Изучение влияния на репаративную регенерацию костной ткани и фармакокинетических свойств комплексной соли ацексамовой кислоты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Даниленко Антон Павлович

• Даниленко Антон Павлович
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Даниленко Антон Павлович

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Патогенез остеопоротического перелома

1.2 Влияние остеопороза на заживление переломов

1.3 Экспериментальные модели остеопороза на животных

1.4 Влияние лекарственных препаратов от остеопороза на заживление переломов

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Нормативно-правовые аспекты экспериментальных исследований

2.1.2 Объекты исследования

2.1.3 Реактивы, материалы и оборудование

2.1.4 Лабораторные животные

2.1.5 Методы исследования

2.2 Дизайн исследования

2.3 Статистическая обработка результатов

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Результаты компьютерного моделирования фармакокинетических свойств и взаимодействия комплексной соли ацексамовой кислоты с молекулярными биомишенями

3.2 Влияние комплексной соли ацексамовой кислоты на пролиферативную активность мезенхимальных стволовых клеток в исследовании in vitro

3.3 Изучение влияния комплексной соли ацексамовой кислоты на репаративную регенерацию костной ткани при постменопаузальном остеопорозе

3.4 Изучение влияния комплексной соли ацексамовой кислоты на репаративную регенерацию костной ткани при введении глюкокортикостероидов (вторичный остеопороз)

3.5 Изучение влияния комплексной соли ацексамовой кислоты на репаративную регенерацию костной ткани у трансгенных животных с отсутствием экспрессии фермента 11P-HSD2

3.5.1 Влияние комплексной соли ацексамовой кислоты на экспрессию мРНК генов VEGF и eNOS при переломе у трансгенных животных с отсутствием экспрессии

фермента 11P-HSD2

3.5.2 Влияние комплексной соли ацексамовой кислоты на экспрессию генов проапоптических и антиапоптического фактора при переломе у трансгенных

животных с отсутствием экспрессии фермента 11P-HSD2

3.6 Оценка фармакокинетических свойств комплексной соли ацексамовой кислоты

ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение влияния на репаративную регенерацию костной ткани и фармакокинетических свойств комплексной соли ацексамовой кислоты»

Актуальность темы исследования

Переломы костей являются важной современной проблемой общественного здравоохранения во всём мире. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), ежегодно в мире регистрируется более 180 миллионов переломов [18]. В России частота переломов составляет в среднем 3000 случаев в год на 100 000 населения, что представляет почти 23% от всех полученных травм [17]. Осложнения, возникающие после переломов костей, часто приводят к временной потере трудоспособности, госпитализации, вызывая хронические боли, инвалидность, снижение качества жизни и повышение риска преждевременной смерти [78, 79].

Общепринятые подходы в лечении переломов чаще всего включают в себя применение гипсовых повязок, шин и аппаратов остеосинтеза [199]. В тоже время известные фармакологические подходы для ускорения регенерации костной ткани, на практике применяются крайне редко что может быть связано с неубедительными и противоречивыми результатами по эффективности, отсутствием однозначных клинических данных, а также высокой стоимостью и опасениями по поводу риска серьезных нежелательных эффектов [14].

Высокая необходимость в лекарственной стимуляции регенерации костной ткани в дополнение к базисному хирургическому методу лечения может быть обусловлена наличием сопутствующего остеопороза и высокотравматического повреждения.

В этой связи проблема медикаментозного подхода в лечении переломов не решена и ждет дальнейших интенсивных исследований. Пристальное внимание экспериментаторов в последнее время привлечено к производным ацексамовой кислоты в связи с их широким спектром биологической активности и безопасности [1, 8].

Степень разработанности темы исследования

Переломы, возникающие на фоне остеопороза, представляют собой серьезную проблему с удручающими последствиями в виде снижения качества жизни, инвалидизации и смертности [9, 10].

Высокий интерес у исследователей в области регенерации костной ткани на фоне остеопороза в последнее время вызывает ацексамовая кислота. Однако с клинической точки зрения, в монотерапии она оказалась недостаточно эффективной для практического применения [12]. Поэтому были синтезированы ее многочисленные производные, некоторые из которых (^ацетил-6-аминогексаноат цинка, натрия, кальция, церия, серебра; 2-(5-этил-1,3,4-тиадиазолил) амид N ацетил-6-аминогексановой кислоты, 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния N ацетил-6-аминогексаноат), продемонстрировали в экспериментальных исследованиях множественные свидетельства, биологической активности при заживлении диабетических и плоскостных ран, ожогах I и II степени, улучшении образовании послеоперационного косметического рубца [1, 8]. При несомненной эффективности, полученных результатов у большинства производных ацексамовой кислоты, одним из высоко потенциальных соединений в данном ряду оказалось -2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния ^ацетил-6-аминогексаноат (комплексная соль ацексамовой кислоты) полученное путем топохимического синтеза в виде супрамолекулярного комплекса в ВНЦ БАВ, коллективом отдела химии и технологии лекарственных средств под руководством д.х.н., проф. С.Я. Скачиловой. При проведении фармакокинетических исследований комплексной соли ацексамовой кислоты установлено, что он обладает улучшенной фармакокинетической характеристикой в сравнении с отдельными компонентами (повышение биодоступности) [30]. Что явилось основой для дальнейшего исследования комплексной соли ацексамовой кислоты в качестве многообещающего кандидата в препараты для улучшения регенерации костной ткани при остеопоротических переломах.

Моделирование переломов на различных моделях остеопороза (двухсторонней овариэктомии, ведения глюкокортикостероидов и трансгенных животных с нулевой экспрессией 11бета-гидроксистероиддегидрогеназы 2 типа) позволило лучше оценить процессы происходящие в костной ткани при том или ином виде остеопороза и понять механистические и клеточные процессы, лежащие в основе заживления перелома и оценить вклад комплексной соли ацексамовой

кислоты на различные этапы регенерации костной ткани включая воспаление, восстановление и ремоделирование, где весь процесс требует скоординированных усилий на множество типов клеток и биохимических процессов.

И так как в настоящее время нет одобренных идеальных фармакологических средств для улучшения сращивания переломов, полученные результаты вносят значительный вклад в дальнейшую стратегию по выявлению терапевтических средств, влияющих на репаративную регенерацию костной ткани.

Цель исследования

Повышение эффективности репаративной регенерации костной ткани при остеопоротических переломах путем использования комплексной соли ацексамовой кислоты.

Задачи исследования

1. Провести предикторный анализ и прогнозирование основных молекулярных мишеней комплексной соли ацексамовой кислоты.

2. Оценить влияние комплексной соли ацексамовой кислоты на пролиферацию мезенхимных стволовых клеток в экспериментах in vitro в сравнении с этилметилгидроксипиридина сукцинатом.

3. Изучить влияние комплексной соли ацексамовой кислоты на репаративную регенерацию костной ткани при переломах на фоне гипоэстроген- и стероид-индуцированного остеопорозав в исследованиях in vivo.

4. Изучить влияние комплексной соли ацексамовой кислоты на репаративную регенерацию костной ткани при переломах у трансгенных животных с нулевой экспрессией 11бета-гидроксистероиддегидрогеназы 2 типа по показателям денситометрии, микроциркуляции костной ткани, гистоморфологических, биохимических маркеров и экспрессии генов, отвечающих за процессы апоптоза и неоангиогенеза.

5. Изучить биодоступность комплексной соли ацексамовой кислоты в сравнении с отдельными компонентами, входящими в состав комплекса.

Научная новизна исследования

1. Впервые проведен молекулярный докинг и предикторный анализ с оценкой влияния на энергию связывания с предполагаемыми молекулярными биомишенями комплексной соли ацексамовой кислоты.

2. Впервые в исследованиях in vitro показано, что комплексная соль ацексамовой кислоты превосходит этилметилгидроксипиридина сукцинат по влиянию на пролиферационный потенциал мезенхимных стволовых клеток.

3. Комплексная соль ацексамовой кислоты улучшает регенерацию костной ткани при переломах на фоне гипоэстроген- и стероид-индуцированного остеопороза.

4. Фармакологическое воздействие комплексной соли ацексамовой кислоты на процессы регенерации костной ткани у трансгенных животных с нулевой экспрессией 11бета-гидроксистероиддегидрогеназы 2 типа приводит к положительной динамике сращивания переломов, снижая экспрессию генов апоптоза p53 и Bax и повышая экспрессию мРНК генов eNOS и VEGF.

5. Впервые проведенный фармакокинетический анализ комплексной соли ацексамовой кислоты свидетельствует о повышении биодоступности комплекса по сравнению с отдельно взятыми компонентами.

Теоретическая и практическая значимость работы

В исследовании проведена оценка эффективности комплексной соли ацексамовой кислоты на репаративную регенерацию костной ткани на различных экспериментальных моделях остеопоротических переломов (гипоэстроген- и стероид-индуцированного остеопороза), а также у трансгенных животных с нулевой экспрессией 11бета-гидроксистероиддегидрогеназы 2 типа, с целью выявления новых фармакотерапевтических мишеней в реализации патогенетических звеньев развития остеопороза и коррекции переломов на его фоне. Такой комплексный подход позволит улучшить стратегии поиска новых лекарственных препаратов, необходимых для регенерации костной ткани при переломах. Показано, что комплексная соль ацексамовой кислоты является

перспективным соединением в коррекции переломов и превосходит по ряду показателей препараты-референсы.

Методология и методы исследования Методологическое формирование диссертационной работы основано на экспериментальном усовершенствовании автором методических подходов по моделированию экспериментального остеопороза и переломов на его фоне, описанных в источниках отечественной и зарубежной литературы. Поиск фармакологических агентов для улучшения регенерации костной ткани при переломах был направлен на различные фармакотерапевтические мишени в зависимости от патогенетических механизмов развития остеопороза.

Дизайн и протоколы экспериментальных исследований были спланированы с учетом всех рекомендаций по проведению доклинических исследований, результатов предшествующих исследований, проведенных в лабораториях НИИ Фармакологии живых систем.

Внедрение результатов научных исследований Полученные результаты позволяют сформировать и расширить представления о современных подходах к улучшению регенерации костной ткани у пациентов при переломах. Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, могут быть положены в основу дальнейшего клинического испытания комплексной соли ацексамовой кислоты. Результаты диссертационной работы внедрены в учебно-методическую и научно-исследовательскую деятельность кафедры фармакологии и клинической фармакологии и НИИ Фармакологии живых систем НИУ «БелГУ».

Положения, выносимые на защиту 1. Комплексная соль ацексамовой кислоты является перспективным и безопасным соединением, соответствует всем критериям Липински. Энергия связывания с мишенями ранжируется следующим образом: eNOS>VEGF>RANKL>TNF-a>RANK>OPG>BMP-2. Комплексная соль ацексамовой кислоты в дозе 0,5 мкг/мл превосходит препарат сравнения

этилметилгидроксипиридина сукцинат в дозе 1 мкг/мл по влиянию на пролиферационный потенциал в экспериментах in vitro.

2. Комплексная соль ацексамовой кислоты в дозе 50 мг/кг при переломах на фоне гипоэстроген- и стероид-индуцированного остеопороза и у трансгенных мышей с нулевой экспрессией 11бета-гидроксистероиддегидрогеназы 2 типа приводит к снижению количества несросшихся переломов, увеличению показателей плотности костной ткани, повышению уровня микроциркуляции и снижению КЭД, улучшению гистоморфологических характеристик костной ткани в зоне перелома, снижению экспрессии генов апоптоза p53 и Bax и повышению экспрессии мРНК генов VEGF и eNOS в сравнении с группой животных без лечения.

3. Данные фармакокинетического анализа комплексной соли ацексамовой кислоты при пероральном введении свидетельствуют о повышении биодоступности комплекса в среднем в 14,3 раза и увеличению максимальной концентрации более чем в 40 раз по сравнению с отдельными компонентами, входящими в состав комплекса.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность и обоснованность полученных результатов обеспечиваются репрезентативным объемом выборки, применением валидированного методического аппарата, адекватного поставленным исследовательским задачам, а также последующей статистической обработкой данных с определением уровня статистической значимости наблюдаемых различий.

Результаты работы представлены на международных и всероссийских научных конференциях: всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «НИИ фармакологии живых систем: семь лет пассионарного развития» (Белгород, 10 апреля 2023 г.); VI съезд фармакологов России «Смена поколений и сохранение традиций. Новые идеи - новые лекарства» (Москва, 20-24 ноября 2023 г.); международная научно-практическая конференция «Генетические технологии для биологии и медицины» (Белгород (Россия), Дэчжоу (Китай), 18-19 ноября 2024 г.); XXVII всероссийская конференция с

международным участием «Жизнеобеспечение при критических состояниях» (Москва, 7-8 ноября 2025 г).

Методы, применяемые в настоящей диссертационной работе, использовались в рамках программы «Приоритет 2030», проект № 23120024 при выполнении гранта «Разработка способов коррекции повреждений органов и тканей травматического и сосудистого генеза с использованием генно-терапевтических конструкций».

Публикации

По теме исследования опубликовано 11 работ, из них 5 - в рекомендованных ВАК рецензируемых научных изданиях, включая 3 статьи в изданиях, индексируемых в международной базе данных Scopus, и 2 свидетельства о государственной регистрации базы данных.

Личный вклад

На первом этапе работы над диссертацией автор проанализировал публикации отечественных и зарубежных источников, провел анализ актуальности проблемы и имеющихся клинических рекомендаций по данному вопросу. Под руководством научного руководителя автор провел работу по интерпретации результатов по предикторному анализу и молекулярному докингу комплексной соли ацексамовой кислоты. В исследованиях in vitro оценил перспективность дальнейшего исследования комплексной соли ацексамовой кислоты, в связи с ее возможностью превосходить препарат-референс по влиянию на пролиферацию мезенхимных стволовых клеток в эксперименте. Диссертант участвовал в моделировании переломов на различных экспериментальных моделях остеопороза, и оценке полученных результатов, в том числе результатов денситометрии, гемодинамических показателей, биохимических и гистоморфологических показателей. Автор обобщил полученные данные и провел статистическую обработку по результатам фармакокинетических исследований. Интерпретировал выводы по работе, а также подготовил и опубликовал результаты собственных экспериментальных исследований.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 9 таблицами и 41 рисунком и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты экспериментальных исследований, обсуждение, заключение, выводы, список сокращений и условных обозначений и список литературы (включает 127 источников, из которых 94 - зарубежные).

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Патогенез остеопоротического перелома

Лечение остеопороза и связанных с ним переломов костей остается важной и сложной задачей. Большинство переломов заживают без осложнений, в тоже время примерно в 5-15% случаев происходит замедленное или незаживающее (сращение), которое зависит от многих факторов, в том числе от возраста, места перелома, наличия остеопороза, степень смещенности фрагментов, возраста. Экономическая составляющая связанная с несращением переломов, велика и ложится тяжким бременем на пациентов [75]. Возможные последствия, возникающие из-за плохо заживления перелома, включают как несращение в целом, неправильное сращение, хроническую боль, подвижность суставов и возникновение остеоартрита [125]. Понимание заживления переломов и последствий замедленного или незаживающего переломов, позволяет оптимизировать тактику лечения что имеет решающее значение в фармакотерапии переломов.

Заживление перелома кости представляет собой сложный и многофазный процесс, включающий серию взаимосвязанных этапов, каждый из которых играет ключевую роль в ремоделировании костной ткани. Этот процесс можно разделить на такие этапы как: воспаление, репаративная фаза и ремоделирование.

Заживления переломов костей могут происходить двумя основными путями: прямым и непрямым. Прямое заживление происходит, когда костные фрагменты плотно прилегают друг к другу и практически неподвижны. Что облегчает процесс формирования новой кости непосредственно на поверхности старых костных фрагментов, минуя стадию образования хрящевой ткани, так как костные фрагменты напрямую соединяются новой костью, образованной интрамембранозным окостенением.

Прямое сращение переломов сопровождается процессами ремоделирования костной ткани, включающими образование новых гаверсовых систем посредством активизации остеокластов, формирующих специфические структуры, именуемые

режущими конусами. Указанные образования проходят через зону повреждения, транспортируя вместе с собой сосудистые эндотелиальные клетки, способствующие ангиогенезу путем последующей дифференцировки в элементы сосудистой сети, а также периваскулярные мезенхимальные клетки, являющиеся предшественниками остеогенных клеточных линий и впоследствии трансформирующиеся в остеобласты. Заполнение образующихся каналов вновь сформированной костной тканью обеспечивает восстановление механических свойств поврежденного участка [46]. Источниками эндотелиальных клеток сосудов и периваскулярных мезенхимальных клеток, является кортикальная кость, лежащая под местом перелома, надкостница, прилегающая к перелому, и костный мозг в месте перелома [59] (Рисунок 1.1).

DIRECT FRACTURE HEALING

Примечание - А - фрагменты кости соединяются; В - остеокласты используются для формирования режущих конусов; С - режущие конусы проходят линию перелома и приносят с собой сосудистые эндотелиальные клетки и периваскулярные МСК, которые дифференцируются в остеобласты; D - вновь сформированная кость.

Рисунок 1.1 - Прямое заживление перелома (M. Chandran, 2024 [70])

Заживление прямых переломов в целом происходит за счет первичного сращения и образования новой кости путем интрамембранозной оссификации. Однако, даже в прямых переломах могут быть области аваскулярного некроза и деформации, которые вызывают стимуляцию хондроцитов, что приводит к некоторой эндохондральной оссификации. Аналогично, даже в максимально смещенных переломах, если степень периостального кровоснабжения осталась неповрежденной, могут возникнуть области интрамембранозной оссификации. [70]. В действительности большинство переломов на практике используют комбинацию интрамембранозной и эндохондральной оссификации [65, 77].

Вторичное сращивание костной ткани происходит, когда существует значительное смещение или подвижность фрагментов перелома, например, при нестабильной фиксации или значительных дефектах тканей. Это процесс сращивания является более сложным и состоит из фазы воспаления (длится несколько дней), когда сразу же после травмы образуется гематома, которая привлекает к себе воспалительные клетки такие как нейтрофилы, тромбоциты, эритроциты, гранулоциты и лимфоциты, это все приводит к образованию сгусток, который служит временной фибриновой матрицей. Нейтрофилы заменяются моноцитами, которые затем дифференцируются в макрофаги. Эта фаза является очень значимой для заживления. Например, было показано что при удалении гематомы, замедление процесса сращения перелома у экспериментальных животных [101]. Следующей фазой заживления при вторичном сращивании костной ткани является фаза восстановления (может длится несколько месяцев), когда активируются макрофаги и нейтрофилы и запускают процесс очищения поврежденной ткани путем фагоцитоза мертвых клеток и внеклеточных остатков (дебриса). Кроме того, макрофаги выделяют ряд цитокинов, таких как: фактор некроза опухоли альфа (Т№-а), который стимулирует воспаление и привлечение лейкоцитов; интерлейкины ГЬ-1 и ГЬ-6 которые усиливают воспаление и привлекают новые иммунные клетки и трансформирующий фактор роста бета (TGFP), способствующий пролиферации фибробластов и синтезу коллагена; ангиогенный фактор роста эндотелия сосудов VEGF втягивающий эндотелиальные клетки сосудов в богатый коллагеном

хрящевой матрикс и способствующий ангиогенезу [67, 70], костный морфогенетический белок-2 (ВМР-2) [71].

Эти факторы роста привлекают мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые дифференцируются в прегипертрофические хондроциты, эндотелиальные клетки и остеобласты. В ответ на межфрагментарную деформацию прегипертрофические хондроциты продуцируют богатый коллагеном II типа матрикс [38]. После того, как деформация снижена до достаточной степени, прегипертрофические хондроциты увеличиваются, образуя гипертрофические хондроциты, которые способствуют проникновению сосудов, вырабатывая цитокины и факторы роста, и создают поддерживающий каркас для притока остеобластов. Гипертрофические хондроциты высвобождают микровезикулы, покрытые щелочной фосфатазой, которая гидролизует пирофосфат — основной ингибитор образования гидроксиапатита [59]. Остеобласты накапливаются вместе с эндотелиальными клетками. Остеобласты дифференцируются и способствуют отложению микрогидроксиапатита на хрящевой матрице, образуя хондроидную мягкую мозоль, которая перекрывает перелом. Предположительно, существует максимально допустимая нестабильность и требуемая минимальная степень деформации для индукции образования мозоли [67]. Напротив, если деформация слишком высока, стабилизация хондроцитов, гипертрофия и костное сращение могут быть предотвращены, что приведет к псевдоартрозу [15, 82].

Графическое изображение процесса непрямого заживления (Рисунок 1.2). Фаза воспаления: (а) гематома привлекает воспалительные клетки; (Ь) нейтрофилы, тромбоциты, эритроциты и лимфоциты образуют фибриновый сгусток. 2. Фаза восстановления: (а) нейтрофилы заменяются моноцитами, которые трансформируются в макрофаги. Макрофаги секретируют фактор некроза опухоли а (ФНО-а), интерлейкин-1 (ИЛ-1), интерлейкин-6 (ИЛ-6), трансформирующий фактор роста в (ТФР-в) и ангиогенные факторы; (МСК) (Ь) дифференцируются в остеобласты, прегипертрофические хондроциты и эндотелиальные клетки (с). Прегипертрофические хондроциты образуют богатый коллагеном матрикс Прегипертрофические хондроциты увеличиваются до гипертрофических

хондроцитов, которые высвобождают микровезикулы, покрытые щелочной фосфатазой и содержащие фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), костный морфогенетический белок 2 (ВМР2); (е) VEGF притягивает эндотелиальные клетки, полученные из МСК. Остеобласты также накапливаются. Остеобласты способствуют отложению микрогидроксиапатита на хрящевой матрице для формирования мягкой мозоли. (3) Фаза ремоделирования: а) Остеокласты рассасывают мягкую мозоль. Остеобласты откладывают новую кость, и происходит минерализация с образованием жесткой сотканной мозоли. (Ь) Дальнейшее остеокластическое ремоделирование.

INDIRECT FRACTURE HEALING Примечание - 1. Фаза воспаления; 2. Фаза восстановления; 3. Фаза ремоделирования.

Рисунок 1.2 - Этапы непрямого заживления перелома (M. Chandran, 2024 [70])

Параллельно с образованием хондроидной мягкой мозоли остеобластами при вторичном сращивании начинается набор и инфильтрация остеокластов, остеокласты резорбируют мягкую мозоль, а остеобласты постепенно посредством отложения новой кости заменяют мягкую мозоль на твердую костью. Необходимо

отметит, что остеокласты играют жизненно важную роль в ремоделировании костной мозоли [90, 101]. Так животные с дефицитом остеокластов и получавшие лечение остеопротегерином (ингибитором остеокластогенеза) не демонстрировали каких-либо изменений в сращении перелома, однако показывали значительное ингибирование ремоделирования твердой мозоли [98, 117]. Затем происходят сопряженные циклы активности остеобластов и остеокластов, в результате чего происходит ремоделирование тканей мозоли до исходной кортикальной структуры кости, а также восстанавливается пространство костного мозга.

Стоит отметить, что время заживления перелома отличается в зависимости от сложности и места перелома. Так при переломе позвонков может потребоваться 10-12 недель, при метафизарных переломах длинных костей до 8 недель, а диафизарные переломы длинных костей может занять до 3-4 месяцев. Немаловажную роль в заживлении перелома играет наличие остеопороза.

1.2 Влияние остеопороза на заживление переломов

Факторы, влияющие на ухудшение сращивания переломов могут быть как эндогенные, так и экзогенные. К первым можно отнести возраст пациента [43], пол, наличие остеопороза, вредные привычки [91], наличие сахарного диабета [116], дисфункция щитовидной железы, гиповитаминоз, патология сердечно-сосудистой системы и прием нестероидных и стероидными противовоспалительных средств [113]. К экзогенным факторам относят степень сложности перелома, неудовлетворительное сопоставление костной ткани, обширное поражение прилегающих к перелому окружающих мягких тканей, потерю минеральной плотности костей и инфекционные осложнения.

Проблема влияния остеопороза на процессы консолидации переломов продолжает оставаться предметом дискуссий среди исследователей. Биомеханический анализ патологических изменений костной ткани при данном заболевании свидетельствует о снижении структурной целостности костей вследствие уменьшения плотности минерального компонента и истончения

кортикального слоя, что неизбежно влечет за собой изменение динамических характеристик костной структуры и снижение её способности выдерживать нагрузки, оказывая негативное влияние на процесс репарации перелома и увеличивая пористость кортикального слоя, трабекулярную дезориентацию относительно направления нагрузки и изменения в составе костного матрикса [39]. Костные клетки при остеопорозе могут иметь измененную реакцию относительно процессов пролиферации и секреции трансформирующего фактора роста бета (TGF-P) и оксида азота (N0). Эти данные могут свидетельствовать о возможном нарушении механизмов механической передачи сигналов и регуляторных функций, характерных для патогенеза остеопоротического состояния костной ткани. [62].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Даниленко Антон Павлович, 2026 год

- й

\л/т/п п/нэсю-/- п/нваг-мксАк

Рисунок 3.31 - Динамика показателей ширины костных трабекул при фармакологической коррекции диафиза перелома бедренной кости КсАк у

животных с генотипом ПP-HSD2-/-

Кроме того, результаты биохимического анализа концентрации костной щелочной фосфатазы (маркер остеосинтеза), гидроксипролина и дезоксипринолина (маркер остеорезорбции), позволили дополнительно подтвердить влияние комплексной соли ацексамовой кислоты на репаративные процессы костной ткани у генетически модифицированных животных Hsd2-/-(Рисунок 3.32).

Рисунок 3.32 - Динамика показателей биохимических маркеров регенерации костной ткани у животных при фармакологической коррекции перелома бедренной кости КсАк у животных с генотипом ПP-HSD2-/-

Результаты биохимического анализа согласуются с результатами показателей денситометрии, микроциркуляции и гистоморфологических показателей. В группе животных с генотипом ПP-HSD2-/-обнаружено статистически значимое повышение гидроксипролина и дезоксипринолина, при отсутствии достоверных изменений концентрации костной щелочной фосфатазы. Указанный факт свидетельствует о выраженной активации процессов костной резорбции при отсутствии активации процессов остеосинтеза что и приводит к обнаруженному нарушению процессов костного ремоделирования без лечения. КсАк способствует восстановлению биохимических маркеров. приближая значения их к группе интактных животных.

Таким образом КсАк в дозе 50 мг/кг через четыре недели с момента перелома у животных с генотипом 11P-HSD2-/- эффективно предотвращала снижение регионарной микроциркуляции в костной мозоли и усиливала эндотелийзависимое расслабление сосудов снижая КЭД. Это позволило снизить количество несросшихся переломов у животных без лечения и поддерживать на адекватном уровне процессы костного ремоделирования что также способствовало повышению плотности костной ткани и уменьшению истощения костных трабекул.

3.5.1 Влияние комплексной соли ацексамовой кислоты на экспрессию мРНК генов VEGF и eNOS при переломе у трансгенных животных с отсутствием

экспрессии фермента Пp-HSD2

Для оценки патогенетических звеньев развития остеопороза у трансгенных животных с отсутствием экспрессии 11 P-HSD2-/-, был проведен анализ экспрессии мРНК генов eNOS и VEGF, ассоциированных с развитием эндотелиальной дисфункции у животных на фоне нарушений обмена стероидных гормонов11Р-HSD2-/- (Рисунок 3.33).

Рисунок 3.33 - Динамика показателей экспрессии мРНК генов, фактор роста эндотелия сосудов VEGF и eNOS при фармакологической коррекции перелома бедренной кости КсАк у животных с генотипом ПP-HSD2-/-

Обращает на себя внимание тот факт, что в группе животных с отсутствием экспрессииПP-HSD2 экспрессия мРНК генов, ответственных за эндотелиальную N0- синтазу была ниже, чем у животных дикого типа WT на 16,4 % (Рисунок 3.33).

Анализ ПЦР выявил повышенную мРНК экспрессию генов eN0S и VEGF в бедренной кости у животных 1lp-HSD2-/-, подвергшихся лечению КсАк до уровня близкого к показаниям интактных животных (Рисунок 3.33). В этой связи, фармакотерапевтический подход, в виде КсАк направленный на восстановление ремоделирования костной ткани при переломе у животных с генотипом ПP-HSD2-/- является обоснованным и перспективным, так как во время заживления перелома баланс уровней N0 может иметь решающее значение для правильного выполнения оссификации и ремоделирования.

3.5.2 Влияние комплексной соли ацексамовой кислоты на экспрессию генов проапоптических и антиапоптического фактора при переломе у трансгенных животных с отсутствием экспрессии фермента Hp-HSD2

Одну из центральных ролей в развитии апоптоза играют апоптические гены р53 и Вах и антиапоптический Вс1-2.

Повышение экспрессии генов р53 и Вах и снижение Вс1-2 отмечается у животных с генотипом ПP-HSD2-/-, где средние значения экспрессии генов р53 увеличиваются на 30,1 % и Вах на 15,2 %, а экспрессии генов Вс1-2 снижается на 14,5 % в сравнении с группой животных дикого типа WT/П.

Животные, получавшие лечение КсАк имели статистически значимые показатели снижения экспрессии р53 до уровня 0,91 (р<0,05) и Вах 0,75 (р<0,05) и повышение экспрессии Вс1-2 (0,87) (р<0,05) в сравнении с животными с генотипом ПP-ШD2-/-(Рисунок 3.34).

Таким образом, консолидация экспериментальных остеопоротических переломов диафиза бедра у мышей-самцов с генотипом 11P-HSD2-/- протекает в условиях эндотелиальных повреждений сопровождающейся ухудшением кровоснабжения костной мозоли, увеличением коэффициента эндотелиальной

дисфункции, что в целом отрицательно сказывается на результатах сращивания переломов в группе контроля ^Т/П).

Рисунок 3.34 - Динамика показателей экспрессии мРНК генов, участвующих в апоптозе у животных при фармакологической коррекции диафиза перелома бедренной кости КсАк у животных с генотипом ПP-HSD2-/-

КсАк в дозе 50 мг/кг у мышей-самцов с генотипом 11P-HSD2-7- на фоне перелома оказывают выраженное эндотелиопротективное действие, предотвращают ухудшение кровоснабжения костной ткани бедра и увеличивают количество сращений костно-травматических повреждений. Одновременно изучаемое соединение способствовало повышению экспрессии мРНК генов VEGF и eNOS. При этом отмечалось снижение экспрессии генов проапоптических р53 и Bax и повышение антиапоптического фактора Bel. Результаты биохимического анализа подтвердили положительную динамику изменения концентрации маркер остеосинтеза щелочной фосфатазы и маркеров остеорезорбции гидроксипролина и дезоксипринолина на фоне коррекции перелома комплексной солью ацексамовой кислоты.

3.6 Оценка фармакокинетических свойств комплексной соли ацексамовой

кислоты

Анализ фармакокинетических параметров представляет собой ключевой аспект исследования фармакологических свойств новых активных соединений. Скорость фармакокинетических процессов в значительной степени влияет на действие лекарственного препарата. Все эти процессы взаимосвязаны и взаимозависимы. Понимание фармакокинетических характеристик изучаемого вещества позволяет обосновать выбор способов и методов его введения, определить ткани, в которые оно проникает с наибольшей эффективностью, а также установить основные пути его выведения. На основе экспериментального изучения фармакокинетики можно прогнозировать уровень концентрации препарата в крови, что позволяет разработать предварительную схему дозирования, которую впоследствии можно уточнить в процессе клинических испытаний.

КсАк предварительно растворяли в воде для инъекций в объеме 2 мл и вводили внутрижелудочно в дозе 50 мг/кг с помощью специального зонда. Отбор проб крови проводили из краевой ушной вены уха животного через катетер в объеме 0,3 мл в полипропиленовые пробирки, содержащие 20 мкл 5% ЭДТА перед введением (контроль), через 0,083; 0,17; 0,25; 0,50; 1,00; 1,50; 2,00; 2,50; 3,00; 4,00; 6,00; 8,00; 12,00; 24 часа после введения. Плазму крови отделяли центрифугированием при 5600 g в течение 10 мин и хранили до анализа при температуре - 70 °С.

Количественное определение КсАк и соединений, входящих в состав комплекса 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния 3-пиридинокарбоноата (ЛХТ 2116) и N-ацетил-б-аминогексаноата (ЛХТ 21-18) определяли в плазме на 12 кроликах, оно осуществлялось с использованием системы ВЭЖХ Thermo Fisher Scientific UltiMate 3000 RS LC с тандемным масс-селективным детектором Thermo Fisher Scientific Velos Pro. Масс-спектры ЛХТ 21-18 и (ЛХТ 21-16) были получены в режиме мониторинга множественных реакций (MRM). Хроматографическое

разделение аналитов проводилось с использованием колонки Nova-Pak Silica C18 150x3,9 мм, 4,0 мкм.

С целью реализации качественного разделения аналитов были подобраны следующие элюенты: а) ацетонитрил for LC-MS (Panreac, Испания), b) раствор аммония ацетата PA-ACS (Panreac, Испания). Подвижная фаза содержала смесь 10 mM аммония ацетата в ацетонитриле (5:95, v:v). Скорость потока подвижной фазы

- 1 мл/мин. Температура термостата колонки 40 °С. Объём ввода пробы 1 мкл. Общее время анализа составило 6 мин.

Оптимизация параметров детектирования аналитов осуществлялась методом прямого ввода стандартных растворов в источник ионов шприцевым инжектором в концентрациях близких к пределу количественного определения. Данные отношения массы к заряду (m/z) дочерних ионов и продуктов распада были использованы в качестве аналитического отклика для анализа масс-спектров в режиме положительных ионов путём мониторинга множественных реакций.

Методика валидировалась по следующим показателям: матричный фактор (нижний стандарт качества (LQC) - 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния 3-пиридинокарбоноата (ЛХТ 21-18) 5,3% и для N-ацетил-б-аминогексаноата (ЛХТ 21-16) 4,8%; верхний стандарт качества (HQC) - для ЛХТ 21-18 4,4% и для ЛХТ 2116 3,6%), степень извлечения (нижний предел количественного определения (LLOQ) - для ЛХТ 21-18 92,8% и для ЛХТ 21-16 92,2%, LQC - для ЛХТ 21-18 96,8% и для ЛХТ 21-16 97,2%, средний стандарт качества (MQC) - для ЛХТ 21-18 99,1% и для ЛХТ 21-16 98,1%, HQC - для ЛХТ 21-18 94,4% и для ЛХТ 21-16 93,6%), перенос вещества (отсутствует для всех аналитов), прецизионность (внутри аналитического цикла: LLOQ - для ЛХТ 21-18 10,3% и для ЛХТ 21-16 11,6%, LQC

- для ЛХТ 21-18 7,4% и для ЛХТ 21-16 6,6% , MQC - для ЛХТ 21-18 3,2% и для ЛХТ 21-16 3,1%, HQC -для ЛХТ 21-18 2,0% и для ЛХТ 21-16 1,9%; между аналитическими циклами: LLOQ - для ЛХТ 21-18 3,8% и для ЛХТ 21-16 4,2%, LQC

- для ЛХТ 21-18 2,2% и для ЛХТ 21-16 2,6%, MQC -для ЛХТ 21-18 1,8% и для ЛХТ 21-16 1,8%, HQC - для ЛХТ 21-18 1,4% и для ЛХТ 21-16 1,6%), диапазон определения и линейность (для ЛХТ 21-18 от 4,1 нг до 118000 нг в 1 мл плазмы

крови с R 0,9921 и для ЛХТ 21-16 от 3,8 нг до 118000 нг в 1 мл плазмы крови с R 0,9931).

Фармакокинетическое исследование Хроматографическое определение ЛХТ 21-18 и ЛХТ 21-16 проводили с применением хроматографии в режиме HILIC, для детекции применяли способ селективного мониторинга реакций (SRM) с переходом m/z 174,0 ^ m/z 114,0 и m/z 138,0 ^ m/z 123,0 для целевых веществ.

Таблица 3.4 - Концентрации ЛХТ 21-16 и ЛХТ 21-18 в плазме крови кроликов при пероральном введении после дозирования в виде отдельных компонентов и в

качестве КсАк (n = 6) (нг/мл)

Точки отбора, ч Исследуемые соединения

ЛХТ 21-16 ЛХТ 21-18

Отдельное соединение В комплексе КсАк Отдельное соединение В комплексе КсАк

M SD M SD M SD M SD

0 0,0 - 0,0 - 0,0 - 0,0 -

0,083 487,3 36,6 896,4 344,3 218,0 133,4 43424,3 12109,5

0,167 1051,7 123,4 867,1 135,6 499,4 149,9 63611,3 9956,2

0,25 747,3 147,5 1514,3 414,8 864,8 150,3 111137,1 30519,2

0,5 543,4 135,7 821,9 333,8 996,5 419,6 60296,9 25384,1

1,0 258,3 82,5 181,8 30,7 1509,8 269.4 13294,8 2255,3

1,5 195,7 90,1 99,2 10,2 1466,0 610,4 7229,9 750,3

2,0 162,3 92,7 68,2 27,4 1555,7 839,5 4951,9 1365,6

2,5 122,6 61,8 49,4 3,2 2523,8 2734,9 3570,4 233,6

3,0 110,2 66,4 50,5 4,3 725,0 655,3 2699,4 119,5

4,0 115,0 68,1 41,5 7,6 1430,6 1571,4 2101,3 44,8

6,0 92,9 54,0 51,4 14,9 556,5 585,7 2957,1 1524,4

8,0 74,9 49,1 26,0 5,8 0,0 - 786,4 544,1

12,0 51,5 29,6 15,1 13,5 0,0 - 0,0 -

24,0 6,6 9,2 4,9 5,8 0,0 - 0,0 -

Примечание - М - среднее арифметическое; SD - стандартное отклонение; ЛХТ 2116 - 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния 3-пиридинокарбоноат; ЛХТ 21-18 - №ацетил-6-аминогексаноат; КсАк - комплексная соль ацексамовой кислоты.

Количественную оценку каждого компонента проводили по собственной калибровочной кривой, построенную с использованием 8 уровней концентраций. Времена удерживания аналитов составили 5,3 мин для ЛХТ 21-16 и 2,6 мин для ЛХТ 21-18.

Найденные концентрации исследуемых препаратов представлены в таблице 3.4 и систематизированы для каждого препарата.

Для наглядной демонстрации результатов строили графики зависимости усредненной плазменной концентрации от времени в исходных единицах и в логарифмически преобразованных (по оси абсцисс). Результаты представлены на рисунке 3.35.

2

2

А Б

Рисунок 3.35 - Зависимость плазменной концентрации от времени для ЛХТ 21-16 (А) и ЛХТ 21-18 (Б) в нормальной системе (1) и полулогарифмической системах

координат (2)

1

1

Графики показывают, что для описания профиля «плазменная концентрация-время» достаточно данных, а именно, на стадии абсорбции измерено более 4 точек, на стадиях распределения и элиминации болей трех, 80 % всех измерений находиться вблизи T max.

После получения информации о концентрациях аналитов в дискретные интервалы времени были рассчитаны фармакокинетические показатели, необходимые для оценки относительной биодоступности сравниваемых лекарственных препаратов:

AUCo-t - площадь под кривой «плазменная концентрация - время» с момента дозирования до момента (t) отбора последней пробы биоматериала (24 часа), рассчитанная по методу линейных трапеций на восходящем участке кривой и по методу лог-линейных трапеций на нисходящем участке кривой;

Cmax - максимальная плазменная концентрация за период наблюдения; tmax - время достижения максимальной плазменной концентрации (Cmax) лекарственного вещества в крови кроликов;

f - относительная биодоступность (AUCo-t (K1)/AUCo-t (отдельно)); (Cmax(K1)/AUCo-t (K1)) / (Стах(отдельно)МиСоч (отдельно)) - относительная скорость всасывания;

kei - константа скорости элиминации, рассчитанная с помощью линейного регрессионного анализа конечного участка фармакокинетической кривой в полулогарифмических координатах с наибольшим значением коэффициента регрессии без учета Cmax;

Все последующие процедуры математической обработки данных выполняли с использованием программы Statistica 6.0, MS Excel, программная среда R (version 4.2.0) с установленным пакетом power TOST (version от 21.02.2022 License GPL (> 2).

Оценивая полученные результаты (Таблица 3.5-3.6), можно отметить, что исследуемые аналиты быстро всасываются в системный кровоток.

Таблица 3.5 - Фармакокинетические параметры ЛХТ 21-18 в плазме крови кролика после однократного перорального введения

Пока за тели AUC(o-t) «КсАк» (нг/мл) *мин AUC(o-t) «отдельно» (нг/мл) *мин tmax мин kel Cmax «КсАк», нг/мл Т1/2, мин Cmax(KcAK)/A UCo-t (КсАк), минА(-1) f

M 4681640 474479,7 15 0,0043 111137,1 2,7 0,02349 14,29

SD 1626274 463271,2 0 0,0006 46591,7 (2,5-2,7)1 0,00564 7,0

Мед

иана 4014700 213928,9 15 0,0042 116586,6 2,7 0,02368 16,3

Таблица 3.6 - Фармакокинетические параметры ЛХТ 21-16 в плазме крови кролика после однократного перорального введения

Показ а тели AUC(o-t) «КсАк» (нг/мл) *мин AUC(o-t) «отдельно» (нг/мл) *мин tmax мин kel C max «КсАк», нг/мл Т1/2, мин C max (КсАк)/АиС<м (КсАк), минА (-1) f

M 80274,1 116570,3 15 0,062 1514,3 4,8 0,01836 0,78

SD 10908,4 57779,6 0 0,004 634,5 (3,4-5,1)1 0,00559 0,30

Media n 81880,5 94064 15 0,060 1588,5 5,3 0,0194 0,70

Количественный анализ показывает положительный контроль уже на 5 минуте (0,083ч). Cmax достигается на 10 минутах для ЛХТ 21-18 и 15 минутах для ЛХТ 21-16. С точки зрения лекарственных форм немедленного высвобождения, в направлении которых предполагается дальнейшее развитие изучаемых активных молекул, повышенная скорость оказания терапевтического эффекта - неоспоримое преимущество.

Однако данное исследование позволило выявить одно из основных преимуществ синтезированного комплекса КсАк - более высокую относительную биодоступность (f) для ЛХТ 21-18 (Таблица 3.5). Результаты показали, что в среднем при дозировании комплексом «КсАк» f ЛХТ 21-18 превышала в 14(±7) раз

по сравнению с отдельным дозированием. Немаловажным фактом является, и разница в Cmax, составляющая более чем 40-кратное различие по отношению к дозированию в отдельном виде (Таблица 3.4). Такие показатели, как скорость всасывания kei, Cmax (КсАк)/АиСоч(КсАк) и tmax практически не отличаются (в пределах межиндивидуальных отклонений), что хорошо коррелируется с предположением о разложении с комплекса в момент абсорбции из желудочно-кишечного тракта. Данные фармакокинетического анализа соединения ЛХТ 21-18 в виде отдельного компонента и в виде «КсАк» в последующих временных интервалах отбора проб схожи между собой.

Оценивая данные в отношении ЛХТ 21-16, можно отметить, что комплекс КсАк практически не оказал влияние на фармакокинетические характеристики. f близка к 1, различия между AUC(o-t) КсАк и AUC(o-t) «отдельно» находятся в пределах межиндивидуальных различий.

Становится очевидным, что применяемый подход с использованием супрамолекулярного комплекса КсАк в качестве «носителя» для ЛХТ 21-18 позволит существенно снизить дозировку, уменьшить токсические эффекты и повысить фармакоэкономические показатели готовой лекарственной формы за счет многократного повышения биодоступности.

Результаты полученного исследования позволили получить существенную информацию о свойствах фармакокинетического и фармакологического характера о КсАк на основе N-ацетил-б-аминогексаноата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния 3-пиридинокарбоноата. Известно, что ацексамовая кислота оказывает большую часть своих биологических эффектов при местном применении или в виде раствора, имея невысокую биологическую активность за счет низкой биодоступности. Как показали результаты фармакокинетического исследования путем топохимического синтеза удалось улучшить биодоступность ацексамовой кислоты в 14,3 %.

Исследование фармакокинетических показателей ацексамовой кислоты in vivo показало разницу в достижении показателей максимальной концентрации во времени в зависимости от исследуемой формы: при введении монокомпонента

максимальная концентрация соединения (2 523,8 нг/мл) в плазме крови кроликов была отмечена через 2 часа 30 минут; при введении супрамолекулярного комплекса «КсАк» значение максимальной концентрации увеличилось в 44 раза (111 137,1 нг/мл) и было достигнуто за 15 минут. Также отмечено увеличение времени выведения препарата из крови животных при использовании фармацевтической композиции. Так, при введении монопрепарата ацексамовой кислоты через 8 часов отклика детектора на аналитический компонент уже обнаружено не было, тогда как анализ плазмы крови кроликов из группы исследования комплекса КсАк показал плавную кривую снижения концентрации аналита с последним его обнаружением через 8 часов после дозирования. Однако, с учётом высокого значения коэффициента вариации (CVmean = 148,5%) для ацексамовой кислоты в виде отдельного компонента в диапазоне 2,5 - 6 ч, нельзя достоверно установить корреляцию между значениями концентраций в данном промежутке времени.

Данные фармакокинетического анализа комплексной соли ацексамовой кислоты на основе N-ацетил-б-аминогексаноата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния 3-пиридинокарбоноата при пероральном введении показали повышение биодоступности соединения ЛХТ 21-18 в среднем в 14,3 раза. Также было выявлено увеличение максимальной концентрации более чем в 40 раз по сравнению с отдельно дозируемыми веществами. Сравнительный анализ показал, что существенное влияние на ЛХТ 21-18 происходит на стадии абсорбции, после полного всасывания поведение молекул в сравнении с отдельными веществами не наблюдается. Влияние комплексной соли ацексамовой кислоты на ЛХТ 21-16 практически не наблюдается. Таким образом, комплексная соль ацексамовой кислоты на основе N-ацетил-б-аминогексаноата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния 3-пиридинокарбоноата имеет неоспоримые перспективы для создания пероральной лекарственной формы и требует дальнейшего изучения.

ОБСУЖДЕНИЕ

Во всем мире ежегодно 100-200 миллионов человек подвергаются риску остеопоротического перелома. Статистика предсказывает, что с увеличением продолжительности жизни уже к 2030 году число мужчин и женщин с остеопорозом увеличится на 89% и 69%, что приведет к 800 000 и 1,8 миллиона переломов шейки бедра в год соответственно [11, 73, 75]. Кроме того, лечение остеопоротических переломов затруднено из-за низкого качества костной ткани, что вызывает проблемы с недостаточной прочностью фиксации имплантатов, используемых для стабилизации перелома до сращения. Различные отчеты указывают на частоту несращения в 2-10%, частоту смещений после операции - 440%, частоту поломок металлоконструкций - 1-10% и частоту повторных операций - 3-23% [76, 125].

В связи с тем, что остеопороз один из основных факторов риска возникновения переломов, современные исследования в данной области в основном сосредоточены на его профилактике. Но в последние годы появляется все больше данных об изменении заживления переломов в остеопоротической кости, что может иметь важное значение для выбора тактики лечения данной категории пациентов. Механизмы влияния остеопороза на заживление переломов до сих пор не выяснены, и клинических данных по-прежнему недостаточно [17, 79, 83, 84]. Так известно, что потеря кортикального слоя кости во время остеопороза происходит за счет уменьшения толщины кости и увеличения пористости, что снижает ее прочность. Потеря трабекулярной кости приводит к истончению, перфорации и снижению связности между трабекулярными пластинками. Обилие губчатого вещества кости отрицательно влияет на фиксацию остеопоротических переломов. В этой связи, дорогостоящее социально-экономическое и личное бремя для пациентов, связанное с переломами, побуждает исследователей к поиску новых способов такой сложной проблемы как регенерация костной ткани в условиях остеопороза [99, 119].

Стоит отметить, что современные средства применяемые для улучшения регенерации костной ткани на фоне остеопороза полностью не отвечают требованиям, предъявляемым к ним, так как проявляют недостаточную эффективность и имеют побочные эффекты, среди которых могут быть такие как остеонекроз челюсти, раздражение слизистой оболочки желудка и пищевода, нарушение минерализации кости, гиперкалиемия.

Перспективными в этом направлении могут оказаться соединения с ацексамовой кислотой [104], в частности ее комплексная соль, состоящая из производных 3-оксипиридина: 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния 3-пиридинокарбоноата и N-ацетил-б-аминогексаноата в соотношении 1:1, полученная путем топохимического синтеза [13].

Производные 3-оксипиридина известны широким спектром фармакологической активности, в частности в ряде работ подтверждается их влияние на рецепторы костного морфогенетического белка (BMPR 1A, 2) и активатора ядерного фактора каппа В (RANKL), а также на клетки-носители указанных рецепторов: остеоциты, остеобласты, хондроциты, метаболизм оксида азота и снижение активных форм кислорода, факторов вносящих значительный вклад в ряд серьезных заболеваний, в том числе в процессы регенерации костной ткани [3, 7, 19, 20, 99]. Анализ перспективы применения комплексной соли ацексамовой кислоты в регенерации костной ткани на фоне остеопороза в экспериментальном исследовании включал несколько ключевых этапов (Рисунок 3.36).

В результате проведенного компьютерного прогноза биологической активности комплексной соли ацексамовой кислоты было установлено, что по всем ключевым критериям сходства с лекарственными препаратами, разработанным Липински, Гоузом, Вебером и Иганом и Muegge комплексная соль ацексамовой кислоты демонстрируют четкое соответствие всем оцениваемым критериям (Absorbtion, Distribution, Metabolism, Excretion, Toxicity).

Рисунок 3.36 - Этапы экспериментальных исследований

Прогнозируя высокий потенциал комплексной соли ацексамовой кислоты в качестве перспективного лекарственного средства, был проведен анализ токсикологической характеристики соединения, который позволил отнести ее к четвертому классу токсичности, что характеризует его как малотоксичное. При компьютерном прогнозировании наиболее вероятных вариантов биомишеней были исследованы: эндотелиальная синтетаза оксида азота (eNOS), фактор роста

эндотелия сосудов (VEGF), активатор рецептора лиганда NF-kB (RANKL), фактор некроза опухоли (TNF-a), костный морфогенетический белки (BMP-2), остеопротегерин (OPG). Показано, что наиболее сильное связывающее сродство комплексной соли ацексамовой кислоты с происходило с лигандами молекулярных биомишеней в следующей последовательности (в порядке убывания) eNOS> VEGF> RANKL> TNF-a> RANK> BMP-2> OPG.

Исследование in vitro подтвердило влияние комплексной соли ацексамовой кислоты на пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток. Так в ходе исследования было установлено, что пролиферативная активность МСК по сравнению с положительным контролем увеличивается при содержании в питательной среде субстанции комплексной соли ацексамовой кислоты в меньшем количестве - 0,5 мкг/мл, чем препарата-референс этилметилгидроксипиридина сукцинат - 1 мкг/мл. Кроме того, увеличение дозы субстанции в питательной среде до 0,5 мг/мл снижает пролиферативную активность МСК до 69,23%, тогда как препарат референс при увеличении содержания до 1 мг/мл в питательной среде не вызывал как резкого снижения, так и активацию пролиферативной активности МСК. В экспериментах in vitro с использованием мезенхимных стволовых клеток комплексная соль ацексамовой кислоты в дозе 0,5 мкг/мл способствует увеличению метаболической активности и как следствие стимулирующего действием на пролиферацию, превосходя по своей активности препарат этилметилгидроксипиридина сукцинатв дозе 1 мкг/мл.

Животные модели имеют основополагающее значение для углубления знаний о патофизиологии потери костной массы и изучения фармацевтических контромер. Поэтому в работе для оценки фармакологической эффективности комплексной соли ацексамовой кислоты на репаративную регенерацию костной ткани при переломе с остеопротическим повреждением были выбраны несколько экспериментальных моделей остеопороза с различными звеньями патогенеза.

Модель перелома у мышей с постменопаузальным остеопорозом, где пусковым механизмом развития прежде всего является дефицит эстрогенов, обеспеченный путем проведенной овариэктомии. Через 56 дней с момента

двухстороннего удаления яичников, животным моделировали перелом метафеза бедренной кости и начинали ежедневное пероральное введение комплексной соли ацексамовой кислоты в течение 28 дней в дозе 50 мг/кг. К окончанию эксперимента, у животных которым проводили лечение комплексной солью ацексамовой кислоты отмечалось увеличение количества сращивания переломов в 4 раза, в сравнении с группой контроля, повышение плотности костной ткани на 26,9 % (р<0,05), статистически значимое увеличение микроциркуляции на 44,6 % (р<0,05) и 1,9 раза (р<0,05) снижение КЭД в сравнении с группой контроля. Характеризуя качественные характеристики костной ткани, хочется отметить что средняя ширина трабекул кости у животных в группе контроля снижалась на 29 % (при р < 0,05) и достигала уровня 42,91 ± 0,7 (при р < 0,05) мкм, тогда как в группе с применением комплексной соли ацексамовой кислоты этот показатель статистически значимо повышался до уровня 57,23 ± 0,7 мкм (при р < 0,05).

Алендроновая кислота в 2 раза увеличивала сращивание переломов и на 23,1 % (р<0,05) повышала плотность костной ткани к концу эксперимента в сравнении с группой контроля. Однако на функциональные показатели микрососудистого русла костной ткани, статистически значимого влияния не оказывала. Стоит отметит, что на моделях гипоэстроген-индуцированного остеопороза значительную роль играют повреждения интимальных структур микрососудов [22, 26, 44]. Субстанция комплексной соли ацексамовой кислоты продемонстрировала значительный вклад по влиянию на микроциркуляцию костной ткани и КЭД, факторов, которые могут оказывать влияние на состояние костных структур, и быть определяющими для регенерации костной ткани в том числе и постменопаузальном остеопорозе.

Модель перелома у мышей на фоне стероид-индуцированного остеопороза, животным в течение 36 дней, через каждые 5 дней вводили внутрибрюшинно метилпреднизалон в дозе 2,5 мг/кг, на 37 день животным проводили перелом костной ткани метафеза бедренной кости и начинали введение изучаемых соединений. К концу эксперимента у всех 10 животных которым проводили лечение КсАк наблюдали сращивание перелома. Применение в качестве

фармацевтической поддержки алендроновой кислоты приводило к 1 несросшемуся перелому в группе. Соединение КсАк и препарат-референс алендроновая кислота повысили плотность костной ткани к концу эксперимента на 27,2 % (р<0,05) и 21,6 % (р<0,05) соответственно. Результаты лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) позволили констатировать достоверно более высокий уровень микроциркуляции в костной мозоли (111,01±19,3 п.е. (р<0,05)) у животных, которым в качестве терапии для улучшения регенерации костной ткани ежедневно вводили комплексную соль ацексамовой кислоты в дозе 50 мг/. А коэффициент эндотелиальной дисфункции снижался до значений 1,42 ±0,1 (р<0,05), тогда как в группе контроля этот показатель составил 2,22 ±0,2 (р<0,05). Алендроновая кислота улучшала показатели регенерации костной ткани за счет известных механизмов влияния на связывание с гидроксиапатитом, основным минеральным компонентом костной ткани и счет ингибирования фермента фософатазы, который необходим для нормального функционирования остеокластов. Это и могло приводит к нарушению энергетического обмена в остеокластах и их апоптозу (программируемой клеточной смерти). Однако статистически значимых результатов по влиянию на показатели микроциркуляции в костной ткани и КЭД у алендроновой кислоты в эксперименте не подтвердилось. Хотя в ряде экспериментальных работ указывается на возможность эндотелиопротекторного эффекта бифосфонатов, в том числе и алендроновой кислоты, за счет антиоксидантной активности и снижения воспалительного процесса в эндотелии [30].

В процессе изучения молекулярно-клеточных механизмов, обусловливающих развитие потери минеральной плотности кости при остеопорозе, установлено, что повышение концентрации кортизола оказывает выраженное ингибирующее воздействие на процессы дифференцировки и формирования остеобластов, приводя к значительному угнетению активности костного ремоделирования и резкому уменьшению минерализации костной ткани [123]. Это нарушение вызывает дисбаланс между процессами остеогенеза и остеорезорбции. Ведущими энзиматическими системами, контролирующими метаболизм кортизола, являются изоформы 11^-гидроксистероиддегидрогеназ типов 1 (110-

HSD-1) и 2 (11P-HSD-2). Данные ферменты осуществляют взаимное превращение биологически активных форм глюкокортикоидов (кортизол, кортикостерон) и соответствующих неактивных кетоаналогов (кортизон, 11-дегидрокортикостерон), обеспечивая регуляцию тканевого уровня и функциональной активности стероидных гормонов. [6, 10, 23]. Экспериментальная модель развития остеопороза была смоделирована в центре доклинических и клинических исследований Белгородского государственного национального исследовательского университета. Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 25-14-00244). У трансгенных животных с отсутствием экспрессии 1ip-HSD2-/-(Hsd2-/-) было продемонстрировано по всем показателям наличие костной резорбции обусловленной активацией дифференцировки остеокластов, преобладающих над процессами остеосинтеза [66].

В этой связи в качестве еще одной, модели остеопороза и перелома на его фоне были выбраны трансгенные животные с нулевой экспрессией 11fi-HSD2 (Hsd2-/-). Количество животных с несросшимися переломами составило 3 животных из 10 что составляет 30% в группе животных без фармацевтической поддержки. В группе мышей с генотипом 11P-HSD2-/- +ПК, после ежедневного перорального введении КсАк был обнаружен 1 несросшийся перелом. Уровень показателей плотности костной ткани, микроциркуляции и КЭД под влиянием соединения комплексной соли ацексамовой кислоты в условиях перелома соответствовало все контрольным значениям. При проведения морфологических исследований в костных структурах у животных с генетическим профилем Hsd2-/- которым проводили коррекцию КсАк были выявлены позитивные структурные трансформации в губчатой костной ткани бедренной кости, выраженные в утолщении сетевой структуры костных трабекул. Дополнительно зафиксировано статистически значимое повышение средней величины трабекулярных элементов губчатого вещества в области проксимального метаэпифизарного отдела бедренной кости, кроме того, в зоне перелома были отмечены регенераторные изменения, связанные с достоверным неоостеогенезом. Результаты биохимического анализа изменений процессов костного метаболизма на фоне

комплексной соли ацексамовой кислоты приводили к повышению уровня щелочной фосфатазы (маркер остеосинтеза), и снижению уровня гидроксипролина и дезоксипринолина (маркер остеорезорбции).

Для понимания биологических процессов у трансгенных животных с генотипом ПP-HSD2-/- и определения биологических мишеней для терапевтических методов эффективной регенерации костной ткани был использован анализ экспрессии генов, который позволил оценить эффективность лечения комплексной солью ацексамовой кислоты, отслеживая изменения в экспрессии генов, принимающих участие в регенерации костной ткани. Результаты полученные в эксперименте показали, что введение мышам-самцам с генотипом ПP-HSD2-/- комплексной соли ацексамовой кислоты способствует увеличению экспрессии мРНК генов eNOS - в 1,6 раза (р < 0,05) и VEGF- в 2,3 раза (р < 0,05) соответственно, генов, ассоциированных с развитием эндотелиальной дисфункции у животных на фоне нарушений обмена стероидных гормоновПP-HSD2-/-, что объясняет положительное влияние соединения на уровень микроциркуляции в костной ткани и КЭД. Кроме того при применении КсАк происходило повышение уровня мРНК антиапоптического фактора Вс12 - в 1,8 раза (р <0,05), и снижение экспрессии генов мРНК проапоптических факторов р53 - в 2,1 раза (р <0,05). и Вах - в 1,5 раза (р < 0,05) соответственно.

Комплексная оценка регенеративной активности исследуемого соединения на всех трех моделях с различным патогенезом развития остеопороза показывает, что КсАк в дозе 50 мг/кг улучшает регенерацию костной ткани на всех экспериментальных моделях остеопороза. Особо хотелось бы отметить положительную динамику на коррекцию сосудистых повреждений в костной мозоли, которую связывают с их антиоксидантными свойствами изучаемого соединения. Известно, что производные 3-оксипиридина взаимодействуют с образующимися в ходе перекисного окисления липидов (ПОЛ) перокси- и алкокси-радикалами за счёт легкоподвижного атома водорода фенольной группы в составе молекулы. Связывая свободные радикалы активных форм кислорода [36, 38], они угнетают процессы ПОЛ, что, способствует увеличению содержания метаболитов

NO в плазме крови [20, 106]. А так как эндотелиальный слой внутрикостных сосудов является неотъемлемой частью кости и играет центральную регуляторную роль в регуляции кровоснабжения костной ткани, обладая значительной метаболической активностью, одновременно выполняя различные функциональные процессы, включая регуляцию адгезии лейкоцитов, регуляцию роста сосудов, атромбогенность и тромбогенность стенки сосуда, а также иммунные функции что делает эндотелий одной из фармакологических мишенией при повреждении костной ткани [35]. Сами эндотелиальные клетки продуцируют множество биологически активных веществ, участвующих в регуляции сосудистого тонуса. Оксид азота NO образуется в эндотелиальных клетках из L-аргинина катализируемой синтазой оксида азота (NOS), имеющей имеет три изоформы: нейрональную (nNOS, NOS1), индуцибельную (iNOS, NOS2) и эндотелиальную (eNOS, NOS3). Считается, что наиболее важной изоформой NOS для заживления ран и костей является - eNOS и iNOS, однако все три изоформы играют свою роль [96]. Цитокины, в частности IL-1 и TNFa, стимулируют выработку NO за счёт активации iNOS и eNOS [122]. Во время острой воспалительной фазы заживления перелома повышенная активность eNOS в кровеносных сосудах, окружающих перелом, приводит к увеличению выработки оксида азота, расширению сосудов и облегчению доставки воспалительных клеток и цитокинов к месту перелома. Важно отметить, что у пациентов с нарушениями сосудистой функции заживление переломов происходит медленнее [118]. Нейтрофилы, макрофаги и тучные клетки мигрируют в место перелома как часть острой воспалительной реакции. Инфильтрирующие макрофаги и тучные клетки увеличивают экспрессию iNOS, дополнительно усиливая высвобождение NO [85]. Важность NO-опосредованного привлечения воспалительных клеток очевидна и позже при заживлении кости, когда макрофаги M1 поляризуются в сторону макрофагов M2 вовремя эндохондрального окостенения. Нарушения в этом процессе могут привести к длительному воспалению, замедленной резорбции хрящевой ткани и нарушению окостенения, что приводит к несращению [88]. Таким образом, во время заживления переломов необходимый уровень NO может

иметь решающее значение для правильного протекания процессов окостенения и ремоделирования. Конкретный механизм, с помощью которого оксид азота регулирует работу остеобластов и остеокластов, сложен и до конца не изучен, но известно, что он включает в себя как цГМФ-зависимые, так и цГМФ-независимые пути. В клетках остеобластной линии низкие дозы оксида азота способствуют дифференцировке, пролиферации и выживанию клеток, и эти эффекты опосредованы цГМФ-зависимым путём. В остеобластах присутствие оксида азота активирует растворимую гуанилатциклазу, что приводит к повышению уровня цГМФ, который воздействует на множество нижестоящих мишеней, таких как цГМФ-зависимые протеинкиназы, которые обеспечивают рост костной ткани [74]. Было также доказано, что оксид азота постоянно вырабатывается в остеобластах в небольших количествах и, как считается, защищает остеобласты от окислительного стресса и помогает поддерживать гомеостаз скелета [95]. Механизм, с помощью которого оксид азота защищает остеобласты от окислительного стресса, связан с антиапоптотическим митохондриальным путём. АФК инициируют митохондриальную апоптотическую сигнализацию и подавляют экспрессию остеогенных маркеров, ослабляя остеогенез [100]. Сигнальные пути МАРК и кВ опосредуют положительное влияние АФК на дифференцировку остеокластов [95]. Антиоксидантные ферменты и препараты, обладающие антиоксидантной активностью, не только устраняют негативное влияние АФК, но и напрямую участвуют в регуляции метаболизма костной ткани. Целенаправленное лечение окислительного стресса может значительно оптимизировать терапевтический график различных методов лечения остеопороза и переломов.

Полученные результаты исследований позволяют выдвинуть предположение, согласно которому КсАк способна оказывать свое влияние на процесс восстановления костной ткани при развитии остеопороза благодаря нескольким механизмам действия:

Во-первых, КсАк способствует повышению синтеза оксида азота (N0), связывая свободные радикалы активных форм кислорода. А повышение уровня N0 играет одну из ведущих ролей в регуляции сосудистого тонуса, клеточной

сигнализации и процессах воспаления, способствуя активации процессов образования новых кровеносных сосудов (ангиогенез). Улучшение кровоснабжения поврежденных участков кости способствует ускорению её регенерации, поскольку кислород и питательные вещества доставляются быстрее и эффективнее.

Рисунок 3.37- Предполагаемые мишени улучшения репаративных процессов костной ткани при применении КсАк на различных экспериментальных моделях

остеопороза

Во-вторых, подтверждено влияние КсАк на экспрессию факторов, препятствующих апоптозу клеток костных тканей (антиапоптический ряд). Это особенно важно у трансгенных животных с генетическим дефектом 110-гидроксистероиддегидрогеназы второго типа (HSD2), характеризующимся повышенной чувствительностью клеток к повреждению и гибели вследствие

нарушения метаболизма глюкокортикоидов.

Таким образом, подавление избыточного апоптоза позволяет сохранить большее количество жизнеспособных клеток и улучшить восстановление структуры костной ткани. Полученные данные могут свидетельствовать о многофакторном механизме реализации положительных эффектов комплексной соли ацексамовой кислоты (КсАк) на регенерацию костной ткани при различной патологии остеопорозного характера.

Ряд предполагаемых мишеней комплексной соли ацексамовой кислоты при переломах на фоне остеопороза представлен на рисунке 3.34.

Анализ проведенного фармакокинетического исследования подтвердил перспективность дальнейших исследований КсАк, характеризуя ее как соединение с более высокой биодоступностью при пероральном применении в сравнении с отдельно взятыми компонентами входящими в состав изучаемого комплекса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итоги выполненного исследования

Комплексная соль ацексамовой кислоты обладает потенциалом в отношении улучшения репаративной регенерации костной ткани, что подтверждается результатами исследований in vitro и in vivo. В исследовании in vitro комплексная соль ацексамовой кислоты способствует увеличению пролиферативной активности МСК, в исследовании in vivo улучшает процессы сращивания переломов на различных экспериментальных моделях остеопороза, обеспечивая улучшение показателей плотности костной ткани, толщины костных трабекул, одновременно снижая показатели эндотелиальных повреждений. На модели остеопоротического перелома у трансгенных животных с нулевой экспрессией 11P-HSD2, комплексная соль ацексамовой кислоты кроме улучшения функциональных и биохимических показателей, способствовала предотвращению ухудшения кровоснабжения костной ткани, обеспечивая повышение экспрессии мРНК генов VEGF и eNOS. При этом снижая экспрессию проапоптических генов р53 и Bax и повышая уровень антиапоптического фактора Bcl-2.

По результатам проведенного исследования комплексная соль ацексамовой кислоты является перспективным терапевтическим средством для улучшения регенерации костной ткани. Ее комплексный механизм действия, сочетающийся с высокой биодоступностью, что подтверждают результаты фармакокинетических исследований, делает ее многообещающим кандидатом для разработки эффективного фармакотерапевтического агента, способного обеспечить повышение регенерации костной ткани при переломах.

Научно-практические рекомендации

Результаты исследования позволяют рекомендовать комплексную соль ацексамовой кислоты для дальнейших доклинических и клинических исследований с целью создания потенциального лекарственного средства, обладающего влиянием на репаративные процессы костной ткани, в виде оптимизации процессов сращения переломов, улучшения кровоснабжения и

стимуляции остеогенеза, имеющего низкий уровень токсичности и высокую биодоступность при пероральном применении.

Перспективы дальнейшей разработки темы

1. Разработка пероральной лекарственной формы с содержанием комплексной соли ацексамовой кислоты с учетом фармакокинетических характеристик соединения и поиска оптимальных технологических подходов, что позволит рекомендовать перспективную лекарственную форму с высокой вероятностью эффективности при остеопоротических переломах.

2. Проведение дальнейшего изучения предварительной схемы дозирования комплексной соли ацексамовой кислоты, которую впоследствии можно уточнить в процессе клинических испытаний.

3. Дополнительное изучение механизмов действия комплексной соли ацексамовой кислоты с учетом патогенеза развития остеопороза и переломов на его фоне.

4. Разработка и внедрение новых методов диагностики остеопороза, с учетом зарубежного опыта (радиочастотная эхографическая мультиспектрометрия, расчет трабекулярного костного индекса, высокоразрешающая периферическая количественная КТ, генетическое тестирование) для диагностики риска развития остеопороза и переломов на его фоне.

ВЫВОДЫ

1. Комплексная соль ацексамовой кислоты соответствует всем критериям Липински и относится к четвертому классу токсичности, что характеризует соединение как малотоксичное. Степень энергии связывания комплексной соли ацексамовой кислоты с биологическими мишенями ранжируются следующим образом: eNOS > VEGF > RANKL > TNF-a > RANK > BMP-2 > OPG.

2. В экспериментах in vitro с использованием мезенхимных стволовых клеток комплексная соль ацексамовой кислоты в дозе 0,5 мкг/мл способствует увеличению метаболической активности и, как следствие, стимулирующему действию на их пролиферацию, превосходя по своей активности этилметилгидроксипиридина сукцинат в дозе 1 мкг/мл.

3. Комплексная соль ацексамовой кислоты в дозе 50 мг/кг при однократном внутрижелудочном введении мышам в течение эксперемента при переломе на фоне гипоэстроген- и стероид-индуцированного остеопороза снижает количество несращений переломов в 4 и 2 раза (р<0,01), предотвращает снижение плотности костной ткани в 1,5 и 1,2 раза (р<0,05), предотвращает снижение уровня микроциркуляции на 44,6% и 34,2% (р<0,05), снижает КЭД до значений 1,5 и 1,3 (р<0,05), а также увеличивает ширину костных трабекул на 27,3% и 21,4% (p<0,05), соответственно, превосходя эффективность препарата-референса алендроновой кислоты.

4. Комплексная соль ацексамовой кислоты в дозе 50 мг/кг при введении 1 раз в сутки в течение 28 дней у мышей-самцов с нулевой экспрессией фермента 11P-HSD2 (Hsd2-/-) вызывает снижение количества несросшихся переломов в 3 раза, повышение плотности костной ткани на 14,6% (р <0,05), повышение уровня микроциркуляции на 10,8% (р <0,05) и снижение КЭД в 1,9 раза (р <0,05). Кроме того, снижает выраженность процессов апоптоза - в среднем на 19,55% (р<0,05) и повышает показатели экспрессии факторов роста эндотелия сосудов в среднем на 9,6% (p<0,05) в сравнении с группой животных с нулевой экспрессией фермента 11P-HSD2 без фармакологической поддержки.

5. Данные фармакокинетического анализа комплексной соли ацексамовой кислотына основе №ацетил-6-аминогексаноата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния 3-пиридинокарбоноата при пероральном введении показали повышение биодоступности комплексного соединения в среднем в 14,3 раза. Также было выявлено увеличение максимальной концентрации более чем в 40 раз по сравнению с отдельно дозируемыми веществами, входящими в состав комплекса.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

11Р-ЖО1 - фермент 11^-гидроксистероиддегидрогеназа 1 типа 11Р-ЖО2 - фермент 11^-гидроксистероиддегидрогеназа 2 типа Белок р53 - транскрипционный фактор апоптоза ИЛ-1 - интерлейкин-1 ИЛ-6 - интерлейкин-6

КсАк - комплексная соль ацексамовой кислоты МСК - мезенхимальные стволовые клетки ПМПО - постменопаузальный остеопороз ФНО-а - фактор некроза опухоли а

ВАХ - проапоптотический белок митохондриального пути активации апоптоза

В1с-2 - антиапоптотический белок

ВМО - минеральная плотность костной ткани

ВМР-2 - костный морфогенетический белок-2

eNOS - эндотелиальная синтаза оксида азота

FPPS - фарнезилпирофосфатсинтазу

IGF1 - нсулиноподобный фактор роста 1

iNOS - индуцибельная синтаза оксида азота

№-кВ - ядерного фактора каппа-В

OPG - остеопротегерин

PDGF - фактор роста тромбоцитов

РТГ - паратиреоидный гормон

РТНгР - паратиреоидный гормон-связанный белок

ЯАККЬ - активатор рецептора лиганда ядерного фактора каппа-В

SERM - селективный модулятор эстрогеновых рецепторов

TGF-P - трансформирующий фактор роста в

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алхататнех Башар Абед Саллам. Регенеративные и косметические эффекты топических лекарственных форм солей ацексамовой кислоты при ожоговых поражениях кожи (экспериментальное исследование) : специальность : специальность 3.3.6. «Фармакология, клиническая фармакология» : автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. мед. наук / Алхататнех Башар Абед Саллам. - Саранск, 2023. - 23 с.

2. Влияние 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния N-ацетил-б-аминогексаноата на микроциркуляцию в костной ткани у мышей с нулевым уровнем llß-гидроксистероиддегидрогеназы 2-го типа / А.П. Даниленко, О.С. Гудырев, А.А. Хентов [и др.] // Генетические технологии для биологии и медицины : сборник материалов междунар. науч.-практ. конф., Белгород (Россия), Дэчжоу (Китай), ноябрь 2024 г. / под ред. М.В. Покровского. - Белгород, 2024. - С. 20-22.

3. Влияние L-изомера 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния гидроксибутандиоата на коррекцию эндотелиальной дисфункции / А.В. Кузнецов, Т.В. Пузанова, А.А. Хентов [и др.] // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2025. - Т. 24, № 6S. - С. 211. - (XXXII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», 14-17 апреля 2025 г. : сборник тезисов).

4. Гудырев, О.С. Остеопротективное действие эналаприла и лозартана при экспериментальном остеопорозе и переломах на его фоне : специальность 14.00.25 «Фармакология, клиническая фармакология» : автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. мед. наук / О.С. Гудырев ; [Место защиты: Курский гос. мед. ун-т МЗ РФ]. - Курск, 2008. - 22 с.

5. ГОСТ 33044-2014. Межгосударственный стандарт. Принцип надлежащей лабораторной практики.

6. Даниленко, А.П. Влияние 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния N-ацетил-6-аминогексаноата на коррекцию остеопороза у генетически модифицированных мышей с нарушениями энзиматической регуляции обмена стероидных гормонов / А.П. Даниленко // Генетические технологии для биологии

и медицины : сборник материалов междунар. науч.-практ. конф., Белгород (Россия), Дэчжоу (Китай), ноябрь 2024 г. / под ред. М.В. Покровского. - Белгород, 2024. - С. 16-20.

7. Даниленко, А.П. Комплекс производных 3-оксипиридина с ацексамовой кислотой ингибирует резорбцию костной ткани при остеопорозе и переломов на его фоне / А.П. Даниленко // НИИ фармакологии живых систем: семь лет пассионарного развития : сборник материалов всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Белгород, 10 апр. 2023 г. / НИУ «БелГУ» ; под ред. М.В. Покровского. - Белгород, 2023. - С. 8-9.

8. Доказательные аспекты стимулирования заживления неосложненной раны при локальном применении серебряной соли ацексамовой кислоты / Д.В. Пахомов, Е.В. Блинова, Д.Н. Шимановский [и др.] // Оперативная хирургия и клиническая анатомия (Пироговский научный журнал). - 2020. - Т. 4, № 1. - С. 1925.

9. Драгунова, Н.В. Состояние костно-мышечной системы при эндогенном гиперкортицизме / Н.В. Драгунова, Ж.Е. Белая, Л.Я. Рожинская // Остеопороз и остеопатии. - 2012. - Т. 15, № 3. - С. 18-24.

10. Есаулов, А.Д. Особенности нарушения метаболизма при тяжелой механической травме, протекающей на фоне стероидного остеопороза, и принципы ее коррекции : специальность 14.03.03 «Патологическая физиология» : автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. мед. наук / А.Д. Есаулов ; [Место защиты: Донецкий нац. мед. ун-т им. М. Горького М-ва здравоохранения ДНР]. -Донецк, 2019. - 23 с.

11. Ершова О.Б. Эпидемиология переломов проксимального отдела бедренной /О.С. Синицына, К.Ю. Белова, О.А. Ганерт [и др.] // Фарматека. - 2022. - Т. 1 С. 12.

12. Корокин, М.В. Роль метаболизма кортизола в реализации патогенетических звеньев развития остеопороза - обоснование поиска новых фармакотерапевтических мишеней (обзор) / М.В. Корокин, О.В. Солдатов О.С.

Гудырев и [и др.] // Научные результаты биомедицинских исследований. - 2022. -Т. 8 С. 457-473.

13. Комплексные соли ацексамовой кислоты, стимулирующие регенерацию костной ткани, ускоряющие процессы репаративного остеогенеза, стимулирующие минерализацию костной ткани при остеопорозе : патент 2668966 Российская Федерация : МПК C07D 213/65 (2006.01), C07C 233/47 (2006.01), A61K 31/195 (2006.01), A61K 31/4412 (2006.01), A61P 19/10 (2006.01) / С.Я. Скачилова, Г.А. Ермакова, Е.В. Блинова [и др.] ; патентообладатель: «АО «Всесоюзный научный центр по безопасности биологически активных веществ» (АО «ВНЦ БАВ»). - № 2018102872 : заявл. 25.01.2018 : опубл. 05.10.2018, Бюл. № 28. - 11 с.

14. Набиев, Е.Н. Стабильность остеосинтеза при переломах проксимального конца плечевой кости в эксперименте / Е.Н. Набиев // Гений ортопедии. - 2012. - № 1. - С. 15-18.

15. Никитина, Н.М. Проблемы остеопороза у пациентов с анкилозирующим спондилитом (обзор литературы) / Н.М Никитина., М.И. Юпатова, А.П. Ребров // Медицинский алфавит. - 2023. - № 9. - С. 40-45.

16. Никитинская, О.А. Высокий риск переломов среди жителей российской федерации. / О.А. Никитинская, О.В. Добровольская, Н.В. Торопцова Остеопороз и остеопатии. - 2022. - Т. 25. - № 3. - С. 88-88.

17. Мишенин, М.О. Роль дисфункции эндотелия сосудов в развитии остеопоротических изменений костной ткани / М.О. Мишенин, О.С. Гудырев // MEDCHEM-RUSSIA 2021 : 5-я Рос. конф. по медицинской химии с междунар. участием «МедХим-Россия 2021» : материалы конференции, Волгоград, 16-19 мая 2022 / Европейская федерация мед. химии ; М-во науки и высшего образования Рос. Федерации ; Рос. акад. наук [и др.]. - Волгоград, 2021. - С. 464.

18. Остеопороз в Российской Федерации: эпидемиология, медико-социальные и экономические аспекты проблемы (обзор литературы). / О.М. Лесняк, И.А. Баранова, К.Ю Белова [и др.] // Травматология и ортопедия России. Гений ортопедии. - 2020. - № 1. - 155-168.

19. Оценка возможных механизмов остеопротекторного действия супрамолекулярного комплекса на основе производных 3-оксипиридина в условиях стероид-индуцированного остеопороза / Л.М. Даниленко, М.В. Корокин, М.В. Покровский [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2023. - Т. 86. - № 1^. - С. 47. - (Материалы VI съезда фармакологов России «Смена поколений и сохранение традиций. Новые идеи - новые лекарства», 20-24 ноября 2023 г.).

20. Оценка стимулирующего влияния на репаративную регенерацию костной ткани на стероид-индуцированном остеопорозе комплексной соли ацексамовой кислоты : свидетельство о гос. регистрации базы данных 2025624125 Рос. Федерация / А.П. Даниленко, А.В. Миллер, Х.Ё. Назармамадов, Н.С. Ляпкалов ; правообладатель ФГАОУ ВО «Белгор. гос. нац. исслед. ун-т. - № 2025623842 ; заявл. 19.09.2025 ; опубл. 30.09.2025, Бюл. № 10.

21. Раджкумар Денсинг Самуэл Радж. Фармакотерапия экспериментального остеопороза и нарушений консолидации переломов на его фоне L-аргинином и его комбинациями с эналаприлом и лозартаном : специальность 14.03.06 «Фармакология, клиническая фармакология» : автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. мед. наук / Раджкумар Денсинг Самуэл Радж. - Курск, 2014. - 23 с.

22. Результаты влияния комплексной соли ацексамовой кислоты на репаративную регенерацию костной ткани при гипоэстроген-индуцированном остеопорозе с учетом функциональных, биохимических и морфометрических критериев : свидетельство о гос. регистрации базы данных 2025624267 Рос. Федерация / А.П. Даниленко ; правообладатель ФГАОУ ВО «Белгор. гос. нац. исслед. ун-т. - № 2025623853 ; заявл.18.09.2025 ; опубл. 07.10.2025, Бюл. № 10.

23. Роль метаболизма кортизола в реализации патогенетических звеньев развития остеопороза - обоснование поиска новых фармакотерапевтических мишеней : обзор / М.В. Корокин, В.О. Солдатов, О.С. Гудырев [и др.] // Научные результаты биомедицинских исследований. - 2022. - Т. 8, № 4. - С. 457-473.

24. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая /Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 994с.

25. Санитарно-эпидемиологические правила СП.21.3218-14 «Санитарно-эпидимиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденное постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 20 августа 2014 г. №51 (зарегистрировано Министерством юстиции Российской федерации 31 октября 2014 года, регистрационный № 34547.

26. Снижение показателей оксидативного стресса при лечении остеопороза новым комплексным соединением с производным с N-ацетил-б-аминогексановой кислоты / А.А. Хентов, А.А. Кочкаров, А.П. Даниленко [и др.] // НИИ фармакологии живых систем: семь лет пассионарного развития : сборник материалов всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Белгород, 10 апр. 2023 г. / НИУ «БелГУ» ; под ред. М.В. Покровского. - Белгород, 2023. - С. 59-60.

27. Способ коррекции остеопороза и остеопоротических переломов 3-гидрокси-2-этил-6-метилпиридиния никотинатом в эксперименте : патент 2763011 Рос. Федерация : МПК G09B 23/28 (2006.01), A61K 31/4425 (2006.01), A61P 19/10 (2006.01) / К.С. Трунов, С.Я. Скачилова, О.С. Гудырев [и др.] ; патентообладатель ФГАОУ ВО «Белгор. гос. нац. исслед. ун-т» (НИУ «БелГУ»). - № 2021114187 ; заявл. 19.05.2021 ; опубл. 24.12.2021, Бюл. № 36.

28. Трунов, К.С. Остеопротекторная активность супрамолекулярного комплекса на основе производных 3-оксипиридина в эксперименте : специальность 3.3.6. «Фармакология, клиническая фармакология» : автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. мед. наук / К.С. Трунов. - Белгород, 2023. - 24 с.

29. Файтельсон, А.В. Фармакологическая коррекция дефицита оксида азота при экспериментальном остеопорозе и переломах на его фоне : специальность 14.03.06 «Фармакология, клиническая фармакология» : автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора мед. наук / А.В. Файтельсон. - Старая Купавна, 2013. - 48 с.

30. Фармакокинетические свойства нового супрамолекулярного комплекса на основе 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния N-ацетил-б-аминогексаноата и 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния 3-пиридинокарбоноата, обладающего остеопротекторной активностью в исследованиях in vitro / А.П. Даниленко, Н.С. Жунусов, А.А. Хентов [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2024. - Т. 87, № 2. - С. 13-19.

31. Хентов, А.А. Исследование противовоспалительной активности комплекса 2-этил6-метил-3-гидроксипиридиния п-ацетил-6-аминогексаноата / А.А. Хентов, А.П. Даниленко // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. -2025. - Т. 24, № 6S. - С. 197. - (XXXII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», 14-17 апреля 2025 г. : сборник тезисов).

32. Эффективность комплекса 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния n-ацетил-6-аминогексаноата при фармакологической коррекции костной ткани у трансгенных мышей с нокаутом 11^-гидроксистероиддегидрогеназы 2 типа / А.П. Даниленко, А.А. Хентов, М.В. Корокин [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2025. - Т. 88, № 3. - С. 29-35.

33. Эффективность комплекса 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридиния N-ацетил-6-аминогексаноата для фармакологической коррекции костной ткани у трансгенных мышей с отсутствием экспрессии 11^-гидроксистероиддегидрогеназы 2 типа / А.П. Даниленко, А.А. Хентов, М.В. Корокин [и др.] // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2025. - Т. 88, № 3. - С. 29-35.

34. 11P-HSD1 plays a critical role in trabecular bone loss associated with systemic glucocorticoid therapy / C.G. Fenton, C.L. Doig, S. Fareed [et al.] // Arthritis Res. Ther. - 2019. - Vol. 21, № 1. - Art. 188.

35. 11P-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 within osteoclasts mediates the bone protective properties of therapeutic corticosteroids in chronic inflammation / C.G. Fenton, A. Crastin, C.S. Martin [et al.] // Int. J. Mol. Sci. - 2022. - Vol. 23, № 13. - Art. 7334.

36. Abu-Amer, Y. NF-KB signaling and bone resorption / Y. Abu-Amer // Osteoporos. Int. - 2013. - Vol. 24, № 9. - P. 2377-2386.

37. Activation of ROS/MAPKs/NF-kB/NLRP3 and inhibition of efferocytosis in osteoclast-mediated diabetic osteoporosis / Y. An, H. Zhang, C. Wang [et al.] // Faseb J. - 2019. - Vol. 33, № 11. - P. 12515-12527.

38. Adami, G. Glucocorticoid-induced osteoporosis update / G. Adami, K.G. Saag // Curr. Opin. Rheumatol. - 2019. - Vol. 31, № 4. - P. 388-393.

39. Agidigbi, T.S. Reactive Oxygen Species in Osteoclast Differentiation and Possible Pharmaceutical Targets of ROS-Mediated Osteoclast Diseases / T.S. Agidigbi, C. Kim // Int. J. Mol. Sci. - 2019. - Vol. 20, № 14. - Art. 3576.

40. Baker, C.E. Bone fracture acute phase response-a unifying theory of fracture repair: clinical and scientific implications / CE Baker, SN Moore-Lotridge, AA Hysong [et al.] // Clin Rev Bone Min Metab. - 2018. - Vol. 16, № 4. - P. 142-158.

41. Biological effects of melatonin on osteoblast/osteoclast cocultures, bone, and quality of life: Implications of a role for MT2 melatonin receptors, MEK1/2, and MEK5 in melatonin-mediated osteoblastogenesis / S. Maria, R.M. Samsonraj, F. Munmun [et al.] // J. Pineal Res. - 2017. - Vol. 64, № 3. - Art. e12465.

42. Bone turnover markers in postmenopausal osteoporosis and their correlation with bone mineral density and menopause duration / C.V. Gurban, M.O. Bala§, M.M. Vlad [et al.] // Rom. J. Morphol. Embryol. - 2019. - Vol. 60, № 4. - P. 1127-1135.

43. Briarane-type diterpenoids suppress osteoclastogenisis by regulation of Nrf2 and MAPK/NF-kB signaling pathway / J. Meng, X. Zhang, X. Guo [et al.] // Bioorg. Chem. - 2021. - Vol. 112. - Art. 104976.

44. Chandra, A. Skeletal Aging and Osteoporosis: Mechanisms and Therapeutics / A. Chandra, J. Rajawat // Int. J. Mol. Sci. - 2021. - Vol. 22, № 7. - Art. 3553.

45. Changes of bone formation markers osteocalcin and bone-specific alkaline phosphatase in postmenopausal women with osteoporosis / F. Lumachi, M. Ermani, V. Camozzi [et al.] // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2009. - Vol. 1173, suppl. 1: Integrative Physiology. - P. E60-E63.

46. Cheng, C.H. Osteoporosis due to hormone imbalance: An overview of the effects of estrogen deficiency and glucocorticoid overuse on bone turnover / C.H. Cheng, L.R. Chen, K.H. Chen // Int. J. Mol. Sci. - 2022. - Vol. 23, № 3. - Art. 1376.

47. Clinician's guide to prevention and treatment of osteoporosis / F. Cosman, S.J. de Beur, M.S. LeBoff [et al.] // Osteoporos. Int. - 2024. - Vol. 25, № 10. - P. 23592381.

48. Coupling of bone resorption and formation by RANKL reverse signaling / Y. Ikebuchi, S. Aoki, M. Honma [et al.] // Nature. - 2018. - Vol. 561, № 7722. - P. 195200.

49. Crane, J.L. Bone marrow mesenchymal stem cells and TGF-P signaling in bone remodeling / J.L. Crane, X. Cao // J. Clin. Investig. - 2014. - Vol. 124, № 2. - P. 466-472.

50. Deterioration of cortical and trabecular microstructure identifies women with osteopenia or normal bone mineral density at imminent and long-term risk for fragility fracture: A prospective study / R. Chapurlat, M. Bui, E. Sornay-Rendu [et al.] // J. Bone Miner. Res. - 2020. - Vol. 35, № 5. - P. 833-844.

51. Dimethyloxalylglycine prevents bone loss in ovariectomized C57BL/6J mice through enhanced angiogenesis and osteogenesis / J. Peng, Z.G. Lai, Z.L. Fang [et al.] // PLoS One. - 2014. - Vol. 9, № 11. - Art. e112744.

52. Effects of alendronate for treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: A meta-analysis of randomized controlled trials / Y.K. Wang, Y.M. Zhang, S.Q. Qin [et al.] // Medicine (Baltimore). - 2018. - Vol. 97, № 42. - Art. e12691.

53. Effects of IGF-I combined with GH on glucocorticoid-induced changes of bone and connective tissue turnover in man / K. Berneis, M. Oehri, M. Kraenzlin, U. Keller // J. Endocrinol. - 1999. - Vol. 162, № 2. - P. 259-264.

54. Endothelial nitric oxide synthase gene-deficient mice demonstrate marked retardation in postnatal bone formation, reduced bone volume, and defects in osteoblast maturation and activity / J. Aguirre, L. Buttery, M. O'Shaughnessy [et al.] // Am. J. Pathol. - 2001. - Vol. 158, № 1. - P. 247-257.

55. Equol and resveratrol improve bone turnover biomarkers in postmenopausal women: A clinical trial / G. Corbi, V. Nobile, V. Conti [et al.] // Int. J. Mol. Sci. - 2023.

- Vol. 24, № 15. - Art. 12063.

56. European guidance for the diagnosis and management of osteoporosis in postmenopausal women / J.A. Kanis, E.V. McCloskey, H. Johansson [et al.] // Osteoporos. Int. - 2013. - Vol. 24, № 1. - P. 23-57.

57. Executive summary of the Japan Osteoporosis Society Guide for the Use of Bone Turnover Markers in the Diagnosis and Treatment of Osteoporosis (2018 edition) / Y. Nishizawa, M. Miura, S. Ichimura [et al.] // Clin. Chim. Acta. - 2019. - Vol. 498. - P. 101-107.

58. Experimental evaluation of osteogenic activity of certain hormonal drugs N.A. Smirnov, N.N. Volkhin, A.L. Khokhlov [et al.] // Research Results in Pharmacology. - 2025. - Vol. 11, № 2. - P. 17-26.

59. Experimental fracture protocols in assessments of potential agents for osteoporotic fracture healing using rodent models / N.' Ibrahim, S. Mohamad, N. Mohamed, A.N. Shuid // Curr. Drug Targets. - 2013. - Vol. 14, № 14. - P. 642-650.

60. Extracellular vesicles in bone homeostasis: Emerging mediators of osteoimmune interactions and promising therapeutic targets / X. Huang, Y. Lan, J. Shen [et al.] // Int. J. Biol. Sci. - 2022. - Vol. 18, № 10. - P. 4088-4100.

61. Features of bone remodeling and osteoreparation processes in modeling femoral fracture in genetically modified mice with impaired enzymatic regulation of steroid hormone metabolism / M.V. Korokin, O.S. Gudyrev, P.R. Lebedev [et al.] // Research Results in Pharmacology. - 2023. - Vol. 9, № 4. - P. 113-123.

62. Fibroblast growth factor signaling promotes physiological bone remodeling and stem cell self-renewal / T. Itkin, K.B. Kaufmann, S. Gur-Cohen [et al.] // Curr. Opin. Hematol. - 2013. - Vol. 20, № 3. - P. 237-244.

63. Fischer, V. Interaction between bone and immune cells: Implications for postmenopausal osteoporosis / V. Fischer, M. Haffner-Luntzer // Semin. Cell Dev. Biol.

- 2021. - Vol. 123. - P. 14-21.

64. Fracture healing in osteoporotic fractures: Is it really different? A basic science perspective / P. Giannoudis, C. Tzioupis, T. Almalki, R. Buckley // Injury. - 2007. - Vol. 38, suppl. 1. - P. S90-S99.

65. Gehrke, B. Long-term consequences of osteoporosis therapy with bisphosphonates / Gehrke B, Alves Coelho MC, Brasil d'Alva C [et al.] // Arch. Endocrinol. Metab. - 2023. - Vol. 10, № 68. - P. e220334.

66. Gallagher, J.C. Molecular biology of bone remodeling: Implications for new therapeutic targets for osteoporosis / J.C. Gallagher, A. Sai // Maturitas. - 2010. - Vol. 65, № 4. - P. 301-307.

67. Genetically modified animals for use in bio-pharmacology: from research to production / A.V. Deykin, O.V. Shcheblykina, E.E. Povetka [et al.] // Research Results in Pharmacology. - 2021. - Vol. 7, № 4. - P. 11-27.

68. Gerstenfeld, L.C. Chondrocytes provide morphogenic signals that selectively induce osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells / LC Gerstenfeld, J Cruceta, CM Shea [et al.] // Bone Miner Res. - 2018. - Vol. 17, № 2. - P. 221-223.

69. Hlaing, T.T. Biochemical markers of bone turnover—uses and limitations / T.T. Hlaing, J.E. Compston // Ann. Clin. Biochem. - 2014. - Vol. 51, pt. 2. - P. 189-202.

70. Imaging of metabolic bone diseases / G. Guglielmi, S. Muscarella, A. Leone, W.C. Peh // Radiol. Clin. North Am. - 2008. - Vol. 46, № 4. - P. 735-754.

71. Impact of osteoporosis and osteoporosis medications on fracture healing: a narrative review / M Chandran, KE Akesson, MK Javaid [et al.] // Fracture Working Group of the Committee of Scientific Advisors of the International Osteoporosis Foundation, on behalf of the International Osteoporosis Foundation, Société Internationale de Chirurgie Orthopédique et de Traumatologie. Osteoporos Int. - 2024. -Vol. 35, № 8. - P. 1337-1358.

72. Immunolocalization of BMPs, BMP antagonists, receptors, and effectors during fracture repair / YY Yu , S Lieu, C Lu [et al.] // Bone - 2010. - Vol. 26, № 3. - P. 841-851.

73. Investigation of bone matrix composition, architecture and mechanical properties reflect structure-function relationship of cortical bone in glucocorticoid

induced osteoporosis / L. Xi, Y. Song, W. Wu [et al.] // Bone. - 2020. - Vol. 136. - Art. 115334.

74. Johnell, O. An estimate of the worldwide prevalence and disability associated with osteoporotic fractures / O. Johnell, J.A. Kanis J.A. // Osteoporos. Int. -2006. - Vol. 17, № 12. - P. 1726-1733.

75. Kalyanaraman, H. Nitric oxide and cyclic GMP functions in bone / H. Kalyanaraman, N. Schall, R.B. Pilz // Nitric Oxide. - 2018. - Vol. 76. - P. 62-70.

76. Kanakaris, N.K., The health economics of the treatment of long-bone nonunions/ N.K. Kanakaris, P.V. Giannoudis // Injury. - 2017. - Vol. 38, № 2. - P. 77-84.

77. Kanis, J.A. Risk of hip fracture according to the World Health Organization criteria for osteopenia and osteoporosis / J.A. Kanis, O. Johnell, A. Oden, Jonsson B. [et al.] // Bone. - 2020. - Vol. 27, № 5. - P. 585-590.

78. Kostenuik, P. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion / P. Kostenuik, F.M. Mirza // J. Orthop. Res. - 2017. - Vol. 35, № 2. - P. 213-223.

79. Kuo, T.R. Bone biomarker for the clinical assessment of osteoporosis: Recent developments and future perspectives / T.R. Kuo, C.H. Chen // Biomark. Res. -2017. - Vol. 5. - Art. 18.

80. Khosla, S. Osteoporosis treatment: recent developments and ongoing challenges / S Khosla, LC. Hofbauer // Lancet Diabetes Endocrinol. - 2017. - Vol. 5, № 11. - P. 898-907.

81. Kusumbe, A.P. Coupling of angiogenesis and osteogenesis by a specific vessel subtype in bone / A.P. Kusumbe, S.K. Ramasamy, R.H. Adams // Nature. - 2014. - Vol. 507, № 7492. - P. 323-328.

82. Li, H. Osteoporosis: Mechanism, Molecular Target and Current Status on Drug Development / H. Li, Z. Xiao, L.D. Quarles [et al.] // Curr Med Chem. - 2021. -Vol. 28, № 8. - P. 1489-1507.

83. Mills, L.A. The risk of non-union per fracture: current myths and revised figures from a population of over 4 million adults. / L.A. Mills, S.A. Aitken, Simpson AHRW // Acta Orthop. - 2017. - Vol. 88, № 4. - P. 434-439.

84. Major osteoporotic fragility fractures: Risk factor updates and societal impact / P. Pisani, M.D. Renna, F. Conversano [et al.] // World J. Orthop. - 2016. - Vol. 7, № 3. - P. 171-181.

85. Martin, T.J. Historically significant events in the discovery of RANK/RANKL/OPG / T.J. Martin // World J. Orthop. - 2017. - Vol. 4, № 4. - P. 186197.

86. Manolagas, S.C. From estrogen-centric to aging and oxidative stress: A revised perspective of the pathogenesis of osteoporosis / S.C. Manolagas // Endocr. Rev.

- 2010. - Vol. 31, № 3. - P. 266-300.

87. Mechanistic advances in osteoporosis and anti-osteoporosis therapies / H. Wang, Y. Luo, H. Wang [et al.] // MedComm. - 2023. - Vol. 4, № 3. - Art. e244.

88. Melatonin accelerates osteoporotic bone defect repair by promoting osteogenesis-angiogenesis coupling / S. Zheng, C. Zhou, H. Yang [et al.] // Front. Endocrinol. (Lausanne). - 2022. - Vol. 13. - Art. 826660.

89. Miller, PD. Management of severe osteoporosis / PD Miller // Expert Opin Pharmacother. - 2016. - Vol. 17, № 4. - P. 473-488.

90. Ming, L.G. Functions and action mechanisms of flavonoids genistein and icariin in regulating bone remodeling / L.G. Ming, K.M. Chen, C.J. Xian // J. Cell Physiol.

- 2023. - Vol. 228, № 3. - P. 513-521.

91. miR433-3p suppresses bone formation and mRNAs critical for osteoblast function in mice / J. Garcia, S.S. Smith, S. Karki [et al.] // J. Bone Miner. Res. - 2021. -Vol. 36, № 9. - P. 1808-1822.

92. Mirza, F. Management of endocrine disease: Secondary osteoporosis: Pathophysiology and management / F. Mirza, E. Canalis // Eur. J. Endocrinol. - 2015. -Vol. 173, № 3. - P. R131-R151.

93. Molecular mechanisms involved in hypoxia-induced alterations in bone remodeling / R. Usategui-Martín, R. Rigual, M. Ruiz-Mambrilla [et al.] // Int. J. Mol. Sci.

- 2022. - Vol. 23, № 6. - Art. 3233.

94. Molecular mechanisms of glucocorticoids on skeleton and bone regeneration after fracture / Y. Hachemi, A.E Rapp, A.K. Picke [et al.] // J. Mol. Endocrinol. - 2018.

- Vol. 61, № 1. - P. R75-R90.

95. Molecular-Based Treatment Strategies for Osteoporosis: A Literature Review / Y. Ukon, T. Makino, J. Kodama [et al.] / International Journal of Molecular Sciences. - 2019. - Vol. 20, № 10. - P. 2557.

96. Mollazadeh, S. Role of apoptosis in pathogenesis and treatment of bone-related diseases Role of apoptosis in pathogenesis and treatment of bone-related diseases / S. Mollazadeh, B.S. Fazly Bazzaz, M.A. Kerachian // J. Orthop. Surg. Res. - 2015. -Vol. 10. - Art. 15.

97. Nanomaterial nitric oxide delivery in traumatic orthopedic regenerative medicine / A.T. Anastasio, A. Paniagua, C. Diamond [et al.] // Front. Bioeng. Biotechnol.

- 2021. - Vol. 8. - Art. 592008.

98. Network pharmacology and molecular docking approach to elucidate the mechanisms of Liuwei Dihuang pill in diabetic osteoporosis / Z. Lu, M. Huang, H. Lin [et al.] // J. Orthop. Surg. Res. - 2022. - Vol. 17, № 1. - Art. 314.

99. Osteoporosis, bisphosphonate use, and risk of moderate or worse hearing loss in women / S.G. Curhan, K. Stankovic, C. Halpin [et al.] // J. Am. Geriatr. Soc. -2021. - Vol. 69, № 11. - P. 3103-3113.

100. Osteoporosis in the European Union: medical management, epidemiology and economic burden : A report prepared in collaboration with the International Osteoporosis Foundation (IOF) and the European Federation of Pharmaceutical Industry Associations (EFPIA) / Hernlund E., Svedbom A., Ivergárd M., [et al.] //. Arch Osteoporos. -2023. - Vol. 8. - P. 136.

101. Oxidative stress: A common pathological state in a high-risk population for osteoporosis / C. Zhang, H. Li, J. Li [et al.] // Biomed Pharmacother. - 2023. - Vol. 163.

- Art. 114834.

102. Park, J.H. Current understanding of RANK signaling in osteoclast differentiation and maturation / J.H. Park, N.K. Lee, S.Y. Lee // Mol. Cells. - 2017. -Vol. 40, № 10. - P. 706-713.

103. Panday, K. Medication-induced osteoporosis: Screening and treatment strategies / K. Panday, A. Gona, M.B. Humphrey // Ther. Adv. Musculoskelet. Dis. -2014. - Vol. 6, № 5. - P. 185-202.

104. Pennisi, P. Glucocorticoid-induced osteoporosis and its treatment / P. Pennisi, A. Trombetti, R. Rizzoli // Clin. Orthop. Relat. Res. - 2016. - Vol. 443. - P. 3947.

105. Predictive analysis and prediction of the main molecular targets for the N-acetyl-6-aminohexanoate derivative / A.P. Danilenko, A.A. Khentov, A.V. Kuznetsov [et al.] // Research Results in Pharmacology. - 2025. - Vol. 11, № 2. - P. 73-85.

106. Protective effects of Dipsacus asper polysaccharide on osteoporosis in vivo by regulating RANKL/RANK/OPG/VEGF and PI3K/Akt/eNOS pathway / X. Sun, B. Wei, Z. Peng [et al.] // Int. J. Biol. Macromol. - 2019. - Vol. 129. - P. 579-587.

107. Pyrroloquinoline quinone prevents estrogen deficiency-induced osteoporosis by inhibiting oxidative stress and osteocyte senescence / Q. Geng, H. Gao, R. Yang [et al.] // Int. J. Biol. Sci. - 2019. - Vol. 15, № 1. - P. 58-68.

108. Starling, S. New anti-osteoporosis drug target identified / S. Starling // Nat. Rev. Endocrinol. - 2021. - Vol. 17, № 1. - P 4-5.

109. Sheweita, S.A. Calcium metabolism and oxidative stress in bone fractures: role of antioxidants / S.A. Sheweita, K.I. Khoshhal // Curr. Drug Metab. - 2024. - Vol. 8, № 5. - P. 519-525.

110. Study of endothelio- and osteoprotective effects of combination of rosuvastatin with L-norvaline in experiment. Journal of Osteoporosis / MS Sobolev, AV Faitelson, OS Gudyrev, [et al.] // Chernomortseva ES - 2018. - Vol. 15, № 1. - P. 1585749.

111. Stein, E. Secondary osteoporosis / E. Stein, E. Shane // Endocrinol. Metab. Clin. North Am. - 2003. - Vol. 32, № 1. - P. 115-134.

112. Study of endothelio-and osteoprotective effects of combination of rosuvastatin with L-norvaline in experiment / M.S. Sobolev, A.V. Faitelson, O.S. Gudyrev [et al.] // J. Osteoporos. - 2018. - Vol. 2018. - Art. 1585749.

113. Study on the treatment of postmenopausal osteoporosis with quercetin in Liuwei Dihuang Pill based on network pharmacology / F. Zhu, W. Li, L. Wang [et al.] // J. Orthop. Surg. Res. - 2023. - Vol. 18, № 1. - Art. 21.

114. Tanski, W. Osteoporosis - risk factors, pharmaceutical and non-pharmaceutical treatment / W. Tanski, J. Kosiorowska, A. Szymanska-Chabowska // Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci. - 2021. - Vol. 25, № 9. - P. 3557-3566.

115. Tella, S.H. Bazedoxifene + conjugated estrogens in HT for the prevention of osteoporosis and treatment of vasomotor symptoms associated with the menopause / S.H. Tella, J.C. Gallagher // Expert Opin. Pharmacother. - 2013. - Vol. 14, № 17. - P. 24072420.

116. The anti-epileptic drugs valproate, carbamazepine and levetiracetam cause bone loss and modulate Wnt inhibitors in normal and ovariectomised rats / B. Parveen, A.K. Tiwari, M. Jain [et al.] // Bone. - 2018. - Vol. 113. - P. 57-67.

117. The epidemiology of osteoporosis / M.A. Clynes, N.C. Harvey, E.M. Curtis [et al.] / // Br. Med. Bull. - 2020. - Vol. 133, № 1. - P. 105-117.

118. The IFN-y/miniTrpRS signaling axis: An insight into the pathophysiology of osteoporosis and therapeutic potential / E. Biros, U.H. Malabu, V.N. Vangaveti [et al.] // Cytokine Growth Factor Rev. - 2022. - Vol. 64. - P. 7-11.

119. The mechanism of coupling: A role for the vasculature / A.M. Parfitt // Bone. - 2000. - Vol. 26, № 4. - P. 319-323.

120. The treatment gap in osteoporosis / N. Ayub, M. Faraj, S. Ghatan [et al.] // J. Clin. Med. - 2021. - Vol. 10, № 13. - Art. 3002.

121. Tyloxapol inhibits RANKL-stimulated osteoclastogenesis and ovariectomized-induced bone loss by restraining NF-kB and MAPK activation / W. Guo, H. Li, Y. Lou [et al.] // J. Orthop. Transl. - 2021. - Vol. 28. - P. 148-158.

122. Urolithin A suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis and postmenopausal osteoporosis by, suppresses inflammation and downstream NF-kB activated pyroptosis pathways / H. Tao, W. Li, W. Zhang [et al.] // Pharmacol. Res. -2021. - Vol. 174. - Art. 105967.

123. Van't Hof, R.J. Nitric oxide and bone / R.J. Van't Hof, S.H. Ralston // Immunology. - 2021. - Vol. 103, № 3. - P. 255-261.

124. Wang, L.T. Hormone-related and drug-induced osteoporosis: A cellular and molecular overview / L.T. Wang, L.R. Chen, K.H Chen // Int. J. Mol. Sci. - 2023. - Vol. 24, № 6. - Art. 5814.

125. Xavier, A. Animal model for glucocorticoid induced osteoporosis: A systematic review from 2011 to 2021 / A. Xavier, H Toumi, E. Lespessailles // Int. J. Mol. Sci. - 2022. - Vol. 23, № 1. - Art. 377.

126. Yeo, J.H. Surgical strategy for scaphoid nonunion treatment / J.H. Yeo, J.Y. Kim // J. Hand. Surg. Asian-Pac. - 2018. - Vol. 23, № 4. - P. 450-462.

127. Zhang, S. Cell and Regenerative Therapies for the Treatment of Osteoporotic Vertebral Compression Fractures / S. Zhang, Y. Lee, Y. Liu [et al.] // Int. J. Mol. Sci. -2024. - Vol. 25, № 9. - P. 4979.