МЕТОДЫ И ТЕХНИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Гулин Алексей Сергеевич

• Гулин Алексей Сергеевич
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Гулин Алексей Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 АНАЛИЗ СОВРЕМЕННОГО СОСТОЯНИЯ ТЕОРИИ И ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

1.1 Цели и задачи культивирования микроводорослей

1.1.1 Биотопливо

1.1.2 Биохимическое применение водорослей

1.1.3 Косметика

1.1.4 Фармацевтика

1.1.5 Производство бумаги

1.1.6 Продукты питания

1.1.7 Корма для аквакультуры

1.1.8 Пигменты

1.1.9 Очистка воды

1.2 Способы культивирования микроводорослей

1.3 Системы культивирования микроводорослей

1.3.1 Использование природных водоёмов

1.3.2 Открытые пруды

1.3.3 Закрытые системы

1.3.4 Резервуары с перемешиванием

1.3.5 Плоские фотобиореакторы

1.3.6 Вертикальные трубчатые фотобиореакторы

1.3.7 Системы с барботажной колонкой

1.3.8 Эрлифтные фотобиореакторы

1.3.9 Горизонтальные трубчатые фотобиореакторы

1.3.10 Плавающие фотобиореакторы

1.4 Методы определения оптических характеристик микроводорослей

1.4.1 Определение биомассы химическим методом

1.4.2 Определение биомассы методом диэлектрической спектроскопии

1.4.3 Определение биомассы спектрофотометрическим методом

1.4.4 Определение концентрации пигмента хлорофилла а

1.5 Современные конструкции систем для культивирования и измерения

основных параметров роста микроводорослей

Выводы к ГЛАВЕ

ГЛАВА 2 РАЗРАБОТКА МЕТОДА ДЕКОМПОЗИЦИИ КРАСНОЙ ОБЛАСТИ СПЕКТРА ПОГЛОЩЕНИЯ И МОДЕЛИ ФОТОМЕТРИЧЕСКОЙ ЯЧЕЙКИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ПИГМЕНТА ХЛОРОФИЛЛА А

2.1 Общие сведения

2.2 Декомпозиция красной области спектра поглощения

2.3 Моделирование конструкции микроводорослевой фотометрической ячейки

2.4 Обоснование выбора светодиода для фотометрической ячейки и

моделирование спектров

Выводы к ГЛАВЕ

ГЛАВА 3 РАЗРАБОТКА МЕТОДОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОПТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК КУЛЬТУР С ПОМОЩЬЮ ВНЕШНИХ ДАТЧИКОВ ОБЛУЧЁННОСТИ

3.1 Общие сведения

3.2 Модель расчета хлорофилла а по оптическим характеристикам плотных культур микроводорослей

3.3 Выводы к ГЛАВЕ

ГЛАВА 4 ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ И КОМПЛЕКСНАЯ АПРОБАЦИЯ АППАРАТНО-ПРОГРАММНОГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ

4.1 Общие сведения

4.3 Устройство системы

4.3.1 Фотобиореактор

4.3.2 Система освещения

4.3.3 Система газообеспечения

4.3.4 Система термостабилизации

4.3.5 Система обеспечения непрерывного культивирования

4.3.6 Контрольно-измерительная система

4.3.7 Система подачи питательной среды

4.3.8 Система питания

4.4 Практическая реализация аппаратно-программного комплекса

4.4.1 Система контроля биомассы

4.4.2 Система регистрации облучённости

4.4.3 Система измерения температуры

4.4.4 Программа управления аппаратно-программным комплексом

4.5 Разработка исследовательского фотобиореактора гибридной конструкции

4.6 Комплексная апробация аппаратно-программного комплекса и исследовательского фотобиореактора

4.6.1 Объекты исследования

4.6.2 Методы и условия выращивания Arthrospira platensis

4.6.3 Методы и условия выращивания Platimonas viridis и Dunaliella salina

4.6.4 Измерение оптической плотности культуры

4.6.5 Определение pH суспензии микроводорослей

4.6.6 Постановка и организация эксперимента в лабораторных условиях

4.6.7 Постановка и организация эксперимента в естественных условиях

4.6.8 Апробация экспедиционного фотобиореактора

4.6.9 Проведение таксономической идентификации

4.7 Выводы к ГЛАВЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «МЕТОДЫ И ТЕХНИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА ИССЛЕДОВАНИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. На сегодняшний день исследование микроводорослей представляет собой сложную задачу, требующую применения современных методов, аппаратных средств и технологий мониторинга и контроля параметров роста культуры. Используемые в альгологии методы сбора данных о состоянии популяций микроводорослей часто связаны с большими затратами времени и ресурсов, а также подвержены влиянию человеческого фактора.

В этой связи разработка новых методов и аппаратно-программных комплексов для контроля параметров роста микроводорослей приобретает особую актуальность. Такие системы позволяют значительно повысить точность и оперативность регистрации и обработки данных, минимизировать влияние субъективных факторов и обеспечить многопараметрический мониторинг параметров роста культуры в режиме реального времени, необходимый для контроля и управления процессами роста, что способствует снижению трудоёмкости и повышению эффективность производства.

Разработкой методов, приборов и систем для исследования и культивирования микроводорослей занимались такие учёные как: Тренкеншу Р. П., Белянин В. Н., Лисовский Г. М., Погосян С. И., Антал Т. К., Габриэлян Д. А. и др. Крайне актуальным является развитие подобных исследований, в том числе направленных на разработку новых методов, аппаратных средств, технологий контроля и алгоритмов сбора и обработки результатов, позволяющих в перспективе получать знания о процессах роста и накопления биохимических компонентов клетками микроводорослей.

Разработанные в настоящее время комплексы для исследования микроводорослей имеют высокую стоимость, не являются мобильными и не позволяют производить исследования непосредственно на водоеме в экспедиционных условиях. Используемые методы определения биомассы - одного из важнейших параметров роста микроводорослей имеют ряд недостатков. В тоже

время, современные технологии позволяют создавать весьма эффективные и недорогие аппаратно-программные комплексы, внедрение которых способствует повышению эффективности культивирования и снижению трудоёмкости.

Таким образом, разработка новых методов определения оптических характеристик культур микроводорослей и создание мобильного аппаратно-программного комплекса для исследования микроводорослей в естественных условиях, позволяющего производить контроль параметров роста культуры в режиме реального времени в естественных условиях, а так же разработка новых методов определения оптических характеристик культур микроводорослей является актуальной задачей, решение которой будет способствовать развитию фундаментальных и прикладных наук, а также внедрению инновационных технологий в практику обеспечения экологической безопасности окружающей среды.

Степень разработанности темы исследования. Тема разработки методов и приборов для исследования микроводорослей в естественных условиях находится на стыке нескольких дисциплин, включая микробиологию, биоинженерию, экологический мониторинг и информационные технологии. Несмотря на то, что отдельные аспекты данной проблемы уже были предметом внимания ученых, комплексный подход к созданию мобильных аппаратно-программных комплексов остается недостаточно изученным.

На сегодняшний день существует ряд исследований, посвященных разработке методов и средств для мониторинга биологических объектов в естественной среде. Так, например, работы Глуховца Д. И., который разработал методику автоматического определения концентрации хлорофилла в водной среде, и Габриэляна Д. А., где предложена концепция лабораторной системы для культивирования микроводорослей и цианобактерий. Тем не менее, ни одна из этих разработок не была интегрирована в единую систему, способную осуществлять полный цикл исследования микроводорослей в естественных условиях.

Данная диссертация направлена на восполнение этого пробела и разработку комплексной системы, позволяющей эффективно решать задачи мониторинга

основных параметров роста микроводорослей в различных природных средах.

Объект исследования - процесс контроля оптических характеристик культур микроводорослей в искусственных фотобиореакторах и в естественных водоёмах.

Предмет исследования - методы, модели и технические средства контроля оптических характеристик культур микроводорослей. Их алгоритмы оценки.

Цель работы - совершенствование процессов контроля основных параметров роста микроводорослей за счёт разработки методов определения концентрации пигментов в культуре, и создания мобильных аппаратно-программных комплексов.

Для достижения поставленной цели решены следующие задачи:

1. Анализ существующих методов культивирования и технических средств для исследования микроводорослей;

2. Разработка метода декомпозиции красной области спектра поглощения и математической модели фотометрической ячейки;

3. Разработка метода контроля оптических характеристик культур микроводорослей с помощью внешних датчиков облучённости;

4. Разработка конструкции мобильного аппаратно-программного комплекса, позволяющего проводить исследования микроводорослей в автоматическом режиме, а так же исследовательского фотобиореактора гибридный конструкции для исследования микроводорослей в естественных условиях;

5. Апробация мобильного аппаратно-программного комплекса для исследования микроводорослей в естественных условиях и оценка достоверности полученных результатов о росте микроводорослей.

Научная новизна. В результате проведенных в работе исследований был получен ряд новых научных результатов:

1. Представлен новый метод декомпозиции красной области спектра поглощения, позволяющий восстанавливать спектр поглощения культуры, измерив значение оптической плотности на трёх длинах волн с помощью фотометрических датчиков. Данный метод отличается от существующих тем, что позволяет

описывать спектр культуры, а не ацетонового экстракта, не требует предварительной пробоподготовки в лабораторных условиях, и исключает ошибки, связанные с ручным отбором проб и их разбавлением.

2. Разработанная на основе анализа спектров поглощения культур микроводорослей и оптических характеристик излучающих светодиодов, математическая модель фотометрической ячейки, отличается возможностью определения концентрации пигмента хлорофилла а в культуре, а так же позволяет обосновать характеристики оптических элементов конструкции.

3. Предложен метод и модель оценки оптических характеристик культуры микроводорослей с помощью внешних датчиков облучённости, позволяющий оценить продукцию микроводорослей в искусственных фотобиореакторах и в естественных водоёмах. Метод отличается отсутствием необходимости погружения датчиков в культуру, либо созданием отдельных приспособлений для прокачки культуры через датчики, тем самым позволяет исключить обрастание и решить проблему точности измерения.

Теоретическая значимость работы заключается в разработке новых подходов к созданию аппаратно-программных комплексов, способных проводить комплексный анализ биологических объектов в их естественной среде обитания, в природных условиях.

Автоматизация процесса сбора данных позволяет получить информацию о влиянии микроводорослей на другие организмы и процессы в водной среде, что является важным шагом в понимании структуры и функций водных экосистем.

Разработка методов анализа данных, полученных с помощью аппаратно-программного комплекса, позволит создавать модели, предсказывающие изменения в составе и структуре сообществ микроводорослей под воздействием различных факторов. Это имеет важное значение для экомониторинга и контроля экологической безопасности окружающей среды.

Практическая значимость работы заключается в создании мобильного аппаратно-программного комплекса для исследований микроводорослей в различных природных условиях, использующего современные методы

мониторинга и анализа основных параметров роста микроводорослей; в возможности использования разработанного комплекса для постоянного многопараметрического мониторинга состояния популяций микроводорослей, что важно для возможность оперативного реагирования на изменения в экосистеме; в автоматизации процесса сбора данных, что способствует минимизации человеческого фактора, как результат повышает объективность результатов и уменьшает вероятность ошибок при проведении экспериментов.

Экспериментальные исследования с помощью исследовательского фотобиореактора гибридной конструкции, предназначенного для выращивания микроводорослей в открытом водоёме, позволили определить сколько видов диатомовых водорослей способно проникнуть через ячейки сетки и заселить внутреннюю поверхность культиватора. Поскольку оценка полученной в ходе культивирования биомассы отражает экологическую ситуацию в водоеме, т.е. наличие питательных веществ и отсутствие токсического воздействия возможных загрязнителей антропогенного происхождения, то устройство может быть предложено в качестве индикаторной системы при проведении комплексного экомониторинга.

Результаты внедрения. Полученные модели и алгоритмы используются при организации научно-исследовательской и образовательной деятельности следующими организациями:

- в Отделе биотехнологии и фиторесурсов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федерального исследовательского центра «Институт биологии южных морей имени А.О. Ковалевского РАН» (ФИЦ «ИнБЮМ») для проведения научно-исследовательских работ;

- в ПТБ «Гранит», г. Севастополь, технические средства на базе платформы ЛМшпо, разработанные в ходе диссертационного исследования, используются в качестве лабораторной установки для ведения кружков детского технического творчества в юнармейском отряде «Гранит»;

- в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Институт природно-технических систем» (ФГБУН «ИПТС») методы и модели для

определения оптических характеристик морской среды используются при организации научно-исследовательской работы.

Методология и методы диссертационного исследования. В диссертационной работе использованы методы вычислительной математики, математической статистики, аппроксимации, спектрального анализа. Для расчета и моделирования процессов были использованы методы программирования и моделирования в среде Matlab. Использовалось современное измерительное лабораторное оборудование.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Метод декомпозиции красной области спектра поглощения и математическая модель фотометрической ячейки, позволяющие восстанавливать спектр поглощения культуры микроводорослей и определять концентрацию пигмента хлорофилла а.

2. Метод контроля оптических характеристик культур микроводорослей с использованием двух датчиков облучённости, позволяющий проводить исследования не только планктонных, но и бентосных микроводорослей в различных условиях в режиме реального времени.

3. Модель расчета хлорофилла а по оптическим характеристикам плотных культур микроводорослей, с использованием внешних датчиков облучённости, позволяющая определять концентрацию пигмента и профиль интенсивности света, действующего на клетки в зависимости от глубины слоя.

4. Мобильный аппаратно-программный комплекс для исследования микроводорослей в различных природных условиях.

Соответствие содержания диссертации паспорту научной специальности.

Диссертационное исследование соответствует паспорту специальности 2.2.8. Методы и приборы контроля и диагностики материалов, изделий, веществ и природной среды: п. 1. Научное обоснование новых и совершенствование существующих методов, аппаратных средств и технологий контроля, диагностики материалов, изделий, веществ и природной среды, способствующее повышению

надежности изделий и экологической безопасности окружающей среды; п. 2. Разработка методологий прогнозирования работоспособности и остаточного ресурса изделий, направляющих оптимизацию методов, приборов, систем контроля и диагностирования изделий, повышение надежности изделий и экологической безопасности окружающей среды; п. 3. Разработка, внедрение, испытания методов и приборов контроля, диагностики материалов, изделий, веществ и природной среды, способствующих повышению надежности изделий и экологической безопасности окружающей среды; п. 4. Разработка методического, математического, программного, технического, приборного обеспечения для систем технического контроля и диагностирования материалов, изделий, веществ и природной среды, экологического мониторинга природных и техногенных объектов, способствующих увеличению эксплуатационного ресурса изделий и повышению экологической безопасности окружающей среды. п. 6. Разработка математических моделей, алгоритмического и программно-технического обеспечения обработки результатов регистрации сигналов в приборах и средствах контроля и диагностики с целью автоматизации контроля и диагностики, подготовки их для внедрения в цифровые информационные технологии; п. 7. Автоматизация технологий, приборов контроля и средств диагностирования, способствующая снижению трудоемкости, увеличению оперативности и достоверности оценки эксплуатационного ресурса изделий, повышению уровня экологической безопасности окружающей среды.

Степень достоверности результатов. В работе использованы современные высокотехнологичные методы анализа и обработки экспериментальных данных, достоверность которых обеспечена многократностью повторения измерений и характеризуется воспроизводимостью и сопоставимостью. Все полученные результаты представлены в виде рисунков и таблиц.

Личный вклад соискателя. Материалы диссертации являются обобщением работ, выполненных автором в период с 2019 по 2025 год, и отражают его личный вклад в настоящее исследование. Основные научные результаты получены автором самостоятельно. Постановка цели исследования и решаемых задач, обсуждение

полученных результатов и подготовка материалов к печати выполнена совместно с научным руководителем.

Подготовка некоторых результатов исследования к публикациям в научных изданиях проводилась в ходе обсуждения с соавторами. Диссертационная работа написана лично соискателем.

Апробация работы. Диссертационное исследование выполнено в рамках тем НИР: № 124021300070-2 «Комплексное исследование экологических и физиолого-биохимических особенностей микроводорослей различных таксономических групп при адаптации к меняющимся условиям среды» и № 124030100137-6 «Функциональные, метаболические и молекулярно-генетические механизмы адаптации морских организмов к условиям экстремальных экотопов Черного и Азовского морей и других акваторий Мирового океана».

Работа выполнялась в лабораториях отдела биотехнологии и фиторесурсов ФИЦ ИнБЮМ имени А.О. Ковалевского РАН и НОЦКП «Спектрометрия и хроматография».

Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались на международных научных конференциях: «Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2020» (г. Севастополь, 14-16 сентября г. Севастополь, 2020 г.); «Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ-2021» (г. Севастополь, 13-17 сентября г. Севастополь, 2021 г.).

По результатам исследований получен патент на полезную модель: RU № 217112, МПК А0Ш 33/00: «Устройство для культивирования микроводорослей в естественных условиях».

Автору научной работы объявлены благодарности: губернатора г. Севастополя; департамента природных ресурсов и экологии г. Севастополя; департамента по работе с молодежью г. Севастополя; директора департамента образования и науки г. Севастополя.

Публикации. Опубликовано 11 научных работ, из них 7 статей в журналах из перечня ВАК, а также получен патент на полезную модель.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 152 страницах, состоит из введения, 4 глав, заключения, списка литературы, включающего 141 источник, из них 76 иностранных. Работа содержит 13 таблиц и 64 рисунка.

Благодарности. Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю, к.б.н. Р. П. Тренкеншу. Автор глубоко благодарен в.н.с., д.б.н. А. С. Лелекову, в.н.с., к.б.н. А. Б. Боровкову и г.н.с. акад. РАН. д.б.н. проф. Егорову В.Н. за наставление и внимательное отношение.

Автор признателен сотрудникам отдела биотехнологии и фиторесурсов ФИЦ ИнБЮМ за систематическое обсуждение полученных результатов на семинарах.

ГЛАВА 1 АНАЛИЗ СОВРЕМЕННОГО СОСТОЯНИЯ ТЕОРИИ И ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ

В данной главе рассмотрена актуальность культивирования микроводорослей на сегодняшний день. В результате проведенного анализа, были определенны основные направления использования сырья, полученного при культивировании. Представлены основные методы культивирования, а также наиболее востребованные системы культивирования. Проведено сравнение различных автоматизированных комплексов для культивирования и определения основных параметров роста микроводорослей, показаны их основные преимущества и недостатки.

1.1 Цели и задачи культивирования микроводорослей

Микроводоросли являются одним из важнейших объектов биотехнологии, благодаря особенностям метаболизма, связанными с выработкой веществ с ценными для человека свойствами [1, 2].

Первые попытки культивирования микроводорослей в промышленных масштабах производились в Германии в 40-х годах. С целью получения пищевых масел использовались диатомовые водоросли.

На протяжении последующих 50 лет, наиболее популярными объектами исследований были зеленые микроводоросли из родов Chlorella и Scenedesmus [3]. Но в связи с низкой продуктивностью культивирования, интерес к этой проблеме значительно снизился. В начале 70-х годов возобновились активные исследования в области промышленного культивирования [2]. В настоящее время доказано, что благодаря комплексу физиолого-биохимических особенностей, микроводоросли являются перспективным объектом исследования в промышленных биотехнологиях [4].

Но не смотря на большое количество исследований и разработок в области культивирования микроводорослей, значительное количество известных видов, по-прежнему являются малоизученными [2, 3].

Развитие экономических аспектов биотехнологии микроводорослей включает в себя ряд направлений: производство продуктов питания, косметики и лекарственных средств для использования в медицинских целях; производство биотоплива; разработка технологий по защите окружающей среды [5].

Микроводоросли - это фотосинтезирующие организмы, которые используются для производства биомассы в коммерческих целях. Для того чтобы обеспечить им максимальную продуктивность, их необходимо культивировать, при этом создавая оптимальные условия для максимального роста. Микроводоросли используют С02 в качестве неорганического источника углерода для синтеза органических соединений и выделяют 02 в качестве побочного продукта фотосинтеза в присутствии солнечного света, как описано в уравнении:

СО +И2° ^ [СН20] +02. (111)

Исходя из требований по стехиометрии, для получения одного килограмма сухой биомассы микроводорослей необходимо 1,83 кг С02 [6].

Чем выше эффективность преобразования света в биомассу под солнечным светом, тем выше будет выход биомассы [7]. Занимающая 1% от общего количества солнечного света, ФАР используется для фотосинтеза, в котором участвуют только фотоны длиной волны от 400 до 700 нм. Это приводит к потере около 55% падающего излучения [8].

В настоящее время определены основные направления использования биомассы микроводорослей, которая может быть получена либо путем культивирования в различных промышленных фотобиореакторах, либо путем выделения из природных водоёмов [4].

На рисунке 1.1.1 представлена область применения микроводорослей.

Рисунок 1.1.1 - Область применения микроводорослей

1.1.1 Биотопливо

Биотопливо представляет собой твердое, жидкое или газообразное топливо, производимое из возобновляемых источников, таких как растительная биомасса, с использованием современных биологических процессов [8].

Количество выбросов С02 растет со скоростью 1,2% в год, что приводит к таким последствиям, как глобальное потепление и повышение уровня моря, вследствие таяния полярных ледяных шапок [8, 9]. Эти выбросы также являются основной причиной ухудшения качества воздуха во всем мире. Так же опасение вызывает снижение количества запасов природных ископаемых и как следствие рост их стоимости. Следовательно, спрос на устойчивую, возобновляемую и углеродно-нейтральную энергию постоянно растет, что приводит развитию биотопливной промышленности.

Биотопливо классифицируется на первое, второе и третье поколения в зависимости от источников сырья и технологий его производства. Биотопливо первого поколения, представляет собой топливо, получаемое из сахаров и масел

растительного происхождения, извлекаемых из сельскохозяйственных культур. Биотопливо второго поколения получают из лигноцеллюлозной биомассы, включая сельскохозяйственные отходы, пищевые остатки и специально возделываемые энергетические, с использованием комплекса физических и химических методов обработки.

Тем не менее, производство биотоплива первого и второго поколения создает конфликт между производителями продовольствия и топлива, поскольку площади пахотных земель ограничены. Их использование для выращивания энергетических культур может привести к увеличению цен на продукты питания и их нехватке, особенно в странах с низким уровнем развития [8, 10].

Таким образом, большая часть биотопливной промышленности сместила свое внимание с сельскохозяйственного сырья на выращивание водорослей из-за быстрого роста, возможности очистки сточных вод, круглогодичного производства, а также отсутствия потребности в использовании плодородных почв.

Биотопливо третьего поколения является объектом обширных исследований с целью увеличения производства биомассы и выхода биотоплива, чтобы сделать его конкурентоспособным по стоимости топливом.

В настоящее время производству биомассы микроводорослей для биотоплива, характерна наиболее высокая стоимость. Производство различных побочных продуктов наряду с биотопливом позволяет повысить рентабельность [11].

Недостатками современной технологии являются нестабильность культуры, высокие экономические затраты на строительство и обслуживание установок для культивирования, а также потребность значительном количестве электроэнергии для переработки биомассы в готовую продукцию [12].

Вследствие указанных обстоятельств, производство биотоплива из микроводорослей еще далеко от коммерческой реализации. Основным фактором, способствующим устойчивому производству, является применение остаточных источников питательных веществ, а также использование сточных вод, таких как

вторичные стоки очистных сооружений, для культивации микроводорослей и одновременного производства продукции [8, 13].

Тем не менее, биотопливо из водорослей остается перспективным для синтеза зеленой энергии во всем мире благодаря его преимуществам. Благодаря технологическому прогрессу появляется множество новых подходов для улучшения управления культурой, разработки масштабируемых систем и интегрированного производства [14]. В настоящее время проводятся обширные исследования, направленные на то, чтобы обойти ценовой барьер и вывести биотопливо на рынок.

1.1.2 Биохимическое применение водорослей

Микроводоросли характеризуются широким применением в химической промышленности. Морская микроводоросль Porphyridium cruentum используется для производства резиноидов, применяемых в качестве ароматизаторов и красителей в бытовой химии, пищевых, косметических и парфюмерных продуктах. Некоторые штаммы Chlorella и Scenedesmus содержат более 20% резиноидов в сухой биомассе [2, 15].

Однако основная проблема производства резиноидов из микроводорослей заключается в высокой себестоимости по сравнению с синтетическими аналогами. Повысить рентабельность производства можно с помощью комплексной переработки биомассы. Продукты переработки Spirulina также находят применение в косметологии, в частности, при производстве красителей, эмульгаторов, кремов, гелеобразователей и моющих средств [2].

Микроводоросли могут использоваться в качестве промышленного сырья при получении альгиновых кислот, органических кислот, ацетона, нитроцеллюлозы, эфиров, агар-агара, каррагенина, сорбита, маннита, спиртов, меченых аминокислот, стеролов, инсектицидов, репеллентов, агароида [16].

1.1.3 Косметика

Микроводоросли широко используются в космецевтике благодаря своим увлажняющим, антиоксидантным, антивозрастным и противозагарным свойствам. В основном он используется в форме экстрактов, из которых изготавливаются

крема против морщин, солнцезащитные крема, различные загустители, сенсибилизаторы кожи, средства по уходу за волосами и увлажняющие средства

[17].

Наиболее востребованными в индустрии ухода за кожей являются штаммы Arthrospira и Chlorella. Они широко используются такими компаниями, как Carnac, LVMH, Daniel Jouvance, имеющими собственные предприятия по выращиванию микроводоро слей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гулин Алексей Сергеевич, 2025 год

источнику питания

Рисунок 4.4.1.1 - Конструкция фотометрического датчика. Составные части: 1 -внешний корпус, 2 - корпус датчика, 3 - фоторезистор, 4 - кювета, 5 - светодиод

В поперечное отверстие корпуса вставлена стеклянная кювета, обеспечивающая циркуляцию суспензии клеток водорослей через датчик. В продольное отверстие корпуса с противоположных сторон встроен светодиод и

фоторезистор ОЬ5539 таким образом, чтобы кювета находилась между ними. Для обеспечения непроницаемости датчика от внешнего светового излучения, внешний корпус датчика покрыт алюминиевой фольгой.

Для контроля нулевого значения напряжения в кювету заливали дистиллированную воду, при этом напряжение на фотоприёмнике составляла 3,17 В. В процессе эксплуатации датчика необходимо проверять данное значение и при снижении напряжения более чем на 5 % промывать кювету [98].

Поглощение света суспензией микроводорослей на разных длинах волн связано с различным пигментным составом клеток. Например, у А рШвтгя основной фотосинтетический пигмент хлорофилл а имеет два пика в синей и красной области спектра на 430 нм и 660 нм, каротиноиды - 440 нм, С-фикоцианин - 620 нм, реакционный центр П700 - 700 нм [102]. Поэтому для измерения поглощения биомассы в целом необходимо выбрать такую длину волны, на которой поглощение пигментов не является определяющим, например, дальнюю красную (730 - 750 нм) область спектра. В качестве светодиода выбран красный светодиод с максимумом излучения при 740 нм. Спектральная характеристика светодиода представлена на рисунке 4.4.1.2.

Для калибровки датчика использовали культуру А. рШвтгя, которую выращивали в течение 16 суток в накопительном режиме. На рисунке 4.4.1.3 представлена корреляционная зависимость биомассы от напряжения на фоторезисторе. Полученные результаты свидетельствуют о линейной зависимости между напряжением на фотоприёмнике Л и и биомассой микроводорослей [98].

Для используемой в датчике проточной стеклянной кюветы коэффициент пропорциональности составил:

В = 0,71-Ли, (4.1)

где В - биомасса А. рШгтгя, г СВ/л; Ли - разница между напряжением на фотоприёмнике, если в кювете залита дистиллированная вода и напряжением и, если в кювете находится культура [98].

80-

h 60

u о X to x

u X <u H X

5

40-

20-

-,-,-,-,-1

700 720 740 760

Длина волны, нм

780

Рисунок 4.4.1.2 - Спектральная характеристика светодиода 740 нм

Рисунок 4.4.1.3 - Корреляционная зависимость биомассы от напряжения на фоторезисторе. Линия представляет собой аппроксимацию экспериментальных

данных методом линейной регрессии

4.4.2 Система регистрации облучённости

Вторым важнейшим компонентом предлагаемого устройства является система регистрации облучённости. При создании приборов для измерения интенсивности света, как правило, применяют датчики на основе фоторезисторов, фотодиодов, вакуумных и газонаполненных фотоэлементов, их существует большое количество [98].

Поскольку одно из требований к конструкции разрабатываемой автоматизированной экспедиционной системы для исследования микроводорослей в естественных условиях - использование максимального количества составных узлов заводского изготовления, в качестве датчика облучённости предлагается использовать модуль облучённости ЬМ393 из набора Агёшпо. В качестве основного элемента в датчике используется фоторезистор GL5539.

Спектр фоторезистора датчика облучённости представлен на рисунке 4.4.2.1. Отметим, что спектральная характеристика фоторезистора соответствует диапазону ФАР (380 -700 нм) [98].

Л

а

Длина волны, нм

Рисунок 4.4.2.1 - Спектральная характеристика фоторезистора GL5539

Для защиты датчиков от влияния окружающей среды, были изготовлены стеклянные корпуса, в которые помещали платы датчиков, а затем герметизировали. На рисунке 4.4.2.2 представлен внешний вид датчика облучённости в герметичном стеклянном корпусе.

Предлагается использовать два датчика облучённости в герметичных корпусах. Один датчик размещается на корпусе фотобиореактора на уровне культуральной жидкости. Второй датчик размещается на дне фотобиореактора. Схема установки датчиков освещенности в фотобиореакторе представлена на рисунке 4.4.2.3.

Подключение датчиков облучённости к Arduino: GND датчиков подключаем к пину GND Arduino, Vdd датчиков подключаем к пину +5V Arduino, сигнальные выводы датчиков подключаем к пинам A0 и A1 платы Arduino Mega.

Рисунок 4.4.2.2 - Внешний вид датчика облучённости

=3 с

Рисунок 4.4.2.3 - Размещение датчиков облучённости в фотобиореакторе

Платформа Arduino mega позволяет реализовать как чтение и запись на карту памяти параметров с обоих датчиков одновременно, так и вычисление разности показаний с датчиков с последующей записью на карту памяти.

Таким образом предлагается на базе датчиков облучённости реализовать дополнительную систему для определения концентрации биомассы.

Для калибровки использовалась культура A. platensis. На рисунке 4.4.2.4 представлена корреляционная зависимость биомассы от разницы напряжений двух датчиков облучённости.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Биомасса, г СВ/л

Рисунок 4.4.2.4 - Корреляционная зависимость напряжения на датчиках облучённости от биомассы. Линия - аппроксимация экспериментальных данных

линейной регрессией

Произведем расчет коэффициента корреляции, согласно методике, приведенной в [130].

Находим значения средних:

У х

х =ух = 2,23; (4.2)

п

у =^ = 1,18, (4.3)

п

где п - количество точек на графике. Определим стандартные отклонения выборок:

— \2

= (4.4)

£(^ - у )2 _ /8,54

п

11

0,88.

(4.5)

Находим смешанный начальный момент первого порядка:

М

у) = 15,17 =

п

11

= 1,379.

(4.6)

Коэффициент корреляции:

Т =

М

1,379

££ 1,617 • 0,88

= 0,97.

(4.7)

Тогда коэффициент линейной регрессии:

£ 0 88 8у1х = Т-^ = 0,97—1— = 0,527.

(4.8)

£ 1,617

Полученные результаты свидетельствуют о линейной зависимости между напряжением АЦ и биомассой микроводорослей.

Для калибровки датчика облучённости с помощью люксметра установлена взаимосвязь внешней облучённости (Е) и выходного напряжения датчика облучённости (Ц). Калибровочная кривая представлена на рисунке 4.4.2.5.

Рисунок 4.4.2.5 - Калибровочная кривая выходного напряжения датчика от

облучённости

Выходное напряжение и облучённость связаны между собой нелинейно. В результате аппроксимации, показано высокое соответствие (R2 = 0,97) уравнения (4.9) с экспериментальными данными:

E = 3,42 • U2 - 30,97 • U + 80,42. (4.9)

4.4.3 Система измерения температуры

Третьим компонентом разрабатываемого устройства является датчик температуры. На сегодняшний день существует большое количество датчиков определения температуры в различных средах. Для наших задач подходят датчики для определения температуры жидких сред [98].

В устройстве использовался один из наиболее популярных цифровых датчиков температуры - DS18B20. У датчика есть 3 контакта: GND - земля, Vdd -питание, Data - сигнал, подключаемый к любому цифровому входу.

Погрешность измерения не больше 0,5 °С (для температур от -55 до +125 °С), что позволяет точно определить значение температуры [98].

4.4.4 Программа управления аппаратно-программным комплексом

Важным элементом, без которого невозможно функционирование и запуск цифровых процессов в устройстве - управляющая программа для контроллера Arduino.

Платы Arduino имеют постоянную Flash память, которая содержит информацию о коде прошивки, константах, и оперативную SRAM память.

Написание программы производится в интегрированной среде разработки Arduino IDE. Приложение доступно для Windows, Linux и macOS. В Arduino IDE можно писать код, оптимизировать работу платы, получать данные об эффективности кода, устанавливать сторонние библиотеки и разрабатывать свои.

После написания и отладки программы производится ее запись в память микроконтроллера через USB порт с помощью Arduino IDE.

На первом этапе написания программы необходимо подключить библиотеки для работы:

LCD дисплея;

протокола связи по одному проводу OneWire; датчика температуры; Whire, для связи по 12С интерфейсу; часов реального времени DS1307RTC; контроллера записи и чтения на SD карту.

Для работы датчика температуры назначаем 5 пин контролера. На рисунке 4.4.4.1 представлен первый блок программы.

1 #include <LiquidCrystal_I2C.h>

2 LiquidCnystal_I2C lcd(0x27, 20, 4);

3 ttinclude <OneWire.h>

4 #include <DallasTemperature.h>

5 #define ONE_WIRE_BUS Б

6 OneWire oneWire(ONE_WIRE_BUS);

7 Da1lasTempenature sensors(SoneWire);

8 ttinclude <Wine.h>

9 #include <TimeLib.h>

10 #include <DS1307RTC.h>

11 #include "SPI.h"

12 #include "SD.h"

Рисунок 4.4.4.1 - Подключение библиотек для работы устройств

Далее необходимо задать переменные основного блока программы. На рисунке 4.4.4.2 представлен блок программы с указанием всех переменных значений.

14 const int chipSelect = 4;

15 int f;

16 int flj

17 int f2;

18 float fr;

19 int fi;

20 float filjfi2;

21 float T;

22 unsigned long timer;

23 unsigned long timerl;

Рисунок 4.4.4.2 - Блок переменных значений

Блок Setup, представленный на рисунке 4.4.4.3 содержит инициализацию работы с периферийными устройствами. В нем производится: инициализация LCD дисплея; включение подсветки; инициализация датчика температуры; инициализация датчика оптической плотности; инициализация датчиков освещенности; установка скорости UART порта; инициализация модуля чтения/записи SD карт.

33 SD.begin( chipSelect);

Рисунок 4.4.4.3 - Блок инициализации работы с периферийными устройствами

Далее проводим вход в цикл loop и присваивание переменным значений, считывающихся с аналоговых входов микроконтроллера. На рисунке 4.4.4.4 представлен основной блок программы с циклом loop. В этом блоке происходит считывание данных с датчика, их суммирование, вычисление среднего арифметического за установленный период и запись на SD карту.

Все временные задержки в программе реализованы с помощью функции millis(). Функция millis() - Возвращает количество миллисекунд, прошедших с запуска. Возвращает unsigned long, от 1 до 4 294 967 295 миллисекунд (~50 суток), имеет разрешение 1 миллисекунда, после переполнения сбрасывается в 0. Работает на системном таймере Timer 0. Далее происходит:

запрос показаний с датчика температуры; запрос показаний с датчика оптической плотности; запрос показаний датчиков освещенности.

ЗБ void 1оор() {

36 tmElements_t tm;

37 if (millis() - timer>= 1000){

38 sensors.requestTemperatures();

39 f = analogRead(A2);

40 fl = analogRead(A0);

41 f2 = analogRead(Al);

42 T = sensors.getTempCByIndex(0);

43 fi=map(fj0,704,100,0);

44 fil=(5.0/1024.0)*fl;

45 fi2=(5.0/1024.0)*f2;

46 fr=fil-fi2;

47 led.clear();

48 timer=millis();

49 >

Рисунок 4.4.4.4 - Основной блок программы

Функция fi=map() позволяет задать диапазон минимального и максимального значения датчика оптической плотности. Диапазон значений остальных датчиков задаётся по формулам fil, fi2. Разница значений датчиков освещенности задается формулой fr. Далее происходит очистка дисплея для следующей итерации и сброс таймера времени.

На следующем этапе работы начинается повторный отсчет времени, с проверкой прошедшего времени. Открывается файл на карте памяти с последующей записью в него следующих значений: даты и времени измерения, показания датчиков температуры, оптической плотности и освещенности. На рисунке 4.4.4.5 представлен блок программы, обеспечивающий запись значений на карту памяти.

if (millis() - timerl>= 600000){ myFile = SD.open("test.txt"j FILE_WRITE);

if (RTC.read

my my my my my my my my my my my my my my my my my my my my my my my my my

Й

e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print e.print

tm)) Щ "Время = "); tm.Hour);

tm.Minute);

tm.Second);

Дата (Д/М/Г) = "); tm.Day);

tm.Month); '/');

tmYearToCalendar(tm.Year));

Прозрачность воды:"); fi);

"j Датчик освещения 1:"); fil);

"j Датчик освещения 2:"); fi2);

Разница датчиков освещения:"); fr);

Температура:");

т);

e.println(" С"); e.close();

Рисунок 4.4.4.5 - Блок записи параметров на карту памяти

Далее с помощью блока команд lcd. выводим параметры полученных значений на LCD дисплей. На рисунке 4.4.4.6 представлен блок программы, обеспечивающий отображение значений на LCD дисплее.

81 1сс1 .зе1:Сиг5Ог(0,0);

82 1сс1

83 1сс1 .рг:1п1: (-Рз.);

84 1 с с! .pгint('%');

85 1сс1 .Бе1:Сиг5ог(0,1);

86 1сс1 .ргз.1тЦ"и=");

87 1сс1 .рг:1п1:(-Рг);

88 1сс1 . зе1:Сиг5ог(7,0);

89 1сс1 . ргз.п1:("Т=");

90 1сс1 .ргз.п1: (Т);

91 1сс1 .ргз.п1;(" С");

92 1с с1 . Бе1:Сиг5ог(0,2);

93 1сс1 .ргз.п1("111=");

94 1сс1 .ргз.п1:(-Р:11);

95 1сс1 . Бе1:Сиг5ог(0,3);

96 1сс1 .рга.п1("112=");

97 1сс1 .рга-п-Ц-^г);

98 }

Рисунок 4.4.4.6 - Блок вывода значений на LCD дисплей

4.5 Разработка исследовательского фотобиореактора гибридной

конструкции

В ходе выполнения диссертационного исследования, была выявлена необходимость в разработке конструкции исследовательского фотобиореактора, обеспечивающего условия для роста микроводорослей условиях природного водоёма.

В этих целях, для проведения экспериментальных исследований предложена конструкция, позволяющая проводить культивирование в открытом водоеме, с возможностью выделения новых перспективных видов, обладающих высокой скоростью роста при минимальных затратах. В перспективе устройство может быть использовано в иных научно-практических исследованиях, в т.ч. и в экомонитринге.

Предлагаемая конструкция, представляет собой гибридную систему открытого пруда и закрытого фотобиореактора, что позволяет совмещать преимущества указанных систем.

В основе конструкции - контейнер, выполненный из дерева и имеющий форму параллелепипеда. В нижней части установлена сетка из мельничного газа с ячейками, имеющими размер от 0,02 до 0,2 мм, который выбирают в зависимости от вида культивируемых водорослей. Сетка обеспечивает беспрепятственное попадание воды из водоема внутрь фотобиореактора. Благодаря тому, что размер ее ячейки меньше размеров клетки микроводорослей, она удерживает микроводоросли внутри устройства. Возможность выбора размеров ячейки позволяет удерживать в фотобиореакторе более крупные клетки, которые могут питаться более мелкими, поступающими из вне, что в свою очередь в перспективе позволит изучать процессы фаготрофии. Для защиты технологического объема контейнера от попадания брызг и мусора с водной поверхности, по периметру устройства закреплен каркас с защитным тентом. В качестве тента используется прозрачный полиэтилен, характеризующийся высокой светопропускающей способностью.

Использование дерева в конструкции позволяет обеспечить поддержание ее положительной плавучести, без применения дополнительной поплавковой системы, что существенно снижает производственные затраты [76]. Конструкция поясняется чертежами, представленными на рисунке 4.5.1, где схематично изображено устройство.

Рисунок 4.5.1 - Общий вид исследовательского фотобиореактора

гибридной конструкции

Одним из наиболее важных факторов, влияющих на рост микроводорослей, является перемешивание жидкости в технологическом объеме [121]. Данный процесс выполняет следующие очень важные функции в культивировании микроводоро слей:

- равномерное распределение клеток микроводорослей в фотобиореакторе;

- усиление газообмена;

- постоянное поступление питательных веществ из воды водоема;

- охлаждение и поддержание постоянного температурного режима в фотобиореакторе;

- быстрое перемещение клеток водорослей между темными и светлыми зонами на пути света, что может значительно увеличить продуктивность биомассы [76].

Таким образом, продуктивность роста микроводорослей можно повысить за счет увеличения интенсивности перемешивания, если этот процесс не будет вызывать повреждения клеток водорослей.

В предлагаемой конструкции для снижения стоимости изготовления и эксплуатации, а также в целях отказа от использования электрического оборудования в процессе культивирования в качестве системы перемешивания используется энергия волн.

Для работы устройства его устанавливают на поверхность водоема в прибрежной зоне. В контейнер помещают планируемую к выращиванию культуру. Крышка защитного тента закрывается и фиксируется посредством пластиковых стяжек. Под действием силы тяжести устройство погружается в воду до рабочего уровня, после чего глубина слоя жидкости над дном достигает от 80 до 90 мм.

По завершению цикла культивирования, устройство транспортируется на берег для последующей разгрузки. При извлечении устройства из воды, жидкая среда выливается через сетку, а биомасса остается в контейнере. После открытия крышки с защитным тентом, биомасса извлекается и отправляется на дальнейшую переработку.

Перед повторным использованием производится очистка и дефектовка (проверка состояния) устройства.

Предлагаемое устройство позволяет получать некоторые экологические характеристики (индикаторы), а также несет потенциальные возможности, которые могут быть использованы в биотехнологии и в исследовательской практике для изучения новых перспективных видов микроводорослей, обладающих высокой скоростью роста, для получения биологически ценных веществ, а также как средство для изучения фаготрофии [76].

Разработанный фотобиореактор может быть использован при культивировании и отдельных видов индикаторных микроводорослей, особенно требовательных к условиям среды, с последующим анализом нарастания их численности и биомассы.

Поскольку оценка полученной в ходе культивирования биомассы отражает экологическую ситуацию в водоеме, т.е. наличие питательных веществ и отсутствие токсического воздействия возможных загрязнителей антропогенного происхождения, то устройство может быть предложено в качестве индикаторной системы при проведении комплексного экомониторинга [76].

4.6 Комплексная апробация аппаратно-программного комплекса и исследовательского фотобиореактора

Апробация производилась в несколько этапов и включала в себя проведение исследований как в лабораторных, так и в естественных условиях.

4.6.1 Объекты исследования

На основании анализа перспектив развития биотехнологий культивирования микроводорослей, в качестве объектов исследования использовали:

- культуру цианобактерий Spirulina (Arthrospira) platensis North. Geitl, из коллекции культур ФИЦ ИнБЮМ;

- культуру зеленой жгутиковой микроводоросли Tetraselmis viridis Rouch (syn. Platimonas viridis), (штамм IBSS-25) из коллекции культур ФИЦ ИнБЮМ [92].

4.6.2 Методы и условия выращивания Arthrospira platensis

Культуру Spirulina (Arthrospira) platensis North. Geitl, получали из коллекции ФИЦ ИНБЮМ РАН. Для ее выращивания использовались различные методы, включая накопительные и квазинепрерывные культуры [54, 131] в культиваторах на стерильной питательной среде «Zarrouk», состав которой приведен в таблице 4.6.2.1, перечень микроэлементов, входящих в состав питательной среды представлен в таблице 4.6.2.2 [132].

Основой для питательной среды служила дистиллированная вода. При культивировании поддерживали температуру среды на уровне 26-28°С. Культуру круглосуточно освещали люминесцентными лампами дневного света CC PIL 1 LF 36W/54-765 2450 lm. Освещённость поверхности культиватора составляла 80 Вт/м2. Равномерное перемешивание суспензии в биореакторе осуществляли посредством барботирования воздуха с помощью компрессорной установки. Культуру, адаптированную к концентрированным питательным средам, использовали в качестве инокулята для экспериментальных работ. Экстрагирование пигментов из клеток микроводоросли производилось ацетоном (100%) [106].

Таблица 4.6.2.1 - Состав питательной среды «Zarrouk» для культивирования цианобактерий Arthrospira platensis

Наименование вещества Обозначение вещества Объем, г/л

1 Гидрокарбонат натрия NaHCO3 16,8

2 Гидроортофосфат калия K2HPO4 0,5

3 Нитрат натрия NaNO3 2,5

4 Сульфат калия K2SO4 1,0

5 Хлорид натрия NaCl 1,0

6 Динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ТРИЛОН Б) Na2EDTA 0,08

7 Железо сернокислое 7-водное FeSO4 x 7H2O 0,01

8 Хлорид кальция CaCl2 0,04

9 Магний сернокислый 7-водный MgSO4 x 7H2O 0,2

10 Раствор микроэлементов 1 мл/л -

Таблица 4.6.2.2 - Перечень микроэлементов

Наименование вещества Обозначение вещества Объем, г/л

1 Динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ТРИЛОН Б) Na2EDTA 0,5

2 Борная кислота H3BO3 2,86

3 Марганец II хлористый четырехводный MnCl2 x 4H2O 1,81

4 Цинк сернокислый 7-водный ZnSO4 x 7H2O 0,222

5 Кристалогидрат сульфата меди CuSO4 x 5H2O 0,079

6 Оксид молибдена M0O3 0,015

7 Метаванадат аммония NH4VO3 0,02296

8 Нитрат кобальта Co(NO3)3 x 6H2O 0,04398

9 Хромовая смесь K2Cr2(SO4)4 x 24H2O 0,0960

10 Никель сернокислый 7-водный NÍSO4 x 7H2O 0,04785

11 Дигидрат оксида вольфрама Na2WO4 x 2H2O 0,01794

12 Сульфат титана Ti2(SO4)3 0,040

4.6.3 Методы и условия выращивания Platimonas viridis и Dunaliella salina

Культуры Platimonas viridis и Dunaliella salina Teod. из коллекции культур ФИЦ ИНБЮМ РАН, выращивали методами накопительных и квазинепрерывных культур [54, 131] в культиваторах на стерильной питательной среде «Тренкеншу», состав которой приведен в таблице 4.6.3.1. Основой для питательной среды служила предварительно фильтрованная и стерилизованная вода из открытой части моря. При культивировании поддерживали температуру среды на уровне 26-28°С. Культуры круглосуточно освещали люминесцентными лампами дневного света CG PIL 1 LF 36W/54-765 2450 lm. Освещённость поверхности культиватора составляла 80 Вт/м2. Культуры, адаптированные к концентрированным питательным средам, использовали в качестве инокулята для экспериментальных работ.

Экстрагирование пигментов из клеток микроводоросли производилось ацетоном (100%) [108].

Таблица 4.6.3.1 - Состав питательной среды Тренкеншу

Наименование вещества Обозначение вещества Объем, г/л

1 Нитрат натрия (азотнокислый натрий) NaNO3 1,8

2 Натрия дигидрофосфат дигидрат NaH2PO4 х 2H2O 0,3

3 Динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ТРИЛОН Б) Na2EDTA 0,037

4 Кристаллогидрат цитрат железа (III) (лимоннокислое железо) FeC6HsO7 х 7H2O 0,042

5 Марганец II хлористый четырехводный (марганец хлорид (II) татрагидрат) MnCl2 х 4H2O 0,008

6 Нитрат кобальта Co(NO3)2 х 6H2O 0,00635

7 Гептамолибдат аммония (парамолибдат аммония, парамолибденовокислый аммоний) (NH4)6M07025 х 4H2O 0,00183

8 Хромовая смесь K2Cr2(SO4)2 х 24H2O 0,00238

10 Диоксид титана (двуокись титана, титановые белила, пищевой краситель Е171) TiO2 0,00058

4.6.4 Измерение оптической плотности культуры

Контроль накопления биомассы микроводорослей осуществлялся путем измерения оптической плотности, что является стандартным методом оценки концентрации клеток в суспензии. Для этого использовался спектрофотометр Unico 2100, который отличается высокой точностью: абсолютная погрешность при определении величины пропускания не превышает 1,0 % [133], что позволяет получать надежные данные о состоянии культуры.

Измерения проводились в прямоугольных стеклянных кюветах с рабочей длиной 5 мм при длине волны X = 750 нм, что выбрано не случайно. Данная длина волны позволяет минимизировать влияние других компонентов, присутствующих в среде, и сосредоточиться именно на поглощении света микроводорослями. Прямоугольные стеклянные кюветы с рабочей длиной 5 мм обеспечивают оптимальные условия для проведения спектрофотометрического анализа, позволяя свету проходить через образец без значительных искажений. В качестве эталона

использовалась дистиллированная вода, что является общепринятой практикой в таких измерениях. Для уменьшения ошибок, связанных с рассеянием света, кювету устанавливали в максимальной близости к фотоприемнику.

Динамику роста биомассы фиксировали по изменению оптической плотности клеточной суспензии каждые сутки. Отбор проб проводили после перемешивания клеточной суспензии в фотобиореакторе. При необходимости выполняли разбавление суспензии чистой культуральной средой и учитывали разбавление при расчете концентрации клеток в суспензии.

4.6.5 Определение pH суспензии микроводорослей Для определения уровня pH проб суспензии микроводорослей использовался иономер модели И-160МИ. Этот прибор является высокоточным инструментом для измерения активности ионов в растворах, что позволяет получать достоверные данные о кислотно-щелочном балансе исследуемых образцов. Методика проведения измерений была основана на стандартах ГОСТа 26180-84, которые описывают процедуру анализа pH. В ходе эксперимента стеклянный электрод, который отвечает за измерение pH, и солевой контакт электрода сравнения, помещали в колбу с суспензией микроводорослей. После установки электродов в пробу ожидали стабилизации потенциала, что позволяло получить точные и стабильные показания. Важно отметить, что перед помещением электродов в каждую новую пробу, тщательно промывали их дистиллированной водой, чтобы избежать перекрестного загрязнения между образцами.

4.6.6 Постановка и организация эксперимента в лабораторных условиях В эксперименте использовалась альгологически чистая культура зеленой жгутиковой микроводоросли Tetraselmis viridis Rouch (syn. Platimonas viridis) -штамм IBSS-25 из коллекции Института биологии южных морей им. А.О. Ковалевского РАН [132].

Изучение динамики роста биомассы одноклеточной зелёной микроводоросли Tetraselmis viridis проводилось с помощью экспериментальной установки, представленной на рисунке 4.6.6.1 и разработанной с учётом опыта, накопленного в ходе предыдущих исследований [98, 120, 76, 134, 77].

Выбор места проведения эксперимента - лаборатория отдела биотехнологии и фиторесурсов ФИЦ ИнБЮМ - был продиктован необходимостью минимизировать влияние внешних факторов, таких как колебания температуры, освещённости и влажности, на рост и развитие культуры Tetraselmis viridis.

Экспериментальная установка представляла собой сложную систему, состоящую из нескольких модулей:

Пластиковую ёмкость объемом 10 литров, используемую в качестве фотобиореактора, систему контроля роста с датчиками облучённости, температуры и оптической плотности, насос для перемешивания культуры и циркуляции ее через датчик оптической плотности, систему подачи углекислого газа, газовые шланги, систему искусственного освещения.

V V V

Рисунок 4.6.6.1 - Схема экспериментальной установки, где: 1 - фотобиореактор; 2 - датчики облучённости; 3 - датчик температуры; 4 - датчик оптической плотности; 5 - насос; 6 - система контроля роста;

7 - светодиодные лампы

На рисунке 4.6.6.2 представлен внешний вид лабораторной установки.

Рисунок 4.6.6.2 - Экспериментальная установка

Культивирование производилось с использованием постоянного искусственного освещения. Для этого применялись светодиодные лампы мощностью 10 Вт в количестве 10 штук. Находящиеся на расстоянии 40 см от поверхности фотобиореактора. На момент начала эксперимента значение облучённости на поверхности фотобиореактора составило 25 кЛк. Для определения значения облучённости использовался люксметр Ш1010А.

Культивирование микроводорослей в экспериментальной установке осуществлялось следующим образом. Вначале процесса включали светодиодные лампы 7, насос 5 и систему контроля роста 6.

В фотобиореактор вносили инокулят и питательную среду в такой пропорции, чтобы начальная плотность культуры составила 0,2 г/дм3.

Культивирование микроводоросли в накопительном режиме производилось в течение 27 суток, до момента достижения стационарной фазы роста. Объем

суспензии микроводорослей в фотобиореакторе в течении эксперимента поддерживался на постоянном уровне, путем долива дистиллированной воды в культиватор. В процессе выращивания культуру непрерывно барботировали газовоздушной смесью с 3% по объему углекислого газа с помощью компрессорной установки.

Система контроля роста регистрировала с интервалом 10 минут параметры облучённости, оптической плотности и температуры суспензии микроводорослей. Контрольный замер оптической плотности на спектрофотометре Unico 2100 производился 1 раз в сутки, с фиксацией времени измерения.

Для обеспечения правильных условий измерения, показания прибора Unico 2100 должны находиться в диапазоне наименьшей погрешности, который составляет от 0,3 до 0,6 единиц. Поэтому, пробы суспензии с оптической плотностью, превышающей 1,0, предварительно разбавляли питательным раствором. Подбор коэффициента разбавления осуществлялся с учетом характеристик конкретной пробы. Так же производился контроль pH.

Ниже приведены технологические характеристики процесса накопления биомассы:

- начальная концентрация биомассы: 0,26 г/л;

- температура культивирования: +22... +29 оС;

- освещение: светодиодные лампы ФАРЛАЙТ 10W G13 800лм 6500К 10

штук;

- концентрация углекислого газа в газовоздушной смеси: 5 %.

По завершению эксперимента полученные данные были обработаны, полученные значения оптической плотности пересчитывались согласно формуле (4.10) на АСБ, г/л [135].

СВ = к • D750, (4.10)

где СВ - биомасса высушена при 105°С, D750 - значение оптической плотности на длине волны 750 н.м., k - эмпирический коэффициент, равный 0,8 г-л-1 ед. опт. пл-1.

Результаты аппроксимации экспериментальных значений биомассы,

полученных с помощью разработанного устройства и спектрофотометра Unico 2100 представлены на рисунке 4.6.6.3.

Поскольку культура микроводорослей неоднородна, датчик оптической плотности фиксирует различные неоднородности в области измерения. На рисунке изображена усредненная кривая, «выбросы» исключались из данных.

Коэффициент детерминации для системы с датчиком оптической плотности составил R2=0,991 и R2=0,962 для системы с датчиками облучённости.

На рисунках 4.6.6.4 и 4.6.6.5 приведены результаты измерения температуры и pH культуральной среды.

« 5 10 15 20 25 30

Продолжительность культивирована сут.

Рисунок 4.6.6.3 - Ростовые характеристики микроводоросли Tetraselmis viridis

Рисунок 4.6.6.4 - Температурный режим культуральной среды

Рисунок 4.6.6.5 - Динамика изменения рН в ходе эксперимента

4.6.7 Постановка и организация эксперимента в естественных условиях

В эксперименте использовалась альгологически чистая культура цианобактерий Arthrospira platensis - штамм из коллекции Института биологии южных морей им. А.О. Ковалевского РАН.

Для проведения исследований была выбрана Тепличный комплекс отдела биотехнологии и фиторесурсов ФИЦ ИнБЮМ, представляющий собой конструкцию, состоящую из металлического каркаса 14 м длиной и 4 м шириной, обшитую листами прозрачного поликарбоната.

Основная задача комплекса - создать оптимальные условия для роста микроводорослей при проведении научно-исследовательских работ.

Тепличный комплекс позволяет круглогодично производить работы при естественном солнечном освещении, обеспечивая защиту исследовательского оборудования и культуры от резких перепадов температуры, за счет того, что днём воздух внутри теплицы быстро нагревается сам и нагревает грунт, а ночью грунт отдаёт накопленное тепло обратно. Так же теплица позволяет исключить влияние негативных факторов, такие как сильные ветры и осадки на ход проведение эксперимента.

Экспериментальная установка включала в себя следующее оборудование:

Пластиковую ёмкость объемом 18 литров, используемую в качестве фотобиореактора, систему контроля роста с датчиками облучённости, температуры и оптической плотности, насос для перемешивания культуры и циркуляции ее через датчик оптической плотности, источник бесперебойного питания, аккумулятор напряжением 12 В и емкостью 60 Ач. На рисунке 4.6.7.1 представлен внешний вид установки.

Культивирование производилось в условиях естественного освещения. На момент начала эксперимента значение облучённости на поверхности фотобиореактора составило 60 кЛк. Для определения значения облучённости использовался люксметр Ш1010А. На начальном этапе культивирования в фотобиореактор вносили инокулят и питательную среду в такой пропорции, чтобы начальная плотность культуры составила 0,12 г/дм3.

Рисунок 4.6.7.1 - Экспериментальная установка

Затем подключали аккумулятор к источнику бесперебойного питания. Систему контроля роста, а также насос подключали через источник бесперебойного питания, тем самым обеспечивая автономность устройства.

Культивирование производилось в течение 16 суток в накопительном режиме, до момента достижения стационарной фазы роста. Объем суспензии в фотобиореакторе в течении эксперимента поддерживался на постоянном уровне, путем долива дистиллированной воды.

Система контроля роста регистрировала с интервалом 10 минут параметры облучённости, оптической плотности и температуры суспензии микроводорослей. Контрольный замер оптической плотности на спектрофотометре Unico 2100 производился 1 раз в сутки, с фиксацией времени измерения.

Пробы суспензии с оптической плотностью, превышающей 1,0, предварительно разбавляли питательным раствором. Подбор коэффициента разбавления осуществлялся с учетом характеристик конкретной пробы. Так же

производился контроль pH. По завершению эксперимента полученные данные были обработаны, полученные значения оптической плотности пересчитывались согласно формуле (4.10) на АСБ, г/л [135].

Результаты аппроксимации экспериментальных значений биомассы, полученных с помощью разработанного устройства и спектрофотометра Unico 2100 представлены на рисунке 4.6.7.2.

На рисунках 4.6.7.3, 4.6.7.4 и 4.6.7.5 приведены результаты измерения pH, а так динамика изменения температуры культуральной среды и облучённости.

Рисунок 4.6.7.2 - Ростовые характеристики цианобактерий Arthrospira platensis

Коэффициент детерминации для системы с датчиком оптической плотности составил Я2=0,984 и Я2=0,951 для системы с датчиками облучённости.

Рисунок 4.6.7.3 - Динамика изменения рН в ходе эксперимента

Рисунок 4.6.7.4 - Температурный режим культуральной среды

100

5 80 Л

С и

х 60 в

т

.5 40

20-

0 4 8 12 16

Продолжительность культнвнровяння, сут

Рисунок 4.6.7.5 - Изменение облучённости культуральной среды

4.6.8 Апробация экспедиционного фотобиореактора

Апробация проводилась в период с 08.10.2021 по 16.11.2021 в прибрежной акватории Чёрного моря, на территории ФИЦ ИнБЮМ имени А. О. Ковалевского РАН. Внешний вид фотобиореактора в процессе апробации представлен на рисунке 4.6.8.1.

Рисунок 4.6.8.1 - Фотобиореактор в процессе эксперимента

Эффективная площадь поверхности плавающего фотобиореактора составила 0,5 м2, с размером ячейки сетки 0,26 мм. Фотобиореактор был установлен на поверхности воды и зафиксирован растяжками. Ежедневно производили контроль температуры морской воды и уровня облучённости, с помощью разработанного аппаратно-программного комплекса. Результаты измерений приведены в таблице 4.6.8.1 [134].

Таблица 4.6.8.1 - Изменение суммарной энергии ФАР и температуры морской воды ( °С) в гибридном исследовательском фотобиореакторе в период эксперимента.

Дата 08.10 09.10 10.10 11.10 12.10 13.10 14.10 15.10 16.10 17.10

t °С 19 18 17 17 17 17 18 19 19 18

Ея, мДж/м2 7,2 7,2 7,1 5,8 6 6,2 5,7 5,8 4,2 5,6

Дата 18.10 19.10 20.10 21.10 22.10 23.10 24.10 25.10 26.10 27.10

t °С 17 17 17 17 18 17 17 18 16 16

Е, мДж/м2 5,6 5,5 5,7 5,3 3,7 4,9 4,9 4,7 4,9 4,5

Дата 28.10 29.10 30.10 31.10 01.11 02.11 03.11 04.11 05.11 06.11

t °С 16 16 16 17 16 16 16 16 16 17

Ея, мДж/м2 4,1 4,3 4,2 4 3,9 3,8 3,6 4,8 4,3 3,2

Дата 07.11 08.11 09.11 10.11 11.11 12.11 13.11 14.11 15.11 16.11

t °С 17 17 17 16 16 16 15 15 15 15

Е, мДж/м2 3,3 3,6 3,4 4,1 3,3 3,2 2,9 2,7 3,1 2,7

На рисунке 4.6.8.2 представлен внешний вид фотобиореактора после извлечения из воды с биомассой водорослей.

к

Рисунок 4.6.8.2 - Биомасса микроводорослей, полученная в результате

эксперимента

4.6.9 Проведение таксономической идентификации

Для выполнения таксономической идентификации диатомовых водорослей, собранных в ходе эксперимента, их панцири очищались от органических компонентов с использованием концентрированной серной кислоты H2SO4, смешанной с кристаллами дихромата калия К2СГ2О7. Затем осадок промывался дистиллированной водой 7-10 раз до полного устранения остатков серной кислоты.

Для создания образцов для сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) капля суспензии очищенных створок наносились на поликарбонатную мембрану Nuclepore Whatman, после чего она сушилась, закреплялась на алюминиевом держателе и покрывалась слоем золота и палладия в вакуумной камере [134, 136].

Фотосъемку створок осуществляли с применением СЭМ Hitachi SU3500. Таксономический статус Bacillariophyta определялся по классификации [137], с дополнениями [138, 139, 140]. Измерения морфологических характеристик клеток проводились с использованием программного обеспечения ImageJ [141].

Проведенная идентификация состава микроводорослей в контейнере фотобиореактора показала отсутствие иных альгологических таксонов, помимо

Bacillariophyta. В составе диатомовых водорослей выявлено 18 массовых видов, относящихся к 15 родам, 11 семействам, 9 порядкам и 3 классам Bacillariophyta. Все они относятся к бентопланктонным формам, т.е. в течение жизненного цикла способны подниматься из бентоса в толщу воды и переноситься течениями, что дает им значительное преимущество при расселении в различные местообитания. Именно эта особенность оказалась важной для заселения фотобиореактора клетками, способными проникнуть через ячейки секи.

Наибольшее видовое богатство отмечено у представителей класса Bacillariophyceae - 10 видов, у класса Fragilariophyceae обнаружено 6 видов, у класса Coscinodiscophyceae - 2 вида [134].

По численности доминировал мелкоклеточный вид Cylindrotheca closterium (Ehrenb.) Reimann et Lewin, отличающийся наибольшей скоростью деления. По биомассе преобладали крупноклеточные таксоны Licmophoraflabellata (Carmichael ex Grev.) C. Agardh, Licmophora abbreviata C. Agardh, Striatella unipunctata (Lyngb.) C. Agardh, Synedrosphenia crystallina (C. Agardh) Lobban et Ashworth [Syn.: Ardissonea crystallina (C. Agardh) Grunow], Tabularia tabulata (C. Agardh) Snoeijs.

Средние размеры клеток приведены в таблице 4.6.9.1, изображения видов -на рисунке 4.6.9.1 [134].

Таблица 4.6.9.1 - Средние размеры клеток массовых видов BacШariophyta, обнаруженных в гибридном исследовательском фотобиореакторе

Таксон (класс, порядок, семейство, род, вид) Длина створки, мкм Ширина створки, мкм

COSCINODISCOPHYCEAE

Thalassiosirales Gleser et I.V. Makarova 1986 Thalassiosiraceae M. Lebour 1930 Thalassiosira Cleve 1873

Thalassiosira eccentrica (Ehrenb.) Cleve 40 40

Coscinodiscales Round et R.M. Crawford 1990 Hemidiscaceae Hendey 1937 emend. Simonsen 1975 Actinocyclus Ehrenb. 1837

Таксон (класс, порядок, семейство, род, вид) Длина створки, мкм Ширина створки, мкм

Actinocyclus subtilis (W. Greg.) Ralfs 68 68

FRAGILARIOPHYCEAE

Fragilariales P.C. Silva 1962 Fragilariaceae Grev. 1833 Tabularia (Kütz.) D.M. Williams et Round 1986

Tabularia tabulata (C. Agardh) Snoeijs 27 4,5

Licmophorales Round 1990 Licmophoraceae Kütz. 1844 Licmophora C. Agardh 1827

Licmophora flabellata (Carmichael ex Grev.) C. Agardh 125 5

Licmophora abbreviata C. Agardh 44 6,7

Ardissoneales Round 1990 Ardissoneaceae Round 1990 Ardissonea De Not. ex De Not. et Bagl. 1870

Ardissonea crystallina (C. Agardh) Grunow [Currentl. accept. name: Synedrosphenia crystallina (C. Agardh) Lobban et Ashworth 2022] 235 12

Striatellales Round 1990 Striatellaceae Kütz. 1844 Striatella C. Agardh 1832

Striatella unipunctata (Lyngb.) C. Agardh 48 11,7

Grammatophora Ehrenb. 1840

Grammatophora marina (Lyngb.) Kütz. 38 5,7

BACILLARIOPHYCEAE

Naviculales Bessey 1907 emend. D.G. Mann Pinnulariaceae D.G. Mann 1990 Caloneis Cleve 1894

Caloneis liber (W. Sm.) Cleve 77 13

Naviculaceae Kütz. 1844 Navicula Bory 1822

Navicula perminuta Grunow ex Van Heurck 10,5 2,6

Navicula ramosissima (C. Agardh) Cleve 10 2,8

Haslea Simonsen 1974

Haslea sp. 19 4

Таксон (класс, порядок, семейство, род, вид) Длина створки, мкм Ширина створки, мкм

Pleurosigmataceae Mereschk. 1903 Pleurosigma W. Sm. 1852

Pleurosigma elongatum W. Sm. 184 26

Thalassiophysales D.G. Mann 1990 Catenulaceae Mereschk. 1902 Amphora Ehrenb. 1844

Amphora marina (W. Sm.) Chase 35 10,8

Halamphora (Cleve) Levkov 2009

Halamphora sp. 49,5 14,5

Bacillariales Hendey 1937 emend. D.G. Mann Bacillariaceae Ehrenb. 1831 Cylindrotheca Rabenh. 1859

Cylindrotheca closterium (Ehrenb.) Reimann et Lewin 25 1,5

Nitzschia Hassall 1845