Молекулярно-биологические аспекты создания укороченных форм цитохрома Р450 2В4 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Прозоровский, Тимур Владимирович

• Прозоровский, Тимур Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2001

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Прозоровский, Тимур Владимирович

б.ВЫВОДЫ

1. Были созданы методами генетической инженерии химерные конструкции цитохрома Р450 2В4 с глутатион-Б-трансферазой, которые содержали встроенные в N-концевую аминокислотную последовательность протеолитические сайты для фактора Ха и тромбина: ГЗТ- (Д2-27)2В4Ха, ГБТ-(А2-27)2B4gXa(his)6, TST-(A2-27)2B4Th(his)б, TST-2E1:2B4(his)б. Указанные конструкции были экспрессированы в Escherichia coli.

2. Обнаружено, что при гетерологической экспрессии химерных конструкций 2В4 в Escherichia coli рекомбинантный белок образует прочный комплекс с молекулярными шаперонами DnaK и GroEL, что указывает, вероятно, на нарушие локального фолдинга доменов, составляющих химерный белок.

3. Диссоциация комплекса цитохрома Р450 2В4 с молекулярными шаперонами DnaK и GroEL происходит при расщеплении пептидной связи в линкерной последовательности между FST доменом и 2В4 (при протеолизе с фактором Ха или тромбином), а также при ограниченном протеолизе в PPGP мотиве с IgA эндопротеиназой.

4 . Установленно сайты узнавания фактором Ха и тромбином (позиция 4 6-4 9) являются доступными для действия протеиназ, что указывает на специфичность его структурной организации.

5. Получена укороченная форма цитохрома (1-3 4) 2В4 за счет проведения ограниченного протеолиза с IgA эндопротеиназой, узнающей нативную последовательность PPGP (31-34). Укороченный цитохром (1-34) 2В4 находится в олигомерном состоянии, соответствующем, вероятно, тетрамеру. Полученный белок представляет интерес для изучения его каталитических свойств и расшифровки пространственной структуры.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе впервые была показана возможность получения укороченной формы цитохрома Р450 2В4, лишенного 33 N-концевых аминокислотных остатка. Ограниченный протеолиз был выполнен с IgA эндопротеиназой, узнающей специфическую последовательность РРХР (где X соответствует аминокислотным остаткам аланина, серина, треонина или глицина). Интересно, что PPGP район присутствует во многих микросомальных формах цитохрома Р450 в составе PPGPXPXXG мотива и играет важнейшую роль в процессе фолдинга белка (Yamazaki S. et al., 1993) . Полученный белок представляет интерес для изучения его каталитических свойств и расшифровки пространственной структуры. Предварительный анализ показал, что белок находится в олиго-мерном состоянии, соответствующем преимущественно тетрамеру.

Попытка получения белка с более укороченным N-концевым сегментом оказалась неудачной. Выбранный район 4 6-4 9 в Р450 2В4 является устойчивым к действию специфических протеиназ. Даже после удаления TST домена и ассоциированных с химерным белком молекулярных шаперонов, которые могли бы блокировать доступ к данному району, ограниченный протеолиз носит неспецифический характер и протекает не во встроенных сайтах для расщепления протеолитическими ферментами: фактором Ха и тромбином.

Также было обнаружено, что встраивание протеолитического сайта для тромбина (MYPRGN) в N-концевую аминокислотную последовательность играет критическую роль в экспрессии белка. Выделение этих форм цитохрома (EST-(Д2-27)2В4(Th) (his)6 и TST-2E1:2В4(his)6) в виде холоэнзимов не привело к успеху.

Результаты, полученные в настоящей работе, говорят о том, что ассоциация молекулярных шаперонов GroEL/DnaK с химерным белком происходит, вероятно, из-за локального нарушения структуры 2В4 в районе соединения с глутатион-Б-трансферазой, либо локального нарушения структуры в С-концевом районе глутатион-Б-трансферазы. Это подтверждается результатами о том, что диссоциация комплекса происходит после проведения ограниченного протеолиза в районе соединения двух белков .

Структурные элементы или мотивы, являющиеся недоступными для СгоЕЬ/БпаК в нативной молекуле ГБТ и/или Р450 2В4, при химеризации этих двух белков распознаются шаперонами и являются ответственными за образование комплексов. Искусственное сближение двух различных белковых структур (в данном случае глутатион-З-трансферазы и цитохрома Р450 2В4) за счет соединения пептидной связью, осуществленное при помощи генной инженерии, вероятно, приводит к нарушению фолдинга белковых структур в районе «вынужденного» взаимодействия. Накопленные сведения дают основание полагать, что данная проблема является общей для белков, экспрессируемых в системе с глутатион-Б-трансферазой (ТЬа1п А. е! а1., 1996; КоИтап М. е! а1. , 2000).

При разделении ГЭТ и Р450 2В4 происходит восстановление целостности структур этих белков, возможно, благодаря тем же СгоЕЪ/БпаК, после чего комплекс диссоциирует. Интересно, что непосредственное участие шаперонина СгоЕЬ в формировании фолдинга другой формы цитохрома млекопитающих, Р450 ЗА7, недавно было подтверждено в работе 1поие Е. еЬ а1. (2000) .

Полученные в настоящей работе результаты указывают на возможное участие ОпаК-СгрЕ-БпаJ и СгоЕЪ-СгоЕБ систем шаперонов в экспрессии химерной молекулы цитохрома Р4 5 0 2В4 с глутатион-Б-трансферазой. Таким образом, ко-экспрессия этих систем шаперонов с химерной молекулой цитохрома 2В4 возможно будет способствовать увеличению уровня экспрессии функционально активного фермента, как это было показано при гетерологической экспрессии Р450 ЗА7 с СгоБЬ-СгоЕБ в работе Тпоие Е. ЕЬ а1. (2000) .

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Прозоровский, Тимур Владимирович, 2001 год

1. Amarneh B., Simpson E.R. Expression of a recombinant derivative of human aromatase P450 in insect cells utilising the baculovirus vector // Mol. Cell. Endocrinol.-1995.- V.109.- R.l-5.

2. Argos, P., Mathews F.S. Microsomal cytochromes b5 and P450 during induction of aryl hydrocarbon hydroxylase activity in mammalian cell culture // J. Biol. Chem.- 1975.- V.250.1. P.747-751.

3. Barnes H.J., Arlotto M.P. and Waterman M.R. Expression and enzymatic activity of recombinant cytochrome P450 17 alpha-hydroxilase in Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci.-1991.- V.88.- P.5597-5561.

4. Barnes H.J. Maximising Expression of Eucaryotic Cytochrome P450s in Escherichia coli. in Eucaryotic cytochrome P450s in E.coli // Methods, in Enzymology.- 1995.- V.I.- P.3-13.

5. Bar-Nun S., Kreibich G., Adesnik M., Alterman L., Negishi M., Sabatini D.D. Synthesis and insertion of cytochrome P450 into endoplasmic reticulum membranes // Proc. Natl. Acad. Sci.- 1980.- V.77.- P. 965-969.

6. Black S.D., Coon M.J. Structural features of liver microsomal NADPH-cytochrome-P450 reductase. Hydrophobic domain, hydrophilic domain, and connecting region // J. Biol. Chem.- 1982,- V.257.- P. 5929-5938.

7. Black S.D. and Coon M.G. Coexpression of genetically engineered fused enzyme between yeast NADPH-P450 reductaseand human cytochrome P450 3A4 and human cytochrome b5 in yeast // FASEB. J.- 1982,- V.6.- 680-685.

8. Bridges A., Gruenke L., Chang Y.-T., Vakser I.A., Loew G., Waskell 1. Identification of the binding site on cytochrome P450 2B4 for Cytochrome b5 and cytochrome P450-reductase // J. Biol. Chem.-1998.- V.273- P.17036-17049 .

9. Brown C.A. and Black S.D. Membrane topology of mammalian cytochromes P-450 from liver endoplasmic reticulum. Determination by trypsinolysis of phenobarbital-treated microsomes // J. Biol. Chem. -1989.- ¥.264.- P.4442-4449.

10. Buchberger A., Schroder H., Hestercamp T., Schonfeld H.-J., Bukau B. Substrate shuttling between the DnaK and GroEL systems indicates a chaperone network promoting protein folding // J. Mol. Biol.- 1996.- V.261.- P.328-333.

11. Bukau B., Hotwich A.L // The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines // Cell.- 1998.- V.92- P.351-366.

12. Chen W., Peter R.M, McArdle S., Thummel K.E., Sigle R.O., Nelson S.D. Baculovirus expression and purification of human and rat cytochrome P450 2E1 // Arch. Biochem. Biophys.- 1996.- V.335.- P.123-130.

13. Clark B.J., Waterman M.R. The hydrophobic amino-terminal sequence of bovine 17 alpha-hydroxylase is required for theexpression of a functional hemoprotein in COS 1 cells // J. Biol. Chem.- 1991.- V.25.- P.5898-5904.

14. Coon M.J., Ding X.X., Pernecky S.J., Vaz A.D. Cytochrome P450: progress and predictions // FASEB. J.- 1992.- V.6.-P.669-673 .

15. Cosrrie J., Johnson E.F. Engineering microsomal cytochrome P450 2C5 to be a soluble, monomeric Enzyme // J. Biol. Chem.- 2000.- V.275.- P.2545-2553.

16. Crouy-Chanel A., Kohiyama M. , Richarme G. Interaction of DnaK with native proteins and membrane proteins correlates with their accessible hydrophobicity // Gene.- 1999.-V.230.- P.163-170.

17. Cullin C. Two distinct sequences control the targeting and anchoring of the mouse P450 1A1 into the yeast endoplasmic reticulum membrane // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1992.- V.184- P.1490-1495.

18. Dean W.L, Gray R.D. Relationship between state of aggregation and catalytic activity for cytochrome P-450LM2 and NADPH-cytochrome P-450 reductase // J. Biol. Chem.-1982.- V.25.- P.14679-14685.

19. Durley R.C.E., Mathews F.S. Enzymatic and electron transfer activities in crystalline protein complexes // Acta. Crystallogr.- 1996.- V. D.52.- P.65-76.

20. Estabrook R.W., Shet M.S., Fisher C.W., Jenkins C.M., Waterman M.R. The interaction of NADPH-P450 reductase with P450: an electrochemical study of the role of the flavinmononucleotide-binding domain // Arch. Biochem. Biophys -1996.- V.333.- P.308-315.

21. Ewalt K.L., Hendrick J.P., Houry W.A., Hartl F.U. In vivo observation of polypeptide flux through the bacterial chaperonin system // Cell.- 1997- V.90.- P.491-500.

22. Faulkner K.M., Shet M.S., Fisher C.W., Estabrook R.W. Electrocatalytically driven omega-hydroxylation of fatty acid using cytochrome P450 4A1 // Proc. Natl. Acad. Sci.-1995,- V. 92.- P.7705-7709.

23. Fenton W.A., Kashi Y., Furtak K., and Horwich A.L. Residues in the chaperonin GroEL required for polypeptide binding and release // Nature.- 1994,- V.371- P.614-619.

24. Fisher C.W., Caudle D.L., Martin-Wixtrom C., Waterman M.R., Estabrook R.W. High-level expression of functional human cytochrome P450 1A2 in Escherichia coli // FASEB. J. 1992,- V.6.- P.759.

25. Gasser R., Negishi M., Philpot R.M. Primary structures of multiple forms of cytochrome P-450 isozyme 2 derived from rabbit pulmonary and hepatic cDNAs // Mol. Pharmacol.-1988. -V.32. -P.22-30.

26. Gilliam E.M.J., Baba I, Kim B.R., Ohmori S, Guengerich F.P. Expression of modified human cytochrome P450 3A4 in Escherichia coli and purification and reconstitution of the enzyme // Arch. Biochem. Biophys.- 1993.- V.305.- P.123-131.

27. Gilliam E.M.J., Guo Z., Martin M.V., Jenkins C.M., Guengerich F.P. Functional expression of cDNAs for bovine 11 beta-hydroxylase-aldosterone synthases, P450-11 beta)-2 and -3 and their chimeras // Arch. Biochem. Byophys.-1995,- V.319.- P.540.

28. Gold L. and Stormo G.D. in "Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology",

29. Neidhardt F.C. and Ingraham J.L., eds.) American. Society, for Microbiology. Washington. DC.- 1990.- V. 1302- P.342

30. Gruenke L., Konopka K., Cadieu M., Waskell L. The stoichiometry of the cytochrome P-450-catalyzed metabolism of methoxyflurane and benzphetamine in the presence and absence of cytochrome b5 // J. Biol. Chem.- 1995.- V.250.-P.747-751.

31. Guengerich F.P. in „Frontiers in Biotransformation" (Ruckpaul K. and Rein H. , eds.) // London.- 1989.- V.I.-P.101-150.

32. Guengerich F.P., Martin M.V., Guo Z., Chun Y.-J. Purification of Functional Recombinant P450s from Bacteria // Arch. Biochem. Biophys.- 1996.- V.312.- P.35-37.

33. Hartl F.U. Molecular chaperones in cellular protein folding // Nature.- 1996.- V.381.- P.571-580.

34. Hesterkamp T., Hauser S., Lutke H., Bukau B. Escherichia coli trigger factor is a prolyl isomerase that associates with nascent polypeptide chains // Proc. Natl. Acad. Sci.-1996.- V.93.- P.4437-4441.

35. High S., Dobberstein B. Mechanisms that determine the transmembrane disposition of proteins // Curr. Opin. Cell. Biol.- 1992.- V.4.- P.581-586.

36. Houry W.A., Frishman D, Eckerskorn C, Lottspeich F, and Hartl F.U. Identification of in vivo substrates of the chaperonin GroEL // Nature.- 1999.- V.371.- P.614-619.

37. Hsu P.Y., Tsai A.L., Kulmacz R., and Wang L.H. Expression, purification, and spectroscopic characterization of human thromboxane synthase. J. Biol. Chem.- 1999.- V.274.- P.762-769.

38. Johnson J.L., Craig E.A. Protein folding in vivo: unraveling complex pathways // Cell.- 1997.- V.90.- P.201-204 .

39. Kedzie K.M., Philport R.M., Halpert J.R. Functional expression of mammalian cytochromes P450IIB in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Arch. Biochem. Biophys.- 1991.-V. 291.- P.176-186.

40. Kempf A., Zanger U.M., Meyer U.A. Truncated human P450 2D6: expression in Escherichia coli, Ni(2+)-chelate affinity purification, and characterisation of solubility and aggregation // Arch. Biochem. Biophys.- 1995.- V. 321. -277 .

41. Kyte J., Doolittle R.F. A simple method for displaying the hydrophobic character of a protein // J. Mol. Biol.-1982.- V.157. P.105-132.

42. Laemmli U.K. One-Dimensional SDS-PAGE // Nature. London.-1970.- V.227.- P.680-684.

43. Lamb D.C., Kelly D.E., Venkateswarlu K., Manning N.J., Bligh H.F.J., Schunck W.-H., Kelly S.L. Generation of a complete, soluble, and catalytically active sterol 14 alpha-demethylase-reductase complex // Biochemistry.-1999.- V.38.- P.8733-8738 .

44. Lambert L.A., Abshire K., Blankenhorn D., Slonczewski J.L. Proteins induced in Eschericgia coli by benzoic acid // J. of Bacteriology.- 1997.- V.179.- P.7595-7599.

45. Larson J.R., Coon M.J., Porter T.D. Alcohol-inducible cytochrome P-450IIE1 lacking the hydrophobic NH2-terminal segment retains catalytic activity and is membrane-bound when expressed in Escherichia coli // J. Biol. Chem.-1991.- V. 266.- P.7321-7324.

46. Mary L., Shank-Retzlaff K., Raner G.M., Coon M.J., Sligar S.G. Membrane topology of cytochrome P450 2B4 in Langmuir-Blodgett mono-layers // Arch, of Biochem. and Biophysics.-1998.- V.359.- P.82-88.

47. Matsuura S., Fujii-Kuriyama Y., Taskiro Y. The transmembrane region of microsomal cytochrome P450 identified as the endoplasmic reticulum retention signal // J. Cell. Biol.- 1978.- V.78.- P.503-519.

48. Modi S., Paine M.J., Sutcliffe M.J., Lian L.Y., Primrose W.U., Wolf C.R., Roberts G.C. A model for human cytochrome P450 2D6 based on homology modeling and NMR studies of substrate binding // Biochemistry.- 1996.- V.35.- P.4540-4 55 0 .

49. Monier S., Van Luc P., Kreibich G., Sabatini D., Adesnik M. Signals for the incorporation and orien-tation of cytochrome P450 in the endoplasmic Reticulum membrane // J. Cell. Biol.- 1988,- V.107.- P.457-470.

50. Nebert D.W, Gonzalez F.J. P450 genes: structure, evolution, and regulation // Annu. Rev. Biochem.- 1987.-V.56.- P.945-993.

51. Nelson D.R., Strobel H.W. On the membrane topology of vertebrate cytochrome P-450 proteins // J. Biol. Chem.-1988.- V. 263.- P.6038-6050.

52. Nilsson O.S., DePierre J.W., Dallner G. Investigation of the transverse topology of the microsomal membrane usingcombinatios of proteases and the non-penetrating reagent diazobenzene sulfonate // Biochem. Biophys. Acta.- 1978.-V.511.- P.93-104.

53. Omura T., Sato R. Structute and function of cytochrome P450 // Biochemistry.- 1964.- V.5.- P.156-164.

54. Omura T. Forty years of cytochrome P450 // Biochem Biophys Res Commun.- 1999.- V.266.- P.690-698.

55. Pernecky S.J., Coon M.J. N-terminal modifications that alter P450 membrane targeting and function. Methods Enzymol.- 1996.- V.272.- P.25-34.

56. Pfanner N. Who chaperones nascent chains in bacteria? // Current. Biology.- 1999.- V.9- P.720-724.

57. Pompon D., Louerat B., Bronine A, Urban P. Yeast expression of animal and plant P450s in optimized redox environments // Methods. Enzymol.- 1996.- V.272.- P.51-64.

58. Porter T.D., Coon M.J. Cytochrome P-450. Multiplicity of isoforms, substrates, and catalytic and regulatory mechanisms // J. Biol. Chem.- 1991.- V.25.- P.13469-13472.

59. Poulos T.L., Finzel B.C., Howard A.J. High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam // J. Mol. Biol.-1987.- V.195.- P.687-700.

60. Ravichandran K.G., Boddupalli S.S., Hasermann C.A., Peterson J.A., Deisenhofer J. Crystal structure of hemoprotein domain of P450BM-3, a prototype for microsomal P450's // Science.- 1993.- V.6.- P.731-736.

61. Rohman M., Harrison-Lavoie K.J. Separationm of copurifing GroEL from gfutathione-S-transferase fusion proteins // Protein. Expression, and Purific.- 2000.- V.20.- P.45-47.

62. Ryan R., Grimm S.W., Kedzie K.M., Halpert J.R., Philpot R.M. Sequence of a chicken phenobarbital-inducible cytochrome P450 cDNA: regulation of two P450 mRNAs transcribed from different genes // Arch. Biochem. Biophys.- 1993 .- V.304.- P.454-463.

63. Sagara Y., Barnes H.J., Waterman M.R. Protein synthesis inhibitors and ethanol selectively enhance heterologous expression of P450s and related proteins in Escherichia coli // Arch. Biochem. Biophys.- 1993.- V.304.- P.272-278.

64. Sakaguchi M., Katsuyoshi M., Sato R. Signal recognition particle is required for co-translational insertion ofcytochrome P-450 into microsomal membranes // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.- 1984,- V.81-11.- P.3361-3364.

65. Sakaguchi M., Mihara K., Sato R. A short amino-terminal segment of microsomal cytochrome P-450 functions both as an insertion signal and as a stop-transfer sequence // EMBO J.- 1987,- V. 6.- P.2425-2431.

66. Scheller U., Kraft R., Schroder K.-L.,Schunck W.-H. Generation of the soluble and functional cytosolic domain of microsomal cytochrome P450 52A3 // J. Biol. Chem.-1994.- V. 269.- P.12779-12783.

67. Smith D.B., Johnson K.S. Single step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase // Gene.- 1988.- V. 67.- P.31-40.

68. Smith G.,Tew D., Wolf C. Membrane topology of NADPH-cytochrome P450 reductase on the endoplasmic reticulum // Proc. Natl. Acad. Sci. Usa.- 1994.- V.91.- P.8710-8714.

69. Shimoji M., Yin H., Higgins L., Jones J.P. Design of a novel P450: a functional bacterial-human cytochrome P450 chimera // Biochemistry.- 1998.- V.37.- P.8848-8852.

70. Shoun H., Suyama W., Yasui T. Soluble nitrate/nitrite-inducible cytochrome P450 of the fungus, Fusarium oxysporum // FEBS Lett.- 1989. -V.244.- P.11-14.

71. Szczesna-Skorupa E., Browne N., Mead D., Kemper B. Positive charges at the NH2 Terminus convert the membrane-anchor signal peptide of cytochrome P-450 to a secretory signal peptide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1988.-V.85.- P.738-742.

72. Szczesna-Skorupa E., Kemper B. NH2-terminal substitutions of basic amino acids induce translocation across the microsomal membrane and glycosylation of rabbit cytochrome P450IIC2 // J. Cell. Biol.- 1989.- V.108.- P.1237-1243.

73. Thain A., Gaston K., Jenkins 0., and Clarkie A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from copurifying GroEL // Trends. Genet.- 1996.- V.12.- P.209-210.

74. Tsuprun V.L., Myasoedova K.N., Berndt P., Sograf O.N., Orlov E.V., Ya C.V., Archakov A.V., Skulachev V.P. Quaternary structure of the liver microsomal cytochrome P-450 // FEES. Lett.- 1986.- V.205.- P.35-50.

75. Uvarov V.Yu., Sotnichenko A.I., Vodovozova E.L., Molotkovsky J.G., Kolesanova E.F., Lyulkin Y.A., Stier A., Krueger V., Archakov A.I. Determination of membrane-bound fragments of cytochrome P-450 2B4 // Eur. J. Biochem.-1994.- V.222P.483-489.

76. Vergeres G., Waskell L. Microsomal cytochromes b5 and P450 during induction of aryl hydrocarbon hydroxylase activity in mammalian cell culture // Biochemie.- 1995.- V. 77.- P.604-620.

77. Viitanen P.V., Gatenby A.A., Lorimer G.H. Purified chaperonin 60 (groEL) interacts with the nonnative states of a multitude of Escherichia coli proteins // Protein. Sci.- 1992.- V.I.- P.363-9.

78. Vlasuk G.P., Ghrayeb J., Ryan D.E., Reik L., Thomas P.E., Levin W., Walz F.G. Multiplicity, strain differences, and topology of phenobarbital-induced cytochromes P450 in rat liver microsomes // Biochemistry.- 1982.- V.21.- P.789-798.

79. Von Wachenfeldt C., and Johnson E.F. in „Cytochrome P450-Structure, Mechanism, and Biochemistry" (Oritz de Montellano P., edc.), 2n<: Ed., Plenum. Publishing. Corp. NY.- 1995.- P.183-223.

80. Von Wachenfeldt C., Richardson T.H., Cosme J., Johnson E.F. Microsomal P450 2C3 is expressed as a soluble dimer in Escherichia coli following modifications of its N-terminus // Atch. Biochem. Biophis.- 1997.- V.339.- P.107-114.

81. Wagner S.L., Dean W.L., Gray R.D. Zwitterionic detergent mediated interaction of purified cytochrome P-450LM4 from5,6-benzoflavone-treated rabbits with NADPH-cytochrome P-450 reductase // Biochemistry.- 1987.- V.26.- P.2343-2348.

82. Waterman M.R. and Johnson E.F. The P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, and recommended nomenclature // Methods. Enzymol.- 1991.- V.206.- P.320-327 .

83. Wang M., Roberts D., Paschke R., Shea T., Masters B., Kim J. Acetone catabolism by cytochrome P450 2E1: studies with CYP2El-null mice // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1997.-V. 94P.8411-8416.

84. White S.H. Hydrophaty plots and the prediction of membrane topology. Membrane protein structure: Experimental approaches (White S.H., ed.) Oxford. University. Press. London.- 1994.- P.97-124.

85. Williams P.A., Cosme J., Sridhar V., Johnson E.F., McRee D.E. Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase: structural adaptations for membrane binding and functional diver-sity // Mol. Cell.- 2000.- V.5.- P.121-131.

86. Wolin S.L. From the elephant to E.coli: SRP-dependenr protein targeting // Cell.- 1994,- V.77.- P.787-790.

87. Xu Z., Horwich A.L., Sigler P.B.: The crystal structure of the asymmetric GroEL-GroES-(ADP)7 chaperonin complex // Nature.- 1997,- V.388.- P.741-750.

88. Yamazaki S., Sato K., Suhara K., Sakaguchi M., Mihara K., Omura T. Importance of the proline-rich region following signal-anchor sequence in the formation of correct conformation of microsomal cytochrome P-450s // J. Biochem. 1993.- V.114.- P.652-657.