Химико-ферментативное получение физиологически активных соединений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Юфряков Вячеслав Сергеевич

• Юфряков Вячеслав Сергеевич
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Юфряков Вячеслав Сергеевич

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2. 1. Введение

2.2. Роль липаз в биологических системах и их важнейшие свойства

2.3. Липазы в реакциях стереоселективного гидролиза, этерификации и переэтерификации

2.4. Липазы в реакциях стереоселективного О-ацилирования

2.5. Липазы в реакциях стереоселективного К-ацилирования

2.6. Другие реакции, катализируемые липазами

2.7. Десимметризация прохиральных соединений липазами

2.8. Ферментативные реакции в микрожидкостных биореакторах

2.9. Заключение

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

3.1. Попытки кинетического разделения ряда фтор- и фосфорорганических соединений на отдельные энантиомеры

3.2. Химико-ферментативный метод получения (Б,5>)-2,2'-(этилендиимино)дибутан-1-ола

3.3. Энантиоселективный синтез (£)-5-фтор-ДОФА химико-ферментативным путем

3.4. Получение отдельных стереомеров 1-(6-бром-2-хлорхино-3-лил)-4-диметиламино-2-(нафтален-1-ил)-1-фенилбутан-2-ола и его солей

3.5. Необычная стереоселективность метионин- у-лиазы из СЫгоЪа^ег freundii

в отношении к диастереомерному £-метионинсульфоксиду

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

5. ВЫВОДЫ

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

7. ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ CAL-A Липаза А, полученная из Candida antarctica CAL-B Липаза B, полученная из Candida antarctica CCL Липаза, полученная из Candida cylindracea PPL Липаза, полученная из поджелудочной железы свиньи PSIM Липаза, полученная из Burkholderia cepacian CVL Chromobacterium viscosum липаза PSL Pseudomonas cepacia липаза

proRML генно-модифицированная липаза из Rhizomucor miehei Novozym 435 Иммобилизованная липаза B из Candida antarctica МГЛ Метионин-у-лиаза АК Аминокислота

ВИЧ Вирус имуннодифицита человека Boc трет-Бутилоксикарбонил Cbz Бензилоксикарбонил DMAP Диметиламинопиридин

GMP англ. «good manufacturing practice», соответствие международным требованиям ВОЗ

In vitro лат. «В стекле» в искуственных условиях вне организма In vivo лат. «В (на) живом», в условиях эксперимента на живом организме TBDMSCl трет-Бутилдиметилсилилхлорид ТГФ тетрагидрофуран

ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматография ДОФА L-3,4-Диоксифенилаланин ДМФА Диметилформамид ДМСО Диметилсульфоксид

МАЛДИ Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация РСА Рентгеноструктурный анализ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Химико-ферментативное получение физиологически активных соединений»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В последние десятилетия биокатализ (синтетический катализ на основе ферментов), хорошо дополняет традиционные методы производства, такие как асимметрический синтез энантиомерно чистых органических соединений, за счет эффективного катализа известных химических реакции, проходящей с высокой энантио- и региоселективностью. При всем многообразии имеющихся методов выделения отдельных стереомеров оптически активных органических соединений в каждом конкретном случае приходится экспериментально выбирать наиболее приемлемый для данного класса веществ вариант синтеза или расщепления рацематов, очистки и выделения конкретных стереоизомеров. Причем если для обычных органических соединений подобные методы, как правило, хорошо отработаны, то при работе с большинством физиологически активных соединений сложного состава с несколькими хиральными центрами, такие методы предплолагают особые условия применения. В тоже время важность выделения в стереомерно-чистом виде соединений, среди которых важнейшие асимметрические катализаторы органического синтеза и многочисленные физиологически активные препараты лекарственного и сельскохозяйственного назначения в настоящее время не вызывает сомнений. Стремление к повышению эффективности предназначенных для воздействия на живую природу химических соединений привело к появлению инсектицидных и гербицидных составов с повышенным содержанием одного из стереомеров, а в области фармакологических препаратов

высокая энантиомерная чистота стала обязательной и в международный стандарт производственных требований ^МР) непременно включается получение, изучение строения и биологических свойств всех индивидуальных стереомеров физиологически активных веществ.

Высокая энантиомерная чистота продуктов является преимуществом именно ферментативного подхода, благодаря присущей ферментам стереоселективности. В отличие от химического синтеза, биокатализ можно проводить в сравнительно мягких условиях. В качестве катализаторов в биокатализе все чапще используются доступные липазы как изолированные, так и иммобилизованные и даже целые клетки. Известно, что многие липазы продемонстрировали высокую активность по отношению к неприродным субстратам в органических и водных средах и стали использоваться для синтетических превращений органических веществ.

Степень разработанности темы исследования. Липазы привлекают внимание химиков-органиков во всем мире своей простотой в обращении, широкой толерантностью к субстрату, высокой стабильностью к повышенным температурам и органическим растворителям и коммерческой доступностью. Хотя липазы позволяют стереоселективно осуществить реакции переацилирования, этерификации, гидролиза и некоторые другие, они пока еще очень ограниченно используются в органической и элементоорганической химии. В тоже время липазы являются распространенными и хорошо изученными ферментами, могут быть использованы для различных видов

превращений и позволяют использовать необычные субстраты, круг которых может быть существенно расширен. Всё это позволяет их эффективно применять на одной из стереоселективных стадий химического получения оптически активных соединений, реализуя тем самым химико-ферментативный подход к получению отдельных стереомеров ценных физиологически активных веществ.

Цель работы: Разработка химико-ферментативных подходов к получению хиральных физиологически активных органических соединений с участием липаз на ключевых стадиях. При этом основное внимание уделено синтезу веществ, обладающих ценными противотуберкулезными или противоопухолевыми свойствами.

Задачи работы:

1) Химико-ферментативное получение (Я^-этамбутола

2) Получение отдельных стереомеров хлорного аналога бедаквилина

3) .Химико-ферментативный метод получения (£)-5-фтор-3,4-диоксифенилаланина ((5)-5-фтор-ДОФА)

4) Ферментативное выделение чистого (^^-диастереомера окиси метионина

5) Сравнение химико-ферментативной стратегии получения с чисто химическими подходами, выявление их особенностей и установление преимуществ использования.

Научная новизна работы включает следующие основные результаты:

Разработан химико-ферментативный способ получения (^^-этамбутола из 1-нитропропана и других доступных соединений в результате пятистадийного процесса с расщеплением производных рацемического 2-амино-1-бутанола на ключевой стадии с помощью липаз.

Выделены индивидуальные стереомеры хлорного аналога бедаквилина стереоселективным ацилированием с использованием PPL-липазы. Получен широкий набор их растворимых солей.

Осуществлен химико-ферментативный способ получения (5)-5-фтор-3,4-диоксифенилаланина из 2-фторфенола с использованием тирозинфеноллиазы на ключевой стадии синтеза энантиомерного чистого 3-фтор-(5)-тирозина.

Разработан стереоселективный метод выделения отдельного (Sc,Ss)-диастереомера окиси метионина из смеси (Sc,Ss) и ^с^)-диастереомеров c использованием метионин-у-лиазы.

Теоретическая и практическая значимость работы определяется разработкой неизвестных ранее химико-ферментативных превращений с применением PPL-липазы, тирозинфеноллиазы, метионин-у-лиазы, а также иммобилизованной липазы В, выделяемой из микроорганизма Candida antarctica, разработкой экологичных способов получения лекарственных препаратов этамбутола и 5-фтор-ДОФА.

Совокупность результатов исследования вносит фундаментальный и практический вклад в решение актуальных проблем органического

стереоселективного синтеза и повысит эффективность получения ряда фармацевтических ингредиентов.

Методология и методы диссертационного исследования. Представленные в работе результаты получены с использованием современных физико-химическихметодов исследования: спектроскопии 1Н, ^ и 13С ЯМР-, ИК-, УФ-спектроскопии, масс-спектрометрии высокого разрешения,

рентгеноструктурного анализа, а также результатов элементного анализа. Стереохимические особенности новых соединений устанавливали с использованием методов ВЭЖХ на хиральных колонках.

Положения научно-квалификационной работы, выносимые на защиту:

• Химико-ферментативный метод получения (5,5)-этамбутола

• Химико-ферментативный синтез (£)-5-фтор-ДОФА

• Результаты получения отдельных энантиомеров хлорного аналога бедаквилина

• Ферментативное выделение чистого (5"с,5^)-диастереомера окиси метионина

Достоверность результатов исследования обеспечивалась тщательной экспериментальной работой с контролем условий проведения химических и ферментативных процессов, использованием приборов и измерительных средств необходимой точности и воспроизведением всех экспериментов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на научных конференциях: молодежной конференции «Веснянка» ИНЭОС РАН

2020, 2021, 2022 гг., XII Международной конференции молодых учёных по химии МЕНДЕЛЕЕВ 2021 (Санкт-Петербург, 2021 г.), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2024», (Москва, 2024 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК (Белый список) и индексируемых в международных базах данных Web of Science и Scopus. Получены два патента РФ. Результаты научного исследования подтверждены участием на научных мероприятиях всероссийского уровня: опубликовано 5 работ в материалах всероссийских конференций.

Личный вклад автора состоит в обсуждении целей и задач исследований, проведении экспериментов по синтезу целевых соединений и изучению их свойств, обобщении, анализе и трактовке полученных экспериментальных данных, формулировке положений и выводов работы, а также в написании научных публикаций и представлении докладов по теме диссертации на конференциях различного уровня.

Благодарности. Автор выражает особую благодарность к.х.н. Н.Г.Фалееву, м.н.с. М.А. Цветиковой, к.х.н. О.Н. Горуновой, к.х.н. Н.А. Быстровой, к.х.н. М.М. Ильину (ИНЭОС РАН), д.х.н. В.Н. Хрусталеву (РУДН), а также всему коллективу лаборатории ГРЭОС ИНЭОС им. А.Н. Несмеянова РАН за участие в постановке экспериментов и обсуждении полученных результатов на разных этапах работы.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 148 страницах машинописного текста и включает в себя введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы, список цитируемой литературы из 203 ссылок, список публикаций автора по теме работы и дополнительные материалы. Работа содержит 5 таблиц, 44 схемы, 18 рисунков.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЛИПАЗ В ПОЛУЧЕНИИ ОПТИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ.

2. 1. Введение

Большой интерес к получению новых биологически активных соединений обусловлен не только объективной логикой развития органической химии, но и тем, что в последнее время появилась надежда на переориентацию фармацевтической промышленности на получение отечественных лекарственных препаратов. Среди биотехнологических процессов, которые используются в химической промышленности, значительное внимание уделено производству хиральных соединений в качестве целевых или промежуточных продуктов при получении лекарственных веществ. Особенно важным является производство энантиомерно чистых соединений в фармацевтической промышленности, поскольку примерно 80% разрабатываемых в настоящее время лекарств являются хиральными [1]. Ряд обзоров посвящен применению ферментов в синтезе оптически чистых лекарственных препаратов или их промежуточных соединений [2 - 7], которые всё чаще выступают в качестве альтернативы хиральных химических катализаторов.

Асимметрия биологически ориентированных веществ подразумевает стереоспецифичность взаимодействия субстратов с регуляторными сайтами и активными центрами ферментов и рецепторов. Соответственно, в соединениях с

хиральными центрами, используемых в качестве лекарственных средств, обычно только один из стереомеров проявляет нужные свойства [1, 8, 9]. Другие стереомеры оказываются антагонистами или, в лучшем случае, балластом. Поэтому поиск сравнительно простых и дешевых, в частности ферментативных, способов получения оптически чистых лекарственных препаратов или промежуточных соединений в их синтезе в виде отдельных стереомеров, становится необходимостью [10 - 12]. В последние десятилетия биокатализ хорошо дополняет традиционные методы производства, такие как асимметрический синтез энантиомерно чистых органических соединений, за счет эффективного катализа известных химических реакции, проходящей с высокой энантио- и региоселективностью [13, 14]. При всем многообразии имеющихся методов выделения отдельных стереомеров хиральныхорганических соединений в каждом конкретном случае приходится экспериментально выбирать наиболее приемлемый для данного класса веществ вариант синтеза или расщепления рацематов, очистки и выделения конкретных стереоизомеров. Причем если для обычных органических соединений подобные методы, как правило, хорошо отработаны, то при работе с большинством элементоорганических, особенно металлорганических соединений, которые часто малоустойчивы на свету, на воздухе или в присутствии воды, такие методы требуют особых условий применения. В тоже время важность выделения в стереомерно-чистом виде элементоорганических соединений, среди которых важнейшие асимметрические катализаторы органического синтеза и

многочисленные физиологически активные препараты лекарственного и сельскохозяйственного назначения, в настоящее время не вызывает сомнений. В области фармакологических препаратов высокая энантиомерная чистота стала обязательной и в международные требования GМP непременно включается получение, изучение строения и биологических свойств всех индивидуальных стереомеров физиологически активных веществ.

Высокая энантиомерная чистота продуктов является преимуществом именно ферментативного подхода, благодаря присущей ферментам высокой стереоселективности. В отличие от химического синтеза, биокатализ можно проводить в сравнительно мягких условиях [15]. В качестве катализаторов в биокатализе используются как изолированные, так и иммобилизованные на подложке ферменты, и даже целые клетки. Известно, что многие ферменты продемонстрировали высокую активность по отношению к неприродным субстратам в органических и водных средах и стали широко использоваться для синтетических превращений, в числе которых восстановление, окисление, эпоксидирование, альдольные реакции и ряд других [16 - 18]. Липазы являются наиболее широко используемыми и хорошо изученными ферментами, которые обладают высокой стабильностью и активностью и могут быть использованы для различных видов превращений [16, 17]. В тоже время широко распространенные в органической химии ферментативные методы стереоселективного переацилирования [18] липазами пока еще очень ограниченно используются в элементоорганической химии. Липазы привлекли внимание химиков-органиков

во всем мире своей простотой в обращении, широкой толерантностью к субстрату [19], высокой стабильностью к температурам и органическим растворителям и коммерческой доступности [20]. Все липазы используются и в иммобилизованной форме [21], что удобно для повторного использования. Методы иммобилизации делают ферментативное производство энантиомеров во многих случаях выгоднее химических процессов. Липазы позволяют стереоселективно осуществить реакции переацилирования, этерификации и гидролиза [22, 23]. Существенно, что наряду с хорошо известными липазами постоянно появляются новые генетически модифицированные аналоги, обладающие более высокой стереоспецифичностью и позволяющие использовать необычные субстраты. В данном обзоре проведен анализ современных данных и оценка возможностей использования коммерчески доступных липаз в стереоселективном синтезе биологически ориентированных соединений и расщеплении необычных субстратов практически важных рацемических, в том числе элементоорганических соединений, с целью получения отдельных стереомеров веществ.

2.2. Роль липаз в биологических системах и их важнейшие свойства

Согласно иерархический классификации ферментов (Enzyme Comission code,, EC) липазы, или триацилглицерин ацилгидролазы, относятся к подклассу эстераз, которые входят в класс гидролаз (обозначение — EC 3.1.1.3). Они действуют на границе раздела органических и водных веществ, катализируя

гидролиз сложноэфирных связей и высвобождая жирные кислоты, а также глицерин и/или его производные (моно- и диглицериды). Привлекательной особенностью липаз является то, что, помимо высокой каталитической активности и термостабильности в органических растворителях, они демонстрируют высокую энантиоселективность и широкую субстратную специфичность [24]. Хотя природными субстратами липаз являются ацилглицериды, они также могут катализировать гидролиз широкого спектра нерастворимых в воде сложных эфиров с высокой степенью энантиоселективности. Трехмерная структура липазы состоит из трех доменов: контактного домена, ответственного за субстратную специфичность, гидрофобного домена, ответственного за связывание одной молекулы субстрата и ее ассоциацию с функциональным доменом, содержащим каталитическую триаду, которая включает Ser, His и Asp/Glu [25]. Структурной особенностью липаз является наличие аминокислотной последовательности, покрывающей активный центр фермента, которая называется крышкой. Крышка представляет собой одну или более a-спиралей различной длины с двумя поворотными сегментами на каждом конце контактного домена, который служит для связывания с подложкой. Крышка имеет разные размеры для липаз различного происхождения (животного, микробного); ее движения позволяют субстрату проникать в активный центр фермента [26]. Наличие крышки определяет активность липаз по отношению к нерастворимым в воде субстратам, содержащим остатки высших жирных кислот, в отличие от других эстераз,

которые гидролизуют сложные эфиры и глицериды короткоцепочечных жирных кислот. Структурные преобразования в молекуле липазы в результате межфазной активации в присутствии нерастворимых в воде субстратов приводят к открытию крышки каталитического сайта (функционального домена) и повышению активности липазы. В водных средах при отсутствии гидрофобного субстрата крышка закрывается [27, 28].

На рисунке 1 приведено Molscript изображение молекулы липазы из Thermomyces (Humicola) lanuginosus в суперпозиции открытой и закрытой конформаций [29]. Бета-листы «контактного» домена (синий) окружены альфа-спиралями «гидрофобного» домена (желтый), красные полосы - «крышка», «функциональный» домен также показан красным цветом. Сайт связывания у липаз находится на среднем бета-листе, который может быть, как гидрофобным карманом, так и каналоподобной структурой. а/р-Гидролазная складка состоит преимущественно из восьми Р-нитей, образуя надспирально закрученный Р-лист, окруженный различным числом а-спиралей, однако количество и укладка Р-нитей может варьироваться (рисунок 2). Оксианионный карман играет очень важную роль в процессе катализа, так как при гидролизе субстрата реализуется стабилизированный тетраэдрический отрицательно заряженный интермедиат.

Современные методики ЯМР-спектроскопии позволяют изучать динамику белковых цепей липаз при их взаимодействии с субстратом [30]. Липазы

богаты цистеином, который образует дисульфидные мостики (от одного до четырех), что позволяет усилить конформационную стабильность фермента, уменьшить энтропию молекулы [31].

Липазы играют важную роль в большинстве живых организмов, а гены, кодирующие липазы, присутствуют даже у некоторых вирусов [32]. Липазы участвуют в разнообразных биологических процессах, начиная от простого метаболизма пищевых триглицеридов до воспалений и передачи межклеточных сигналов [33]. Как правило, они катализируют реакции гидролитического расщепления липидов по одной или двум сложноэфирным связям. При этом большинство липаз взаимодействует с определенным фрагментом глицеринового скелета [34] в липидном субстрате. Например, липаза поджелудочной железы человека, которая является основным ферментом, расщепляющим поступающие с пищей жиры, превращает триглицеридные липиды, в моноглицериды и две жирные кислоты [35]. Липазы могут быть специфичны по отношению к насыщенности остатков жирных кислот, их строению и длине.

Рисунок 1. Липаза Humicola lanuginosa, представленная в виде Molscript [29].

Рисунок 2. Липаза Candida rugosa с крышкой в открытом состоянии (слева) и липаза Rhizomu cormiehei с закрытой крышкой (справа), крышка выделена красным. [27].

Оптимальное значение рН для большинства липаз находится в диапазоне 8,0 -9,0. Однако существуют липазы, активные в кислых или основных средах [36]. Например, липазы грибов предпочитают кислые значения pH, липаза из лейкоцитов человека проявляет максимальную активность при рН 5,25. Гормон-чувствительная липаза наиболее активна при рН 6,8. Температурный диапазон действия липаз тоже довольно широк, особенно это относится к бактериальным липазам. Например, оптимальная рабочая температура для липазы из Mucor pшШш равна 50° С, а для липазы из Puccinia graminis миа 15° С. Многообразие липаз и их свойств [37] предоставляют химикам большие возможности их использования в проведении химических процессов с нестандартными субстратами. При этом иммобилизация ферментов увеличивает шансы их регенерации и повторного использования, что необходимо для того, чтобы липазы стали более привлекательными для промышленного применения [38]. Невысокая скорость реакции компенсируется энантиоселективностью и возможностью проведения реакций в мягких условиях и в водно-органических смесях. Считается, что биологический катализ с участием иммобилизованных ферментов может стать альтернативой химическому катализу для химических реакций в обозримом будущем [39].

2.3. Липазы в реакциях стереоселективного гидролиза, этерификации и

переэтерификации

Липазы катализируют не только гидролиз эфиров, но и в почти безводных средах (с содержанием воды 1 % и ниже) данные ферменты могут осуществлять реакции этерификации или переэтерификации [40]. Они катализируют реакции ацилирования вторичных спиртов, аминолиза и аммонолиза и даже присоединения по Михаэлю [41, 42]. На схеме 1 приведены традиционные реакции, катализируемые липазами.

1) Гидролиз:

11СО(Ж' + Н20 —► ЯСООН + Я'ОН

2) Этерификация

ЫСООН + Ы'ОН —ЯСОСЖ' + н2о

3) Трансэтерификация

реакции в этой категории могут быть дополнительно разде:

(а) Переэтерификация

ксосж' + ысосж* —► ясосж* + я-соок'

(б) Алкоголиз

КСОСЖ' + Я"ОН -► 11СО(Ж" + Я'ОН

Схема 1. Типы реакций, катализируемые липазами.

Достаточно широко липазы применяются в таких отраслях промышленности, как производство жиров, моющих средств, полимеров, биодизельного топлива. Например, в жировой и нефтехимической промышленности иммобилизованные липазы используются для катализа гидролиза и этерификации масел и жиров в

качестве альтернативы традиционным процессам, что обусловлено вопросами энергосбережения [43].

Липазы в присутствии воды осуществляют гидролиз разнообразных сложных эфиров (схема 1), при этом гидролиз хиральных субстратов происходит стереоселективно. Так, в работе [44] описан простой и эффективный метод синтеза энантиомерно обогащенных ацетоксиметиларилсульфоксидов, основанный на гидролизе рацемических субстратов, катализируемом липазами в условиях кинетического разделения. В присутствии фермента только (Я)-энантиомер субстрата подвергался гидролизу до

гидроксиметиларилсульфоксида (схема 2), а (£)-энантиомер, оставшийся неизменным, был выделен в случае АК-липазы (Р. Аиотеясете) с ее до 98%.

О Enzyme О

м „ м .

s --s

R^ ^СН2ОАс Solvent R4' ^СН2ОАс

(S)

О

II

R ^СН2ОН (Я)

R= Ph, р-МеС6Н4

О

R-S-S-R ."Н2° ^БОН] + СН20

Схема 2. Ферментативное разделение рацемических ацетоксиметиларилсульфоксидов

В работе [45] был изучен гидролиз карбоциклических этиловых эфиров Р-аминокислот при помощи липазы СДЬ-Б с целью последующего получения циспентацина - противогрибкового антибиотика (схема 3). В оптимальных условиях реакции при концентрации фермента 30 мг/мл в трет-бутилметиловом эфире при 65° С за 24 ч выход составил 75 % при ее 98 %.

,COOEt

CAL-B

»COOEt

'NH,

лСООН "NH2

Схема 3. Ферментативный гидролиз карбоциклических эфиров Р-

аминокислот

Липазы с успехом применяются для стереоселективного гидролиза сложных эфиров фторированных аналогов аминокислот. Описан эффективный химико -ферментативный метод синтеза энантиомеров Р-фторфенилзамещенных Р-аминокислот [46], исходя из соответствующих арилальдегидов, первая химическая стадия которого представлена на схеме 4. Выходы рацемических продуктов составили 76 - 98 %.

Схема 4. Р-Фторфенилзамещенные Р-аминокислоты

На ферментативной стадии в результате энантиоселективного гидролиза с использованием липазы PSIM, полученной из Burkholderia cepacia, было произведено кинетическое разделение гидрохлоридных солей рацемических

эфиров Р-фтораминокарбоновых кислот, показанное на схеме 5. Отличная энантиоселективность (Е > 200) была получена при проведении реакций в водно-органической среде в присутствии Е13М Как непрореагировавшие эфиры (Я)-аминокарбоновых кислот, так и образующиеся (£)-аминокислоты выделены с ее > 99 % и высокими выходами (> 48 %).

ОЕ1

R1=F, Рз=СРэ

R1=F, Р2=Р4=Н, Рз=СН3

епгуте, Н20, /Рг20 Е13М, 45 °С

МН2 О

ОЕ1

МНг О

ОЕ1

Схема 5. Ферментативное разделение рацемических эфиров Р-аминокарбоновых кислот

Стереоселективный ферментативный гидролиз шиффового основания этилового эфира (^-РИе, совместно с добавлением в раствор органического основания для рацемизации оставшегося производного (Я^-энантиомера, привел в результате тандемной реакции к эффективной асимметрической трансформации исходного эфира и выделению (5)-РИе с выходом до 88 % [47] (схема 6).

Cl

H

\

C=NL , „

О Et (D)H CH2Ph

BH(D)+

[Carbanion]

BH(D)+

H20 (D20)

Cl

C=N

OEt

PhH2C H(D)

H20 (D20)

Cl

•o + (D2)H2NX .0Et (D)H bH2Ph

Enzyme

H20 (D20)

Cl

+ (D2)H2N .0Et PhH2C H(D)

V 2) 2 v^/ OH(D) + C2H5OH(D) (D)H 'CH2Ph

Схема 6. Тандемная реакция получения (S)-Phe

В реакциях образования сложных эфиров валериановой кислоты и гексанола в водно-мицеллярных средах при 30о С в качестве катализаторов были протестированы четыре доступные липазы (Candida rugosa, Rhizopus niveus, Burkholderia cepacia и Rhizomucor miehei), из которых последняя показала наилучшие результаты по высокой конверсии (до 99 %) [48]. Установлено, что этерификация протекала только с первичными спиртами, причем добавление 1 экв трифторметилбензола по отношению к субстрату в реакционную среду увеличивала конверсию. Использование этой добавки, приводящее, как полагают авторы, к изменению формы ферментативного кармана, может предоставить захватывающие возможности и расширить список вступающих в

реакцию кислот и спиртов.

В литературе описаны примеры разделения рацемических сложных эфиров при помощи цельноклеточной культуры суспензии микроорганизмов. Так, стереоселективное получение напроксена, известного нестероидного противовоспалительного препарата, проводили разделением сложных эфиров (±)-6-метокси-а-метил-2-нафталинуксусной кислоты при помощи штамма дрожжей ТпсИо8рогоп 8р [49]. Были изучены биохимические характеристики клеток, а также выделенной из них липазы. Её использование для проведения процесса, приводящего к образованию (5)-(+)-напроксена, показало очень высокую стереоселективность (ее > 99 %, Е ~ 500) и скорость гидролиза (схема 7). Другой стереомер, (Я)-(-)-6-метокси-а-метил-2-нафталинуксусной кислоты рацемизировали кипячением в метилате натрия, очищали активированным углем, и полученный рацемат повторно использовали для кинетического разделения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Юфряков Вячеслав Сергеевич, 2025 год

использованием

трет-

бутилдиметилсилилхлорида (TBDMSCl) с последующим ферментативным ацилированием свободной аминогруппы (схема 14).

Enzyme, solvent 30 "С, 250 rprn

(S)-2 R=COCH3 (S)-3 R=COCH2CH2CH3 (S)-4 R=COCH2OCH3

Схема 14. Расщепление 3-амино-3-фенил-1-трет-бутилдиметилсилилоксипропан-1 -ола

В результате данного подхода с хорошим общим выходом и высоким энантиомерным избытком был получен ценный промежуточный продукт для производства (£)-дапоксетина [59], а липаза CAL-A отнесена к лучшим катализаторам разделения стерически затрудненных при хиральном центре молекулы соединений.

Другим примером стереоселективного ацилирования по аминогруппе [60] является получение оптически активных прекурсоров препарата лабеталола (рисунок 3), применяемого при гипертонии и стенокардии. Лабеталол является Р-адреноблокатором, оказывающим одновременно а1-адреноблокирующее действие.

Acyl donor

OTBDMS

он

он

Рисунок 3. Лабеталол

Физиологическую активность проявляют два стереомера: (R,R) и (S,R), при этом первый более активен в отношении P-1-рецепторов, а второй - в отношении a-1-рецепторов. Однако (RRj-изомер обладает большой гепатотоксичностью, поэтому в изолированном виде не используется. Для получения оптически активных прекурсоров в данном способе, в отличие от традиционного, применяется кинетическое разделение 1-метил-3-фенилпропиламидов бензойных кислот с использованием липазы, полученной из Candida antarctica, (схема 15). Высокая энантиомерная чистота целевого продукта с ee > 99 % при конверсии 24 % достигнута в среде толуола за 4 суток.

Схема 15. Ферментативное получение ^-замещенных бензиламидов

Для ферментативных реакций ^-ацилирования важно не только подобрать оптимальный растворитель, но и донор ацильного остатка. Кроме активированных эфиров используются разнообразные ацилирующие агенты, например, 1-этоксивиниловые эфиры [61] и 2-алкоксиацетаты [62]. Однако ряд

стандартных ацилирующих агентов не может быть использован из-за более высокой нуклеофильности аминов по сравнению с соответствующими спиртами, приводящей к возможности реакции с аминами [63]. Использование липаз для образования амидных связей в органических растворителях с целью препаративного синтеза пептидов одним из первых было описано А. Клибановым в 1987 г, на примере реакции ферментативного аминолиза [64]. В настоящее время липазы широко применяются для получения амидов целого ряда хиральных высших жирных карбоновых кислот [65]. Липаза ССЬ оказалась эффективным биокатализатором в процессах выделения различных хиральных амидов в энантиомерно чистом виде с высокими выходами. Тот же фермент способен катализировать реакцию этилхлорпропионата с диаминами с образованием хиральных диамидов, а при использовании рацемических аминов [66] могут быть получены амиды с двумя стереогенными центрами (схема 16).

Для кинетического разделения некоторых хиральных аминов, представляющих интерес для фармацевтики, могут быть использованы как липазы, так и протеазы [64]. Однако липазы обладают рядом преимуществ, такими как очень низкая амидазная активность и возможность проведения реакции в неводных органических растворителях. Рацемические амины можно разделить с помощью этилметоксиацетата в качестве ацилирующего агента [67].

С1

сосш

(±)

Ш\1Н2, ССЦ Нехапе ог СС14

R = А1ку1, Т = 2-25 °С 14 = Агу1, Т = 60 °С

1\1Н2

14 = п-реп1у1, Вп

ССЦ ССЦ виЫШБт, 3-Ме-3-реп1апо1

Н2М МН2

* ' п

СС1_ ог ЗиЫШэт

Н С1

ЧС01ЧНР

О К

N * Н

Н Н

V:

о о

72-100% с!е, 21-88% ее

С1

Схема 16. Ферментативное получение хиральных амидов и диамидов

Например, РБЬ липаза катализирует ^-ацетилирование азидоаминов. Этот процесс интересен тем, что разделяемые так азидоамины являются исходными соединениями для синтеза азасахаров. В качестве примера оптимизации кинетического разделения аминов, содержащих фенильные фрагменты, можно привести исследование группы французских ученых [68]. Было установлено, что реакции ферментативного разделения 2-амино-4-фенилбутана с использованием липазы CAL-B, проведенные с использованием длинноцепочечных эфиров и соответствующих кислот в качестве доноров ацила, протекают с исключительно высокой энантиоселективностью (схема 17). Использование карбоновых кислот в качестве ацилирующих агентов привело к заметному увеличению скорости реакции по сравнению с их сложноэфирными аналогами. Так, использование лауриновой кислоты приводит к образованию продукта с энантиомерным избытком > 99 % как для оставшегося амина, так и для соответствующего

лаурамида при полной конверсии, достигаемой в гептане при 80° С вдвое быстрее, чем в случае использования сложного эфира кислоты. Эти оптимизированные условия впоследствии были применены для разделения ряда алифатических и бензиловых аминов.

СА1_-В СЦНззСОСЖ

Нер1апе, 80 °С

1\1Нс

Р = Е1 0 = 6И) Р = Н 0 = 31п)

ее > 99,5% ее > 99,5%

ее = 97,0% ее > 99,5%

Схема 17. Оптимизация кинетического расщепления 2-амино-4-фенилбутана

Ученые университета Овьедо сообщили [69] о получении при помощи липаз стереомерно чистых производных 3-(1-аминоэтил)-пиридина (схема 18). Первоначально были получены рацемические смеси целевых соединений, которые ацилировали этиловым эфиром 2-метоксиуксусной кислоты в присутствии липазы СЛЬ-Б при 30° С в течение 2 - 7 часов, с получением (Я)-

метоксиацетамидов. Выход целевых продуктов с ее > 99 % составил 47 - 50 %.

1. n-BuLi, Et20 Br -78°C, 30 min

2. CH3CHO -78°C, 90 min

OH

DMP

CH2CI2 FTT r.t., 2h N

NH,

0 NaBH3CN CH3COONH4

NH,

MeOH r.t., 14h

О

н3со^Лк

FTÍ-

N

NH

N

+ Fn

CAL-B

OCH3 О

THF H3C

CN

MeMgl Et20

F,CT N

0 °C to r.t., 4h

F3C N

NH,

NaBH3CN CH3C00NH4

MeOH r.t., 14h

NH,

F,C" N

О

НзСО^^Л

NH

FiC N

CAL-B

PCH3 О

f^C "N

THF H3C

Схема 18. Расщепление аминопиридинов

Таким образом, в большинстве примеров аминолиза с рацемическими аминами липазы, особенно CAL-B, проявляют предпочтение в отношении (R)-стереоизомера аминов. При этом встречаются сообщения, в которых в аналогичных процессах те же самые липазы не проявляют энантиоселективности. Так, в статье [70] сообщается о высокоэффективном синтезе моноамидных эфиров малоновой, янтарной и яблочной кислот путем десимметричных превращений их диэфиров при помощи различных коммерчески доступных липаз (CAL-B, PSL, Candida rugosa, R. miehei и Carica papaya). Иммобилизованная липаза CAL-B (Novozym 435) катализировала моноаминолиз бифункциональных диэфиров, таких как диэтилмалонат, диэтилсукцинат и (^£)-малат, приводя к соответствующим моноамидам с

высокой конверсией, но практически в рацемическом виде. Так, реакция сложного эфира и амина (схема 19) под действием липазы СЛЬ-Б приводит с высоким выходом к преобладанию одного продукта - рацемического а-гидроксимоноамида яблочной кислоты.

Схема 19. Региоселективный моноаминолиз бензиламином

В последнее время при получении амидов особое внимание уделяется вопросам «зеленой» химии, поскольку их традиционный химический синтез включает использование токсичных хлорирующих агентов для активации карбоновых кислот. Недавно была разработана ферментативная стратегия получения амидов с использованием липазы СЛЬ-Б в качестве биокатализатора и циклопентилметилового эфира в качестве экологически чистого и безопасного растворителя [71]. Метод позволяет получать амиды с высокими выходами без проведения стадий очистки. Реакция была распространена на получение 28-ми различных амидов. Данную ферментативную методологию можно отнести к экологичному и потенциально промышленному процессу прямого синтеза амидов. Другая перспективная «зеленая» концепция ферментативного амидирования в водной системе заключается в активации жирных кислот глицерином и их последующим аминолизом глицином в присутствии

модифицированной липазы proRML приводящая к получению длинноцепочечных N-ацилглицинов с выходом до 80 % [72, 73].

2.6. Другие реакции, катализируемые липазами

Известны примеры разнообразных химических реакций, катализируемых липазами. Так, группа бразильских ученых исследовала механизмы катализируемых ферментативных реакций Михаэля между первичными или вторичными аминами и акрилонитрилом [74]. Были протестированы несколько видов липаз и получен ряд аддуктов Михаэля (схема 20) за существенно более короткое время реакции, чем в их отсутствие.

R1^M"R2 /CN Lipase

N + ^ ---.N.

I

H

Toluene, 30 °C R£ ^^ CN

Схема 20. Катализируемое липазами присоединение вторичных аминов к

акрилонитрилу

В статье [75] опубликовано описание реакций с участием генно-инженерной мутантной липазы B из Candida antarctica, используемой для катализа реакций образования углерод-углеродных связей. Мутации Ser105Ala и Ser105Gly, при которых отсутствует нуклеофильный остаток серина в каталитической триаде, вызывали отчетливую альдолазную активность. Фермент «дикого» типа также был способен осуществлять эту реакцию, хотя и в меньшей степени. На основании теоретических расчетов предложен механизм, в

котором оксианионная дырка активного центра стабилизирует отрицательный заряд переходных состояний, а пара His-Asp служит протонным челноком (схема 21).

Схема 21. Предполагаемый механизм катализа реакции Михаэля [76]

Анализ данного механизма, позволил авторам [76] предположить, что этот фермент может также катализировать реакции присоединения по Михаэлю, что и было подтверждено в результате успешного присоединении вторичного амина к акрилонитрилу. Реакция акрилонитрила с различными вторичными аминами в присутствии липазы СЛЬ-В приводит к соответствующему аддукту Михаэля в

100 раз быстрее, чем в её отсутствие [76]. Начальная скорость была практически пропорциональна количеству фермента, что свидетельствовало о каталитическом эффекте. Скорость реакции зависела от структуры амина (схема 22), причем реакционная способность убывала при переходе от циклических к нециклическим аминам, что хорошо согласуется с их нуклеофильностью.

I

н

Lipase

+

Схема 22. Схема реакции Михаэля с алифатическими аминами.

Китайские ученые [77] осуществили взаимодействие

дифенилфосфиноксида с производными стирола, имеющего

электроноакцепторную группу в Р-положении (схема 23).

Novozym 435

EtOH, r.t.

Схема 23. Присоединение дифенилфосфиноксида по реакции Михаэля,

катализируемое липазой СДЬ-Б.

Реакция проводилась при комнатной температуре в среде этанола с липазой CAL-B, выход продукта за 2 часа реакции составил от 75 до 95%. Меньшие выходы наблюдались у стерически затрудненных веществ.

Известны также случаи энантиоселективного раскрытия лактамных циклов в присутствии липаз. В работе [78] описывается разделение фторорганических веществ путем селективного раскрытия лактамного цикла, катализируемого липазами CAL-B и PS из Burkholderia cepacia (схема 24). Высокоэнантиоселективное раскрытие кольца в соединениях rac-1 и rac-2 липазой в метаноле позволило получить (К/(3^,4К))-Р-лактамы в виде непрореагировавших энантиомеров и (57(25,,35))-Р-амино эфиры с ee > 99 %. В тех же условиях рацемический лактам rac-3 был неактивен. Реакция проводилась в течение 24 часов при комнатной температуре, в среде метанола, давая количественный выход продукта при высокой энантиоселективности (Е > 200). Отмечено, что наличие фтора в непосредственной близости от гидролизуемой связи способствует процессу и реакция не идет в его отсутствие (R = R1 = H).

КГ РЬ"

//

-и

ОМе

гас- 1а, гас-2а, Р=Н, Р-,=Р

-Л/

/I—ын

р\\

гас-Л, гас-2, Р=Н, Кт=Р гас-3, К=К1=Н

,СООМе

Л

Г

-1ЧН

ОМе

,СООН

РЬГ 1ЧН2

(28,38)-7, R=H, Р-,=Р (Я)-8,

I

—N14

Р^'

(Б)-з, Р=Р1=Н

Схема 24. Стереоселективное раскрытие лактамных циклов

Особенно привлекательно расширение круга тандемных процессов, приводящих к получению новых элементоорганических или гетероциклических структур [6, 7]. В работе [79] описывается многокомпонентная реакция получения бис-(а-аминофосфонатов) при участии липаз. Для синтеза используются производные бензальдегида, диэтилфосфит и бензидин (схема 25). Использование в данной реакции липазы СЛЬ-Б позволило получить 11 соединений с выходом от 67 до 90 % и ее 52 - 100 %. При этом выход понижался при наличии стерических затруднений у производных бензальдегида, а энантиомерный избыток уменьшался при наличии ярко выраженных электронодонорных групп в пара-положении ароматического кольца.

О

о

+ нр^ОЕХ + Н21Ч-Ч0Е1

\\ /Г^ //

ЫН'

СА1_-В (50тд)

ТНР (2т1)/ 50 °С ЗОтт

ЕЮ.

ГК

нм-

сш

\ / Р=0

Е10 ОИ

\ /

0=Р /=

\\ /лл /

N4

(Г К

Схема 25. Многокомпонентная реакция под действием липазы 2.7. Десимметризация прохиральных соединений липазами

В отличие от химических катализаторов липазы позволяют достаточно просто переводить прохиральные соединения в хиральные, селективно взаимодействуя с одной из функциональных групп такого соединения; они катализируют образование энантиомерно обогащенных хиральных производных. Такой процесс десимметризации под действием ферментов имеет преимущество перед реакциями кинетического разделения с точки зрения потенциальной возможности перевода прохирального соединения практически полностью в один стереомер. Так, сообщалось о ферментативной десимметризации прохирального 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола,

приводящей к энантиомерно обогащенному моноэфиру [80]. Ацилирующим агентом выступал винил-н-гексаноат (схема 26). Иммобилизованная PS липаза показала лучший выход 88% и энантиомерную чистоту продукта 89 %.

О

R^O""^ о

Me Immobilized lipase II Me

НО'^у^ОН from pseudomonus sp. R'^^O'^^^j^^OH

NHBoc Solvent, room temperature NHBoc

Схема 26. Десимметризация прохирального 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола

Десимметризация прохиральных соединений при помощи липаз может достигаться не только селективным ацилированием симметричного соединения, но и образованием гетероциклических соединений. В работе [81] был рассмотрен синтез хирального фторлактама на основе прохирального фторированного производного малонового эфира (схема 27). Для получения стереомерно чистого соединения на одном из этапов была использована липаза. В ходе скрининга определено, что лучшая из них - липаза CAL-B определяет выход целевого продукта в 47 % (20° С, 8 ч, pH 7.3, 0.025М фосфатный буфер). При масштабировании реакции и увеличении концентрации исходного вещества для поддержания pH требуется постепенное добавление соли исходного соединения совместно раствором гидроксида натрия.

0 0 0 0

Схема 27. Синтез хирального (Я)-фторлактама из прохирального производного

малонового эфира

Джонсон с соавторами осуществляли десимметризацию мезо-диолов и соответствующих им мезо-диацетатов, полученных из циклопентадиена, бензола и циклогептатриена при помощи липаз в органических или водных средах (схема 28) [82]. Предположено, что присутствие дополнительного заместителя в циклическом кольце существенно изменяет расположение диола в активном центре липазы. При этом, замена водной среды на органический растворитель полностью обращает конфигурацию продукта реакции. Авторы акцентируют внимание на потенциальной возможности существенно расширить круг субстратов ферментативных реакций за счет использования мезо-соединений в органических средах.

Схема 28 - Десимметризация мезо-диолов и мезо-диацетатов

В работе [83] рассматривается получение оптически активных дифенилфосфинов и их производных дерацемизацией симметричных двухатомных спиртов (схема 29). Реакция селективного ацилирования проводилась винилацетатом при помощи липазы CAL-B при 30° С в течение 11 суток для дифенилфосфина и 21 суток для трифенилфосфина. Выходы в обеих реакциях оказались невелики, как и стереоселективность превращения. Авторы статьи объясняют это наличием побочных продуктов окисления кислородом воздуха.

В работе [84] рассматривается разделение похожего вещества, но в окисленной форме - дифенилфосфиноксида. Разделение производится липазой CAL-A в среде водного толуола (схема 30).

X = lone pair, S

Yield: 10-80% ее: 16-98%

Схема 29. Десимметризация прохиральных фосфинов

Схема 30. Ферментативная десимметризация прохиральных фосфиноксидов

Реакция проводится при температуре 37° С в течение суток. Выход целевого продукта составил 66 %, его энантиомерный избыток - 96 %.

Этот уникальный подход позволил осуществить разделение рацемата четырехатомного полифторсодержащего спирта [85]. Предварительно центральные гидроксигруппы защитили образованием кеталя, после чего две оставшиеся функциональные группы подвергались ацилированию, при катализе РБ липазой (схема 31). В качестве растворителя использовали смесь фосфатный буфер-ДМФА (3:1), и за 18 ч целевое моноацилированное производное было получено с выходом 98 % и ее > 99 %.

Схема 31. Десимметризация прохиральных фторсодержащих спиртов.

2.8. Ферментативные реакции в микрожидкостных биореакторах

Использование систем, содержащих ферменты и/или живые клетки, позволяет проводить химические реакции в мягких условиях, создавая новые пути синтеза как за счет увеличения времени проведения процесса, так и за счет наличия регио- и стереоселективности, устраняя введение защитных групп и их удаление, требующие использования агрессивных реагентов. В то же время

он

микрожидкостные биореакторы, рассчитанные на использование очень малых количеств веществ, позволяют дополнительно резко уменьшить время проведения процесса и решить проблему скрининга ферментативных реакций [86].

В работе [87] для проведения реакции получения диола из эпоксида (схема 32) использовался простой Т-образный микрочип. Применение ферментов в качестве катализаторов приводит к высокой стереоселективности процесса (до 95 % ее). Данный микрочип был интегрирован с системой хирального электрофореза, что позволяло сразу разделять и идентифицировать продукты реакции. Соединения разделяли при рН 8,5 с использованием боратного буфера, содержащего гептакис-6-сульфато^-циклодекстрин в качестве дополнительного хирального компонента. В этих условиях продукты реакции могут быть одновременно разделены на соответствующие энантиомеры менее чем за 90 секунд. Для обнаружения аналитов использовали метод флуоресценции с применением глубокого УФ-лазера (Nd : YAG, = 266 нм).

Схема 32. Реакция раскрытия эпоксида

В статье [88] сообщается о кинетическом разделении смеси рацематов аминов путем стереоселективного ацилирования этилацетатом при катализе иммобилизованными липазами СДЬ-Б (схема 33). Реакции проводили как в колбе, так и в проточном микрореакторе; температура варьировалась от 0 до 70° С. Результаты продемонстрировали, что различные способы иммобилизации ферментов являются оптимальными для катализируемого липазой кинетического разрешения рацемических аминов для различных типов субстратов и/или условий реакции. Методы иммобилизации, которые ограничивают подвижность фермента в сочетании с «гибкими» субстратами, позволяют поддерживать селективность при повышенных температурах. С другой стороны, методы иммобилизации, ограничивающие подвижность ферментов, в сочетании с «жесткими» субстратами приводили к низкой

реакционной способности и селективности при низких температурах. Как

показал анализ проб, полное разделение стереомеров в колбе занимает около 24 часов, тогда как время разделения в микрореакторе составляет всего 1 час.

Схема 33. Стереоселективное ацилирование этилацетатом, катализируемое

иммобилизованной липазой B

Недавно Грубер с коллегами [89] сообщили о двухстадийном способе синтеза в микрореакторе (2^,3Я)-2-аминобутан-1,3,4-триола (ABT) — блока для синтеза ингибиторов протеазы и ряда лекарств (схема 34). В ходе оптимизации условий реакции были получены желаемые параметры для успешной каскадной реакции. Реактор первой ступени показан на рисунке 4(а). Сыворотку с транскетолазой и субстрат вводят в верхнюю часть реактора, построенного из двух полиметилметакрилатных пластин. На рисунке 4(б) показано устройство для смешивания продуктов первой реакции с другим субстратом в Y-образном соединителе для следующей стадии, катализируемой трансаминазой, которую вводят в центр блока. В целом микрофлюидные технологии позволили сократить время ферментативной реакции более чем на порядок и получить более чистое соединение ABT.

и

NH

и :i [i

133

J

134

,0 ThDP, MgCl2

HOOC' '—" HO transketolase HO

130 131

hydroxypytuvate (HP) glycolaldehyde (GA)

OH

CO,

transaminase

OH 132

L-erythrulose (ERY)

NH,

OH

HO

OH 135

(2S, 3R)-2-amino-1,3,4-butanetriol (ABT)

Methylbenzylamine-

Hydroxypyruvate Glycolaldehyde

Transketolase lysate -

Transketolase serpentine reactor

micromixer

Transaminade lysate —

Transamine coil reactor

(2S,3R)-2-amino-l,3,4,-butanetriol

Схема 34. Синтез АВТ и общая схема реактора

Рисунок 4. Реактор для первой и второй (б) стадии реакции

В статье [90] обсуждается реакция ацилирования первичной гидроксильной группы производных уридина проводимая в проточном микрореакторе с катализатором Lipozyme TLIM, полученным путем иммобилизации липазы ТЬвгтотусв8 \anuginosus на силикагеле. Полученные аналоги нуклеозидов, такие

как азидотимин, телбивудин и доксифлуридин, используются в медицине в качестве противовирусных и противоопухолевых препаратов. Реакцию проводили с различными субстратами (схема 35). Выход эфиров составил 80 - 99 % при следующих оптимальных условиях: растворитель ДМСО / трет-амиловый спирт (1 : 14); соотношение субстрата уридин / виниллаурат (1 : 9); 30 °С; 30 минут в проточном микрореакторе. Эта реакция при проведении в колбе требует более длительного времени (24 часа) для достижения желаемого результата [91].

Схема 35. Ферментативное ацилирование первичной гидроксильной группы в

производных уридина

Важно отметить, что, несмотря на большое разнообразие природных ферментов, относительно немногие из них были успешно применены в промышленных процессах. В недавнем исследовании [92], для того чтобы обойти это ограничение использовался метод направленной эволюции (ЭБ). Данный подход, имитирующий естественный отбор, был использован в

сочетании с капельной микрофлюидикой. Это позволило анализировать несколько вариантов ферментов в сверхкороткие сроки, создавая новые ферменты с индивидуальными характеристиками. Разработка метода ЭБ в последние годы относится к наиболее важным достижениям в области компьютерного моделирования и получения ферментов.

Недавно микрофлюидный биореактор был предложен в качестве экологически чистой альтернативы традиционному синтезу Ь-ДОФА и ферментативного производства дофамина в последовательности реакций с выходами соответственно 30 % и 70 % [93]. Кроме того, был проведен эксперимент по масштабированию процесса в 780 раз, чтобы достичь объемов в литрах при сохранении выхода. Эта схема отличается снижением расхода реагентов за счет иммобилизации фермента на носителе, который затем можно использовать в реакторе с уплотненным слоем.

Следует подчеркнуть, что время проведения ферментативных реакций в микрореакторах сократилось в среднем на порядок, с нескольких дней до нескольких часов. Использование таких технологий открывает возможности «автоматизации» науки [94] и полностью соответствует требованиям зеленой химии [95]. Синергетическая комбинация искусственного интеллекта, низкой стоимости продукта, высокой производительности процесса и стандартизированного анализа потенциально может повысить эффективность синтеза низкомолекулярных лекарств [96].

2.9. Заключение

Свойство липаз катализировать разнообразные химические реакции, является главной причиной, почему они всё шире применяются в органическом синтезе. Известно много реакций, катализируемых липазой, с объяснением механизма процесса, происходящего в каталитическом центре. Наличие широких биокаталитических свойств липаз наряду с высокой активностью, стабильностью, энантиоселективностью и доступностью, обеспечивает уникальную возможность расширения числа соединений используемых в качестве их субстратов и применения их потенциала в органическом синтезе. В последнее время открыты новые возможности применения липаз в органическом синтезе, особенно для многокомпонентных реакций, когда в одну стадию можно установить целый ряд функциональных групп, и для синтеза гетероциклических соединений, которые трудно получить классическими химическими методами. Хотя в случае образования новых стереогенных центров в молекуле продукта, стереоселективность используемых ферментов до сих пор не предсказуема. Также слабо изучена связь изменения стереоселективности в зависимости от химической природы субстрата или условий эксперимента, недостаточное распространение ферментативные подходы получили в области элементоорганических соединений.

Использование липаз представляет собой многообещающую стратегию «зеленого» синтеза лекарств и промежуточных продуктов. Однако природные липазы имеют и ряд недостатков, такие как, лабильность при высоких

температурах и экстремальных значениях pH, а также плохая стабильность в органических растворителях, что ограничивает их использование в промышленной практике. Липазы можно улучшить с помощью молекулярно-биологических методов, таких как направленная эволюция, сайт-направленный мутагенез, химическая модификация, иммобилизация и т. д., для приобретения большей стабильности и более высокой каталитической эффективности. Интересна продемонстрированная недавно возможность проведения в воде в одном сосуде сразу нескольких химических и биокаталитических многостадийных реакций [68].

Таким образом, катализируемые липазой превращения, в сочетании с традиционными и новыми методами органического синтеза могут предоставить огромные возможности для синтеза целевых хиральных веществ широкого назначения. Оптимизация выхода и стереоселективности продуктов разнообразных асимметрических реакций, катализируемых липазой, дает прекрасную альтернативу использованию катализаторов на основе комплексов металлов или органокатализаторов. Липазыы, давно используемые в различных крупных отраслях промышленности, все чаще применяются во всех областях синтетической органической химии. Для химика-синтетика, не знакомого с применением липаз в своих исследованиях, открывается огромная новая область биокатализаторов и разнообразных превращений элементоорганических соединений с их использованием.

3. ОБСУЖДЕНИЕ результатов

Биокаталитическое расщепление рацемических молекул хорошо известно [97] и, в частности, липазы применяются в органическом синтезе для разделения рацемических соединений, таких как, например, амины и спирты [98 - 100]. Ранее в нашей лаборатории №128 ИНЭОС РАН липазы были успешно использованы для гидролитического расщепления эфиров аминокислот и аминоспиртов [47, 55, 101]. Однако катализируемое ферментами энантиоселективное расщепление использованных нами в работе субстратов пока не изучалось.

3.1. Попытка кинетического разделения ряда фтор- и фосфорорганических соединений на отдельные энантиомеры

Для исследования способности липаз катализировать энантиоселективный гидролиз фторорганических веществ были выбраны рацемические смеси производных двух небелковых аминокислот: метиловые эфиры 2-амино-2-трифторметилбут-3-иновой кислоты (производное глицина) 1 и 2-амино-2-трифторметилпент-4-иновой кислоты (производное аланина) 2, изображенных на рисунке 5. Нами были рассмотрены возможности кинетического разделения этих соединений, содержащих четвертичный атом углерода. Данные вещества, которые пока известны только в виде рацематов, предоставлены для исследований лабораторией экологической химии ИНЭОС РАН (д.х.н. Осипов С.Н.).

NHCbz NHCbz

HC=-{-CF3 ,-^-CF3

COOMe COOMe

Рисунок 5. ^-Cbz-метиловые эфиры а-трифторпроизводных глицина 1 и аланина 2

Важность использования полифторсодержащих функциональных групп для разработки новых лекарственных средств хорошо известна [102 - 105]. При этом особые свойства CF3-группы, такие как гидрофобный характер, стерический объем и высокая электроотрицательность могут не только существенным образом улучшить фармакокинетические свойства лекарственных средств [106, 107], но и придать соединениям высокую рострегулирующую активность [108]. Исследуемые соединения 1 и 2 могут быть использованы как билдинг-блоки для получения физиологически активных пептидов [109, 110], однако, попытки их выделения в энантиомерно чистом виде ранее не предпринимались.

Для осуществления ферментативного гидролиза были испытаны разнообразные условия реакции. Среди ферментов испытывались а-химотрипсин и широкий круг липаз: PPL, Candida cylindracea, CCL, Candida rugosa и Amino Р, а также иммобилизованная липаза B из Candida antarctica. В качестве растворителя использовались разнообразные водно-органические

среды, такие как ацетонитрил/вода, хлороформ/вода. Однако, все попытки расщепления данных соединений путем стереоселективного гидролиза оказались безуспешными. По данным ВЭЖХ, исходный рацемический субстрат 1 практически не претерпел изменений, что может быть обусловлено стерической затрудненностью четвертичного атома углерода эфира аминокислоты, находящегося непосредственно вблизи реакционного центра стереоселективного гидролиза. По данным ЯМР 1Н- и 19F спектроскопии реакция также не наблюдалась - синглетные сигналы атомов фтора на спектрах, снятых по прошествии 14 суток реакции, сохраняли те же химические сдвиги, что для исходных соединений. Можно было полагать, что повышение температуры позволит добиться протекания реакции, однако при этом возможен и спонтанный гидролиз целевого сложного эфира, и соответствующее снижение селективности. Только через нескольких суток при 45оС в среде ацетонитрил/вода для ферментативного гидролиза менее стерически затрудненного аланинового производного 2 наблюдался слабая конверсия субстрата (Схема 36). Однако, согласно данным ВЭЖХ после 14 суток гидролиз субстрата в присутствии Candida antarctica липазы составил лишь несколько процентов. При этом стереоселективность процесса отсутствовала. Ряд других ферментов (PPL, Candida cylindracea, Candida rugosa) были полностью неактивны в данном процессе.

СБз

НС

СБз

НС

ШСЬг С02Ме (5)-эфир

+

ШСЬг С02Ме (^)-кислота

2 ШСЬг С02Ме

Схема 36. Ферментативный гидролиз метилового эфира 2-амино-2-трифторметилпент-4-иновой кислоты 2

Более удовлетворительными были результаты стереоселективного

дифенилалкилфосфиноксидов, содержащих гидроксигруппу в разных положениях относительного хирального центра (рисунок 6). Данный класс соединений характерен своей сильной психотропной активностью. Так, хорошо известны ноотропные свойства ряда гидразидов диарилфосфониевых кислот [111,112], а среди азотсодержаших фосфорорганических экстрагентов -карбамоилметилфосфиноксидов [113] и ^фосфорилмочевин [114] -наилучшими экстракционными характеристиками обладали производные, содержащие дифенилфосфорильную группу.

Для исследования селективного ацилирования фосфорорганических соединений были взяты дифенилалкилфосфиноксиды 3-7 (рисунок 6), предоставленные для исследования с.н.с. кхн Бодриным Г.В. и с.н.с. кхн Горюновым Е.И. (лаборатория ФОС ИНЭОС РАН).

ацилирования

фосфорорганических

соединений

класса

ОН

Рисунок 6. 3 - 1-(дифенилфосфиноксид)-бутан-3-ол, 4-1-(дифенилфосфиноксид)-1-(4-гидроксифенил)-бутан-3-он, 5 - 1-(дифенилфосфиноксид)-бутан-З-он, 6 - 2-(дифенилфосфиноксид)-2-метил-пентан-3-он, 7 - 1-(дифенилфосфиноксид)-1-фенил-3-(2-гидроксифенил)-пропан-3-он.

Лучшие результаты по кинетическому расщеплению гидроксипроизводных 3 - 7, содержащих дифенилфосфиноксидную группу были получены с использованием винилацетата и фермента Candida antarctica В в среде ацетонитрила. И если для бутанола 3 за сутки конверсия была лишь 2,5 %, то для другого субстрата 4, содержащего более реакционноспособную фенольную гидроксигруппу, ацилирование за тоже время прошло уже на 50% с образованием соответствующего ацетата 4-ОАс. У субстрата 4 стереоцентр не связан непосредственно с ацилируемой гидроксигруппой, поэтому предполагалось, что ацилирование будет менее селективным, чем у бутанола 3. Однако, значения стереоселективности процесса ферментативного гидролиза

субстрата 4 оценить не удалось, поскольку используемые для разделения различные хроматографические системы не позволили разделить смесь на индивидуальные вещества. Затруднение ферментативного гидролиза наблюдалось для пентанола 6. Как видно из строения, пентанол 6 структурно похож на бутанол 3, но имеет дополнительные сильные стерические затруднения, вызванные наличием двух метильных групп в Р-положении относительно ацилируемой гидроксигруппы. Это в данном случае возможно и оказалось основной причиной медленного протекания ацилирования. В дальнейшем осуществлена оптимизация условий проведения гидролиза пентанола 6, включавшая в себя повышение температуры и использование винилацетата в качестве одновременно ацилирующего агента и растворителя, что позволило увеличить конверсию.

Для интерпретации результатов протекания ацилирования всех субстратов 3 - 7 мы в первую очередь руководствовались результатами спектров ЯМР 31Р, поскольку изотоп 31Р является стабильным и вследствие этого самым распространенным среди изотопов фосфора, а химический сдвиг фосфора при этом варьируется в широких пределах, чутко реагируя на изменение структуры соединения.

Для соединения 6 зафиксированы самые интересные результаты. По данным ЯМР-спектроскопии, в этом случае через 5 суток конверсия достигает 50 %. При этом, однако, в условиях данного процесса, кроме появления ацетата 8 фиксируется еще одно вещество, согласно данным ЯМР 1Н и 31Р, является

алкеном 9, который образуется за счет реакции отщепления в образующемся ацетате 8. Данный неожиданный факт послужил дополнительной причиной для проведения исследования методом ЯМР и 31Р кинетики процесса ацилирования. Соотношение веществ в реакционной смеси определялось по площади пиков на 31Р ЯМР-спектре. Было установлено, данный процесс спустя 7 суток приводит к равновесной смеси рацемического спирта 5, соответствующего ацетата 8 и ненасыщенного продукта 9 в приблизительно равном соотношении (Схема 37). При этом в дальнейшем количество ненасыщенного продукта 9 в дальнейшем постепенно уменьшалось. Можно полагать, непредельное соединение 9 появляется в результате обратимого отщепления молекулы уксусной кислоты уже после ацилирования исходного вещества. Несомненно, наличие такого равновесного процесса в любом случае должно нивелировать появление стереоселективности, даже если она имела место на стадии ацилирования.

РЬ Ме ОН

РЬ

N

РЬ Ме ОН

Р

Ме

Ме

+

О

6

О

6

О

8.

РЬ Ме

II

Ме

О

Схема 37. Ферментативное ацилирование у-гидроксипроизводного

диарилфосфиноксида 6

В литературе имеются сведения о подобном равновесном процессе реакции ацилирования фторорганических соединений в присутствии липаз [57]. При этом, после проведенного анализа оптической чистоты полученных спустя длительное время реакции (270 часов) продуктов, также было установлено, что непрореагировавший исходный спирт претерпевает рацемизацию.

Кетон 5 использовался для уточнения неспособности липазы катализировать разрыв других связей, в частности связи С-Р, поскольку необходимо было исключить возможное появление в числе побочных продуктов производных дифенилфосфиноксида, от которых отщеплен фрагмент, содержащий хиральный центр. В стандартных условиях процесса ферментативного ацилирования было проведено ЯМР 1Н и 31Р исследование реакционной смеси после 1, 2, 3, 7 и 14 суток начала реакции, При этом было установлено, что спектры, полученные в ходе исследования, совпадали со спектром исходного соединения, то есть реакции с кетоном 5 не последовало. Это позволило исключить побочный процесс распада фосфорорганических субстратов в данных условиях ферментативного процесса.

Соединение 7 обладает хиральным центром, который находится на дальнем расстоянии (в 5-положении) от ацилируемой о-фенольной гидрокси-группы. Это вещество использовалось нами для уточнения селективности реакционной способности винилацетата в присутствии липазы в отношении 5-гидроксигруппы, связанной с ароматическим кольцом. Анализ методом ВЭЖХ на хиральных колонках показал отсутствие изменений в соотношении пиков

рацемической смеси, что свидетельствует об отсутствии стереоселективности ввиду чрезмерной удаленности реакционного центра от хирального атома (произошло ацилирование обоих стереомеров субстрата в равной степени).

Таким образом, липазы способны к катализу ацилирования ряда изученных субстратов, однако для данных Р и Б-элементоорганических гидроксисоединений реакция идет нестереоселективно.

3.2. Химико-ферментативный метод получения (£,£)-2,2'-(этилендиимино)дибутан-1-ола (этамбутола)

Опыт работы с ферментами в органических и водно-органических средах с субстратами 1 - 7 позволил перейти к осуществлению многостадийных химико-ферментативных методов получения важных физиологически активных веществ, первым из которых был этамбутол 10. Препарат первого ряда антибиотик (5',5)-2,2'-(этилендиимино)ди-1-бутанол — (10, этамбутол, дадибутол, трибутол) является эффективным противотуберкулезным средством [115, 116]. Однако среди стереомеров диола 10 только (5,5)-диастереомер обладает сильной противотуберкулезной активностью [115, 117], мезо-диастереомер на порядок менее активен, а (Я,Я)-стереомер опасен для теплокровных и вызывает слепоту [118]. Установлено, что эффективность действия соединения 10 связана с наличием в его структуре фрагмента Р-аминоспирта, осуществляющего функции известных аминогликозидных антибиотиков. Фармакологическое действие соединения и причины возникновения резистентности микобактерий к этому препарату на генном

уровне достаточно хорошо изучены [115, 117 - 119]. Этамбутол 10 эффективен практически против всех штаммов Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium kansasii, а также ряда штаммов Mycobacterium avium, включая штаммы, устойчивые к изониазиду, стрептомицину, w-аминосалициловой кислоте, этионамиду, канамицину [116]. Соединение 10 малотоксично при введении внутрь, хотя и обладает раздражающим действием, а при контакте с ним возможно развитие нежелательных аллергических реакций [115, 120].

Известные способы получения соединения 10 первоначально [121 - 123] в основном включали промежуточный синтез неприродной аминокислоты (S)-норвалина. При этом энантиомерно чистый (5)-норвалин выделяли из рацемата через его диастереомерные соли, например, кристаллизацией с L-винной кислотой [124, 125] или её производными. (5)-Норвалин после селективного восстановления трансформировали в диол 10 алкилированием дигалогенэтаном [118, 121, 122, 124]. В последние годы предложен и реализован ряд оригинальных, в том числе стереоселективных, химических методов получения соединения 10 путем многостадийного синтеза. Так, в работе [126] описан шестистадийный синтез диола 10 с использованием каталитического асимметрического аллилирования на одной из стадий, исключающим разделение энантиомеров. В работе [127] диол 10 получен в четыре стадии из энантиомерно чистого L-метионина. Этот способ включает предварительную защиту карбоксильной группы, обработку полученного интермедиата оксалилхлоридом и двухстадийное восстановление образующихся промежуточных продуктов.

Стереонаправленный синтез диола 10 в шесть стадий из малодоступного оптически чистого (Я)-бутан-1,2-диола описан в работе [128]. Ферментативные подходы к получению этамбутола ранее в литературе не рассматривались.

Для получения больших количеств этамбутола 10, используется только один общий способ, ключевым интермедиатом в котором выступает (5)-2-аминобутанол ((5)-11). Энантиомерно чистый (5)-11 получают расщеплением промежуточного рацемического аминоспирта (±)-11 на энантиомеры через их диастереомерные соли винной кислоты; выделенный тартрат превращают в свободное основание (5)-11 обработкой основаниями [125]. Возможные альтернативные химико-ферментативные подходы к получению диола 10 в научной литературе не описаны, неизвестно и использование нитросоединений для получения этамбутола. Поэтому мы предприняли поиск новых доступных путей получения диола 10. В результате была разработана химико-ферментативная схема получения диола 10, базирующейся на синтезе рацемического производного 2-аминобутан-1-ола ((±)-12) и его энантиоселективном ацилировании в присутствии липазы на ключевой стадии расщепления с выделением оптически активного спирта (+)-12, используемого после удаления защитной группы далее по известной схеме [118, 121].

Предложенный и реализованный в работе химико-ферментативный подход к получению диола 10 основан на синтезе рацемического (±)-Ж-Я-2-аминобутан-1-ола с защищенной аминогруппой (Я=СЬ7 или Вое) и его энантиоселективном ацилировании в присутствии липазы на ключевой стадии

расщепления с выделением оптически активного спирта (схема 38). Вначале нитробутан-1-ол, полученный моноконденсацией формальдегида с 1-нитропропаном восстанавливали до амина (±)-11, который превращали в N-Cbz или N-Boc-производные (±)-12а или (±)-12b. Для расщепления рацемических соединений (±)-12а, b в качестве ацилирующего агента использовали этилацетат в присутствии липазы, что дало оптически активные спирты (+)-11 и ацетаты его энантиомера (-)-13а, b. Этилацетат является удобным ацилирующим агентом для ферментативного расщепления рацематов соединений, содержащих фрагмент первичного спирта, обладающих низкой нуклеофильностью и поэтому не реагирующих с ним с образованием соответствующих ацетатов в отсутствие фермента [129]. Для повышения энантиоселективности ацилирования, катализируемого PPL-липазой, были испытаны различные растворители. Лучшие результаты были получены в хлороформе. Следует отметить, что использование липаз Candida cylindracea и Candida rugosa не дало положительного результата.

и

т

NH2

(±)-11

АсО

NHR.,

(±)-12 a,b Ri = Cbz (a), Boc (b)

(R> Et

NH R., (S)-12 a,b

NH Rj

(R)-13 a,b

/SbEt v

Et

NH R-, (S)-12 a,b

NH2

(S)-11

(ЗД-10

Условия реакции и реагенты: (i) Pd/C, H2, MeOH; (ii) a) Cbz-Cl, NaOH; Ъ) Boc2°,NaOH;

(iii) lipase PPL, EtOAc; (iv) a) Pd/C, c-C6H10 , b) H+; (v) (CH2C1)2, NaOH.

Схема 38. - предложенный подход к синтезу (З^-этамбутола

Чистые стереомеры (+)-12а с ее 98 % и ацетат (-)-13а (значение ее составляет 91 %) выделяли из реакционных смесей колоночной хроматографией и согласно литературным данным они являются (5)- и (Я)-энантиомерами, соответственно. Для определения энантиомерной чистоты использовали метод энантиомерной ВЭЖХ на хиральных колонках. В качестве эталона использовали рацемические (±)-12 а и его ацетат (±)-13 а, полученный ацилированием уксусным ангидридом спирта (±)-12 а в присутствии ЭМЛР (1 %). Аналогично проводили получение и разделение энантиомеров Вос-производного (±)-12Ь, однако для достижения 90% выхода (5)-Ы-Вос-12Ь потребовалось более

длительное перемешивание в течении 24 часов. Далее удаление защитной

группы в соединениях (5)-12 a,b с высоким выходом привело к продукту (5)-11. Энантиомер (К)-2-аминобутан-1-ол легко подвергается рацемизации при использованием никеля Ренея в качестве катализатора и он был использован повторно. Полученный аминоспирт (5)-12 в дальнейшем трансформировали в целевой диол (5,5)-10 алкилированием дихлорэтаном по известному методу [118, 121, 122, 124].

Благодаря высокой эффективности ферментативного расщепления, достигнутой в реакции PPL-катализируемого ацилирования производных рацемических спиртов (±)-12 а,Ъ в этилацетате и простоте, предлагаемый подход может рассматриваться, как возможная альтернатива известному получению оптически активных предшественников диола 10 через расщепление диастереомерных солей кристаллизацией [124, 125].

3.3. Энантиоселективный синтез (5)-5-фтор-ДОФА химико-

ферментативным путем

Гидроксиаминосоединения [130 - 131], а также многие небелковые аминокислоты [110] имеют большое практическое значение из-за их разнообразной физиологической активности. С другой стороны, введение фтора в биоактивные молекулы для улучшения их физико-химических и фармакологических свойств представляет собой перспективное направление в дизайне новых лекарственных средств [ 115, 132 - 136]. Так, монофторированные производные 3,4-дигидроксифенилаланина (ДОФА) представляют особую ценность для исследования распределения

лекарственного вещества в организме и оценки состояния пациента (для диагностического скрининга болезни Паркинсона с использованием позитронно-эмиссионной томографии) и для получения аналогов физиологически активных пептидов, содержащих необычные аминокислоты [110, 115, 132]. В настоящее время 6-[18F]-(S)-ДОФА является хорошо зарекомендовавшим себя нейротрейсером с широким спектром применения [110, 115, 132, 137, 138].

Способы получения монофторированных производных ДОФА, как и (S)-5-фтор-ДОФА (CAS No. 76936-91-9), в основном, базируются на получении соответствующего фторпроизводного тирозина и его последующего окисления до целевого продукта [110]. При этом рассматривалось получение (5)-3-фтор-тирозина и из 2-фторфенола с использованием тирозинфенол-лиазы [139]. Однако было обнаружено [140, 141], что наличие фтора в положении 3 ароматического фрагмента тирозина резко замедляет его окисление до (S)-5-фтор-ДОФА 14. Более того, фторфенолы окисляются с выделением фторид-иона, что приводит к побочной циклизации в 5,6-дигидрокси-2-карбоксииндол.

Дальнейшие работы были сосредоточены на получении (5)-6-фтор- ДОФА, поскольку окисление 2-фтортирозина протекало легче. 6-Фторированные производные (5)-ДОФА получены также и прямым фторированием аминокислоты [142], однако, этот подход оказался неприемлемым для получения (5)-5-фтор-ДОФА. Aсимметрический синтез (5)-5-фтор-ДОФА [143] стереоселективным алкилированием хирального глицинового синтона в

условиях межфазового переноса включает много стадий, что приводит лишь к небольшому общему выходу целевого продукта. Таким образом, известные способы получения производного (5)-5-фтор-ДОФА весьма ограничены.

Индивидуальные оптические изомеры выделяли, расщепляя рацемический 5-фтор-ДОФА, который затем переводили в [ 18Р]5-фтор-(5)-ДОФА [144 - 146]. Однако трудоемкая стадия расщепления рацемата 5-фтор-ДОФА, приводит к выходу нужного оптического изомера (5)-5-фтор-ДОФА не более 28 %.

В тоже время, как мы отмечали в литературном обзоре, (раздел 2.4) биокаталитические подходы [147 - 149], расщепление рацематов на энантиомеры [55, 150], и комбинированные химико-ферментативные методы [47, 151] в настоящее время широко используются для получения отдельных стереомеров различных гидроксиаминосоединений. Применение этих экологически чистых подходов к производству аминокислот и их производных [150, 152], в частности, к фторпроизводным (5)^ [110, 133], (5)-ДОФА [153 - 155], (5)-6-фтор-ДОФА [156] хорошо известно, однако, для получения (5)-5-фтор-ДОФА эти методы ранее не использовались. Нашей целью была разработка химико-ферментативного метода получения (5)-5-фтор-ДОФА в мягких условиях, которая могла бы исключить использование токсичных исходных и побочных продуктов характерных для химического пути получения окислением (5)-5-фтор-3-фтор-тирозина.

Общая схема осуществленных нами превращений, проведенных с целью получения энантиомерно чистого (5)-5-фтор-ДОФА 14 на основе доступного 2-фторфенола 15, представлена на схеме 39. На первом ферментативном этапе 2-фторфенол 15 в присутствии пировиноградной кислоты и аммиака превращался с выходом 96 % в энантиомерно чистый (S)-3- фтор-тирозин 16 по аналогии с данными [148] с использованием живой клеточной культуры Citrobacter freundii. Клетки бактерий Citrobacter freundii, содержащие фермент тирозинфеноллиазу, использовали сразу после культивирования на питательной среде. Выделенный (5)-3-фтор-тирозин 16 далее нитровали обычным способом с использованием концентрированной азотной кислоты с получением (5)-3-фтор-5-нитро-тирозина 17 с выходом 91 %, который восстанавливали оловом в соляной кислоте, после удаления олова в виде сульфида получал (5)-3-амино-5-фтор^-тирозин 18 с выходом 88 %. Последний этап состоял в диазотировании амина 18 в среде инертного газа с последующим гидролизом без предварительного выделения диазосоединения в инертной атмосфере в мягких условиях процесса с образованием целевого (5)-5-фтор-3,4-диоксифенилаланина 14 с выходом 68 % и полной стереоселективностью. Общий выход по всем стадиям составил 53 %. ДОФА и его производные легко окисляются под действием кислорода воздуха в ДОФА-хиноны [140, 141]. Использование на последней стадии (5)-3-амино-5-фтор-3-тирозина 18 в инертной атмосфере избежать побочной реакции образования хинона без применения ингибиторов или добавок восстановителей.

Схема 39. Реагенты и условия: i, NH3, Me(CO)CO2H, lipase РPL; ii, HNO3; iii, Sn, HCl; iv, Ba(NO2)2, CuSO4.

Результаты исследования ЯМР 1Н и 19F показали отсутствие примеси окисленных соединений. Для получения азотистой кислоты использовали динитрит бария, который в растворе с сульфат-анионом образовывал нерастворимый осадок сульфата бария, что существенно упрощало выделение продукта 14. Для полного осаждения ионов меди в виде CuS через раствор пропускали газообразный H2S, при этом возможное окисление продукта также не наблюдалось, поскольку данные 13С ЯМР указывают на отсутствие в растворе продукта окисления: 5 -фтор-ДОФА-хинона. Азотистую кислоту брали строго в эквимолярном соотношении к аминотирозину 18 для того, чтобы диазотирование проходило селективно по ароматической аминогруппе.

Характерными особенностями осуществленных превращений являются мягкие условия проведения реакций в инертных условиях, высокая

стереоселективность процесса и выходы целевого продукта, устранение окисления промежуточного продукта, приводящего к побочным циклическим соединениям, упрощение выделения чистых продуктов.

3.4. Получение отдельных стереомеров 1-(6-бром-2-хлорхино-3-лил)-4-

диметиламино-2-(нафтален-1-ил)-1-фенилбутан-2-ола и его солей

Напряженная эпидемическая ситуация по туберкулезу и возросшая устойчивость возбудителя к лекарственным препаратам [157] диктуют необходимость поиска и разработки новых эффективных средств борьбы с этим заболеванием [158], тем более что новые лекарства появляются в широком применении довольно редко [159]. Для борьбы с туберкулезом используется ряд лекарственных препаратов [115], среди которых этамбутол, синтез которого рассмотрен нами в разделе 3.2. Известен и ряд новых противотуберкулезных препаратов и их производных [160 - 164], среди которых выделяются обладающие высокой антибактериальной активностью функциональные производные аминоспиртов, содержащие различные ароматические фрагменты - бензольные, хинолиновые и нафталеновые [165 - 168]. Эти соединения получены и были исследованы, как правило, в виде смеси диастереомеров. Среди них на фирме Pharmaceutica Janssen [169 - 170] был обнаружен эффективный стереоизомер [(1^, 2S)-1 -(6-Бром-2-метокси-3-хинолил)-4-диметиламино-2-(1 -нафтил)-1-фенил-бутан-2-ол], получивший название «бедаквилин» (Bedaquiline, также Sirturo, TMC207 или R207910) 19 [168] обладающий высокой

противотуберкулезной активностью (Рисунок 7). Бедаквилин 19 in vitro активен в отношении разнообразных, в том числе с множественной и широкой лекарственной устойчивостью, штаммов Mycobacterium tuberculosis [162, 171 -

173]. Бактерицидное действие препарата 19 обусловлено специфическим ингибированием АТФ-синтазы микобактерий (аденозин 5' трифосфат-синтазы) - фермента играющего основную роль в процессе клеточного дыхания [165, 173,

174]. При этом у него большое число побочных эффектов [162, 174] и лекарственное средство бедаквилина фумарат, как и сам 19, практически нерастворим в водных средах. Поэтому получен ряд производных бедаквилина с сохранением основной структуры, которые также показали высокую противотуберкулезную активность, в том числе и 1-(6-бром-2-хлорхино-3-лил)-4-диметиламино-2-(нафтален-1-ил)-1-фенилбутан-2-ол 20 (Рисунок 7) [175].

19 20

Рисунок 7. Соединения 19 и 20

Однако характеристика структуры всех его 4-х стереомеров 20, как и наличие его чистых растворимых форм для изучения физиологической активности отсутствовали [167, 175]. Поэтому, необходимо было иметь

доступный способ получения отдельных четырех стереомеров растворимых форм данного вещества, причем желательно в удобной растворимой в водных средах форме. Это позволило бы планировать и получение новых, обладающих потенциальной физиологической активностью, функциональных производных. Для решения этой задачи было решено использовать расщепление двух диастереомеров, предварительно выделенных в чистом виде, с использованием ферментативного подхода с применением липаз.

Исходную смесь диастереомеров 1-(6-бром-2-хлорхино-3-лил)-4-диметиламино-2-(нафтален-1-ил)-1-фенилбутан-2-ола 20а,б для расщепления с соотношением ~ 1 : 1 выделяли известным путем (Схема 40), по аналогии с методом получения бедаквилина [167, 175]. Для этого проводили реакцию 3-диметиламино-1-пропионафтона [176] и 2-хлор-6-бром-3-бензилхинолина [177] под действием диизопропиламида лития в диэтиловом эфире при - 20о С. Отдельные диастереомеры 20а и 20б были выделены в индивидуальном виде за счет их различной растворимости в четыреххлористом углероде и хлороформе с выходами 42 % и 43 %, соответственно (Схема 41). Для этого потребовалась двойная перекристаллизация исходной смеси. Строение диастереомеров подтверждено физико-химическими методами (ИК- и ЯМР-спектроскопия ^{^С}, ^^Щ-спектры], РСА (Рисунки 8 и 9).

Ме

0>

N

чМе

ьбл/тгф -20ос

20 а,б

Схема 40. Получение смеси диастереомеров 20а,б

+

Рисунок 8. Диастереомер 20а. (д.х.н. В.Н. Хрусталев, РУДН)

20а Выход 42 %.

// %

20б Выход 43 %.

т.пл. 1B3-1B5 оС (из СНС13 / петр.эфир.)

(SS)

+

RR)

(SR)

+

(RS)

т.пл. 192-194 С (из ацетонитрил / бензол) Me

Me

Схема 41. Кристаллизация диастереомеров 20а и 20б

Рисунок 9. Диастереомер 20б. (д.х.н. В.Н. Хрусталев, РУДН)

Для расщепления индивидуальных диастереомерных рацематов 20а и 20б проводили их ферментативное ацилирование под действием липаз. Были исследованы винилацетат (VinOAc) и этилацетат (EtOAc) в качестве ацилирующего агента и липазы (PPL и CCL) в среде органических растворителей. Использование доступной PPL липазы и винилацетата дало наилучшие результаты, как по выходу целевых продуктов, так и по энантиоселективности процесса ацилирования для 20а диастереомера, приводящего к образованию оптически активных спирта (+)-20а и ацетата (—)-20a-OAc (схема 42, таблица 3). В этом случае при проведении ацилирования в хлороформе при комнатной температуре для достижения конверсии в 48 % (т.е. для практически полного перевода одного из энантиомеров в ацилированный продукт) потребовалось 48 часов. Реакционная способность диастереомеров существенно отличается друг от друга. Для достижения такой же конверсии при использовании другого диастереомера 20б потребовалось в аналогичных условиях существенно большее время - 72 часа. Разделение продуктов проводили методом колоночной хроматографии.

(±)-20 a

(+)-20 a

(-)-20a-0Ac

Схема 42. Расщепление диастереомера 20а стереоселективным ацилированием под действием липазы.

Таблица 3. Энантиоселективное ацилирование диастереомера 20а винилацетатом, катализируемое PPL-липазой.

Время (ч) 20°С йг непроагировавшего (+)-(^5)-спирта * йг полученного (-)-(ЛЯ)-ацетата * Конверсия, %

12 23 > 98 26

24 62 98 38