLoS Pathogens. — 2012. — Vol. 8. — A P-loop Mutation in Ga Subunits Prevents Transition to the Active State. — No. 2. — P. e1002553.

20. Hilger D., Masureel M., Kobilka B.K. Structure and dynamics of GPCR signaling complexes // Nature Structural & Molecular Biology. — 2018.

— Vol. 25. — No. 1. — P. 4-12.

21. Laskowski R.A. PDBsum: summaries and analyses of PDB structures // Nucleic Acids Research. — 2001. — Vol. 29. — PDBsum. — No. 1.

— P. 221-222.

22. Wettschureck N., Offermanns S. Mammalian G proteins and their cell type specific functions // Physiological Reviews. — 2005. — Vol. 85. — No. 4.

— P. 1159-1204.

23. Brust T.F., Conley J.M., Watts V.J. Gai/o-coupled receptor-mediated sensitization of adenylyl cyclase: 40 years later // European journal of pharmacology. — 2015. — Vol. 763. — Gai/o-coupled receptor-mediated sensitization of adenylyl cyclase. — No. 0 0. — P. 223-232.

24. Sharma S.K., Klee W.A., Nirenberg M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1975. — Vol. 72.

— No. 8. — P. 3092-3096.

25. Logothetis D.E., Y K., J G., Ej N., De C. The beta gamma subunits of GTP-binding proteins activate the muscarinic K+ channel in heart // Nature. — 1987.

— Vol. 325. — No. 6102.

26. Zamponi G.W., Currie K.P.M. Regulation of CaV2 calcium channels by G protein coupled receptors: Calcium Channels // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. — 2013. — Vol. 1828. — No. 7. — P. 1629-1643.

27. Solis G.P., Bilousov O., Koval A., Lüchtenborg A.-M., Lin C., Katanaev V.L. Golgi-Resident Gao Promotes Protrusive Membrane Dynamics // Cell. — 2017.

— Vol. 170. — No. 5. — P. 939-955.e24.

28. Solis G.P., Katanaev V.L. Gao (GNAO1) encephalopathies: plasma membrane vs. Golgi functions // Oncotarget. — 2018. — Vol. 9. — Gao (GNAO1) encephalopathies. — No. 35. — P. 23846-23847.

29. Генетический анализ гена gnaol. — URL: https://www.genotek.ru/diagnostic/genes/gnao1/ (дата обращения: 30.04.2025).

30. Clinical and research tests for gnaol - Genetic Testing Registry (GTR) -NCBI. — URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gtr/all/?term=gnao1 (дата обращения: 30.04.2025).

31. JoJo Yang Q.-Z., Porter B.E., Axeen E.T. GNAOl-related neurodevelopmental disorder: Literature review and caregiver survey // Epilepsy & Behavior Reports. — 2023. — Vol. 21. — GNAO1-related neurodevelopmental disorder. — P. 100582.

32. Feng H., Khalil S., Neubig R.R., Sidiropoulos C. A mechanistic review on GNAO1-associated movement disorder // Neurobiology of Disease. — 2018.

— Vol. 116. — P. 131-141.

33. Thiel M., Bamborschke D., Janzarik W.G., Assmann B., Zittel S., Patzer S., Auhuber A., Opp J., Matzker E., Bevot A., Seeger J., Baalen A. van, Stüve B., Brockmann K., Cirak S., Koy A. Genotype-phenotype correlation and treatment effects in young patients with GNAO1-associated disorders // Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. — 2023. — Vol. 94. — No. 10.

— P. 806-815.

34. Li Y., Chen H., Li L., Cao X., Ding X., Chen L., Cao D. Phenotypes in children with GNAO1 encephalopathy in China // Frontiers in Pediatrics.

— 2023. — Vol. 11. — P. 1086970.

35. Schirinzi T., Garone G., Travaglini L., Vasco G., Galosi S., Rios L., Castiglioni C., Barassi C., Battaglia D., Gambardella M.L., Cantonetti L., Graziola F., Marras C.E., Castelli E., Bertini E., Capuano A., Leuzzi V. Phenomenology and clinical course of movement disorder in GNAO1 variants:

Results from an analytical review // Parkinsonism & Related Disorders. — 2019.

— Vol. 61. — Phenomenology and clinical course of movement disorder in GNAO1 variants. — P. 19-25.

36. Harmsen I.E., Wolff Fernandes F., Krauss J.K., Lozano A.M. Where Are We with Deep Brain Stimulation? A Review of Scientific Publications and Ongoing Research // Stereotactic and Functional Neurosurgery. — 2022. — Vol. 100.

— Where Are We with Deep Brain Stimulation? — No. 3. — P. 184-197.

37. Larasati Y.A., Thiel M., Koval A., Silachev D.N., Koy A., Katanaev V.L. Zinc for GNAO1 encephalopathy: Preclinical profiling and a clinical case // Med.

— 2025. — Vol. 6. — Zinc for GNAO1 encephalopathy. — No. 1.

38. Guan J.-S., Su S.C., Gao J., Joseph N., Xie Z., Zhou Y., Durak O., Zhang L., Zhu J.J., Clauser K.R., Carr S.A., Tsai L.-H. Cdk5 is required for memory function and hippocampal plasticity via the cAMP signaling pathway // PloS One.

— 2011. — Vol. 6. — No. 9. — P. e25735.

39. Mercimek-Mahmutoglu S., Sidky S., Hyland K., Patel J., Donner E.J., Logan W., Mendoza-Londono R., Moharir M., Raiman J., Schulze A., Siriwardena K., Yoon G., Kyriakopoulou L. Prevalence of inherited neurotransmitter disorders in patients with movement disorders and epilepsy: a retrospective cohort study // Orphanet Journal of Rare Diseases. — 2015. — Vol. 10. — Prevalence of inherited neurotransmitter disorders in patients with movement disorders and epilepsy. — P. 12.

40. Solis G.P., Koval A., Valnohova J., Kazemzadeh A., Savitsky M., Katanaev V.L. Neomorphic Gao mutations gain interaction with Ric8 proteins in GNAO1 encephalopathies // The Journal of Clinical Investigation. — 2024. — Vol. 134.

— No. 15. — P. e172057.

41. Mirdita M., Schütze K., Moriwaki Y., Heo L., Ovchinnikov S., Steinegger M. ColabFold: making protein folding accessible to all // Nature Methods. — 2022.

— Vol. 19. — ColabFold. — No. 6. — P. 679-682.

42. Gerasimavicius L., Livesey B.J., Marsh J.A. Loss-of-function, gain-of-

function and dominant-negative mutations have profoundly different effects on protein structure // Nature Communications. — 2022. — Vol. 13. — No. 1.

— P. 3895.

43. Richards S., Aziz N., Bale S., Bick D., Das S., Gastier-Foster J., Grody W.W., Hegde M., Lyon E., Spector E., Voelkerding K., Rehm H.L. Standards and Guidelines for the Interpretation of Sequence Variants: A Joint Consensus Recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genetics in medicine: official journal of the American College of Medical Genetics. — 2015. — Vol. 17.

— Standards and Guidelines for the Interpretation of Sequence Variants.

— No. 5. — P. 405-424.

44. Akamine S., Okuzono S., Yamamoto H., Setoyama D., Sagata N., Ohgidani M., Kato T.A., Ishitani T., Kato H., Masuda K., Matsushita Y., Ono H., Ishizaki Y., Sanefuji M., Saitsu H., Matsumoto N., Kang D., Kanba S., Nakabeppu Y., Sakai Y., Ohga S. GNAO1 organizes the cytoskeletal remodeling and firing of developing neurons // FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. — 2020. — Vol. 34. — No. 12.

— P. 16601-16621.

45. Gerfen C.R., Engber T.M., Mahan L.C., Susel Z., Chase T.N., Monsma F.J., Sibley D.R. D1 and D2 dopamine receptor-regulated gene expression of striatonigral and striatopallidal neurons // Science (New York, N.Y.). — 1990.

— Vol. 250. — No. 4986. — P. 1429-1432.

46. Wang J.-H., Gessler D.J., Zhan W., Gallagher T.L., Gao G. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases // Signal Transduction and Targeted Therapy. — 2024. — Vol. 9. — No. 1. — P. 133.

47. Li C., Samulski R.J. Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy // Nature Reviews. Genetics. — 2020. — Vol. 21. — No. 4.

— P. 255-272.

48. Lopez-Gordo E., Chamberlain K., Riyad J.M., Kohlbrenner E., Weber T. Natural Adeno-Associated Virus Serotypes and Engineered Adeno-Associated Virus Capsid Variants: Tropism Differences and Mechanistic Insights // Viruses.

— 2024. — Vol. 16. — Natural Adeno-Associated Virus Serotypes and Engineered Adeno-Associated Virus Capsid Variants. — No. 3. — P. 442.

49. Grosse S., Penaud-Budloo M., Herrmann A.-K., Börner K., Fakhiri J., Laketa V., Krämer C., Wiedtke E., Gunkel M., Menard L., Ayuso E., Grimm D. Relevance of Assembly-Activating Protein for Adeno-associated Virus Vector Production and Capsid Protein Stability in Mammalian and Insect Cells // Journal of Virology. — 2017. — Vol. 91. — No. 20. — P. e01198-17.

50. Aksu Kuz C., Ning K., Hao S., Cheng F., Qiu J. Role of the membrane-associated accessory protein (MAAP) in adeno-associated virus (AAV) infection // Journal of Virology. — 2024. — Vol. 98. — No. 6. — P. e0063324.

51. Flotte T.R., Afione S.A., Solow R., Drumm M.L., Markakis D., Guggino W.B., Zeitlin P.L., Carter B.J. Expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from a novel adeno-associated virus promoter // The Journal of Biological Chemistry. — 1993. — Vol. 268. — No. 5. — P. 37813790.

52. Flotte T.R., Afione S.A., Conrad C., McGrath S.A., Solow R., Oka H., Zeitlin P.L., Guggino W.B., Carter B.J. Stable in vivo expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator with an adeno-associated virus vector // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1993. — Vol. 90. — No. 22. — P. 10613-10617.

53. Earley L.F., Conatser L.M., Lue V.M., Dobbins A.L., Li C., Hirsch M.L., Samulski R.J. Adeno-Associated Virus Serotype-Specific Inverted Terminal Repeat Sequence Role in Vector Transgene Expression // Human Gene Therapy.

— 2020. — Vol. 31. — No. 3-4. — P. 151-162.

54. Davidsson M., Negrini M., Hauser S., Svanbergsson A., Lockowandt M., Tomasello G., Manfredsson F.P., Heuer A. A comparison of AAV-vector

production methods for gene therapy and preclinical assessment // Scientific Reports. — 2020. — Vol. 10. — No. 1. — P. 21532.

55. Lunev E., Karan A., Egorova T., Bardina M. Adeno-Associated Viruses for Modeling Neurological Diseases in Animals: Achievements and Prospects // Biomedicines. — 2022. — Vol. 10. — Adeno-Associated Viruses for Modeling Neurological Diseases in Animals. — No. 5. — P. 1140.

56. Borel F., Kay M.A., Mueller C. Recombinant AAV as a Platform for Translating the Therapeutic Potential of RNA Interference // Molecular Therapy. — 2014. — Vol. 22. — No. 4. — P. 692-701.

57. Haery L., Deverman B.E., Matho K.S., Cetin A., Woodard K., Cepko C., Guerin K.I., Rego M.A., Ersing I., Bachle S.M., Kamens J., Fan M. Adeno-Associated Virus Technologies and Methods for Targeted Neuronal Manipulation // Frontiers in Neuroanatomy. — 2019. — Vol. 13. — P. 93.

58. Powell S.K., Rivera-Soto R., Gray S.J. Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy // Discovery medicine. — 2015. — Vol. 19. — No. 102. — P. 49-57.

59. Nieuwenhuis B., Haenzi B., Hilton S., Carnicer-Lombarte A., Hobo B., Verhaagen J., Fawcett J.W. Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: comparison of four promoters // Gene Therapy. — 2021. — Vol. 28. — Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract. — No. 1. — P. 56-74.

60. Gray S.J., Foti S.B., Schwartz J.W., Bachaboina L., Taylor-Blake B., Coleman J., Ehlers M.D., Zylka M.J., McCown T.J., Samulski R.J. Optimizing promoters for recombinant adeno-associated virus-mediated gene expression in the peripheral and central nervous system using self-complementary vectors // Human Gene Therapy. — 2011. — Vol. 22. — No. 9. — P. 1143-1153.

61. Yasui H., Matsuzaki Y., Konno A., Hirai H. Global Knockdown of Retinoid-related Orphan Receptor a in Mature Purkinje Cells Reveals Aberrant Cerebellar Phenotypes of Spinocerebellar Ataxia // Neuroscience. — 2021. — Vol. 462.

— P. 328-336.

62. St Martin J.L., Klucken J., Outeiro T.F., Nguyen P., Keller-McGandy C., Cantuti-Castelvetri I., Grammatopoulos T.N., Standaert D.G., Hyman B.T., McLean P.J. Dopaminergic neuron loss and up-regulation of chaperone protein mRNA induced by targeted over-expression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra // Journal of Neurochemistry. — 2007. — Vol. 100. — No. 6.

— P. 1449-1457.

63. Hudry E., Andres-Mateos E., Lerner E.P., Volak A., Cohen O., Hyman B.T., Maguire C.A., Vandenberghe L.H. Efficient Gene Transfer to the Central Nervous System by Single-Stranded Anc80L65 // Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. — 2018. — Vol. 10. — P. 197-209.

64. Hammond S.L., Leek A.N., Richman E.H., Tjalkens R.B. Cellular selectivity of AAV serotypes for gene delivery in neurons and astrocytes by neonatal intracerebroventricular injection // PloS One. — 2017. — Vol. 12. — No. 12.

— P. e0188830.

65. Hudry E., Vandenberghe L.H. Therapeutic AAV Gene Transfer to the Nervous System: A Clinical Reality // Neuron. — 2019. — Vol. 101.

— Therapeutic AAV Gene Transfer to the Nervous System. — No. 5.

— P. 839-862.

66. Maxan A., Sciacca G., Alpaugh M., Tao Z., Breger L., Dehay B., Ling Z., Chuan Q., Cisbani G., Masnata M., Salem S., Lacroix S., Oueslati A., Bezard E., Cicchetti F. Use of adeno-associated virus-mediated delivery of mutant huntingtin to study the spreading capacity of the protein in mice and non-human primates // Neurobiology of Disease. — 2020. — Vol. 141. — P. 104951.

67. Miyazaki Y., Du X., Muramatsu S.-I., Gomez C.M. An miRNA-mediated therapy for SCA6 blocks IRES-driven translation of the CACNA1A second cistron // Science Translational Medicine. — 2016. — Vol. 8. — No. 347.

— P. 347ra94.

68. Herranz-Martin S., Chandran J., Lewis K., Mulcahy P., Higginbottom A.,

Walker C., Valenzuela I.M.-P. y, Jones R.A., Coldicott I., Iannitti T., Akaaboune M., El-Khamisy S.F., Gillingwater T.H., Shaw P.J., Azzouz M. Viral delivery of C9orf72 hexanucleotide repeat expansions in mice leads to repeat-length-dependent neuropathology and behavioural deficits // Disease Models & Mechanisms. — 2017. — Vol. 10. — No. 7. — P. 859-868.

69. Chew J., Cook C., Gendron T.F., Jansen-West K., Del Rosso G., Daughrity L.M., Castanedes-Casey M., Kurti A., Stankowski J.N., Disney M.D., Rothstein J.D., Dickson D.W., Fryer J.D., Zhang Y.-J., Petrucelli L. Aberrant deposition of stress granule-resident proteins linked to C9orf72-associated TDP-43 proteinopathy // Molecular Neurodegeneration. — 2019. — Vol. 14. — No. 1.

— P. 9.

70. Du X., Carvalho-de-Souza J.L., Wei C., Carrasquel-Ursulaez W., Lorenzo Y., Gonzalez N., Kubota T., Staisch J., Hain T., Petrossian N., Xu M., Latorre R., Bezanilla F., Gomez C.M. Loss-of-function BK channel mutation causes impaired mitochondria and progressive cerebellar ataxia // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2020.

— Vol. 117. — No. 11. — P. 6023-6034.

71. Uchida A., Sasaguri H., Kimura N., Tajiri M., Ohkubo T., Ono F., Sakaue F., Kanai K., Hirai T., Sano T., Shibuya K., Kobayashi M., Yamamoto M., Yokota S., Kubodera T., Tomori M., Sakaki K., Enomoto M., Hirai Y., Kumagai J., Yasutomi Y., Mochizuki H., Kuwabara S., Uchihara T., Mizusawa H., Yokota T. Non-human primate model of amyotrophic lateral sclerosis with cytoplasmic mislocalization of TDP-43 // Brain: A Journal of Neurology. — 2012.

— Vol. 135. — No. Pt 3. — P. 833-846.

72. Lawlor P.A., Bland R.J., Das P., Price R.W., Holloway V., Smithson L., Dicker B.L., During M.J., Young D., Golde T.E. Novel rat Alzheimer's disease models based on AAV-mediated gene transfer to selectively increase hippocampal Abeta levels // Molecular Neurodegeneration. — 2007. — Vol. 2.

— P. 11.

73. Theofilas P., Brar S., Stewart K.-A., Shen H.-Y., Sandau U.S., Poulsen D., Boison D. Adenosine kinase as a target for therapeutic antisense strategies in epilepsy // Epilepsia. — 2011. — Vol. 52. — No. 3. — P. 589-601.

74. Shen H.-Y., Sun H., Hanthorn M.M., Zhi Z., Lan J.-Q., Poulsen D.J., Wang R.K., Boison D. Overexpression of adenosine kinase in cortical astrocytes and focal neocortical epilepsy in mice // Journal of Neurosurgery. — 2014.

— Vol. 120. — No. 3. — P. 628-638.

75. Lin L.Y., Kelliny S., Liu L.C., Al-Hawwas M., Zhou X.F., Bobrovskaya L. Peripheral ProBDNF Delivered by an AAV Vector to the Muscle Triggers Depression-Like Behaviours in Mice // Neurotoxicity Research. — 2020.

— Vol. 38. — No. 3. — P. 626-639.

76. Guo H., Deji C., Peng H., Zhang J., Chen Y., Zhang Y., Wang Y. The role of SIRT1 in the basolateral amygdala in depression-like behaviors in mice // Genes, Brain, and Behavior. — 2021. — Vol. 20. — No. 8. — P. e12765.

77. Duque S.I., Arnold W.D., Odermatt P., Li X., Porensky P.N., Schmelzer L., Meyer K., Kolb S.J., Schumperli D., Kaspar B.K., Burghes A.H.M. A large animal model of spinal muscular atrophy and correction of phenotype // Annals of Neurology. — 2015. — Vol. 77. — No. 3. — P. 399-414.

78. Jackson K.L., Viel C., Clarke J., Bu J., Chan M., Wang B., Shihabuddin L.S., Sardi S.P. Viral delivery of a microRNA to Gba to the mouse central nervous system models neuronopathic Gaucher disease // Neurobiology of Disease.

— 2019. — Vol. 130. — P. 104513.

79. Biselli T., Lange S.S., Sablottny L., Steffen J., Walther A. Optogenetic and chemogenetic insights into the neurocircuitry of depression-like behaviour: A systematic review // The European Journal of Neuroscience. — 2021.

— Vol. 53. — Optogenetic and chemogenetic insights into the neurocircuitry of depression-like behaviour. — No. 1. — P. 9-38.

80. Wang J., Zhang Y., Mendonca C.A., Yukselen O., Muneeruddin K., Ren L., Liang J., Zhou C., Xie J., Li J., Jiang Z., Kucukural A., Shaffer S.A., Gao G.,

Wang D. AAV-delivered suppressor tRNA overcomes a nonsense mutation in mice // Nature. — 2022. — Vol. 604. — No. 7905. — P. 343-348.

81. Keeler A.M., Flotte T.R. Recombinant Adeno-Associated Virus Gene Therapy in Light of Luxturna (and Zolgensma and Glybera): Where Are We, and How Did We Get Here? // Annual review of virology. — 2019. — Vol. 6.

— Recombinant Adeno-Associated Virus Gene Therapy in Light of Luxturna (and Zolgensma and Glybera). — No. 1. — P. 601-621.

82. Research C. for B.E. and KEBILIDI // FDA. — 2024.

83. Lunev E.A., Shmidt A.A., Vassilieva S.G., Savchenko I.M., Loginov V.A., Marina V.I., Egorova T.V., Bardina M.V. [Effective Viral Delivery of Genetic Constructs to Neuronal Culture for Modeling and Gene Therapy of GNAO1 Encephalopathy] // Molekuliarnaia Biologiia. — 2022. — Vol. 56. — No. 4.

— P. 604-618.

84. Nikitin E.S., Bal N.V., Malyshev A., Ierusalimsky V.N., Spivak Y., Balaban P.M., Volgushev M. Encoding of High Frequencies Improves with Maturation of Action Potential Generation in Cultured Neocortical Neurons // Frontiers in Cellular Neuroscience. — 2017. — Vol. 11. — P. 28.

85. Wilmott P., Lisowski L., Alexander I.E., Logan G.J. A User's Guide to the Inverted Terminal Repeats of Adeno-Associated Virus // Human Gene Therapy Methods. — 2019. — Vol. 30. — No. 6. — P. 206-213.

86. Patel T.P., Man K., Firestein B.L., Meaney D.F. Automated quantification of neuronal networks and single-cell calcium dynamics using calcium imaging // Journal of Neuroscience Methods. — 2015. — Vol. 243. — P. 26-38.

87. Yang L., Wang S., Tang L., Liu B., Ye W., Wang L., Wang Z., Zhou M., Chen B. Universal Stem-Loop Primer Method for Screening and Quantification of MicroRNA // PLOS ONE. — 2014. — Vol. 9. — No. 12. — P. e115293.

88. Berry A.S.F., Farias Amorim C., Berry C.L., Syrett C.M., English E.D., Beiting D.P. An Open-Source Toolkit To Expand Bioinformatics Training in Infectious Diseases // mBio. — 2021. — Vol. 12. — No. 4. — P. e0121421.

89. Bray N.L., Pimentel H., Melsted P., Pachter L. Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification // Nature Biotechnology. — 2016. — Vol. 34.

— No. 5. — P. 525-527.

90. Robinson M.D., McCarthy D.J., Smyth G.K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data // Bioinformatics (Oxford, England). — 2010. — Vol. 26. — edgeR. — No. 1.

— P. 139-140.

91. Ritchie M.E., Phipson B., Wu D., Hu Y., Law C.W., Shi W., Smyth G.K. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies // Nucleic Acids Research. — 2015. — Vol. 43. — No. 7.

— P. e47.

92. Raudvere U., Kolberg L., Kuzmin I., Arak T., Adler P., Peterson H., Vilo J. g:Profiler: a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists (2019 update) // Nucleic Acids Research. — 2019. — Vol. 47. — g.

— No. W1. — P. W191-W198.

93. Alkan F., Wenzel A., Palasca O., Kerpedjiev P., Rudebeck A.F., Stadler P.F., Hofacker I.L., Gorodkin J. RIsearch2: suffix array-based large-scale prediction of RNA-RNA interactions and siRNA off-targets // Nucleic Acids Research.

— 2017. — Vol. 45. — RIsearch2. — No. 8. — P. e60.

94. Li H., Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform // Bioinformatics (Oxford, England). — 2009. — Vol. 25.

— No. 14. — P. 1754-1760.

95. Li H., Handsaker B., Wysoker A., Fennell T., Ruan J., Homer N., Marth G., Abecasis G., Durbin R., 1000 Genome Project Data Processing Subgroup The Sequence Alignment/Map format and SAMtools // Bioinformatics (Oxford, England). — 2009. — Vol. 25. — No. 16. — P. 2078-2079.

96. Robinson J.T., Thorvaldsdottir H., Winckler W., Guttman M., Lander E.S., Getz G., Mesirov J.P. Integrative genomics viewer // Nature Biotechnology.

— 2011. — Vol. 29. — No. 1. — P. 24-26.

97. Edgar R., Domrachev M., Lash A.E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository // Nucleic Acids Research.

— 2002. — Vol. 30. — Gene Expression Omnibus. — No. 1. — P. 207210.

98. Heigwer F., Kerr G., Boutros M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification // Nature Methods. — 2014. — Vol. 11. — E-CRISP. — No. 2.

— P. 122-123.

99. Insel P.A., Ostrom R.S. Forskolin as a tool for examining adenylyl cyclase expression, regulation, and G protein signaling // Cellular and Molecular Neurobiology. — 2003. — Vol. 23. — No. 3. — P. 305-314.

100. Daniele Narzi, Siri C van Keulen, Ursula Röthlisberger Gai1 inhibition mechanism of ATP-bound adenylyl cyclase type 5 // PLoS One. — 2021.

101. Keen A.C., Pedersen M.H., Lemel L., Scott D.J., Canals M., Littler D.R., Beddoe T., Ono Y., Shi L., Inoue A., Javitch J.A., Lane J.R. OZITX, a pertussis toxin-like protein for occluding inhibitory G protein signalling including Gaz // Communications Biology. — 2022. — Vol. 5. — No. 1. — P. 256.

102. Tang T., Gao M.H., Miyanohara A., Hammond H.K. Gaq Reduces cAMP Production by Decreasing Gas Protein Abundance // Biochemical and biophysical research communications. — 2008. — Vol. 377. — No. 2.

— P. 679-684.

103. Jiang L.I., Collins J., Davis R., Fraser I.D., Sternweis P.C. Regulation of cAMP responses by the G12/13 pathway converges on adenylyl cyclase VII // The Journal of Biological Chemistry. — 2008. — Vol. 283. — No. 34.

— P. 23429-23439.

104. Weinstein L.S., Xie T., Zhang Q.-H., Chen M. Studies of the regulation and function of the Gsa gene Gnas using gene targeting technology // Pharmacology & therapeutics. — 2007. — Vol. 115. — No. 2. — P. 271-291.

105. Howard D.B., Powers K., Wang Y., Harvey B.K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and

glia in vitro // Virology. — 2008. — Vol. 372. — No. 1. — P. 24-34.

106. Ellis B.L., Hirsch M.L., Barker J.C., Connelly J.P., Steininger R.J., Porteus M.H. A survey of ex vivo/in vitro transduction efficiency of mammalian primary cells and cell lines with Nine natural adeno-associated virus (AAV1-9) and one engineered adeno-associated virus serotype // Virology Journal. — 2013.

— Vol. 10. — P. 74.

107. Banning A., Zakrzewicz A., Chen X., Gray S.J., Tikkanen R. Knockout of the CMP-Sialic Acid Transporter SLC35A1 in Human Cell Lines Increases Transduction Efficiency of Adeno-Associated Virus 9: Implications for Gene Therapy Potency Assays // Cells. — 2021. — Vol. 10. — Knockout of the CMP-Sialic Acid Transporter SLC35A1 in Human Cell Lines Increases Transduction Efficiency of Adeno-Associated Virus 9. — No. 5. — P. 1259.

108. Royo N.C., Vandenberghe L.H., Ma J.-Y., Hauspurg A., Yu L., Maronski M., Johnston J., Dichter M.A., Wilson J.M., Watson D.J. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity // Brain Research. — 2008. — Vol. 1190. — P. 15-22.

109. Grienberger C., Konnerth A. Imaging calcium in neurons // Neuron.

— 2012. — Vol. 73. — No. 5. — P. 862-885.

110. Keiser M.S., Ranum P.T., Yrigollen C.M., Carrell E.M., Smith G.R., Muehlmatt A.L., Chen Y.H., Stein J.M., Wolf R.L., Radaelli E., Lucas T.J., Gonzalez-Alegre P., Davidson B.L. Toxicity after AAV delivery of RNAi expression constructs into nonhuman primate brain // Nature Medicine. — 2021.

— Vol. 27. — No. 11. — P. 1982-1989.

111. Wallace L.M., Saad N.Y., Pyne N.K., Fowler A.M., Eidahl J.O., Domire J.S., Griffin D.A., Herman A.C., Sahenk Z., Rodino-Klapac L.R., Harper S.Q. Pre-clinical Safety and Off-Target Studies to Support Translation of AAV-Mediated RNAi Therapy for FSHD // Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. — 2018. — Vol. 8. — P. 121-130.

112. Johnston S., Parylak S.L., Kim S., Mac N., Lim C., Gallina I., Bloyd C.,

Newberry A., Saavedra C.D., Novak O., Gonçalves J.T., Gage F.H., Shtrahman M. AAV ablates neurogenesis in the adult murine hippocampus // eLife.

— 2021. — Vol. 10. — P. e59291.

113. Ansari A.M., Ahmed A.K., Matsangos A.E., Lay F., Born L.J., Marti G., Harmon J.W., Sun Z. Cellular GFP Toxicity and Immunogenicity: Potential Confounders in in Vivo Cell Tracking Experiments // Stem Cell Reviews and Reports. — 2016. — Vol. 12. — Cellular GFP Toxicity and Immunogenicity.

— No. 5. — P. 553-559.

114. Penaud-Budloo M., François A., Clément N., Ayuso E. Pharmacology of Recombinant Adeno-associated Virus Production // Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. — 2018. — Vol. 8. — P. 166-180.

115. Günther A., Luczak V., Abel T., Baumann A. Caspase-3 and GFAP as early markers for apoptosis and astrogliosis in shRNA-induced hippocampal cytotoxicity // The Journal of Experimental Biology. — 2017. — Vol. 220.

— No. Pt 8. — P. 1400-1404.

116. Chen S., Li Y., Zhu Y., Fei J., Song L., Sun G., Guo L., Li X. SERPINE1 Overexpression Promotes Malignant Progression and Poor Prognosis of Gastric Cancer // Journal of Oncology. — 2022. — Vol. 2022. — P. 2647825.

117. Szalai R., Till A., Szabo A., Melegh B., Hadzsiev K., Czako M. Overlapping Interstitial Deletions of the Region 9q22.33 to 9q33.3 of Three Patients Allow Pinpointing Candidate Genes for Epilepsy and Cleft Lip and Palate // Molecular Syndromology. — 2023. — Vol. 14. — No. 2. — P. 109-122.

118. Feng H., Larrivee C.L., Demireva E.Y., Xie H., Leipprandt J.R., Neubig R.R. Mouse models of GNAO1-associated movement disorder: Allele- and sex-specific differences in phenotypes // PloS One. — 2019. — Vol. 14. — Mouse models of GNAO1-associated movement disorder. — No. 1. — P. e0211066.

119. Zhu F., Nair R.R., Fisher E.M.C., Cunningham T.J. Humanising the mouse genome piece by piece // Nature Communications. — 2019. — Vol. 10.

— P. 1845.

120. Shumega A.R., Pavlov Y.I., Chirinskaite A.V., Rubel A.A., Inge-Vechtomov S.G., Stepchenkova E.I. CRISPR/Cas9 as a Mutagenic Factor // International Journal of Molecular Sciences. — 2024. — Vol. 25. — No. 2.

— P. 823.

121. McBride J.L., Boudreau R.L., Harper S.Q., Staber P.D., Monteys A.M., Martins I., Gilmore B.L., Burstein H., Peluso R.W., Polisky B., Carter B.J., Davidson B.L. Artificial miRNAs mitigate shRNA-mediated toxicity in the brain: Implications for the therapeutic development of RNAi // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2008.

— Vol. 105. — Artificial miRNAs mitigate shRNA-mediated toxicity in the brain. — No. 15. — P. 5868-5873.

122. Martin J.N., Wolken N., Brown T., Dauer W.T., Ehrlich M.E., Gonzalez-Alegre P. Lethal toxicity caused by expression of shRNA in the mouse striatum: implications for therapeutic design // Gene Therapy. — 2011. — Vol. 18.

— Lethal toxicity caused by expression of shRNA in the mouse striatum.

— No. 7. — P. 666-673.

123. Ros X.B.-D., Gu S. Guidelines for the optimal design of miRNA-based shRNAs // Methods (San Diego, Calif.). — 2016. — Vol. 103. — P. 157-166.

124. Kotowska-Zimmer A., Pewinska M., Olejniczak M. Artificial miRNAs as therapeutic tools: Challenges and opportunities // Wiley interdisciplinary reviews. RNA. — 2021. — Vol. 12. — Artificial miRNAs as therapeutic tools.

— No. 4. — P. e1640.

125. Finneran D.J., Njoku I.P., Flores-Pazarin D., Ranabothu M.R., Nash K.R., Morgan D., Gordon M.N. Toward Development of Neuron Specific Transduction After Systemic Delivery of Viral Vectors // Frontiers in Neurology. — 2021.

— Vol. 12.

126. Hollidge B.S., Carroll H.B., Qian R., Fuller M.L., Giles A.R., Mercer A.C., Danos O., Liu Y., Bruder J.T., Smith J.B. Kinetics and durability of transgene expression after intrastriatal injection of AAV9 vectors // Frontiers in Neurology.

— 2022. — Vol. 13.

127. Harkins A.L., Ambegaokar P.P., Keeler A.M. Immune responses to central nervous system directed adeno-associated virus gene therapy: Does direct CNS delivery make a difference? // Neurotherapeutics. — 2024. — Vol. 21.

— Immune responses to central nervous system directed adeno-associated virus gene therapy. — No. 4. — P. e00435.

128. Sehara Y., Fujimoto K.-I., Ikeguchi K., Katakai Y., Ono F., Takino N., Ito M., Ozawa K., Muramatsu S.-I. Persistent Expression of Dopamine-Synthesizing Enzymes 15 Years After Gene Transfer in a Primate Model of Parkinson's Disease // Human Gene Therapy. Clinical Development. — 2017. — Vol. 28.

— No. 2. — P. 74-79.

129. Pacico N., Mingorance-Le Meur A. New In Vitro Phenotypic Assay for Epilepsy: Fluorescent Measurement of Synchronized Neuronal Calcium Oscillations // PLoS ONE. — 2014. — Vol. 9. — New In Vitro Phenotypic Assay for Epilepsy. — No. 1. — P. e84755.

130. Kawata S., Mukai Y., Nishimura Y., Takahashi T., Saitoh N. Green fluorescent cAMP indicator of high speed and specificity suitable for neuronal live-cell imaging // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 2022. — Vol. 119. — No. 28.

— P. e2122618119.

131. Lee D. Global and local missions of cAMP signaling in neural plasticity, learning, and memory // Frontiers in Pharmacology. — 2015. — Vol. 6.

— P. 161.

132. Li X., Sun X., Kan C., Chen B., Qu N., Hou N., Liu Y., Han F. COL1A1: A novel oncogenic gene and therapeutic target in malignancies // Pathology, Research and Practice. — 2022. — Vol. 236. — COL1A1. — P. 154013.

133. Vega F., Medeiros L.J., Bueso-Ramos C.E., Arboleda P., Miranda R.N. Hematolymphoid neoplasms associated with rearrangements of PDGFRA, PDGFRB, and FGFR1 // American Journal of Clinical Pathology. — 2015.

— Vol. 144. — No. 3. — P. 377-392.

134. Haldrup S.H., Fabian-Jessing B.K., Jakobsen T.S., Lindholm A.B., Adsersen R.L., Aagaard L., Bek T., Askou A.L., Corydon T.J. Subretinal AAV delivery of RNAi-therapeutics targeting VEGFA reduces choroidal neovascularization in a large animal model // Molecular Therapy. Methods & Clinical Development.

— 2024. — Vol. 32. — No. 2. — P. 101242.

135. Feng H., Yuan Y., Williams M.R., Roy A.J., Leipprandt J.R., Neubig R.R. Mice with monoallelic GNAO1 loss exhibit reduced inhibitory synaptic input to cerebellar Purkinje cells // Journal of Neurophysiology. — 2022. — Vol. 127.

— No. 3. — P. 607-622.

136. Aoyama Y., Sasai H., Abdelkreem E., Otsuka H., Nakama M., Kumar S., Aroor S., Shukla A., Fukao T. A novel mutation (c.121-13T>A) in the polypyrimidine tract of the splice acceptor site of intron 2 causes exon 3 skipping in mitochondrial acetoacetyl-CoA thiolase gene // Molecular Medicine Reports.

— 2017. — Vol. 15. — No. 6. — P. 3879-3884.

137. Savitsky M., Solis G.P., Kryuchkov M., Katanaev V.L. Humanization of Drosophila Gao to Model GNAO1 Paediatric Encephalopathies // Biomedicines.

— 2020. — Vol. 8. — No. 10. — P. 395.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Рисунок П1. Карты плазмидных векторов, используемых для клонирования.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Таблица П1. Последовательности праймеров для клонирования.

Название плазмиды Последовательность, 5'-3'

pGNAO1 и pGNAO1-G203R GNAO1_F: AAAGCAAAAAAGAAGTCACCATGGGATGTACTCT GAGCGCAG GNAO1_R: ATATCGCGGCCGCCTACAAGGCCTTCAGTACAAG CCGCAGCCC Для линеаризации вектора*: Backbone F: GGTGACTTCTTTTTTGCTTTCGCTAGCGGATCTGA CGGTTC Backbone_R: CTTGTAGGCGGCCGCGATATTCGAATTCTGCAGTC GACGGTACC

pGNA13 GNA13_F: AAAGCAAAAAAGAAGTCACCATGGCGGACTTCCT GCC GNA13_R: ATATCGCGGCCGCCTACAAGGCCTTCACTGTAGCA TAAGCTGCTTGAGG

pGNAI1 GNAI1_F: AAAGCAAAAAAGAAGTCACCATGGGCTGCACGCT GAG GNAI1_R: ATATCGCGGCCGCCTACAAGGCCTTTAAAAGAGAC CACAATCTTTTAGATTATTTTTTATGATGACATCT

pGNAQ GNAQ_F:

AAAGCAAAAAAGAAGTCACCATGACTCTGGAGTC CATCATGGC GNAQ_R: ATATCGCGGCCGCCTACAAGGCCTTTAGACCAGAT TGTACTCCTTCAGGTT

pGNAS GNAS_F: AAAGCAAAAAAGAAGTCACCATGGGCTGCCTCGG GA GNAS_R: ATATCGCGGCCGCCTACAAGGCCTTTAGAGCAGCT CGTACTGACGAAG

pGNAZ GNAZ_F: AAAGCAAAAAAGAAGTCACCATGGGATGTCGGCA AAGCT GNAZ_R: ATATCGCGGCCGCCTACAAGGCCTTCAGCAAAGGC CAATGTACTTGAGA

pGNAO 1-C351G Праймеры для сайт направленного мутагенеза GNAO1: GNAO1_C351G_F: GGCGGCGGCTTGTACTGAAGGCCTTGTAG GNAO1_C351G_R: AAGCCGCCGCCCCGGAGGTTGTTG

pMusGNAOl MusGNAO1_F: CGCTACCGGTCGCCACCATGGGATGTACGCTGAGC GC MusGNAO1_R: TCAGTTATCTAGATCCGGTGGATTCAGTACAAGCC GCAGCCC Для линеаризации вектора: Backbone F: ATCCACCGGATCTAGATAACTGATCATAATCA

Backbone_R: GGTGGCGACCGGTAGCG

pAAV-GNAO1-myc AAV-GNAO 1_F: GAAGTCACCATGGGATGTACTCTGAGCGCAGAGG AG Myc_R: GATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCGTACAAG CCGCAGCCCCGGA Для линеаризации вектора: Backbone F: AAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGTAATAATAAC CGGGCAGGCCATGTCT Backbone R: GTACATCCCATGGTGACTTCTTTTTTGCTTTAGCA GGCTCTTTC

pAAV-GNAO1 -G203R-FLAG AAV-GNAO 1_F: GAAGTCACCATGGGATGTACTCTGAGCGCAGAGG AG FLAG_R: CTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCGTACAAGCCGC AGCCCCGGA Для линеаризации вектора: Backbone F: CAAAGACGATGACGACAAGTAATAATAACCGGGC AGGCCATGTCT Backbone R: GTACATCCCATGGTGACTTCTTTTTTGCTTTAGCA GGCTCTTTC

pAAV-GNAO1 - wt-IRES- GNAO1_F:

Tomato и pAAV-GNAO1 -G203R-IRES-Tomato CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACATGGGATGTA CTCTGAGCGCA GNAO1_R: CAAGGCCTTCAGTACAAGCCGCAGCCC IRES_F: GCTTGTACTGAAGGCCTTGTAGGCGGC IRES_R: CTCACCATGGTGGCTTATCATCGTGTTTTTCAAAG Tomato_F: TGATAAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG Tomato R: TCACACAGGAAACAGCTATGACGCTCGGTCCGGC TGTCCATAAAACCGCCCAGTAGAAG

hSyn-eGFP-miR1500 hSyn_F TTACGCGTTACAGGGTAAAACGACGGCCAGTTAG TTCATAGCCCATATATGGAGCTAGCAGTGCAAGT GGGTTTTAGGACCAGG hSyn_R TCTGAGCTCCGGATTCTCGACTGCGC

*Для линеаризации вектора при клонировании плазмид pGNAO1, pGNAO1-G203R, pGNA13, pGNAU, pGNAQ, pGNAS и pGNAZ использовались идентичные праймеры.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор искренне благодарит научного руководителя Бардину Марьяну Владимировну за помощь в планировании экспериментов, интерпретации полученных данных и поддержку на всем протяжении исследования. Особую признательность хочется выразить за неоценимый вклад Марьяны Владимировны в формирование научного мышления автора. Сердечная благодарность выражается каждому члену коллектива лаборатории Моделирования и терапии наследственных заболеваний ИБГ РАН. За ценные советы, продуктивные научные дискуссии и поддержку автор выражает особую благодарность Егоровой Татьяне Владимировне. За помощь в выполнении экспериментов автор особенно благодарит Савченко Ирину Михайловну, Васильеву Светлану Геннадьевну, Поликарпову Анну Владимировну, Клементьеву Наталию Владимировну, Шмидт Анну Андреевну, Карань Анну Александровну, Шубину Марию Юрьевну, Галкина Ивана Ильича, Светлову Екатерину Антоновну, Дженкову Марину Александровну, Романову Анну Дмитриевну. Отдельная благодарность сотрудникам ФНКЦ физико-химической медицины имени Ю.М. Лопухина. Благодарность выражается Воловикову Егору Алексеевичу за предоставление культур ГАМКергических нейронов, а также Ануфриевой Ксении Сергеевне за помощь в анализе данных RNAseq. Глубокая благодарность семье и друзьям за неоценимую поддержку.