Характеристика взаимодействия моноклональных антител с различными олигомерными формами D-глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Григорьева, Юлия Александровна

• Григорьева, Юлия Александровна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Григорьева, Юлия Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Моноклональные антитела и их взаимодействие с антигенами.

Взаимодействие антитела с антигенной детерминантой.

Организация эпитопа.

Использование моноклональных антител для изучения олигомеризации и сворачивания белков.

Методы характеристики антигенной детерминанты.

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа: структура и функции.

Основные свойства и роль в катализе.

Олигомерные состояния ГАФД и ее функции в клетке.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы.

Определение концентраций реагентов.

Определение концентрации белков в растворе.

Определение концентрации иммобилизованных белков.

Определение активности ГАФД.

Выделение ГАФД.

ГАФД из мышц кролика.

ГАФД из В. stearothermophilus.

Получение апо-ГАФД.

Гель-фильтрация на Суперозе 12.

Твердофазный иммуноферментный анализ ELISA.

Взаимодействие антител с сорбированным антигеном.

Взаимодействие антител с антигеном в растворе.

Очистка антител.

Иммобилизация белков на сефарозе -4В.

Активация сефарозы.

Иммобилизация ГАФД.

Иммобилизация антител.

Получение иммобилизованных за одну субъединицу димеров

ГАФД.

Получение иммобилизованных за одну субъединицу мономеров

ГАФД.

Получение иммобилизованных за две субъединицы димеров

ГАФД.

Процедуры инкубации иммобилизованных белков с растворимыми партнерами реакции.

ДСН-электрофорез в полиакриламидном геле.

Приготовление экстракта клеток Е. coli.

Определение АТР-азной активности.

Полное карбоксиметилирование ГАФДК.

Определение константы седиментации.

Компьютерный анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Отбор моноклональных антител.

Выделение комплекса антитело - антиген при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Взаимодействие различных олигомерных форм ГАФДК с моноклональными антителами.

Получение иммобилизованных олигомерных форм ГАФДК.

Количественное определение антител, связавшихся с иммобилизованным антигеном.

Анализ взаимодействия различных олигомерных форм антигена с моноклональными антителами при помощи

ДСН-электрофореза в ПААГ.

Влияние антител на активность ГАФДК.

Влияние антител mAbs 6С5 на термоинактивацию ГАФДК

Влияние антител на разворачивание ГАФДК в мочевине.

Влияние антител на спонтанную ренатурацию ГАФДК.

Очистка растворов ГАФДК от денатурированных примесей.

Конкуренция за связывание с мономером ГАФДК между mAbs 6С5 и GroEL.

Взаимодействие белков из экстракта Е. coli с иммобилизованными олигомерными формами ГАФДК.

Конкуренция GroEL и mAbs 6С5 за связывание с мономером

ГАФДк.

Взаимодействие ГАФД из Bacillus stearothermophilus с антителами mAbs 6С5.

Взаимодействие нативной и денатурированной ГАФДвэ! с иммобилизованными антителами.

Взаимодействие димеров и мономеров ГАФДв^ с антителами. 103 Предварительная характеристика вероятного эпитопа, взаимодействующего с антителами mAbs 6С5.

ВЫВОДЫ.