Модификация трехмерной организации генома посредством искусственного привлечения архитектурных белков в норме и в патологии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Тюкачева Евгения Александровна

• Тюкачева Евгения Александровна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Тюкачева Евгения Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Цели и задачи работы

Научная новизна и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Положения выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Личный вклад соискателя

Структура и объём работы

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Уровни компактизации генома

1.2 Строение белка CTCF и структура его взаимодействия с ДНК

1.3 Когезин-зависимая экструзия хроматиновых петель и роль CTCF в ней

1.4 Нарушения пространственной организации генома ведут к патологиям

1.5 Методы редактирования пространственной организации

генома

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Ведение клеточных культур

2.2 Электропорация

2.3 Конструирование плазмид, кодирующих части белка CTCF, слитых с dCas9 и GFP

2.4 Подготовка образцов хроматина

2.5 Вестерн-блоттинг

2.6 C-TALE

2.7 Подготовка BAC-зондов

2.8 ChIP-qPCR и ChIP-seq

2.9 RNA-seq

2.10 Анализ статистических данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Получение химерных белков на основе нативного белка CTCF

3.2 Химерные белки с 3-7 доменами цинковых пальцев активно связываются с эндогенными CBS

3.3 Фрагмент CTCF, включающий К-концевой домен и 2 первых цинковых пальца способен создавать хроматиновые петли

3.4 Связывание химерного белка N+2 приводит к накоплению когезина в целевой точке

3.5 Изменения в пространственной организации локуса при привлечении химерных белков не приводят к изменению эпигенетического профиля и экспрессии генов локуса

3.6 Получение клеточной линии К562 с делецией сайта связывания С^ 5'-CBS в локусе ИОХБ

3.7 Привлечение химерного белка N+2 частично восстанавливает хроматиновую петлю, разрушенную мутацией

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. ПРИЛОЖЕНИЕ 1 100 БЛАГОДАРНОСТИ 110 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

5-ASA - 5-aminosalicylic acid

adRP - Autosomal dominant retinitis pigmentosa

ADLD - Autosomal dominant leukodystrophy with autonomic disease

ANC-INC - Active nuclear compartment - Inactive nuclear compartment

AML - Acute myeloid leukemia

AZF - Artificial zinc finger

BAC - Bacterial artificial chromosome

BET domain - Bromodomain and extraterminal domain

BOFS - Branchio-oculo-facial syndrome

BRD4 - Bromodomain-containing protein

BSA - Bovine serum albumin

CBS - CTCF binding site

CCND4 - cyclin D4

ChIP - Chromatin Immunoprecipitation

CIBN - N-truncated CRY-interacting basic-helix-loop-helix protein 1 CK2 - Casein kinase

CLOuD9 - chromatin loop re-organization using CRISPR-dCas9

CRY2 - (Cryptochrome Circadian Regulator 2)

CT - Chromosome territory

C-TALE - Chromatin TArget Ligation Enrichment

CTCF - CCCTC-binding factor

dCas9 - catalytically inactive ('dead') Cas9

DEPC - Diethyl pyrocarbonate

DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium

DNMT3A - DNA (cytosine-5)-methyltransferase 3A

EGFP - Enhanced green fluorescent protein

ENIT - Engineered nuclease-induced translocations

EPHA4 - EPH receptor A4 (ephrin type-A receptor 4) ESC - Embryonic stem cells FBS - Fetal bovine serum

FMR1 - Fragile X Messenger Ribonucleoprotein

GFI1B - Growth Factor Independent 1B Transcriptional Repressor

GLT8D1 - Glycosyltransferase 8 Domain Containing

HAGLR - HOXD Antisense Growth-Associated Long Non-Coding RNA

HERV-H - Human endogenous retrovirus subfamily H

HoxD - Homeobox D

HTLV-1 - Human T-cell lymphotropic virus type

IC - Interchromatin compartment

ID4 - Inhibitor Of DNA Binding

IHH - Indian hedgehog homolog

IRXA - Iroquois Homeobox A

ITIH3 - Inter-Alpha-Trypsin Inhibitor Heavy Chain

KCNJ - Potassium Inwardly Rectifying Channel Subfamily J

Klf4 - Kruppel-Like Factor

KRAB - Krüppel associated box

LADL - Light-activated dynamic looping

LB - Lysogeny broth

LMNB1 - Lamin-B1

LTR - Long terminal repeat

MSCV - Murine Stem Cell Virus

MTX2 - Metaxin

NEK4 - NIMA Related Kinase

NIPBL - Nipped-B-like protein

Oct4 - Octamer-binding transcription factor

PARP1 - Poly(ADP-Ribose) Polymerase

PAX3 - Paired box 3 gene

PBS - Phosphate-buffered saline

PBST - Phosphate-buffered saline with Tween

Pcdh - Protocadherin

PDGFRA - Platelet-derived growth factor receptor A

PITX1 - Paired-like homeodomain

qPCR - Quantitative polymerase chain reaction

RBRi - internal RNA Binding Region

RIPA - Radioimmunoprecipitation assay

SFMBT1 - Scm-like with four mbt domains

SMC - Structural maintenance of chromosomes

SNP - Single-nucleotide polymorphism

SOX9 - SRY-Box Transcription Factor

STAG1 - Cohesin subunit SA-1

STR - Short tandem repeats

SV - Structural variation

SunTag - tagging system SUperNova

T-ALL - T-cell acute lymphoblastic leukemia

TCF7L2 - Transcription factor 7-like

TE - Tris-EDTA

TFAP2A - Transcription factor AP-2 alpha

TFF - Trefoil factor family

WAPL - Wings Apart-Like Protein Homolog

WNT6 - Wingless-Type MMTV Integration Site Family, Member

YPEL2 - Yippee Like

YY1 - Yin Yang

ZF - Zinc finger

Zfp462 - Zinc Finger Protein 462 ZNF143 - Zinc Finger Protein 143 ATO - AgeH03HmpH$0C$aaT

ПЦР - Полимеразная цепная реакция

ТАД - Топологически-ассоциированный домен

ЭДТА - Этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Модификация трехмерной организации генома посредством искусственного привлечения архитектурных белков в норме и в патологии»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Геном млекопитающих компактизован во множество пространственных структур. Эти структуры разнятся по размерам, механизмам возникновения, стабильности как в клеточных популяциях, так и в эволюционном ряду. Тонкая взаимосвязь этих структур с экспрессией генов является предметом интенсивных исследований. За последние два десятилетия были найдены свидетельства того, что укладка генома может влиять на транскрипцию генов как в отдельных локусах, так и на масштабе целых хромосом [1]. Данные исследования имеют исключительную важность в свете расширяющегося списка заболеваний, вызванных изменением экспрессии генов в локусах с нарушениями пространственной организации [2]. Изучение возможности предотвращения последствий подобных пертурбаций открывает широкие перспективы в терапии многих патологий развития и рака.

Среди процессов образования пространственных структур, влияющих на экспрессию генов, выделяют компартментализацию, обусловленную локальной плотностью хроматина, и петлевую экструзию. Первая охватывает большие области генома, часто на разных хромосомах, и сближает регионы схожего эпигенетического статуса, способствуя их взаимодействию [3]. Вторая же -действует на меньших расстояниях, исключительно in cis, связывая гены и регуляторные элементы, находящиеся на расстоянии от нескольких тысяч до нескольких миллионов пар нуклеотидов друг от друга [3]. Большинство найденных примеров патологий, связанных с изменением укладки генома, приходится именно на нарушения границ топологически ассоциированных доменов (ТАДов) и контактных петель, возникающих, в большинстве своем, за счет процесса петлевой экструзии.

Основными участниками процесса петлевой экструзии в интерфазе у млекопитающих считаются белки когезин и CTCF [4]. Когезин -мультисубъединичный комплекс на основе белков семейства SMC, имеющий

форму кольца и способный двигаться вдоль молекулы ДНК с использованием энергии гидролиза АТФ. CTCF выполняет барьерную функцию, задерживая или останавливая движение когезина по ДНК. Остановка экструзии на сайтах связывания CTCF приводит к стабилизации хроматиновой петли. CTCF состоит из неструктурированных N- и C-концевых доменов, а также центральных одиннадцати ДНК-связывающих доменов вида цинковый палец [5]. Исследования последних лет показывают важность N-концевого домена CTCF для связывания с когезином, в то время как центральная часть белка от 3-го до 7-го цинковых пальцев - обеспечивает связывание CTCF с ДНК [6, 7]. Участок связывания CTCF на ДНК (CTCF-binding site, CBS) имеет коровый мотив и направление. Для стабилизации петли, когезин должен провзаимодействовать с двумя молекулами CTCF, связанными с противоположно направленными CBS. Однако, как правило, одного CTCF с одной из сторон может быть недостаточно, и полная остановка происходит на участке, содержащем группу из нескольких однонаправленных CBS.

Многочисленные эксперименты по изменению границ ТАДов и хроматиновых петель в большинстве своем представляли собой опыты по вырезанию либо вставке CBS, часто - тандемами [8]. Однако, подобные подходы неприменимы для лечения патологий, поскольку неизбежно несут риски хромосомных перестроек в результате внесения разрывов в ДНК [9]. Для изменения профиля петлевых контактов без изменения в самой последовательности ДНК ранее использовали привлечение полноразмерного CTCF слитого с Cas9, лишённый энзиматической активности (dCas9), с использованием системы SunTag или без неё, по аналогии с привлечением метилтрансферазных и других модифицирующих хроматин доменов [10, 11]. Проблемой подобных экспериментов стал неучет побочных эффектов, возникающих, в результате связывания химерного белка с эндогенными CBS. Это обусловлено наличием собственных ДНК-связывающих доменов CTCF в составе химерного белка. Кроме того, экспрессия в клетках полноразмерного CTCF,

слитого с dCas9, имела цитотоксические эффекты, вероятно вызванные тем, что, С-концевой домен CTCF может быть вовлечён в регуляцию и других клеточных процессов, помимо экструзии. В связи с этим создание технологии редактирования трехмерной организации генома (в частности локусов, ассоциированных с развитием патологий), не затрагивающей первичную последовательность ДНК и не имеющую побочных эффектов, представляется актуальным, поскольку может стать основой терапии многих заболеваний. В данной работе мы постарались свести побочные эффекты к минимуму, создав плазмиды, кодирующие фрагменты CTCF (N-концевой домен либо одиночный (N), либо вместе с 2/7/11 (N+2/7/11) цинковыми пальцами), а также полноразмерный CTCF в качестве контроля (Full) слитые с белками dCas9 и EGFP. Их эффективность и отсутствие побочных эффектов были проверены в данной работе. Плазмиды, кодирующие химерные белки были сконструированы таким образом, чтобы иметь возможность применения в разных модельных системах. В частности, полученные плазмиды могут использоваться для лентивирусной доставки в клетки-мишени, что делает удобным их лабораторное использование даже in vivo.

Цели и задачи работы Целью работы было: разработать систему для SD-геномной инженерии через эктопическое привлечение фрагментов белка CTCF к заранее выбранному участку генома.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Создать панель экспрессионных конструктов, кодирующих укороченные формы белка CTCF, слитые с белками dCas9 и EGFP.

2) Исследовать возможность создания хроматиновых петель de novo посредством привлечения различных форм химерного белка CTCF-dCas9-EGFP к заранее заданной точке генома.

3) Исследовать влияние привлечения данных химерных белков на экспрессию генов целевого локуса и его эпигенетический статус.

4) Изучить возможность восстановления исходного петлевого рисунка в линии с делецией сайта связывания CTCF через привлечение различных вариантов химерного белка CTCF-dCas9-EGFP.

Научная новизна и практическая значимость работы

В данной работе впервые показано, что привлечение N-концевого домена CTCF и двух первых цинковых пальцев (химерный белок N+2) способно формировать устойчивые хроматиновые петли. Показано, что химерные белки, включающие полноразмерный CTCF или его усеченные формы, сохраняющие цинковые пальцы с 3-го по 7-й, гораздо слабее связываются с точкой привлечения. Кроме этого, выявлены существенные побочные эффекты от экспрессии таких белков: множество сайтов нецелевого связывания и цитотоксичность. Использование же химерного белка с N-концевым доменом и двумя первыми цинковыми пальцами показало отсутствие побочных сайтов связывания. Формирование новых хроматиновых петель в локусе не повлекло за собой никаких заметных изменений в эпигенетическом и транскрипционном профиле локуса. Кроме того, было показано, что данный химерный белок может быть использован для восстановления хроматиновых контактов, разрушенных вследствие утраты эндогенного CBS. Полученные результаты способствуют лучшему пониманию процесса формирования хроматиновых петель, поскольку выявляют фрагмент белка CTCF, "необходимый и достаточный" для осуществления барьерной функции по отношению к экструзии. Таким образом, полученный химерных белок может быть использован в дальнейшей лабораторной практике в экспериментах с направленным изменением пространственной организации различных геномных локусов и влиянием на различные процессы в ядре клетки.

Данная работа показывает, что химерный белок, включающий N-концевой домен CTCF и два ближайших цинковых пальца, слитые с dCas9, является точным инструментом для редактирования трехмерной организации генома.

Методология и методы исследования

В работе были использованы современные методы молекулярной и клеточной биологии. Доставка плазмид, кодирующих химерные белки и гидовые РНК, осуществлялась электропорацией на приборе Neon, анализ пространственной организации генома выполнялся методом C-TALE, анализ профилей связывания CTCF и когезина - методами ChIP-seq и ChIP-qPCR, а анализ изменения экспрессии генов локуса - методом RNA-seq (секвенирование тотального транскриптома с обогащением целевыми последовательностями). Анализ данных о пространственной организации локуса производился с использованием программы Juicebox. Биоинформатическая обработка результатов секвенирования проводилась в помощью пакетов Hiclib, bwa, samtools, deepTools, STARRseq и featureCounts. Статистическая обработка тепловых карт контактов производилась с использованием программы LASKA.

Положения, выносимые на защиту

1) Химерный белок, в котором программируемый ДНК-связывающий модуль слит с N-концевым доменом CTCF и двумя первыми цинковыми пальцами этого белка способен индуцировать образование хроматиновой петли между точкой его привлечения на ДНК и соседними эндогенными CBS.

2) Химерный белок из N-концевого домена и двух цинковых пальцев в отличие от более длинных химерных белков не имеет сайтов нецелевого связывания.

3) Формирование петли de novo сопровождается реорганизацией сети петлевых взаимодействий в локусе, но не вызывает активации экспрессии генов и не приводит к заметным изменениям в распределении эпигенетический метки H3K27me3 в районе привлечения петлеобразующего белка.

4) Химерный ДНК-связывающий белок на основе N-концевого домена и 2-х цинковых пальцев белка CTCF может быть использован для коррекции

нарушений в петлевой структуре локуса, возникших в результате утраты эндогенного CBS.

Степень достоверности и апробация результатов

По результатам работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах, индексируемых в Scopus и Web of Science и рекомендованных ВАК Министерства науки и высшего образования РФ:

1) Tiukacheva, E. A., Ulianov, S. V., Karpukhina, A., Razin, S. V., & Vassetzky, Y. 3D genome alterations and editing in pathology. Molecular Therapy 2023, 31(4), 924-933. https://doi.org/10.1016/i.ymthe.2023.02.005.

2) Tiukacheva, E. A.; Luzhin, A. V.; Kruglova, N.; Shtompel, A. S.; Antonov, G.; Tvorogova, A.; Vassetzky, Y.; Ulianov, S. V.; Razin, S. V. Ectopic Recruitment of the CTCF N-Terminal Domain with Two Proximal Zinc-Finger Domains as a Tool for 3D Genome Engineering. International Journal of Molecular Sciences 2025, 26 (15), 7446. https://doi.org/10.3390/iims26157446.

3) Canoy, R. J.; Shmakova, A.; Karpukhina, A.; Lomov, N.; Tiukacheva, E.; Kozhevnikova, Y.; André, F.; Germini, D.; Vassetzky, Y. Specificity of Cancer-Related Chromosomal Translocations Is Linked to Proximity after the DNA Double-Strand Break and Subsequent Selection. NAR Cancer 2023, 5 (3), zcad049. https://doi.org/10.1093/narcan/zcad049.

По результатам работы также получен патент РФ №2836135 "МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ N-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА БЕЛКА CTCF/N- КОНЦЕВОГО ДОМЕНА И ДВУХ БЛИЖАЙШИХ К НЕМУ ДОМЕНОВ ТИПА "ЦИНКОВЫЙ ПАЛЕЦ" БЕЛКА CTCF/N- КОНЦЕВОГО ДОМЕНА И СЕМИ БЛИЖАЙШИХ К НЕМУ ДОМЕНОВ ТИПА "ЦИНКОВЫЙ ПАЛЕЦ" БЕЛКА CTCF, СЛИТЫХ С БЕЛКАМИ DCAS9 И EGFP"

Основные результаты данной работы представлены на российских и международных конференциях:

1) Е.А. Тюкачева, А.В. Лужин, Н.А. Круглова, С.В. Ульянов, Е.С. Васецкий, С.В. Разин. Разработка системы направленного редактирования 3D генома человека. Страницы 204-205. Международная конференция «Хромосома 2023», г. Новосибирск, 5-10 сентября 2023 года.

2) Anna Karpukhina, Evgenia Tuikacheva, Zhenrui Pan, Sergey Ulyanov, Yegor Vassetzky. dCAS-CTCF modifies 3D genome organization and DUX4 expression in FSHD myoblasts. Page 3. 29th annual FSHD society international research congress, 2022.

3) A. Karpukhina, E. Tiukacheva, Z. Pan, S. Ulyanov, Y. Vassetzky - Manipulating the 3D genome organization in human myoblasts. Page 151. 7th International Myology Congress, 2022

4) E. Tiukacheva, S. V. Ulianov, A. Luzhin, N. Kruglova, Y. Vassetzky, S. V. Razin. Recruitment of truncated CTCF modifies 3D structure of HOXD locus. Page 102. 49th FEBS Congress, 2025.

Личный вклад соискателя

Автор внёс определяющий вклад в получение представленных в работе научных данных, их анализ, оформление и интерпретацию. Все эксперименты, представленные в данной работе, выполнены автором лично или при непосредственном его участии. Получение линии К562 с делецией сайта связывания белка CTCF в локусе HOXD проводилась при содействии сотрудников лаборатории UMR9018 (Институт Густава Русси, Франция). Секвенирование по Сэнгеру экспрессионных плазмид для химерных белков и гидовых РНК было выполнено компанией «Евроген», секвенирование на платформе Illumina проводилось компаниями Генетико и BGI, биоинформатический анализ карт C-TALE частично выполнил к.б.н. Лужин А.В. (Институт биологии гена РАН). Автор активно участвовал в написании статей, патентных документов, тезисов и в представлении результатов исследования на научных семинарах и конференциях.

Структура и объём работы

Диссертационная работа состоит из введения, шести глав («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов исследования», «Заключение», «Выводы»), приложения и списка используемых сокращений. Работа изложена на 121 страницах, содержит 30 рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает 148 источников.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. 1. Уровни компактизации генома

Система представлений о том, как уложена ДНК в ядре, претерпевала множественные изменения за весь период ее формирования [12]. Современная картина показывает многоуровневую систему регуляции укладки хроматина, зависящую от белков, участвующих в процессе компактизации ДНК, и связанную с наиболее важными для ядра процессами репликации и транскрипции [13]. Базовая концепция, на которую опираются многие современные исследования, такова, что трехмерная организация генома неразрывно связана с транскрипцией генов [14-17]. Хроматин в ядре разделен на рыхлый, открытый, активно транскрибирующийся эухроматин и плотный, репрессированный гетерохроматин [18]. Наиболее общепринятая концепция о том, как осуществляется взаимосвязь транскрипции и укладки генома - модель ANC-INC (активного и неактивного хроматинового компартмента) [19]. Каждая хромосома в ядре занимает определенную территорию (СТ, chromosome territory), пронизанного сетью каналов интерхроматинового компартмента (IC) так, что каждая СТ представляет совокупность небольших хроматиновых доменов. IC разветвлена в ядре от ядерных пор до ядрышка, имеет полости со спеклами и наполнена негистоновыми белками и транскрипционными факторами [20] (Рис. 1). По сути, такие каналы есть система внутриядерного транспорта, которая нужна для доставки белков-участников транскрипции к нужным генам, перераспределению некодирующих РНК в ядре и выводу к ядерным порам мРНК [20].

Рисунок 1. Схема участка хромосомной территории с активным и неактивным компартментом. INC сформирован плотными хроматиновыми доменами, а ANC - интерхроматиновым компартментом и зоной перихроматина с транскрипционными фабриками; ANC через IC соединен с ядерными порами [19, 20].

Граничащую с интерхроматиновым доменом зону называют перихроматином. Он представляет собой деконденсированный хроматин, обогащенный активно транскрибирующимися генами и регуляторными элементами. В перихроматине собственно и происходит, как предполагается, транскрипция, сплайсинг и репарация ДНК [19, 21]. Соответственно, эти зоны обогащены РНК полимеразой II и эпигенетической меткой Н3К4те3, в то время как глыбки плотного хроматина внутри доменов, лежащие под поверхностью перихроматина, содержащие молчащие гены или "генные пустыни", наоборот обогащены метками Н3К27те3 и Н3К9те3 [22] (Рис. 2).

Рисунок 2. Карта плотности хроматина, окрашенного DAPI и визуализированного с помощью 3Б-81М, с распределением ANC-INC в ядре клетки и обогащением факторами и белками, присущими тому или иному компартменту [20]. Цветовая шкала обозначает интенсивность окрашивания по БАРТ.

Небольшие участки генома предположительно могут выпетливаться из толщи плотного хроматина в перихроматин для активации экспрессии определенных генов [19]. Функционал конкретных участков генома, таким образом, неразрывно связан с трехмерной организацией хроматина и принадлежность к определенной пространственной структуре может опосредовать контакты и активность генов различных областей генома [23]. Эти структуры варьируются по способам обнаружения, функционалу, размерам и стабильности [23, 24].

Самым базовым уровнем укладки хроматина считаются нуклеосомы с линкерной ДНК и вместе образующие структуры вида "бусины на нити" (термин предложен в 1974 году Дональдом и Адой Олинс), ее также называют иногда 10 -нм фибриллой [25]. Поскольку каждая нуклеосома имеет области локального положительного (К-хвосты гистонов) или отрицательного заряда (площадка соединения гистонов Н2А и Н2В), то взаимодействие противоположно заряженных частей разных нуклеосом позволяет формировать динамические структуры более высокого порядка, такие как кладки и нанодомены [26] (Рис. 3). Нуклеосомы компактизованы в кладки по 2-18 шт. Количество кладок сильно отличается даже внутри одного ядра. Кладки с большим количеством нуклеосом и высокой плотностью ДНК представляют собой более плотные структуры, обогащены гистоном Н1 и, предположительно, формируют гетерохроматин [26] Кладки с рыхлой структурой и меньшим количеством нуклеосом, наоборот, составляют эухроматин. Они ассоциированы с РНК полимеразой II, причем слабее всего в центре кладки, а сильнее - на периферии, в 70-80 нм от центра кладки. Предположительно, это связано с концентрацией внутри такой кладки громоздкой транскрипционной машинерии [26, 27]. Множество кладок собираются вместе в т.н. нанодомены. В целом, они распределены по ядру равномерно, но есть некоторое увеличение их концентрации на периферии ядра. Нанодомены могут сильно разниться по количеству нуклеосом внутри себя, поскольку могут содержать неоднородный (гетерогенный) набор кладок [26, 27]. Совокупность множества одинаковых кладок/нанодоменов формируют структуры, на тепловых картах, обозначаемые как А/Б компартменты, по сути, представляющие собой эу -и гетерохроматин. Участки генома, лежащие в компартменте А, обогащены метками активного хроматина Н3К36те3, Н3К27ас и Н3К4те1, богаты генами, имеют высокие уровни экспрессии мРНК и рано реплицируются [28] (Рис. 3). Компартмент В, напротив, содержит поздно реплицирующиеся области, лежащие вблизи ядерной ламины, на периферии ядра и обогащенные метками Н3К9те2, Н3К9те3 и Н3К27те3 [28, 29] (Рис. 3). При этом внутри себя А и Б компартменты

не однородны, и их отдельные части могут иметь специфические характеристики: при более высоком разрешении заметно разделение компартментов А и Б на 6 суб -компартментов, длиной приблизительно по 300 т.п.н.: А1-А2 и В1-В4, различающихся специфичностью гистоновых меток, длиной генов внутри, временем репликации и GC составом [28, 29]. Например, субкомпартмент В1 характеризуется меткой Н3К27те3 и реплицируется в середине S фазы, в то время как субкомпартменты В2 и В3 начинают репликацию в конце S фазы и практически не имеют таких меток. Однако, стоит отметить, что это разделение непостоянно: при объемных перестройках, например, при дифференцировке или инактивации Х-хромосомы, большие части генома могут переходить из одного компартмента в другой, для активации или, наоборот, подавления экспрессии определенных генов [30, 31]. При более высоком разрешении, в каждом компартменте можно увидеть структуры, называемые топологически ассоциированными доменами (ТАДами) длиной от 40 т.п.н. до 3 млн.п.н. [32, 33] (Рис. 3). Функциональной особенностью данных структур является то, что частота контактов локусов внутри ТАДа значительно больше, чем с локусами вне ТАДа. Кроме того, участки генома внутри ТАДа начинают репликацию и транскрипцию примерно в одно и то же время [34]. Границы ТАДов характеризуются такими метками как Н3К4те3, Н3К36те3, и особенно сайтами связывания CTCF (75%) [35]. Эти структуры высококонсервативны и сохраняются как при процессах типа дифференцировки, так и эволюционно (у мышей есть схожесть с человеком в ТАДах примерно на 50%) [35]. Внутри ТАДов, иногда наблюдаются и суб-ТАДы. Эти структуры имеют те же сайты связывания белка CTCF на границах, но более вариабельны между различными клеточными линиями, поскольку, как правило, в них происходит экспрессия специфичных для этой линии клеток генов [36, 37]. При разрешении в 2-5 т.п.н. можно увидеть и более низкий уровень пространственной организации, собственно, хроматиновые петли, примерно по 10-100 т.п.н. длиной (Рис. 3). Петли представляют собой два локуса генома, связанных либо через комплексы белка

CTCF с когезином (большинство дальних взаимодействий), либо через комплекс с белком Медиатором и РНК-полимеразой II (близкие взаимодействия) [38-40].

Рисунок 3. Пространственные структуры генома человека [2].

Следует отметить, что хотя все вышеописанные структуры наблюдаются в клетках человека, эти структуры не являются специфическими именно для нашего генома. Различные формы компактизации генома, похожие на человеческие, наблюдаются во всех царствах живого, хоть и со своими особенностями (например, у почкующихся дрожжей границы ТАДов связывают промотор и терминатор каждого гена) [41]. Исследования пространственной организации генома вирусов и архей также показали наличие ТАДов и компартментоподобных структур [42, 43]. А некоторые из вирусов, такие как, например, вирус гепатита В, имеют сайты связывания CTCF и организуют экспрессию своих генов как в составе человеческого генома, так и в виде эписомы, через CTCF-опосредованные хроматиновые петли [44]. Все это позволяет заключить, что механизмы функциональной укладки ДНК происходят от самых ранних этапов жизни [45].

1.2. Строение белка CTCF и структура его взаимодействия с ДНК.

CTCF считается одним из главных белков у млекопитающих, ответственных за укладку хроматина. Он контролирует возникновение петель и границы ТАДов. Деплеция CTCF нарушает сложившуюся геномную организацию, хотя и не полностью: часть петель сохраняется, поскольку формируется за счет связывания когезина с другими архитектурными белками (YY1 и ZNF143) [46, 47]. У человека, ген Ctcf расположен на 16-й хромосоме, имеет 12 экзонов и кодирует белок длиной 727 аминокислот [48, 49]. CTCF состоит из N-концевого домена, одиннадцати ДНК-связывающих доменов вида цинковый палец (ZF) C2H2 типа, и C-концевого домена [5]. В отличие от центральной части белка, N- и C-концевые домены неструктурированы, и их взаимодействие с ДНК и когезином труднее наблюдать в структурных экспериментах с использованием криоэлектронной микроскопии [7]. Все части CTCF подвергаются различным пост-трансляционным модификациям и взаимодействуют с другими регуляторными факторами и мишенями [50-53]. Несмотря на множество белков-партнеров для взаимодействия, на сегодняшний день главной функцией CTCF считается именно регуляция формирования ТАДов и хроматиновых петель в интерфазном ядре [54]. Для прикрепления к ДНК, CTCF использует домены вида цинковый палец, распознающие специальные мотивы на ДНК. Эти мотивы достаточно вариабельны и их число в геноме разнится от 40000 до 90000 штук [4]. Для формирования хроматиновой петли два таких сайта должны быть конвергентно направлены, а ДНК в них не должна быть метилирована, поскольку данная модификация, как будет описано ниже, препятствует связыванию CTCF [35]. Мотив связывания состоит из четырех модулей [55] (Рис. 4). Первый модуль расположен примерно в 21-22 нуклеотидах от остальных и присутствует не у всех CBS, но его наличие, предположительно, определяет направленность сайта, поскольку в основных модулях (со второго по четвертый) часто присутствуют палиндромы. Второй, третий и четвертый модули образуют последовательность 20 нуклеотидов в длину, из который наиболее консервативная

коровая часть - 15 нуклеотидов. Если первый модуль отсутствует, то для определения направленности сайта обычно ориентируются на 24-й нуклеотид: если это «А», то ориентация прямая («forward»), если «Т», то ориентация обратная («reverse») [55, 56]. С коровым мотивом связываются цинковые пальцы с третьего по седьмой [55, 56].

Рисунок 4. Схема связывания цинковых пальцев белка CTCF с модулями корового мотива [55]. А) Аминокислотный состав цинковых пальцев белка CTCF, Б) Последовательности ДНК распознаваемые четырьмя модулями белка CTCF, В) Схема взаимодействия цинковых пальцев CTCF с ДНК.

Разные исследования дают немного отличающиеся данные о том, какой цинковый палец с какой частью мотива CBS связывается. Возможно, это следствие вариабельности нуклеотидов в CBS, однако общая картина как правило одинакова [6, 55, 57]. Так, было показано, что ZF6-7 взаимодействуют с модулем 2, в особенности важна связь между Arg448 ZF7 с нуклеотидами G22 и A21 и Asp451 ZF7 с С20 соответственно (Рис. 5). ZF6 устанавливает контакты с C23 и A24 через Thr421 и Gln418 соответственно, где А24 - ориентационный нуклеотид. Третий модуль распознается ZF4-5. В частности, ZF5 связывается с нуклеотидами 25-27 и распознает G25, A26 и T26' ('- противоположная цепь) через Arg396, Lys393,

Asp390 и Tyr392 напрямую или водородные связи. G25, наиболее консервативный нуклеотид в модуле 3, образует пару водородных связей с боковой цепью Arg396 (Рис. 5). ZF4 распознает тройку нуклеотидов G28-G29-C30. G28, один из наиболее консервативных нуклеотидов в модуле 3, считывается Arg368 через контакты оснований нуклеотидов. Lys365 образует водородные связи с нуклеотидами G29 и G30', а Glu362 - с C30 (Рис. 5).

Особенную важность представляют цитозины - партнеры Asp451 из ZF7 и Gly362 из ZF4, поскольку именно их метилирование не дает CTCF закрепиться на CBS [6, 55, 57].

ZF3 распознает модуль 4, в частности, Arg339 в ZF3 образует водородные связи с нуклеотидами C30 и G31 (Рис. 5). А ZF9-11 распознают модуль 1. Arg508 из ZF9 и Gln534 из ZF10 образуют контакты с G9' и G6, соответственно. Arg566 из ZF11 образует две водородные связи с основанием нуклеотида G3, который является наиболее консервативным в модуле 1, а также с G4' (Рис. 5).

ZF8 нужен по сути для стабилизации всей конструкции. Он не лежит ни в большой, ни в малой бороздке ДНК, а связывается с фосфатными цепями нуклеотидов 12-17 и не имеет никаких связей с нуклеотидными основаниями CBS [6, 55, 57] (Рис. 5).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Тюкачева Евгения Александровна, 2025 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Lupianez DG, Spielmann M, Mundlos S (2016) Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease. Trends Genet 32:225-237. https://doi.Org/10.1016/j.tig.2016.01.003

2. Tiukacheva EA, Ulianov SV, Karpukhina A, et al (2023) 3D genome alterations and editing in pathology. Mol Ther J Am Soc Gene Ther 31:924-933. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2023.02.005

3. Dekker J, Mirny LA (2024) The chromosome folding problem and how cells solve it. Cell 187:6424-6450. https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.10.026

4. Hansen AS (2020) CTCF as a boundary factor for cohesin-mediated loop extrusion: evidence for a multi-step mechanism. Nucleus 11:132-148. https://doi.org/10.1080/19491034.2020.1782024

5. Klenova EM, Nicolas RH, Paterson HF, et al (1993) CTCF, a conserved nuclear factor required for optimal transcriptional activity of the chicken c-myc gene, is an 11-Zn-finger protein differentially expressed in multiple forms. Mol Cell Biol 13:7612-7624. https://doi.org/10.1128/mcb.13.12.7612-7624.1993

6. Hashimoto H, Wang D, Horton JR, et al (2017) Structural Basis for the Versatile and Methylation-Dependent Binding of CTCF to DNA. Mol Cell 66:711-720.e3. https://doi.org/10.1016/j .molcel .2017.05.004

7. Zhang H, Shi Z, Banigan EJ, et al (2023) CTCF and R-loops are boundaries of cohesin-mediated DNA looping. Mol Cell 83:2856-2871.e8. https://doi.org/10.1016/j .molcel .2023.07.006

8. Willemin A, Lopez-Delisle L, Bolt CC, et al (2021) Induction of a chromatin boundary in vivo upon insertion of a TAD border. PLoS Genet 17:e1009691. https://doi.org/ 10.1371/j ournal .pgen.1009691

9. Samuelson C, Radtke S, Zhu H, et al (2021) Multiplex CRISPR/Cas9 genome editing in hematopoietic stem cells for fetal hemoglobin reinduction generates chromosomal translocations. Mol Ther Methods Clin Dev 23:507-523. https: //doi.org/ 10.1016/j .omtm .2021.10.008

10. Kubo N, Ishii H, Xiong X, et al (2021) Promoter-proximal CTCF binding promotes distal enhancer-dependent gene activation. Nat Struct Mol Biol 28:152-161. https://doi.org/10.1038/s41594-020-00539-5

11. Oh S, Shao J, Mitra J, et al (2021) Enhancer release and retargeting activates disease-susceptibility genes. Nature 595:735-740. https://doi.org/10.1038/s41586-021-03577-1

12. Razin SV, Zhegalova IV, Kantidze OL (2022) Domain Model of Eukaryotic Genome Organization: From DNA Loops Fixed on the Nuclear Matrix to TADs. Biochem Biokhimiia 87:667-680. https://doi.org/10.1134/S0006297922070082

13. Liu S, Athreya A, Lao Z, Zhang B (2024) From nucleosomes to compartments: physicochemical interactions underlying chromatin organization. Annu Rev Biophys 53:221-245. https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-030822-032650

14. Batut PJ, Bing XY, Sisco Z, et al (2022) Genome organization controls

transcriptional dynamics during development. Science 375:566-570. https:// doi.org/10.1126/science.abi7178

15. Zuin J, Roth G, Zhan Y, et al (2022) Nonlinear control of transcription through enhancer-promoter interactions. Nature 604:571-577. https://doi.org/10.1038/s41586-022-04570-y

16. Wang J, Yu H, Ma Q, et al (2021) Phase separation of OCT4 controls TAD reorganization to promote cell fate transitions. Cell Stem Cell 28:1868-1883.e11. https://doi.org/10.1016/j.stem.2021.04.023

17. Ryzhkova A, Battulin N (2021) Genome Reorganization during Erythroid Differentiation. Genes 12:1012. https://doi.org/10.3390/genes12071012

18. Morrison O, Thakur J (2021) Molecular Complexes at Euchromatin, Heterochromatin and Centromeric Chromatin. Int J Mol Sci 22:6922. https://doi.org/10.3390/ijms22136922

19. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments - PubMed. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26028501/. Accessed 9 May 2025

20. Cremer T, Cremer M, Hübner B, et al (2020) The Interchromatin Compartment Participates in the Structural and Functional Organization of the Cell Nucleus. BioEssays News Rev Mol Cell Dev Biol 42:e1900132. https://doi.org/10.1002/bies.201900132

21. Hendzel MJ, Boisvert F-M, Bazett-Jones DP (1999) Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture. Mol Biol Cell 10:2051-2062. https://doi.org/10.1091/mbc.10.6.2051

22. Hübner B, Lomiento M, Mammoli F, et al (2015) Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments. Epigenetics Chromatin 8:47. https://doi.org/10.1186/s13072-015-0038-0

23. Bonev B, Mendelson Cohen N, Szabo Q, et al (2017) Multiscale 3D Genome Rewiring during Mouse Neural Development. Cell 171:557-572.e24. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.09.043

24. Hensel KO, Cantner F, Bangert F, et al (2018) Episomal HBV persistence within transcribed host nuclear chromatin compartments involves HBx. Epigenetics Chromatin 11:34. https://doi.org/10.1186/s13072-018-0204-2

25. Fussner E, Strauss M, Djuric U, et al (2012) Open and closed domains in the mouse genome are configured as 10-nm chromatin fibres. EMBO Rep 13:992-996. https://doi.org/10.1038/embor.2012.139

26. Ricci MA, Manzo C, Garcia-Parajo MF, et al (2015) Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo. Cell 160:1145-1158. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.01.054

27. Castells-Garcia A, Ed-daoui I, Gonzalez-Almela E, et al (2021) Super resolution microscopy reveals how elongating RNA polymerase II and nascent RNA interact with nucleosome clutches. Nucleic Acids Res 50:175-190. https://doi.org/10.1093/nar/gkab1215

28. Lieberman-Aiden E, van Berkum NL, Williams L, et al (2009) Comprehensive mapping of long range interactions reveals folding principles of the human genome. Science 326:289-293. https://doi.org/10.1126/science.1181369

29. Ryba T, Hiratani I, Lu J, et al (2010) Evolutionarily conserved replication timing profiles predict long-range chromatin interactions and distinguish closely related cell types. Genome Res 20:761-770. https://doi.org/10.1101/gr.099655.109

30. Dixon JR, Jung I, Selvaraj S, et al (2015) Chromatin Architecture Reorganization during Stem Cell Differentiation. Nature 518:331-336. https://doi.org/ 10.1038/nature14222

31. Giorgetti L, Lajoie BR, Carter AC, et al (2016) Structural organization of the inactive X chromosome in the mouse. Nature 535:575-579. https://doi.org/10.1038/nature18589

32. Nora EP, Lajoie BR, Schulz EG, et al (2012) Spatial partitioning of the regulatory landscape of the X-inactivation center. Nature 485:381-385. https://doi.org/ 10.1038/nature11049

33. Dixon JR, Selvaraj S, Yue F, et al (2012) Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature 485:376-380. https://doi.org/10.1038/nature11082

34. Pope BD, Ryba T, Dileep V, et al (2014) Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature 515:402-405. https: //doi .org/10.1038/nature13986

35. Rao SSP, Huntley MH, Durand NC, et al (2014) A three-dimensional map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell 159:1665-1680. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.11.021

36. Berlivet S, Paquette D, Dumouchel A, et al (2013) Clustering of tissue-specific sub-TADs accompanies the regulation of HoxA genes in developing limbs. PLoS Genet 9:e1004018. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1004018

37. Cao Y, Liu S, Cui K, et al (2023) Hi-TrAC detects active sub-TADs and reveals internal organizations of super-enhancers. Nucleic Acids Res 51:6172-6189. https://doi.org/10.1093/nar/gkad378

38. Hsieh T-HS, Cattoglio C, Slobodyanyuk E, et al (2020) Resolving the 3D Landscape of Transcription-Linked Mammalian Chromatin Folding. Mol Cell 78:539-553.e8. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.03.002

39. Krietenstein N, Abraham S, Venev SV, et al (2020) Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture. Mol Cell 78:554-565.e7. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.03.003

40. Wang DC, Wang W, Zhang L, Wang X (2019) A tour of 3D genome with a focus on CTCF. Semin Cell Dev Biol 90:4-11. https://doi.org/10.1016/j.semcdb.2018.07.020

41. Eser U, Chandler-Brown D, Ay F, et al (2017) Form and function of topologically associating genomic domains in budding yeast. Proc Natl Acad Sci U S A 114:E3061-E3070. https://doi.org/10.1073/pnas.1612256114

42. Badel C, Samson RY, Bell SD (2022) Chromosome organization affects genome

evolution in Sulfolobus archaea. Nat Microbiol 7:820-830. https://doi.org/10.1038/s41564-022-01127-7

43. Guo M, Yao Z, Jiang C, et al (2023) Three-dimensional and single-cell sequencing of liver cancer reveals comprehensive host-virus interactions in HBV infection. Front Immunol 14:1161522. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1161522

44. Dobrica MO, Varghese CS, Harris JM, et al (2024) CTCF regulates hepatitis B virus cccDNA chromatin topology. J Gen Virol 105:. https://doi.org/10.1099/jgv.0.001939

45. Kim IV, Navarrete C, Grau-Bove X, et al (2025) Chromatin loops are an ancestral hallmark of the animal regulatory genome. Nature 1-9. https://doi.org/10.1038/s41586-025-08960-w

46. Nora EP, Goloborodko A, Valton A-L, et al (2017) Targeted Degradation of CTCF Decouples Local Insulation of Chromosome Domains from Genomic Compartmentalization. Cell 169:930-944.e22. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.05.004

47. Sun X, Zhang J, Cao C (2022) CTCF and Its Partners: Shaper of 3D Genome during Development. Genes 13:1383. https://doi.org/10.3390/genes13081383

48. Rakha EA, Pinder SE, Paish CE, Ellis IO (2004) Expression of the transcription factor CTCF in invasive breast cancer: a candidate gene located at 16q22.1. Br J Cancer 91:1591-1596. https://doi.org/10.1038/sj.bjc.6602144

49. Quitschke WW, Taheny MJ, Fochtmann LJ, Vostrov AA (2000) Differential effect of zinc finger deletions on the binding of CTCF to the promoter of the amyloid precursor protein gene. Nucleic Acids Res 28:3370-3378. https://doi.org/10.1093/nar/28.17.3370

50. Arzate-Mejia RG, Recillas-Targa F, Corces VG (2018) Developing in 3D: the role of CTCF in cell differentiation. Dev Camb Engl 145:dev137729. https://doi.org/10.1242/dev.137729

51. Tang X, Zeng P, Liu K, et al (2024) The PTM profiling of CTCF reveals the regulation of 3D chromatin structure by O-GlcNAcylation. Nat Commun 15:2813. https://doi.org/10.1038/s41467-024-47048-3

52. Del Rosario BC, Kriz AJ, Del Rosario AM, et al Exploration of CTCF posttranslation modifications uncovers Serine-224 phosphorylation by PLK1 at pericentric regions during the G2/M transition. eLife 8:e42341. https://doi.org/10.7554/eLife.42341

53. Pavlaki I, Docquier F, Chernukhin I, et al (2018) Poly(ADP-ribosyl)ation associated changes in CTCF-chromatin binding and gene expression in breast cells. Biochim Biophys Acta 1861:718-730. https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2018.06.010

54. Pugacheva EM, Kubo N, Loukinov D, et al (2020) CTCF mediates chromatin looping via N-terminal domain-dependent cohesin retention. Proc Natl Acad Sci U S A 117:2020-2031. https://doi.org/10.1073/pnas.1911708117

55. Yin M, Wang J, Wang M, et al (2017) Molecular mechanism of directional CTCF recognition of a diverse range of genomic sites. Cell Res 27:1365-1377. https://doi.org/10.1038/cr.2017.131

56. Wu Q, Liu P, Wang L (2020) Many facades of CTCF unified by its coding for three-dimensional genome architecture. J Genet Genomics 47:407-424. https://doi.org/10.1016/jjgg.2020.06.008

57. Yang J, Horton JR, Liu B, et al (2023) Structures of CTCF-DNA complexes including all 11 zinc fingers. Nucleic Acids Res 51:8447-8462. https://doi.org/10.1093/nar/gkad594

58. Liu L, Tang Y, Zhang Y, Wu Q (2024) A negatively charged region within carboxy-terminal domain maintains proper CTCF DNA binding. iScience 27:111452. https://doi.org/10.1016/j.isci.2024.111452

59. Huber J, Tanasie N-L, Zernia S, Stigler J (2024) Single-molecule imaging reveals a direct role of CTCF's zinc fingers in SA interaction and cluster-dependent RNA recruitment. Nucleic Acids Res 52:6490-6506. https://doi.org/10.1093/nar/gkae391

60. Saldana-Meyer R, Rodriguez-Hernaez J, Escobar T, et al (2019) RNA Interactions Are Essential for CTCF-Mediated Genome Organization. Mol Cell 76:412-422.e5. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.08.015

61. Li Y, Haarhuis JHI, Cacciatore AS, et al (2020) The structural basis for cohesin-CTCF anchored loops. Nature 578:472-476. https://doi.org/10.1038/s41586-019-1910-z

62. Rao SSP, Huang S-C, Glenn St Hilaire B, et al (2017) Cohesin Loss Eliminates All Loop Domains. Cell 171:305-320.e24. https://doi.org/10.1016/j.cell.2017.09.026

63. Samejima K, Gibcus JH, Abraham S, et al (2025) Rules of engagement for condensins and cohesins guide mitotic chromosome formation. Science 388:eadq1709. https://doi.org/10.1126/science.adq1709

64. Gruber S, Arumugam P, Katou Y, et al (2006) Evidence that Loading of Cohesin Onto Chromosomes Involves Opening of Its SMC Hinge. Cell 127:523-537. https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.08.048

65. Alonso-Gil D, Cuadrado A, Gimenez-Llorente D, et al (2023) Different NIPBL requirements of cohesin-STAG1 and cohesin-STAG2. Nat Commun 14:1326. https://doi.org/10.1038/s41467-023-36900-7

66. Alonso-Gil D, Losada A (2023) NIPBL and cohesin: new take on a classic tale. Trends Cell Biol 33:860-871. https://doi.org/10.1016/j.tcb.2023.03.006

67. Shi Z, Gao H, Bai X-C, Yu H (2020) Cryo-EM structure of the human cohesin-NIPBL-DNA complex. Science 368:1454-1459. https://doi.org/10.1126/science.abb0981

68. Liu NQ, Maresca M, van den Brand T, et al (2021) WAPL maintains a cohesin loading cycle to preserve cell-type-specific distal gene regulation. Nat Genet 53:100-109. https://doi.org/10.1038/s41588-020-00744-4

69. Yuan X, Yan L, Chen Q, et al (2024) Molecular mechanism and functional significance of Wapl interaction with the Cohesin complex. Proc Natl Acad Sci 121:e2405177121. https://doi.org/10.1073/pnas.2405177121

70. Lupey-Green LN, Caruso LB, Madzo J, et al (2018) PARP1 Stabilizes CTCF Binding and Chromatin Structure To Maintain Epstein-Barr Virus Latency Type. J Virol 92:e00755-18. https://doi.org/10.1128/JVI.00755-18

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

Farrar D, Rai S, Chernukhin I, et al (2010) Mutational analysis of the poly(ADP-ribosyl)ation sites of the transcription factor CTCF provides an insight into the mechanism of its regulation by poly(ADP-ribosyl)ation. Mol Cell Biol 30:11991216. https://doi.org/10.1128/MCB.00827-09

Wutz G, Várnai C, Nagasaka K, et al (2017) Topologically associating domains and chromatin loops depend on cohesin and are regulated by CTCF, WAPL, and PDS5 proteins. EMBO J 36:3573-3599. https://doi.org/10.15252/embj.201798004 Filippova GN, Fagerlie S, Klenova EM, et al (1996) An exceptionally conserved transcriptional repressor, CTCF, employs different combinations of zinc fingers to bind diverged promoter sequences of avian and mammalian c-myc oncogenes. Mol Cell Biol 16:2802-2813. https://doi.org/10.1128/mcb.16.6.2802 Bell AC, West AG, Felsenfeld G (1999) The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators. Cell 98:387-396. https://doi.org/10.1016/s0092-8674(00)81967-4

Braccioli L, de Wit E (2019) CTCF: a Swiss-army knife for genome organization and transcription regulation. Essays Biochem 63:157-165. https://doi.org/10.1042/EBC20180069

Ortabozkoyun H, Huang P-Y, Gonzalez-Buendia E, et al (2024) Members of an

array of zinc-finger proteins specify distinct Hox chromatin boundaries. Mol Cell

84:3406-3422.e6. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2024.08.007

Klenova EM, Fagerlie S, Filippova GN, et al (1998) Characterization of the Chicken

CTCF Genomic Locus, and Initial Study of the Cell Cycle-regulated Promoter of

the Gene*. J Biol Chem 273:26571-26579.

https://doi.org/10.1074/jbc.273.41.26571

Peña-Hernández R, Marques M, Hilmi K, et al (2015) Genome-wide targeting of the epigenetic regulatory protein CTCF to gene promoters by the transcription factor TFII-I. Proc Natl Acad Sci U S A 112:E677-686. https://doi.org/10.1073/pnas.1416674112

Shukla S, Kavak E, Gregory M, et al (2011) CTCF-promoted RNA polymerase II pausing links DNA methylation to splicing. Nature 479:74-79. https://doi.org/ 10.1038/nature10442

Kung JT, Kesner B, An JY, et al (2015) Locus-Specific Targeting to the X Chromosome Revealed by the RNA Interactome of CTCF. Mol Cell 57:361-375. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2014.12.006

Xiao T, Wongtrakoongate P, Trainor C, Felsenfeld G (2015) CTCF Recruits Centromeric Protein CENP-E to the Pericentromeric/Centromeric Regions of Chromosomes through Unusual CTCF-Binding Sites. Cell Rep 12:1704-1714. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.08.005

El-Kady A, Klenova E (2005) Regulation of the transcription factor, CTCF, by phosphorylation with protein kinase CK2. FEBS Lett 579:1424-1434. https://doi.org/10.1016/j .febslet.2005.01.044

Gong S, Hu G, Guo R, et al (2022) CTCF acetylation at lysine 20 is required for the early cardiac mesoderm differentiation of embryonic stem cells. Cell Regen Lond

Engl 11:34. https://doi.org/10.1186/s13619-022-00131-w

84. MacPherson MJ, Beatty LG, Zhou W, et al (2009) The CTCF insulator protein is posttranslationally modified by SUMO. Mol Cell Biol 29:714-725. https://doi.org/10.1128/MCB.00825-08

85. Li J, Huang K, Hu G, et al (2019) An alternative CTCF isoform antagonizes canonical CTCF occupancy and changes chromatin architecture to promote apoptosis. Nat Commun 10:1535. https://doi.org/10.1038/s41467-019-08949-w

86. Wang H-LV, Corces VG (2021) Is developmental synchrony enabled by CTCF residence time? Dev Cell 56:2545-2546. https://doi.org/10.1016/j.devcel.2021.09.003

87. Meier M, Grant J, Dowdle A, et al (2018) Cohesin facilitates zygotic genome activation in zebrafish. Dev Camb Engl 145:dev156521. https://doi.org/10.1242/dev.156521

88. Moore JM, Rabaia NA, Smith LE, et al (2012) Loss of maternal CTCF is associated with peri-implantation lethality of Ctcf null embryos. PloS One 7:e34915. https://doi.org/ 10.1371/j ournal .pone.0034915

89. Min H, Kim H-P, Shin J-O (2019) Depletion of CTCF induces craniofacial malformations in mouse embryos. Am J Transl Res 11:6102-6109

90. Hirayama T, Tarusawa E, Yoshimura Y, et al (2012) CTCF is required for neural development and stochastic expression of clustered Pcdh genes in neurons. Cell Rep 2:345-357. https://doi.org/10.1016Zj.celrep.2012.06.014

91. Hori I, Kawamura R, Nakabayashi K, et al (2017) CTCF deletion syndrome: clinical features and epigenetic delineation. J Med Genet 54:836-842. https://doi.org/10.1136/jmedgenet-2017-104854

92. Gregor A, Oti M, Kouwenhoven EN, et al (2013) De novo mutations in the genome organizer CTCF cause intellectual disability. Am J Hum Genet 93:124-131. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2013.05.007

93. Sudmant PH, Rausch T, Gardner EJ, et al (2015) An integrated map of structural variation in 2,504 human genomes. Nature 526:75-81. https://doi.org/10.1038/nature15394

94. Hnisz D, Weintraub AS, Day DS, et al (2016) Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science 351:1454-1458. https://doi.org/10.1126/science.aad9024

95. Giorgio E, Robyr D, Spielmann M, et al (2015) A large genomic deletion leads to enhancer adoption by the lamin B1 gene: a second path to autosomal dominant adult-onset demyelinating leukodystrophy (ADLD). Hum Mol Genet 24:31433154. https://doi.org/10.1093/hmg/ddv065

96. Flöttmann R, Wagner J, Kobus K, et al (2015) Microdeletions on 6p22.3 are associated with mesomelic dysplasia Savarirayan type. J Med Genet 52:476-483. https://doi.org/10.1136/jmedgenet-2015-103108

97. Kragesteen BK, Brancati F, Digilio MC, et al (2019) H2AFY promoter deletion causes PITX1 endoactivation and Liebenberg syndrome. J Med Genet 56:246-251. https://doi.org/10.1136/jmedgenet-2018-105793

98. Kragesteen BK, Spielmann M, Paliou C, et al (2018) Dynamic 3D Chromatin Architecture Contributes to Enhancer Specificity and Limb Morphogenesis. Nat Genet 50:1463-1473. https://doi.org/10.1038/s41588-018-0221-x

99. Franke M, Ibrahim DM, Andrey G, et al (2016) Formation of new chromatin domains determines pathogenicity of genomic duplications. Nature 538:265-269. https://doi.org/10.1038/nature19800

100. Melo US, Schöpflin R, Acuna-Hidalgo R, et al (2020) Hi-C Identifies Complex Genomic Rearrangements and TAD-Shuffling in Developmental Diseases. Am J Hum Genet 106:872-884. https://doi.org/10.1016Zj.ajhg.2020.04.016

101. Laugsch M, Bartusel M, Rehimi R, et al (2019) Modeling the Pathological LongRange Regulatory Effects of Human Structural Variation with Patient-Specific hiPSCs. Cell Stem Cell 24:736-752.e12. https://doi.org/10.1016/j.stem.2019.03.004

102. de Bruijn SE, Fiorentino A, Ottaviani D, et al (2020) Structural Variants Create New Topological-Associated Domains and Ectopic Retinal Enhancer-Gene Contact in Dominant Retinitis Pigmentosa. Am J Hum Genet 107:802-814. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2020.09.002

103. Lupiáñez DG, Kraft K, Heinrich V, et al (2015) Disruptions of Topological Chromatin Domains Cause Pathogenic Rewiring of Gene-Enhancer Interactions. Cell 161:1012-1025. https://doi.org/10.1016/j.cell.2015.04.004

104. Northcott PA, Lee C, Zichner T, et al (2014) Enhancer hijacking activates GFI1 family oncogenes in medulloblastoma. Nature 511:428-434. https://doi.org/10.1038/nature13379

105. Lee Y, Park S-H, Lee H (2024) Prediction of the 3D cancer genome from whole-genome sequencing using InfoHiC. Mol Syst Biol 20:1156-1172. https://doi.org/10.1038/s44320-024-00065-2

106. Li Y, Ma C, Li S, et al (2022) Regulatory Variant rs2535629 in ITIH3 Intron Confers Schizophrenia Risk By Regulating CTCF Binding and SFMBT1 Expression. Adv Sci 9:2104786. https://doi.org/10.1002/advs.202104786

107. Miguel-Escalada I, Bonás-Guarch S, Cebola I, et al (2019) Human pancreatic islet 3D chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nat Genet 51:1137-1148. https://doi.org/10.1038/s41588-019-0457-0

108. Lyssenko V, Lupi R, Marchetti P, et al (2007) Mechanisms by which common variants in the TCF7L2 gene increase risk of type 2 diabetes. J Clin Invest 117:2155-2163. https://doi.org/10.1172/JCI30706

109. Ibrahim DM, Mundlos S (2020) Three-dimensional chromatin in disease: What holds us together and what drives us apart? Curr Opin Cell Biol 64:1 -9. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2020.01.003

110. Sun JH, Zhou L, Emerson DJ, et al (2018) Disease-associated short tandem repeats co-localize with chromatin domain boundaries. Cell 175:224-238.e15. https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.08.005

111. Zhang Y, Li T, Preissl S, et al (2019) Transcriptionally Active HERV-H Retrotransposons Demarcate Topologically Associating Domains in Human Pluripotent Stem Cells. Nat Genet 51:1380-1388. https://doi.org/10.1038/s41588-

112

113

114

115

116

117

118

119

120

121

122

123

124

125

019-0479-7

Melamed A, Yaguchi H, Miura M, et al The human leukemia virus HTLV-1 alters the structure and transcription of host chromatin in cis. eLife 7:e36245. https://doi.org/10.7554/eLife.36245

Bellefroid M, Rodari A, Galais M, et al (2022) Role of the cellular factor CTCF in the regulation of bovine leukemia virus latency and three-dimensional chromatin organization. Nucleic Acids Res 50:3190-3202.

https://doi.org/10.1093/nar/gkac 107

Flavahan WA, Drier Y, Liau BB, et al (2016) Insulator dysfunction and oncogene activation in IDH mutant gliomas. Nature 529:110-114. https://doi.org/ 10.1038/nature16490

Vaillancourt K, Yang J, Chen GG, et al (2021) Cocaine-related DNA methylation in caudate neurons alters 3D chromatin structure of the IRXA gene cluster. Mol Psychiatry 26:3134-3151. https://doi.org/10.1038/s41380-020-00909-x Kloetgen A, Thandapani P, Ntziachristos P, et al (2020) Three-dimensional chromatin landscapes in T cell acute lymphoblastic leukemia. Nat Genet 52:388400. https://doi.org/10.1038/s41588-020-0602-9

Oh HJ, Aguilar R, Kesner B, et al (2021) Jpx RNA regulates CTCF anchor site selection and formation of chromosome loops. Cell 184:6157-6173.e24. https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.11.012

Redin C, Brand H, Collins RL, et al (2017) The Genomic Landscape of Balanced Cytogenetic Abnormalities Associated with Human Congenital Anomalies. Nat Genet 49:36-45. https://doi.org/10.1038/ng.3720

Akdemir KC, Le VT, Chandran S, et al (2020) Disruption of chromatin folding domains by somatic genomic rearrangements in human cancer. Nat Genet 52:294305. https://doi.org/10.1038/s41588-019-0564-y

van Ruiten MS, Rowland BD (2021) On the choreography of genome folding: A grand pas de deux of cohesin and CTCF. Curr Opin Cell Biol 70:84-90. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2020.12.001

Narendra V, Bulajic M, Dekker J, et al (2016) CTCF -mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation. Genes Dev 30:2657-2662. https://doi.org/10.1101/gad.288324.116

Gong W, Liu Y, Qu H, et al (2019) The effect of CTCF binding sites destruction by CRISPR/Cas9 on transcription of metallothionein gene family in liver hepatocellular carcinoma. Biochem Biophys Res Commun 510:530-538. https://doi.org/10.1016/j .bbrc.2019.01.107

Liu XS, Wu H, Ji X, et al (2016) Editing DNA methylation in the mammalian genome. Cell 167:233-247.e17. https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.08.056 Tarjan DR, Flavahan WA, Bernstein BE (2019) Epigenome editing strategies for the functional annotation of CTCF insulators. Nat Commun 10:4258. https://doi.org/10.1038/s41467-019-12166-w

Kantidze OL, Luzhin AV, Nizovtseva EV, et al (2019) The anti-cancer drugs curaxins target spatial genome organization. Nat Commun 10:1441.

https://doi.org/10.1038/s41467-019-09500-7

126. Xu J, Song F, Lyu H, et al (2022) Subtype-specific 3D genome alteration in acute myeloid leukemia. Nature 611:387-398. https://doi.org/10.1038/s41586-022-05365-x

127. Tsujikawa LM, Kharenko OA, Stotz SC, et al (2022) Breaking boundaries: Pan BETi disrupt 3D chromatin structure, BD2-selective BETi are strictly epigenetic transcriptional regulators. Biomed Pharmacother Biomedecine Pharmacother 152:113230. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2022.113230

128. Chen H-S, De Leo A, Wang Z, et al (2017) BET-Inhibitors Disrupt Rad21-Dependent Conformational Control of KSHV Latency. PLoS Pathog 13:e1006100. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006100

129. Miyata K, Imai Y, Hori S, et al (2021) Pericentromeric noncoding RNA changes DNA binding of CTCF and inflammatory gene expression in senescence and cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 118:e2025647118. https://doi.org/10.1073/pnas.2025647118

130. Dahlqvist J, Fulco CP, Ray JP, et al (2021) Systematic identification of genomic elements that regulate FCGR2A expression and harbor variants linked with autoimmune disease. Hum Mol Genet 31:1946-1961. https://doi.org/10.1093/hmg/ddab372

131. Ushiki A, Zhang Y, Xiong C, et al (2021) Deletion of CTCF sites in the SHH locus alters enhancer-promoter interactions and leads to acheiropodia. Nat Commun 12:2282. https://doi.org/10.1038/s41467-021-22470-z

132. Guo YA, Chang MM, Huang W, et al (2018) Mutation hotspots at CTCF binding sites coupled to chromosomal instability in gastrointestinal cancers. Nat Commun 9:1520. https://doi.org/10.1038/s41467-018-03828-2

133. Xu Q, Chen M-Y, He C-Y, et al (2013) Promoter polymorphisms in trefoil factor 2 and trefoil factor 3 genes and susceptibility to gastric cancer and atrophic gastritis among Chinese population. Gene 529:104-112. https://doi.org/10.1016/j.gene.2013.07.070

134. Duan J, Bao C, Xie Y, et al (2021) Targeted core-shell nanoparticles for precise CTCF gene insert in treatment of metastatic breast cancer. Bioact Mater 11:1 -14. https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.10.007

135. Deng W, Rupon JW, Krivega I, et al (2014) Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping. Cell 158:849-860. https://doi.org/10.1016/j.cell.2014.05.050

136. Morgan SL, Mariano NC, Bermudez A, et al (2017) Manipulation of nuclear architecture through CRISPR-mediated chromosomal looping. Nat Commun 8:15993. https://doi .org/ 10.1038/ncomms15993

137. Kim JH, Rege M, Valeri J, et al (2019) LADL: Light-activated dynamic looping for endogenous gene expression control. Nat Methods 16:633-639. https://doi.org/10.1038/s41592-019-0436-5

138. Rasko JE, Klenova EM, Leon J, et al (2001) Cell growth inhibition by the multifunctional multivalent zinc-finger factor CTCF. Cancer Res 61:6002-6007

139. Wei C, Chen G, Chen K, et al (2024) Immune alterations and overexpression of CTCF in endometrial carcinoma: insights from molecular subtyping. Cancer Cell Int 24:392. https://doi.org/10.1186/s12935-024-03576-y

140. Liu Y, Qi W, Yin J, et al (2023) High CTCF expression mediated by FGD5-AS1/miR-19a-3p axis is associated with immunosuppression and pancreatic cancer progression. Heliyon 9:e22584. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2023.e22584

141. Germini D, Saada YB, Tsfasman T, et al (2017) A One-Step PCR-Based Assay to Evaluate the Efficiency and Precision of Genomic DNA-Editing Tools. Mol Ther Methods Clin Dev 5:43-50. https://doi.org/10.1016/j.omtm.2017.03.001

142. Luzhin AV, Golov AK, Gavrilov AA, et al (2021) LASCA: loop and significant contact annotation pipeline. Sci Rep 11:6361. https://doi.org/10.1038/s41598-021-85970-4

143. Amândio AR, Beccari L, Lopez-Delisle L, et al (2021) Sequential in cis mutagenesis in vivo reveals various functions for CTCF sites at the mouse HoxD cluster. Genes Dev 35:1490-1509. https://doi.org/10.1101/gad.348934.121

144. Karagiannis TC, Wall M, Ververis K, et al (2023) Characterization of K562 cells: uncovering novel chromosomes, assessing transferrin receptor expression, and probing pharmacological therapies. Cell Mol Life Sci CMLS 80:248. https://doi.org/10.1007/s00018-023-04905-6

145. Chernukhin I, Shamsuddin S, Kang SY, et al (2007) CTCF interacts with and recruits the largest subunit of RNA polymerase II to CTCF target sites genome-wide. Mol Cell Biol 27:1631-1648. https://doi.org/10.1128/MCB.01993-06

146. Delamarre A, Barthe A, de la Roche Saint-André C, et al (2020) MRX Increases Chromatin Accessibility at Stalled Replication Forks to Promote Nascent DNA Resection and Cohesin Loading. Mol Cell 77:395-410.e3. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.10.029

147. Song Y, Liang Z, Zhang J, et al (2022) CTCF functions as an insulator for somatic genes and a chromatin remodeler for pluripotency genes during reprogramming. Cell Rep 39:110626. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110626

148. Klenova EM, Chernukhin IV, El-Kady A, et al (2001) Functional phosphorylation sites in the C-terminal region of the multivalent multifunctional transcriptional factor CTCF. Mol Cell Biol 21:2221-2234. https://doi.org/10.1128/MCB.2L6.2221-2234.2001