Особенности определения биологически активных веществ из группы бензимидазола в условиях химико-токсикологического анализа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Щербаков Денис Павлович

• Щербаков Денис Павлович
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Щербаков Денис Павлович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Физико-химические свойства производных бензимидазола, их применение и варианты синтеза

1.2 Фармакокинетика производных бензимидазола и их токсикологическая характеристика

1.3 Методы идентификации производных бензимидазола и их количественное определение

1.4 Распределение производных бензимидазола в организме теплокровных, способы их

изолирования из биоматериала и очистки

ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, МАТЕРИАЛЫ, ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАКТИВЫ, СИНТЕЗ АНАЛИТИЧЕСКИХ ФОРМ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

2.2 Синтез и определение аналитических форм исследуемых производных бензимидазола

2.3 Приборы, реактивы, оборудование, посуда и материалы

2.4 Характеристика лабораторных животных и правила работы с ними

2.5 Идентификация производных бензимидазола

2.5.1 Идентификация методом электронной спектрофотометрии

2.5.2 Идентификация хроматографическими методами

2.5.2.1 Идентификация методом нормальнофазовой ТСХ

2.5.2.2 Идентификация методом обращеннофазовой ТСХ

2.5.2.3 Идентификация методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием (ГХ-МС)

2.5.2.4 ГХ-МС аналитов в виде силильных и ацетильных производных

2.5.2.5 Идентификация методом ВЭЖХ с тандемным масс-спектрометрическим

детектированием

Выводы ко второй главе

ГЛАВА 3 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА

3.1 Определение спектрофотометрическим методом

3.1.1 Определение тиабендазола (2-(4-тиазолил)-1Н-бензимидазола)

3.1.2 Определение альбендазола ([5(пропилтио)-1Н-бензимидазол-2-ил]) карбаминовой кислоты метилового эфира)

3.1.3 Определение мебендазола (5-бензоил-2-метоксикарбониламино-бензимидазола)

3.2 Определение спектрофотометрическим методом с применением вторых производных

3.2.1 Определение тиабендазола (2-(4-тиазолил)-1Н-бензимидазола)

3.2.2 Определение альбендазола ([5(пропилтио)-1Н-бензимидазол-2-ил]) карбаминовой кислоты метилового эфира)

3.2.3 Определение мебендазола (5-бензоил-2-метоксикарбониламино-бензимидазола)

3.3 Определение методом ГХ-МС

3.3.1 Определение тиабендазола (2-(4-тиазолил)-1Н-бензимидазола)

3.3.1.1 Определение триметилсилильного производного тиабендазола

3.3.1.2 Определение тиабендазола в виде триметилсилильного деривата

3.3.2 Определение альбендазола ([5(пропилтио)-1Н-бензимидазол-2-ил]) карбаминовой кислоты метилового эфира)

3.3.2.1 Определение триметилсилильного производного альбендазола

3.3.2.2 Определение ацетильного производного альбендазола

3.3.2.3 Определение альбендазола в виде триметилсилильного деривата

3.3.3 Определение мебендазола (5-бензоил-2-метоксикарбониламино-бензимидазол)

3.3.3.1 Определение триметилсилильного производного мебендазола

3.3.3.2 Определение ацетильного производного мебендазола

3.3.3.3 Определение мебендазола в виде триметилсилильного деривата

Выводы к третьей главе

ГЛАВА 4. МОДЕЛИРОВАНИЕ УСЛОВИЙ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА

4.1 Очистка с применением экстракционных методов

4.1.1 Жидкость-жидкостная экстракция производных бензимидазола (на примере тиабендазола) из водных растворов

4.2 Очистка с применением методов хроматографии

4.2.1 Нормальнофазовый вариант тонкослойной хроматографии

4.2.2 Обращеннофазовый вариант тонкослойной хроматографии

4.2.3 Колоночная хроматография обычного давления

4.3 Экспериментальное подтверждение эффективности очистки извлечений из биологического материала в контрольных опытах

4.3.1 Подтверждение эффективности очистки извлечений методом колоночной хроматографии

4.3.2 Подтверждение эффективности очистки извлечений методом тонкослойной хроматографии

4.3.3 Подтверждение эффективности очистки извлечений сочетанием методов жидкость-

жидкостной экстракции и колоночной хроматографии обычного давления

Выводы к четвертой главе

ГЛАВА 5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА В БИОЛОГИЧЕСКИХ

МАТРИЦАХ

5.1 Определение оптимальных условий изолирования группы рассматриваемых веществ из биоматериала

5.1.1 Выбор оптимального изолирующего агента для извлечения производных бензимидазола методом простого настаивания

5.1.2 Определение оптимальных условий изолирования производных бензимидазола из биоматериала диметилкетоном

5.2 Методики определения аналитов в биологических матрицах

5.2.1 Изолирование производных бензимидазола из тканей трупных органов

5.2.2 Изолирование производных бензимидазола из цельной крови

5.2.3 Изолирование производных бензимидазола из плазмы крови

5.2.4 Определение производных бензимидазола с применением очистки методом нормальнофазовой колоночной хроматографии

5.2.5 Определение производных бензимидазола с применением очистки сочетанием методов жидкость-жидкостной экстракции и нормальнофазовой колоночной хроматографии

5.3 Валидационные мероприятия в отношении методик определения рассматриваемых производных бензимидазола в различных биоматрицах на основе применения спектрофотометрии

5.4 Валидационные мероприятия в отношении методик определения рассматриваемых

производных бензимидазола в различных биоматрицах на основе применения ГХ-МС

Выводы к пятой главе

ГЛАВА 6 ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА В ТРУПНОМ МАТЕРИАЛЕ И ИХ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ У ТЕПЛОКРОВНЫХ

6.1 Изучение стабильности производных бензимидазола в трупном материале

6.2 Изучение распределения производных бензимидазола в организме теплокровных

Выводы к шестой главе

ОБЩАЯ СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЯ БИОМАТЕРИАЛА ПРИ ОТРАВЛЕНИИ

ПРОИЗВОДНЫМИ БЕНЗИМИДАЗОЛА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности определения биологически активных веществ из группы бензимидазола в условиях химико-токсикологического анализа»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Биологически активные вещества производные бензимидазола, такие как альбендазол ([5-(пропилтио)-1Н-бензимидазол-2-ил] карбаминовой кислоты метиловый эфир) и мебендазол (5-бензоил-2-метоксикарбониламино-бензимидазол), применяются в качестве антигельминтных лекарственных средств для людей и животных. Тиабендазол (2-(4-тиазолил)-1Н-бензимидазол) известен в качестве фунгицида широкого спектра действия.

Рассматриваемые соединения имеют выраженную токсичность для человека и других теплокровных организмов. ЛД50 тиабендазола, альбендазола и мебендазола составляет соответственно 3330, 1500 и 1280 мг/кг для крыс при условии введения токсикантов в желудок.

Передозировка этих веществ инициирует головные и эпигастральные боли, диспепсические расстройства, нарушения функциональности печени, вплоть до развития гепатита, развитие алопеции, есть данные о влиянии альбендазола на ЦНС.

Исследования в ветеринарии показывают негативное влияние альбендазола и мебендазола на развитие плода.

Описаны отравления людей производными бензимидазола, в том числе и смертельные. Причиной отравлений этими токсикантами могут быть их неосторожное применение, несоблюдение терапевтических доз, возможное использование при попытках самоубийств, а также употребление продуктов, содержащих их остаточные количества.

Всё это подчёркивает важное токсикологическое значение рассматриваемых биологически активных соединений и необходимость их всестороннего исследования в химико-токсикологическом отношении.

Степень разработанности темы. Исследование литературных данных выявило недостаточную изученность вопросов изолирования производных бензимидазола из биоматериала, очистки от соэкстрактивных веществ, качественного и количественного определения, распределения в организме теплокровных, сохраняемости в трупном материале.

Принимая во внимание все вышесказанное, разработка методик изолирования объектов исследования из тканей органов и биологических жидкостей, очистки и определения является актуальной.

Цель исследования. Разработка методик извлечения из биологического материала, очистки, обнаружения и количественного определения альбендазола, мебендазола и тиабендазола в условиях химико-токсикологического анализа.

Задачи исследования. Для решения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- исследовать особенности получения аналитических форм тиабендазола, альбендазола и мебендазола, доказать индивидуальность полученных веществ, выявить их структуру и разработать варианты количественного определения;

- изучить возможность идентификации производных бензимидазола различными методами хроматографии (тонкослойная, колоночная газовая, колоночная жидкостная), электронной спектрофотометрии, в также методами ГХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС;

- исследовать различные способы определения количественного содержания изучаемых соединений методами газовой хроматографии с масс-селективным детектированием, спектрофотометрии и производной спектрофотометрии второго порядка;

- изучить особенности экстрагирования производных бензимидазола из водных растворов и характер их хроматографического поведения в полупрепаративной колонке сорбента. Разработать схемы очистки аналитов от эндогенных компонентов биоматериала экстракцией и колоночной хроматографией обычного давления;

- выявить условия оптимального изолирования тиабендазола, альбендазола и мебендазола настаиванием с органическими и неорганическими жидкостями и возможные варианты их очистки от соэкстрактивных веществ хроматографией и экстракцией;

- разработать методики определения производных бензимидазола в биологических матрицах, провести в их отношении валидационные мероприятия;

- изучить сохраняемость производных бензимидазола в гнилостно разлагающемся биологическом материале и характер их распределения в теплокровных организмах.

Научная новизна. Определены особенности хроматографической активности производных бензимидазола в сорбентах различной химической природы при воспроизведении методов тонкослойной, жидкостной и газо-жидкостной колоночной хроматографии.

Выявлены группы характерных заряженных частиц в масс-спектрах альбендазола и тиабендазола, а также триметилсилильных и ацетильных производных тиабендазола, альбендазола и мебендазола при ионизации молекул электронным ударом (ГХ-МС) или методом электроспрея (ЖХ-МС/МС).

Разработаны и статистически охарактеризованы различные варианты оценки количественного содержания аналитов на основе методов газовой хроматографии с масс-селективным детектированием и электронной спектрофотометрии.

На примере тиабендазола изучены особенности распределения аналитов между водной и органическими фазами в процессе их динамического контакта. Установлено, что в наибольщей степени аналит извлекается из водных растворов дихлорметаном при рН 5 водного слоя и его насыщении хлоридом натрия.

Разработаны эффективные способы очистки анализируемых соединений от соэкстрактивных веществ биологического материала методом колоночной нормальнофазовой хроматографии и его сочетанием с жидкость-жидкостной экстракцией.

Обоснована возможность использования диметилкетона как оптимального изолирующего агента для извлечения анализируемых соединений из биоматериала в режиме настаивания. Выявлены оптимальные условия изолирования диметилкетоном (двукратная инфузия по полчаса, соотношение масс изолирующего агента и биоматрицы 2:1) и разработаны

методики определения производных бензимидазола в твёрдых (органы и ткани) и жидких (кровь, плазма) биологических матрицах.

Показано соответствие разработанных методик количественного определения исследуемых производных бензимидазола в печени, крови и плазме основным валидационным критериям.

Определены закономерности распределения тиабендазола, альбендазола и мебендазола у теплокровных (модельный организм - крысы) и устойчивости данных соединений в трупном материале.

Разработаны 2 варианта общей схемы исследования биоматериала при доказательстве отравлений производными бензимидазола, на основе изолирования аналитов диметилкетоном и очистки колоночной хроматографией обычного давления или её сочетанием с экстракцией.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в ходе выполнении настоящей работы результаты химико-токсикологического исследования производных бензимидазола (тиабендазола, альбендазола и мебендазола) расширяют представления о химических, токсикологических и физико-химических свойствах данных соединений. Проведённые исследования и полученные результаты представляют собой основу для разработки и практического приложения методик химико-токсикологического анализа рассматриваемых аналитов.

По результатам выполненных экспериментов осуществлена разработка оригинальной схемы изолирования из сложных биологического матриц, очистки, идентификации и количественного определения производных бензимидазола, позволяющая повысить надёжность и достоверность доказательства отравлений данными веществами, а также сократить время проведения анализа в силу использования высокотехнологичного оборудования.

Результаты исследования внедрены в работу химико-токсикологической лаборатории ГУЗ «Липецкий областной наркологический диспансер», в учебный процесс кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВО «Воронежский государственный медицинский университет им. Н.Н. Бурденко» Минздрава России и кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии ФГБОУ ВО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России.

Методология и методы исследования. Методология исследований заключалась в изучении особенностей изолирования, очистки, дериватизации и определения производных бензимидазола, их распределения у теплокровных и сохраняемости в биоматериале. При этом использовались современные методы: экстракция, ТСХ и колоночная хроматография обычного давления, электронная и ИК- спектрофотометрия, ГХ-МС и ЖХ-МС/МС. Разработка методик для определения изучаемых веществ в биологических матрицах проводилась с использованием экспериментальных модельных смесей c заданными количествами определяемых соединений. Статистическая обработка результатов проводилась в соответствии с установленными ГФ XIII требованиями с использованием комплекса прикладных программ «Microsoft Ехсе1 2016».

Валидация разработанных методик проводилась в соответствии с требованиями нормативных документов, принятых в области химико-токсикологического и биологического анализа.

Апробация результатов работы. Основные положения работы апробированы на XXIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2017 г.), на международной научно-практической конференции «Новшества в медицине и фармакологии» (Тюмень, 2017 г.), на международной научно-практической конференции «Современная медицина: актуальные вопросы и перспективы развития» (Уфа, 2017 г.), на 83-ей Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность», посвященной 83-летию КГМУ и 85-летию со дня рождения члена-корреспондента РАМН, профессора А.В. Завьялова (Курск, 2018 г.), на V Всероссийском симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» с международным участием (Краснодар, 2018 г.).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертация соответствуют паспорту специальности 3.4.2. Фармацевтическая химия, фармакогнозия по пункту 4 «Разработка методов анализа лекарственных веществ и их метаболитов в биологических объектах для фармакокинетических исследований, эколого-фармацевтического мониторинга, судебно-химической и наркологической экспертизы».

Основные положения, выносимые на защиту:

- синтез аналитических форм (ацетильных и силильных дериватов) 2-(4-тиазолил)-1Н-бензимидазола, [5-(пропилтио)-1Н-бензимидазол-2-ил] карбаминовой кислоты метилового эфира и 5-бензоил-2-метоксикарбониламино-бензимидазола и подтверждение их структуры;

- особенности поглощения электромагнитного излучения изучаемыми соединениями в УФ- и ИК- областях;

- данные по изучению хроматографической активности производных бензимидазола и их аналитических форм в тонких слоях и колонках различных сорбентов;

- варианты идентификации производных бензимидазола методами ТСХ, ГХ-МС, ВЭЖХ-МС/МС и спектрофотометрии, особенности хромато-масс-спектрометрии их триметилсилильных и ацетильных дериватов;

- варианты оценки количественного содержания производных бензимидазола методами ГХ-МС, спектрофотометрии и производной спектрофотометрии второго порядка;

- схемы очистки производных бензимидазола методами колоночной хроматографии и жидкость-жидкостной экстракции;

- методики изолирования рассматриваемых соединений из биологического материала методом настаивания с диметилкетоном и последующей очистки от соэкстрактивных веществ;

- результаты изучения стабильности производных бензимидазола в разлагающемся биологическом материале;

- особенности распределения аналитов в теплокровных организмах (крысы) после внутрижелудочного введения отравляющих агентов.

Степень достоверности результатов. Достоверность полученных результатов диссертационного исследования обусловлена достаточным объемом экспериментального материала, использованием современных методов исследования, валидацией разработанных методик, статистической обработкой данных по требованиям ГФ 13 с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2016». Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета № 36 РАМН и научной проблеме 35.04 «Научные проблемы судебно-медицинской токсикологии, токсикологической и судебной химии» по специальности «Судебная медицина» при РАМН. Номер госрегистрации 01201377075.

Личный вклад автора. Автор диссертации принимал непосредственное участие во всех этапах исследования: им составлен общий план и разработана структура исследований, проведен анализ отечественных и зарубежных литературных источников по теме диссертации, выполнены экспериментальные исследования, проведены статистическая обработка, валидация и анализ данных, сделаны выводы и заключения. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей участия автора 80-95%.

Публикации. Содержание работы отражено в 10 публикациях, их них 2 статьи опубликованы в журналах, индексируемых в базах Scopus и Web of Science, 2 статьи - в журналах списка ВАК, рекомендуемых для опубликования материалов диссертаций, 1 патент на изобретение, 5 тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (главы 2, 3, 4, 5 и 6), выводов, списка литературы и приложения. Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 73 таблицы (из них 42 вынесены в приложение) и 41 рисунок. Библиографический список состоит из 137 источников, в том числе 104 - на иностранном языке.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Физико-химические свойства производных бензимидазола, их

применение и варианты синтеза

Производные бензимидазола играют очень важную роль в области медицины, обладая многими полезными терапевтическими свойствами, такими как противовирусная, противодиабетическая, противоопухолевая, антигистаминная, противоязвенная, гипотензивная, противоглистная, противогрибковая и противомикробная активность [34, 49, 71, 112, 115].

2-(4-тиазолил)-1Н-бензимидазол (тиабендазол) представляет собой кристаллический белый порошок с температурой плавления 296-304°С. Брутто формула - C10H7N3S. Растворимость в диметилсульфоксиде (80 мг/мл), диметилацетамиде (64,7 мг/мл), диметилформамиде (39 мг/мл), диметилкетоне (2,8 мг/мл), этилацетате (1,7 мг/мл), еще хуже он растворим в других органических гидрофобных растворителях ксилоле (0,13 мг/мл) и гептане (0,01 мг/мл). В зависимости от значений рН растворимость в воде вариьируется от 10,0 мг/мл (при рН 2), до 0,03 мг/мл (при рН 7-10). Молекулярная масса 201,3 [2, 3, 7].

Н

Тиабендазол - биологически активное соединение, в настоящее время применяемое как фунгицид широкого спектра действия и пищевая добавка Е233 [2]. Способом его получения является конденсация 4-цианотиазола в присутствии кислого катализатора с ортофенилдиамином, с дальнейшим осаждением спиртом [15].

Возможным способом получения тиабендазола, является взаимодействие тиазолкарбоновой кислоты с о-фенилендиамином, при воздействии катализаторов и температуры. Схему реакции можно посмотреть на рис. 1 [15].

Рисунок 1 - Схема синтеза тиабендазола

[5-(пропилтио)-1Н-бензимидазол-2-ил] карбаминовой кислоты метиловый эфир (Альбендазол) - белый порошок, с температурой плавления 209°С. Брутто формула -Сl2Нl5NзО2S. Хорошо растворим в муравьиной кислоте, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, сильных кислотах и щелочах, незначительно - в спиртах и простых

эфирах, а также хлорированных алканах, практически нерастворим в воде. Молекулярная масса 265,34 [1, 37, 44, 69].

Альбендазол - лекарственное вещество, активен против большинства гельминтов на всех стадиях развития, тканевых и кишечных паразитов, а также некоторых патогенных простейших. Вещество относится к группе бензимидазола [6, 34, 38, 41, 75].

Возможным вариантом синтеза альбендазола (рис. 2) представлено тиоцианирование 2-нитроанилина в присутствии хлора с последующим алкилированием и восстановлением нитрогруппы и конденсацией с образованием имидазольного цикла [80].

Рисунок 2 - Схема синтеза альбендазола

5-бензоил-2-метоксикарбониламино-бензимидазол (мебендазол) - его используют как противоглистное средство. Известно, что мебендазол действует путем необратимого ингибирования поглощения паразитом глюкозы, что приводит к истощению запасов гликогена, ингибирует синтез клеточного тубулина, а также ингибирует синтез нуклеозидтрифосфата. Из пищеварительного тракта всасывается незначительное количество не более 10% от введенной дозы [9, 34, 71].

Согласно известным физическим свойствам, 5-бензоил-2-метоксикарбониламино-бензимидазол представляет собой аморфный порошок белого или желтовато-белого цвета, нерастворимый в воде и других гидрофильных растворителях: одно- и многоатомных спиртах, минеральных кислотах и щелочах, трудно растворимый в сложных эфирах, легко в диметилсульфоксиде и диметилформамиде, а также в муравьиная кислота [6, 83, 102]. Температура плавления вещества составляет 288,5°С. Его общая формула - С1бН1з№Оз, молекулярная масса составляет 295,293 г/моль [40, 100].

Возможный вариант синтеза мебендазола представлен на рис. 3 [15].

н

Рисунок 3 - Схема синтеза мебендазола

Особо следует отметить, что альбендазол и мебендазол были перепозиционированы в качестве перспективных противораковых препаратов. Было показано, что эти препараты активны in vitro и in vivo (животные) против рака печени, легких, яичников, предстательной железы, колоректального рака, молочной железы, головы и шеи и меланомы.

Два клинических испытания для альбендазола и два исследования о случаях использования мебендазола выявили многообещающие эффекты этих соединений у пациентов с различными типами рака. Однако из-за токсичности альбендазола, например, нейтропении из-за миелосупрессии, если высокие дозы используются в течение длительного времени, мебендазол в настоящее время более популярен, чем альбендазол в противораковых клинических испытаниях [34, 45].

1.2 Фармакокинетика производных бензимидазола и их токсикологическая

характеристика

Производные бензимидазола проявляют ряд специфических нежелательных побочных эффектов, таких как мутагенность, тератогенность и эмбриотоксичность в разной степени, в зависимости от размера и полярности молекулы соединения, так же многие из них воздействуют

нежелательным образом на органы и системы теплокровных макроорганизмов [4, 14, 77, 89, 104, 119].

Таким образом, токсичность тиабендазола, по экпериментальным данным выраженная в ЛД50, для крыс составляет 3330 мг/кг, для кроликов - 3800 мг/кг и 3810 мг/кг для мышей [3, 57, 140].

В исследовании токсичности тиабендазола самцам и самкам мышей (50 мышей в группе) вводили тиабендазол в рационе на уровнях 0 (контроль), 0,031, 0,125 и 0,5% в течение 78 недель. Пожизненное исследование было прекращено через 78 недель из-за повышенной смертности от специфических штаммов. Не было выявлено существенных различий в смертности между контрольной и получавшей лечение группами. Однако средняя масса тела групп с высокими дозами показала значительное снижение по сравнению с контрольной группой. Вес мочевого пузыря самцов и самок мышей группы 0,5% был значительно выше, чем у контрольных мышей. Общие результаты у обработанных мышей включали атрофию почек, гидронефроз, конкременты в почечной лоханке и мочевом пузыре и атрофию яичников. Микроскопические находки в почках обработанных мышей включали нефроз, гидронефроз или гиперплазию переходного эпителия почечной лоханки или сосочков. В мочевом пузыре обработанных мышей наблюдалась гиперплазия или плоскоклеточная метаплазия переходного эпителия и одна переходно-клеточная папиллома. Признано дозозависимое снижение частоты спонтанных поражений мужской или женской репродуктивной системы. На основании результатов исследования сделан вывод о том, что тиабендазол не является канцерогенным для мышей обоих полов. Однако следует соблюдать осторожность при длительном применении высоких доз [4].

В другом исследовании самцам мышей вводили тиабендазол в рационе в концентрации 0 (контроль), 0,8, 1,2 и 1,6% в течение 44 недель. Смертность составила 10, 6, 40 или 90%, соответственно, а в контрольной группе, 0,8, 1,2 или 1,6%. У мертвых мышей общие результаты включали аномалии почек, такие как атрофия, гидронефроз или отек в 2, 67, 95 или 96% группы 0, 0,8, 1,2 или 1,6% от общего количества особей в группе соответственно. У выживших мышей в конце исследования вес правой почки обработанных групп был значительно ниже, чем у контрольной группы. Масса мочевого пузыря в обработанных группах была значительно выше, чем в контрольной группе. Общие результаты у обработанных мышей включали атрофию почек, гидронефроз, конкременты в почечной лоханке или мочевом пузыре и утолщение стенки мочевого пузыря. Микроскопические находки в почках обработанных мышей включали нефроз, гидронефроз и гиперплазию переходного эпителия почечной лоханки и сосочков. В мочевом пузыре гиперплазия или плоская метаплазия переходного эпителия были обнаружены у обработанных мышей. Введение тиабендазола в рацион в течение 44 недель приводит к нефрозу

и образованию конкрементов в почечной лоханке и мочевом пузыре самцов мышей и связано с гиперплазией переходного эпителия почечной лоханки или мочевого пузыря [136].

Были исследованы субхронические токсические эффекты тиабендазола, вводимого в рационе на уровнях 0 (контроль), 0,8 и 1,6% для 13 недель для самцов и самок мышей. Средняя масса тела самцов мышей, получавших 0,8 или 1,6% тиабендазола, показала значительное снижение по сравнению с контрольной группой. Параметры эритроцитов у самцов мышей обработанных групп были значительно ниже, чем у контрольной группы. Биохимия показала повышенные концентрации аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы у самцов и самок мышей группы, принимавшей 1,6% тиабендазола. Относительная масса селезенки или печени была значительно увеличена у самцов и самок мышей обработанных групп. Относительная масса почек обработанных мышей, как правило, увеличивался по сравнению с контрольной группой. Гистологические данные показали выраженный гемосидероз и экстрамедуллярный гемопоэз в селезенке обработанных мышей. В печени синусоидальная дилатация и увеличение клеток печени были обнаружены у обработанных мышей. В почках атрофия канальцев с перитубулярным фиброзом, клеточной инфильтрацией и некоторым канальцевым некрозом была обнаружена у обработанных мышей. Незначительная гиперплазия была обнаружена в мочевом пузыре обработанных мышей. Результаты настоящего исследования показывают, что тиабендазол вызвал небольшую анемию и повреждение печени или почек на обоих уровнях, протестированных в этих условиях [129].

Несмотря на это, тиабендазол определяется как малотоксичное вещество для человека и других теплокровных в отечественных источниках информации [3], однако следует отметить, что изучаемое соединение плохо всасывается из желудочно-кишечного тракта и в связи с этим отравления достаточными количествами изучаемого вещества мало изучены и могут повлечь побочные эффекты, присущие данной группе соединений.

Альбендазол - лекарственное противопаразитарное средство, в основном используемое для борьбы с гельминтозами у людей и животных. ЛД50 данного вещества для крыс при пероральном внутрижелудочном введении - 1500 мг/кг, доза вызывающая стойкие побочные эффекты 500 мг/кг животного, при ежедневном введении албендазола крысам в течении четырех недель, она значительно снижалось до 48 мг/кг [17].

Альбендазол при первичном прохождении через печень практически полностью превращается в альбендазола сульфоксид - первичный метаболит альбендазола, обладающий противогельминтоной активностью.

Соединение имеет ряд нежелательных побочных эффектов, присущих данной группе веществ, таких как тератогенность и эмбриотоксичность, гематотоксичность, серьезные

диспепсические расстройства и возможное возникновение психозов и неврозов при длительном применении [6, 84, 88].

Он распространяется по всему организму почти полностью, может быть обнаружен в моче, печени и желчи. Способен проникать в стенки цист паразитов.

Практически полностью распространяется по организму, способен обнаруживаться в моче, желчи, печени, в стенке кисты и кистозной жидкости, спинномозговой жидкости. Проникает в стенку и жидкости цист

гельминтов. Выводится вещество из организма в основном с мочой в виде различных метаболитов, основной из которых - вторичный метаболит альбендазола сульфон [72].

Благодаря проникновению в центральную нервную систему, альбендазол используется для лечения паразитарных инфекций головного мозга, включая нейроцистицеркоз, и сообщалось о неврологических побочных реакциях (то есть судорогах, головных болях). В октябре 2018 года 39-летняя женщина с соответствующим анамнезом большого депрессивного расстройства, пограничного расстройства личности, сахарного диабета 2 типа и расстройства полисубстанции была доставлена в отделение неотложной помощи с измененным психическим статусом, которая принимала только альбендазол в дозировке в 2 раза превышающей терапевтическую (1000 мг), что было подтверждено лабораторными исследованиями. Этот случай впервые связывает монотерапию альбендазолом с психозом, хотя и сверх терапевтических доз [118].

В 2019 году была зафиксирована альбендазол-индуцированная энцефалопатия у 25-летнего пациента [118].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Щербаков Денис Павлович, 2022 год

материала

Рисунок 37 - Результаты сравнительного изолирования альбендазола из биологического

материала

Результаты проведенных исследований показывают, что наибольшие значения извлечения тиабендазола, альбендазола и мебендазола из биологического материала достигается использованием диметилкетона - 88,7%, 86,7%, и 84,9%, дихлорметана - 76,3%, 79,2% и 68,9% и ДМСО - 76,3%, 76,4% и 69,8% соответственно.

В меньшей мере тиабендазол, альбендазол и мебендазол извлекаются из модельных экспериментальных смесей с биологическим материалом гидрофобными изолирующими агентами, например, гексаном - 7,3%, 14,0%, и 9,09% соответственно.

Рисунок 38 - Результаты сравнительного изолирования мебендазола из биологического

материала

Таким образом, как оптимальный и универсальный изолирующий агент можно предложить диметилкетон для изолирования производных бензимидазола методом простого настаивания.

На следующем этапе исследования было определено влияние продолжительности и кратности настаивания, а также зависимости соотношения массы изолирующего агента к массе биоматериала и количества аналита к массе биоматериала.

5.1.2 Определение оптимальных условий изолирования производных бензимидазола из

биоматериала диметилкетоном

А. Изучение зависимости уровня экстракции производных бензимидазола от объёма изолирующего агента и кратности настаивания

Готовили экспериментальные модельные смеси каждого производного бензимидазола с биоматериалом в соотношении 25 мг аналита на 25 г мелкоизмельченной трупной печени (размер частиц 0,2-0,5 см), тщательно перемешивали и выдерживали 90 мин при комнатной температуре.

Каждую искуственную смесь, содержащую производное бензимидазола, параллельно с контрольным образцом настаивали с определённым количеством диметилкетона (25, 50, 62,5, 75 или 100 г) при периодическом помешивании, четырежды по 45 минут каждый, далее каждый изолят пропускали через фильтровальную бумагу, предварительно смоченную диметилкетоном и собирали в индивидуальные пробирки. Точное количество фильтрата (0,3 мл) хроматографировали, используя стеклянные камеры цилиндирической формы (внутренний объем около 600 см3) и смесь ацетонитрил-толуол (7:3) в качестве подвижной фазы, в тонком

слое сорбента на пластинах «^огЬШ» ПТСХ-АФ-А-УФ, после нанесения узкой полоской на линию старта с веществом-свидетелем. Детекцию проводили УФ-облучением, под которым аналит проявлялся в виде темного пятна (И1 должно совпадать с таковым вещества свидетеля). Далее участок пластины с предполагаемым аналитом вырезали и элюировали 5 мл соответствующего растворителя. Тиабендазол и мебендазол элюировали из пластин ДМСО, альбендазол - ДМФА. Измерение оптической плотности элюатов проводили на спектрофотометре СФ-56 (СФ-2000) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм при соответствующих длинах волн 305 нм, 322 нм и 301 нм для оценки количественного содержания изучаемых веществ в извлечениях с учетом навески.

В аналогичных временено-температурных условиях исследовали контрольные образцы измельченной печени, без производных бензимидазола подобным образом.

Результаты определений (п=5; Р=0,95) представлены в табл. 21-23.

Как следует из полученных результатов, условия достаточно полного извлечения производных бензимидазола обеспечиваются, если масса диметилкетона превышает массу биоматериала хотя бы в два раза уже при первых двух настаиваниях.

Б. Изучение зависимости степени от длительности контакта изолирующего агента и биоматериала

Приготовление и консервирование искусственных смесей производных бензимидазола с трупной тканью печени и контрольными образцами биологического материала не содержащими аналит осуществляли согласно схеме представленной в пункте А настоящего раздела.

В ходе исследования порции по 25г экспериментальных смесей и контроли дважды настаивали с 50 г диметилкетона в течение соответствующего времени (15, 30, 45, 60 или 75 минут). В каждом эксперименте определенное количество полученной экстракции наносили на стартовую линию пластины '^огЬШ", а затем действовали, как указано в пункте А этого раздела. Результаты определений (п=5) показаны на рис. 39. Как свидетельствуют полученные данные, минимальное требуемое время контакта биоматериала с изолирующим агентом составляет 30 минут.

В. Изучение зависимости степени извлечения от количественного соотношения массы производных бензимидазола к массе биологического материала в модельной экспериментальной смеси

Согласно схеме, рассмотренной в пункте А данного раздела, готовили модельные экспериментальные смеси тиабендазола, альбендазола и мебендазола с мелкоизмельчённой тканью печени, с различным содержанием исследуемых соединений от 0,005 до 0,2%.

Таблица 21 - Зависимость степени извлечения (R, %) тиабендазола из биоматериала диметилкетоном от количественного соотношения биоматериала и изолирующего агента, и

количества этапов настаивания (n=5)

Взято тиабендазола, Масса Этапы Найдено тиабендазола

мг ацетона, г настаивания мг %

1 10,045 40,18

2 5,91 23,64

1+2 15,72 62,88

25 25 3 3,38 13,52

1+2+3 18,865 75,46

4 2,1825 8,73

1+2+3+4 20,8125 83,25

1 15,255 61,02

2 6,78 27,12

1+2 21,8 87,2

25 50 3 2,5475 10,19

1+2+3 24,1125 96,45

4 0,82 3,28

1+2+3+4 25,2475 99,73

1 15,925 63,7

2 6,425 25,7

1+2 22,115 88,46

25 62,5 3 2,3925 9,57

1+2+3 24,2725 97,09

4 0,5925 2,37

1+2+3+4 24,865 99,46

1 16,24 64,96

2 6,2475 24,99

1+2 22,2525 89,01

25 75 3 1,6875 6,75

1+2+3 23,705 94,82

4 0,95 3,8

1+2+3+4 24,655 98,62

1 17,14 68,56

2 5,445 21,78

1+2 22,35 89,4

25 100 3 1,475 5,9

1+2+3 23,59 94,36

4 0,5725 2,29

1+2+3+4 23,9275 95,71

Таблица 22 - Зависимость степени извлечения (Д, %) альбендазола из биоматериала диметилкетоном от количественного соотношения биоматериала и изолирующего агента и от

количества этапов настаивания (п=5)

Взято альбендазола, Количество Этапы Найдено альбендазола

мг ацетона, г настаивания мг %

1 9,92 39,68

2 5,785 23,14

1+2 15,595 62,38

25 25 3 3,255 13,02

1+2+3 18,74 74,96

4 2,0575 8,23

1+2+3+4 20,6875 82,75

1 15,13 60,52

2 6,655 26,62

1+2 21,675 86,7

25 50 3 2,4225 9,69

1+2+3 23,9875 95,95

4 0,885 3,54

1+2+3+4 24,8725 99,49

1 15,8 63,2

2 6,3 25,2

1+2 21,99 87,96

25 62,5 3 2,2675 9,07

1+2+3 24,1475 96,59

4 0,8925 3,57

1+2+3+4 24,93 99,72

1 16,115 64,46

2 6,1225 24,49

1+2 22,1275 88,51

25 75 3 1,5625 6,25

1+2+3 23,58 94,32

4 0,825 3,3

1+2+3+4 24,295 97,18

1 17,015 68,06

2 5,32 21,28

1+2 22,225 88,9

25 100 3 1,35 5,4

1+2+3 23,465 93,86

4 0,4475 1,79

1+2+3+4 23,8025 95,21

Таблица 23 - Зависимость степени извлечения (R, %) мебендазола из биоматериала диметилкетоном от количественного соотношения биоматериала и изолирующего агента и от

количества этапов настаивания (n=5)

Взято мебендазола, Количество Этапы Найдено мебендазола

мг ацетона, г настаивания мг %

1 9,92 39,68

2 6,285 25,14

1+2 16,345 65,38

25 25 3 3,005 12,02

1+2+3 18,49 73,96

4 2,3075 9,23

1+2+3+4 20,9375 83,75

1 15,08 60,32

2 6,155 24,62

1+2 21,235 84,94

25 50 3 2,1725 8,69

1+2+3 23,6575 94,63

4 1,1225 4,49

1+2+3+4 24,782 99,12

1 16,8075 67,23

2 4,8025 19,21

1+2 21,61 86,44

25 62,5 3 2,6025 10,41

1+2+3 24,2125 96,85

4 1,3075 5,23

1+2+3+4 24,91 99,64

1 17,3275 69,31

2 4,7475 18,99

1+2 22,075 88,30

25 75 3 1,2825 5,13

1+2+3 23,3575 93,43

4 1,5875 6,35

1+2+3+4 24,945 99,78

1 18,04 72,16

2 4,4075 17,63

1+2 22,44 89,76

25 100 3 1,6225 6,49

1+2+3 24,0625 96,25

4 0,9 3,6

1+2+3+4 24,9625 99,85

100 90 80 70 60 50

15 мин 30 мин 45 мин 60 мин 75 мин

Рисунок 39 - Результаты изучения зависимости степени извлечения тиабендазола, альбендазола и мебендазола диметилкетоном из биологического материала от продолжительности

настаивания

Каждую модельную экспериментальную смесь (25 г) изолировали 50 г диметилкетона двукратно при продолжительности каждого настаивания не менее 30 минут. Далее оба изолята объединяли и пропускали через фильтровальную бумагу, предварительно смоченную диметилкетоном. Точное количество фильтрата (0,3 мл) хроматографировали в тонком слое сорбента на пластинах «^огЬШ» ПТСХ-А-УФ, после нанесения узкой полоской на линию старта с веществом свидетелем, далее поступали так, как указано в пункте А настоящего раздела. Результаты определений (п=5) представлены в табл. 24.

Таблица 24 - Результаты изучения зависимости степени извлечения производных бензимидазола от их количественного содержания в модельных смесях с тканью печени

Анализируемое вещество Содержание вещества в биологическом объекте, % Найдено, % (п=5; Р=0,95)

X S ^ S х Ах

Тиабендазол 0,005 88,24 2,59 2,94 1,16 3,22

0,01 89,37 2,20 2,46 0,98 2,73

0,04 89,66 1,76 1,96 0,79 2,19

0,1 90,31 1,65 1,83 0,74 2,05

0,2 91,29 1,50 1,64 0,67 1,86

Альбендазол 0,005 87,65 2,73 3,12 1,22 3,40

0,01 88,91 2,18 2,45 0,97 2,71

0,04 89,19 1,73 1,94 0,77 2,15

0,1 89,78 1,59 1,77 0,71 1,98

0,2 90,73 1,54 1,69 0,69 1,91

Мебендазол 0,005 86,84 2,69 3,09 1,20 3,34

0,01 86,96 2,27 2,61 1,01 2,82

0,04 87,69 1,79 2,05 0,80 2,23

0,1 88,05 1,62 1,85 0,73 2,02

0,2 88,67 1,47 1,66 0,66 1,83

Из полученного в ходе эксперимента результата можно сделать вывод, изучаемые производные бензимидазола при изменении соотношения масс с тканью измельченной печени в исскуственных модельных смесях от 0,005% до 0,2% не превышает 3,1%. Из чего можно сделать заключение, что взаимодействие молекул производных бензимидазола образует не прочные связи со структурными элементами ткани печени.

5.2 Методики определения аналитов в биологических матрицах

5.2.1 Изолирование производных бензимидазола из тканей трупных органов

Схема исследования проводилась таким образом, что 5 искусственных модельных смесей с 25 г измельченной трупной печени содержащие соответственно 1,25, 2,5, 10,0, 25,0 и 50 мг определенного объекта исследования и 5 контрольных образцов не содержащих аналитов выдерживали 90 минут при периодическом помешивании при нормальных условиях.

Затем модельные экспериментальные смеси настаивали с 50 г диметилкетона двукратно не менее чем по 30 мин каждое [20].

Извлечения объединяли и фильтровали через заранее промытый диметилкетоном фильтр. Полученные очищенные от механических включений извлечения упаривали до сухого остатка при комнатной температуре.

5.2.2 Изолирование производных бензимидазола из цельной крови

Схема исследования заключалась в следующем: 5 модельных экспериментальных смесей с цельной кровью (25 г) содержащие различное количество аналита (1,25, 2,5, 10,0, 25,0 и 50 мг) и 5 контрольных образцов выдерживали 90 минут при периодическом перемешивании при комнатной температуре.

Далее модельные экспериментальные смеси настаивали с 50 г диметилкетона двукратно не менее чем по 30 мин каждое [24].

Извлечения объединяли и фильтровали через заранее промытый диметилкетоном фильтр. Полученные очищенные от механических включений извлечения упаривали до сухого остатка при комнатной температуре в токе воздуха.

5.2.3 Изолирование производных бензимидазола из плазмы крови

Схема исследования заключалась в следующем: 5 модельных экспериментальных смесей с плазмой крови (25 г) содержащие различное количество аналита (1,25, 2,5, 10,0, 25,0 и 50 мг) и

5 контрольных образцов выдерживали 90 минут при периодическом перемешивании при комнатной температуре.

Далее модельные экспериментальные смеси настаивали с 50 г диметилкетона двукратно не менее чем по 30 мин каждое.

Извлечения объединяли и фильтровали через заранее промытый диметилкетоном фильтр. Полученные очищенные от механических включений извлечения упаривали до сухого остатка при комнатной температуре в токе воздуха.

5.2.4 Определение производных бензимидазола с применением очистки методом нормальнофазовой колоночной хроматографии

Полученный сухой остаток очищают от соэкстрактивных веществ биоматрицы методом колоночной хроматографии обычного давления, для чего его растворяют в 1 мл ДМФА и 9 мл дихлорметан-диметилкетон (9,5:0,5) (подвижная фаза). В колонку размером 490*11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 мкм, переносили 2 мл полученного раствора и наполняли подвижной фазой, после полного входа аналита, постоянно пополняя её, что бы уровень не опускался ниже 27-28 см, над верхним краем сорбента. Элюат набирают частями по 2 мл. Части элюата, содержащих производное бензимидазола объединяют и упаривают до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре.

К полученному остатку добавляли 1 мл ДМФА, до полного растворения, затем порциями по 1-2 мл - диметилкетон, перенося раствор в мерную колбу на 10 мл и доводят диметилкетоном до метки («исходный раствор»).

После чего в 2 выпарительные чашки (№ 1 и № 2) вносят точные количества (соответственно 0,1-2,5 мл и 4 мл) исходного раствора и испаряют растворитель.

Предварительное определение проводят методом ТСХ. Для чего остаток в чашке № 1 поочередно обрабатывают 0,2 мл ДМФА, и далее 2-3 раза 0,3 мл диметилкетона и переносят образующиеся растворы в одно и то же место на линию старта хроматографической пластины «^огЬШ» ПТСХ АФ-А-УФ в форме полосы. Хроматографировали для очистки от соэкстрактивных веществ биоматрицы и идентификации аналита в присутствии вещества-свидетеля и внутреннего стандарта (дибазола). При этом используют стеклянные камеры цилиндрической формы (внутренний объем около 600 см3) и смесь ацетонитрил-толуол (7:3) в качестве подвижной фазы. Детекцию проводят УФ-облучением (254 нм), в котором аналит проявляется в виде темного пятна (ЯГ должно совпадать с таковым вещества-свидетеля).

Аналит идентифицируют по величинам ЯГ (0,57 - тиабендазол, 0,67 - мебендазол, 0,63 -альбендазол) и Rs (0,80 - тиабендазол, 0,94 - мебендазол, 0,89 - альбендазол).

Подтверждающее и количественное определение производных бензимидазола осуществляли методом электронной спектрофотометрии в УФ-области спектра. Для этого

каждое из пятен предполагаемых аналитов, присутствующих на хроматограммах, вырезают и обрабатывают 5 мл соответствующего растворителя. Тиабендазол и мебендазол элюируют из пластин ДМСО, альбендазол - ДМФА. Измерение оптической плотности элюатов проводили на спектрофотометре СФ-56 (СФ-2000) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм при соответствующих длинах волн 305 нм, 322 нм и 301 нм, для оценки количественного содержания изучаемых веществ в извлечениях с учетом навески.

Результаты количественного определения тиабендазола, альбендазола и мебендазола в ткани измельченной печени, цельной крови, плазме крови и моче представлены в табл. 26-28.

Для идентификации и количественного определения производных бензимидазола применяли метод газовой хроматографии с масс-селективным детектированием. Сухой остаток в чашке № 2 растворяли в 5 мл этилацетата и 1 мкл полученного раствора хроматографировали при рассмотренных в пункте 2.5.2.3 данной диссертации условиях.

Подтверждение наличия аналита в исследуемом растворе проводят сравнением времени удерживания анализируемых соединений со временами удерживания стандартных образцов. А также путем сравнения m/z осколков молекул уникальных для каждого из соединений со m/z осколков молекул стандартых образцов и совпадению с библиотечными масс-спектрами изучаемых соединений.

Количественное содержание производных бензимидазола осуществляли с помощью программы «Маэстро MSD Анализ данных» по размеру площади пика. Расчёты проводили, используя уравнения градуировочных графиков (разделы 3.3.1.2, 3.3.2.3 и 3.3.3.3).

Результаты количественного определения тиабендазола, альбендазола и мебендазола в ткани измельченной печени, цельной крови, плазме крови и моче представлены в табл. 25-27.

Таблица 25 - Результаты количественного определения тиабендазола в модельных смесях с биологическими объектами (очистка колоночной хроматографией)

Биологиче- Внесено Найдено тиабендазола, % (n=5; Р=0,95)

ский объект тиабендазола (мг в

25 г объекта)

х S Sr SXX Ах

1 2 3 4 5 6 7

УФ-спектрофотометрия

Ткань печени 1,25 88,21 2,61 2,96 1,17 3,25

2,5 89,32 2,16 2,42 0,97 2,69

10,0 89,64 1,83 2,05 0,82 2,28

25,0 90,25 1,70 1,88 0,76 2,11

50,0 91,22 1,58 1,73 0,71 1,96

1 2 3 4 5 6 7

Кровь 1,25 88,01 2,58 2,93 1,15 3,21

2,5 89,24 2,10 2,35 0,94 2,61

10,0 89,50 1,73 1,93 0,77 2,15

25,0 90,11 1,62 1,80 0,73 2,02

50,0 91,09 1,52 1,67 0,68 1,89

Плазма крови 1,25 90,09 2,47 2,74 1,10 3,07

2,5 91,14 2,00 2,20 0,90 2,49

10,0 92,68 1,65 1,78 0,74 2,05

25,0 93,64 1,56 1,67 0,70 1,94

50,0 94,78 1,46 1,54 0,65 1,81

ГХ-МС

Ткань печени 1,25 88,53 2,85 3,22 1,27 3,54

2,5 89,60 2,39 2,67 1,07 2,97

10,0 89,98 2,08 2,31 0,93 2,58

25,0 90,47 1,91 2,11 0,85 2,37

50,0 91,52 1,74 1,90 0,78 2,16

Кровь 1,25 88,34 2,80 3,17 1,25 3,48

2,5 89,41 2,34 2,62 1,05 2,91

10,0 89,88 1,98 2,20 0,88 2,46

25,0 90,43 1,83 2,03 0,82 2,28

50,0 91,37 1,70 1,86 0,76 2,11

Плазма крови 1,25 90,36 2,73 3,02 1,22 3,39

2,5 91,47 2,23 2,44 1,00 2,77

10,0 92,88 1,86 2,00 0,83 2,31

25,0 93,95 1,73 1,84 0,77 2,15

50,0 94,99 1,58 1,67 0,71 1,97

Таблица 26 - Результаты количественного определения альбендазола в модельных смесях с биологическими объектами (очистка колоночной хроматографией)

Найдено альбендазола, % (п=5; Р=0,95)

Биологиче- Внесено

ский объект альбендазола (мг в

25 г объекта) X S S х Ах

1 2 3 4 5 6 7

УФ-спектрофотометрия

Ткань печени 1,25 87,51 2,81 3,21 1,26 3,49

2,5 88,75 2,28 2,57 1,02 2,84

10,0 89,01 1,79 2,01 0,80 2,22

25,0 89,54 1,67 1,87 0,75 2,08

50,0 90,60 1,58 1,74 0,71 1,96

1 2 3 4 5 6 7

Кровь 1,25 88,01 2,71 3,08 1,21 3,37

2,5 89,25 2,26 2,53 1,01 2,81

10,0 89,48 1,73 1,93 0,77 2,15

25,0 90,06 1,64 1,82 0,73 2,04

50,0 91,10 1,54 1,69 0,69 1,91

Плазма крови 1,25 89,82 2,49 2,77 1,11 3,09

2,5 91,24 2,18 2,39 0,97 2,71

10,0 92,09 1,68 1,83 0,75 2,09

25,0 93,03 1,58 1,69 0,71 1,96

50,0 94,12 1,45 1,54 0,65 1,80

ГХ-МС

Ткань печени 1,25 87,89 3,07 3,50 1,37 3,82

2,5 89,03 2,53 2,84 1,13 3,14

10,0 89,30 1,99 2,23 0,89 2,48

25,0 89,78 1,85 2,06 0,83 2,30

50,0 90,83 1,73 1,90 0,77 2,15

Кровь 1,25 88,29 2,95 3,34 1,32 3,67

2,5 89,58 2,52 2,81 1,13 3,13

10,0 89,74 1,95 2,17 0,87 2,42

25,0 90,41 1,83 2,02 0,82 2,27

50,0 91,38 1,69 1,85 0,76 2,10

Плазма крови 1,25 90,11 2,69 2,99 1,21 3,35

2,5 91,48 2,40 2,62 1,07 2,98

10,0 92,42 1,88 2,04 0,84 2,34

25,0 93,27 1,75 1,88 0,78 2,18

50,0 94,34 1,58 1,68 0,71 1,97

Таблица 27 - Результаты количественного определения мебендазола в модельных смесях с биологическими объектами (очистка колоночной хроматографией)

Найдено мебендазола, % (п=5; Р=0,95)

Биологиче- Внесено

ский объект мебендазола (мг в 25

г объекта) X S S х Ах

1 2 3 4 5 6 7

УФ-спектрофотометрия

Ткань печени 1,25 86,76 2,75 3,17 1,23 3,42

2,5 86,84 2,34 2,70 1,05 2,91

10,0 87,63 1,89 2,16 0,85 2,35

25,0 87,91 1,71 1,94 0,76 2,12

50,0 88,57 1,56 1,76 0,70 1,94

1 2 3 4 5 6 7

Кровь 1,25 87,91 2,65 3,02 1,19 3,30

2,5 88,39 2,22 2,51 0,99 2,76

10,0 89,48 1,84 2,06 0,82 2,29

25,0 90,06 1,66 1,85 0,74 2,07

50,0 91,12 1,53 1,68 0,68 1,90

Плазма крови 1,25 90,07 2,47 2,74 1,10 3,07

2,5 91,12 2,16 2,37 0,96 2,68

10,0 92,64 1,74 1,88 0,78 2,16

25,0 93,59 1,62 1,73 0,72 2,01

50,0 94,73 1,46 1,55 0,65 1,82

ГХ-МС

Ткань печени 1,25 87,09 3,01 3,45 1,35 3,74

2,5 87,18 2,57 2,95 1,15 3,20

10,0 87,92 2,12 2,41 0,95 2,63

25,0 88,16 1,90 2,15 0,85 2,36

50,0 88,85 1,69 1,90 0,76 2,10

Кровь 1,25 88,26 2,89 3,27 1,29 3,59

2,5 88,67 2,48 2,79 1,11 3,08

10,0 89,78 2,06 2,29 0,92 2,56

25,0 90,70 1,86 2,05 0,83 2,31

50,0 91,43 1,66 1,82 0,74 2,07

Плазма крови 1,25 90,41 2,70 2,99 1,21 3,36

2,5 91,40 2,36 2,59 1,06 2,94

10,0 92,92 1,95 2,09 0,87 2,42

25,0 93,83 1,79 1,91 0,80 2,23

50,0 94,97 1,60 1,69 0,72 1,99

5.2.5 Определение производных бензимидазола с применением очистки сочетанием методов жидкость-жидкостной экстракции и нормальнофазовой колоночной

хроматографии

Для очистки методом жидкость-жидкостной экстракции сухой остаток растворяли в 10 мл ДМФА, прибавляли 50 мл очищенной воды и переносили в делительную воронку, экстрагировали однократно дихлорметаном при рН 5,02 в присутствии натрия хлорида. Образовавшийся экстракт фильтровали через предварительно промытый дихлорметаном бумажный фильтр и высушивали при комнатной температуре до сухого остатка в токе воздуха.

Полученный сухой остаток очищают от соэкстрактивных веществ биоматрицы методом колоночной хроматографии обычного давления, для чего его растворяют в 1 мл ДМФА и 9 мл дихлорметан-диметилкетон (9,5:0,5) (подвижная фаза). В колонку размером 490*11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 мкм, переносили 2 мл полученного раствора и наполняли подвижной фазой, после полного входа аналита, постоянно пополняя её, что бы уровень не

опускался ниже 27-28 см, над верхним краем сорбента. Элюат набирают частями по 2 мл. Части элюата, содержащих производное бензимидазола объединяют и упаривают до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре.

К полученному остатку добавляли 1 мл ДМФА, до полного растворения, затем порциями по 1-2 мл - диметилкетон, перенося раствор в мерную колбу на 10 мл и доводят диметилкетоном до метки («исходный раствор»).

После этого в 3 выпарительные чашки (№ 1, № 2 и № 3) вносили соответственно 0,1-2,5 мл, 4 мл и 2,5 мл исходного раствора и испаряли растворитель до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре.

Предварительное определение проводят методом ТСХ. Для чего остаток в чашке № 1 поочередно обрабатывают 0,2 мл ДМФА, и далее 2-3 раза 0,3 мл диметилкетона и переносят образующиеся растворы в одно и то же место на линию старта хроматографической пластины «^огЬШ» ПТСХ АФ-А-УФ в форме полосы. Хроматографировали для очистки от соэкстрактивных веществ биоматрицы и идентификации аналита в присутствии вещества-свидетеля и внутреннего стандарта (дибазола). При этом используют стеклянные камеры цилиндрической формы (внутренний объем около 600 см3) и смесь ацетонитрил-толуол (7:3) в качестве подвижной фазы. Детекцию проводят УФ-облучением (254 нм), в котором аналит проявляется в виде темного пятна (И1 должно совпадать с таковым вещества-свидетеля).

Подтверждающее и количественное определение производных бензимидазола осуществляли методом электронной спектрофотометрии в УФ-области спектра. Для этого каждое из пятен предполагаемых аналитов, присутствующих на хроматограммах, вырезают и обрабатывают 5 мл соответствующего растворителя. Тиабендазол и мебендазол элюируют из пластин ДМСО, альбендазол - ДМФА. Измерение оптической плотности элюатов проводили на спектрофотометре СФ-56 (СФ-2000) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 10 мм при соответствующих длинах волн 305 нм, 322 нм и 301 нм.

Результаты количественного определения тиабендазола, альбендазола и мебендазола в ткани измельченной печени, цельной крови, плазме крови и моче представлены в табл. 28-30.

Для подтверждающего и количественного определения производных бензимидазола применяли метод газовой хроматографии с масс-селективным детектированием. Для этого остаток в чашке № 2 обрабатывали 5 мл этилацетата. 1000 мкл полученного раствора помещали в стеклянную виалу, добавляли 150 мкл соответствующего дериватизирующего агента (N,0-бис(триметилсилил)трифторацетамид (БСТФА) с 1% триметилхлорсиланом (ТМХС), после чего виалы плотно закручивали крышками и помещали в сухожаровой шкаф на 30 мин при температуре 70оС. По истечении указанного времени виалы охлаждали до комнатной температуры, доводили объём содержимого в них до 2 мл этилацетатом, из них отбирали по 2 мкл и осуществляли хроматографирование при рассмотренных в пунктах 2.5.2.3 и 2.5.2.4 данной диссертации условиях.

Подтверждение наличия аналита в исследуемом растворе проводят сравнением времени удерживания анализируемых соединений со временами удерживания стандартных образцов. А также путем сравнения m/z осколков молекул уникальных для каждого из соединений со m/z осколков молекул стандартых образцов и совпадению с библиотечными масс-спектрами изучаемых соединений.

Результаты определения количества тиабендазола, альбендазола и мебендазола в ткани измельченной цельной крови, плазме крови, печени и моче представлены в табл. 28-30.

Таблица 28 - Результаты количественного определения тиабендазола в модельных смесях с биологическими объектами (очистка экстракцией в сочетании с колоночной хроматографией)

Найдено тиабендазола, % (n=5; Р=0,95)

Биологиче- Внесено

ский объект тиабендазола (мг в

25 г объекта) X S Sr S x Ах

1 2 3 4 5 6 7

УФ-спектрофотометрия

Ткань печени 1,25 85,15 3,09 3,63 1,38 3,84

2,5 86,46 2,74 3,17 1,23 3,41

10,0 86,80 2,27 2,61 1,01 2,82

25,0 87,51 2,14 2,44 0,96 2,66

50,0 88,29 1,95 2,21 0,87 2,43

Кровь 1,25 85,84 2,86 3,34 1,28 3,56

2,5 86,71 2,53 2,91 1,13 3,14

10,0 87,22 1,95 2,24 0,87 2,43

25,0 87,85 1,88 2,14 0,84 2,34

50,0 88,42 1,77 2,00 0,79 2,20

Плазма крови 1,25 87,09 2,69 3,09 1,21 3,35

2,5 88,14 2,40 2,72 1,07 2,98

10,0 89,68 2,06 2,30 0,92 2,56

25,0 90,64 1,88 2,08 0,84 2,34

50,0 91,78 1,74 1,89 0,78 2,16

1 2 3 4 5 6 7

ГХ-МС

Ткань печени 1,25 85,43 3,20 3,75 1,43 3,98

2,5 86,71 2,90 3,35 1,30 3,61

10,0 87,15 2,39 2,74 1,07 2,97

25,0 87,77 2,24 2,56 1,00 2,79

50,0 88,43 2,05 2,32 0,92 2,55

Кровь 1,25 86,17 3,03 3,52 1,36 3,77

2,5 86,99 2,70 3,11 1,21 3,36

10,0 87,46 2,12 2,42 0,95 2,63

25,0 88,12 2,04 2,32 0,91 2,54

50,0 88,75 1,95 2,20 0,87 2,43

Плазма крови 1,25 87,43 2,78 3,18 1,24 3,46

2,5 88,45 2,53 2,86 1,13 3,15

10,0 89,99 2,16 2,40 0,97 2,69

25,0 90,91 2,03 2,24 0,91 2,53

50,0 92,04 1,85 2,01 0,83 2,30

Таблица 29 - Результаты количественного определения альбендазола в модельных смесях с биологическими объектами (очистка экстракцией в сочетании с колоночной хроматографией)

Найдено альбендазола, % (п=5; Р=0,95)

Биологиче- Внесено

ский объект альбендазола (мг в

25 г объекта) х S S х Ах

1 2 3 4 5 6 7

УФ-спектрофотометрия

Ткань печени 1,25 84,56 3,14 3,72 1,41 3,91

2,5 85,83 2,62 3,05 1,17 3,26

10,0 86,04 2,16 2,51 0,97 2,69

25,0 86,69 1,97 2,27 0,88 2,45

50,0 87,67 1,83 2,08 0,82 2,27

1 2 3 4 5 6 7

Кровь 1,25 85,05 3,12 3,67 1,40 3,88

2,5 86,33 2,60 3,01 1,16 3,23

10,0 86,54 2,06 2,38 0,92 2,56

25,0 87,20 1,94 2,22 0,87 2,41

50,0 88,18 1,79 2,02 0,80 2,22

Плазма крови 1,25 86,58 2,71 3,13 1,21 3,37

2,5 87,63 2,43 2,77 1,09 3,02

10,0 89,16 2,11 2,36 0,94 2,62

25,0 90,11 1,88 2,09 0,84 2,34

50,0 91,25 1,76 1,93 0,79 2,13

ГХ-МС

Ткань печени 1,25 84,88 3,31 3,90 1,48 4,12

2,5 86,06 2,81 3,26 1,26 3,49

10,0 86,30 2,32 2,68 1,04 2,88

25,0 86,87 2,12 2,44 0,95 2,63

50,0 87,94 1,96 2,23 0,88 2,44

Кровь 1,25 85,25 3,29 3,86 1,47 4,09

2,5 86,57 2,74 3,17 1,23 3,41

10,0 86,72 2,25 2,60 1,01 2,80

25,0 87,49 2,08 2,38 0,93 2,59

50,0 88,41 1,95 2,20 0,87 2,42

Плазма крови 1,25 86,88 2,82 3,25 1,26 3,51

2,5 87,86 2,55 2,90 1,14 3,17

10,0 89,39 2,21 2,47 0,99 2,75

25,0 90,35 2,03 2,25 0,91 2,53

50,0 91,52 1,90 2,07 0,85 2,36

Ещё один используемый метод подтверждающей идентификации - высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС). Воспроизводя его, остаток в чашке № 3 обрабатывали 5 мл ацетонитрила с 0.1% содержанием деионизированной воды и 0,1% кислоты муравьиной и 5 мМ формиата аммония. 5 мкл полученного раствора вводили в хроматограф и проводили исследование методом ВЭЖХ-МС/МС при указанных ранее условиях (пункт 2.5.2.5).