Получение бактериального суперпродуцента рецептора активированной протеинкиназы C(RACK1) с помощью генетической селекции сайта инициации трансляции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Желябовская, Ольга Борисовна

• Желябовская, Ольга Борисовна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Желябовская, Ольга Борисовна

Список сокращений

Введение.

Глава I. Рекомбинантные белки как инструмент для изучения внутриклеточной сигнализации (на примере белка RACK1).Обзор литературы.

1.1. Введение.

1.2. Белок RACK1 - участник фосфоинозитидного пути передачи сигнала. 10 Фосфоинозитидный путь передачи сигнала. 10 Протеинкиназа С и ее внутриклеточные рецепторы. 11 RACK1 - рецептор активированной протеинкиназы С.

1.3. Экспрессия чужеродных белков в Е.coli.

1.3.1. Генетические элементы экспрессирующего вектора. 17 Промоторы. 17 Решающая роль инициации в эффективности процесса трансляции. 20 Закономерности первичной структуры области инициации трансляции. 22 Влияние вторичной структуры RBS на эффективность инициации трансляции. 26 Применение сильных природных RBS в генноинженерных конструкциях. 28 Усилители трансляции. 29 Терминаторы трансляции. 32 Стабилизаторы мРНК. 33 Использование кодонов.

1.3.2. Компартментализация продуцируемого белка.

1.3.3. Экспрессия правильно сворачивающихся белков в Е. coli.

1.3.4. Химерные белки.

1.4. Рандомизация и генетическая селекция как инструмент молекулярной биологии.

Глава II. Получение бактериального суперпродуцента - рецептора активированной протеинкиназы С (RACK1) с помощью генетической селекции сайта инициации трансляции.Результаты и обсуждение.

2.1. Принцип и дизайн системы генетической селекции.

2.2. Конструирование и клонирование синтетического фрагмента COTR в плазмидном векторе pGEM 1.

2.3. Клонирование кодирующей части гена резистентности к тетрациклину Tetr в плазмиду pGEM-C2.

2.4. Схема введения рандомизованного фрагмента.

2.5. Проведение генетической селекции в одноцистронной системе.

2.6. Клонирование кДНК RACK1 в плазмиду pGCT2.

2.7. Тестирование полученного сайта инициации трансляции для одноцистронной системы (RBS-Tet) в двуцистронной конструкции, содержащей гаск\.

2.8. Контрольная конструкция для экспрессии RACK1 в двуцистронной системе.

2.9. Введение рандомизованного фрагмента в двуцистронную конструкцию pGCT-RACK1.

2.10. Искусственный отбор и анализ отдельных клонов.

2.11. Тестирование области инициации трансляции из клона-суперпродуцента в исходном векторе pGCT2.

Глава III. Материалы и методы.

3.1. Реактивы.

3.2. Ферменты. 78 3.3 Материалы.

3.4. Препараты.

3.5. Олигонуклеотиды.

3.6. Штаммы и векторы.

3.7. Лабораторное оборудование. 81.

3.8. Буферы и растворы.

3.9. Методы.

Электрофорез нуклеиновых кислот в неденатурирующем ПААГ.

Трансформация бактериальных клеток и отбор рекомбинантов. 84 Препаративное выделение и плазмидной ДНК методом щелочного лизиса и очистка на ионообменных колонках "Qiagen-tip 500".

Приготовление лизатов клеток для белкового электрофореза.

Белковый электрофорез.

Амплификация ДНК in vitro.

Очистка продуктов амплификации.

Извлечение ДНК из агарозного геля.

Иммуноблотинг.

Клонирование синтетического дуплекса COTR в составе плазмиды pGEMl. 90 Клонирование кодирующей последовательности гена устойчивости к тетрациклину в плазмиду pGEMC2. 91 Клонирование кодирующей последовательности гена рецептора активированной протеинкиназы С - RACK1 в составе плазмиды pGCT2. 92 Введение рандомизованного олигонуклеотида в конструкцию pGCT2/pGCT

RACK1.

Введение синтетического дуплекса RBS-Tet в вектор pGCT-RACKl.

Введение синтетического дуплекса SD в конструкцию pGCT-RACKl.

Искусственный отбор.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение бактериального суперпродуцента рецептора активированной протеинкиназы C(RACK1) с помощью генетической селекции сайта инициации трансляции»

Совершенствование методологии рекомбинантных ДНК поразительно расширило возможности направленного биосинтеза белка. Среди различных систем экспрессии генетических детерминант важное место занимают прокариотические системы. Бактериальные суперпродуценты позволяют получать значительные количества высокоочищенных рекомбинантных белков для использования в медико-биологических и сельскохозяйственных целях.

Для экспрессии в бактериальной системе безинронный ген (кДНК) клонируют в плазмидный вектор, содержащий структурные элементы, необходимые для его транскрипции и трансляции. Наиболее эффективная и широко используемая система транскрипции (система Студиера) включает промотор из фага Т7 в сочетании с бактериальными штаммами, несущими индуцибельный ген Т7-РНК-полимеразы в своем геноме (Studier & Moffat, 1986). Эта система обеспечивает массивную транскрипцию, эффективность которой практически не зависит от структуры целевого гена. Однако, выход белка в одной и той же системе экспрессии может сильно варьировать от гена к гену. Этот факт объясняется тем, что лимитирующей в этих условиях является следующая стадии биосинтеза белка - трансляция, в особенности ее инициация. Эта стадия является наименее предсказуемой, так как ее эффективность сильно зависит от структуры целевого гена, которая в большой степени определяет вторичную структуру участка связывания рибосом.

В идеале сайт связывания рибосом нужно было бы подбирать специально для каждого целевого гена, однако рациональной основы для такого подбора не существует, так что обычно это делается методом проб и ошибок. В нашей работе, вместо рутинного перебора вариантов различных последовательностей, мы разработали комбинаторный подход при котором нужные последовательности выбираются автоматически в результате генетической селекции в специальной системе.

Этот подход позволяет подобрать эффективный сайт инициации трансляции для любого чужеродного гена в одном эксперименте. Эта система была нами использована для создания суперпродуцента рецептора активированной протеинкиназы С - RACK1.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Желябовская, Ольга Борисовна

Выводы:

1. Создана генетическая система, в которой с помощью направленной эволюции можно оптимизировать сайт инициации трансляции чужеродного гена для экспрессии в бактериальной системе.

2. Разработан новый метод введения короткого рандомизованного фрагмента в плазмидный вектор.

3. С использованием разработанной системы получен суперпродуцент рецептора активированной протеинкиназы С (RACK1) человека.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Желябовская, Ольга Борисовна, 2004 год

1. Adhin M.R., van Duin J. (1990) Scanning model for translational reinitiatin in Eubacteria. J.1. Mol. Biol., 213, 811-818.

2. Altuvia S., Oppenheim A.B. (1986) Translational regulatory signals within the coding of the bacteriophage 1 clll gene. J. Bacterial., 167,415-419.

3. Andre A., Puca A., Sansone F., Brandi A., Antico G., Calogero R.A.(2000) Reinitiation ofprotein synthesis in Escherichia coli can be induced by mRNA cis-elements unrelated to canonical translation initiation signals. FEBS Lett., 468, 73-8.

4. Andrews В., Adari H., Hannig G., Lahue E., Gosselin M., Martin S., Ahmed A., Ford P.J.,

5. Hayman E.G., Makrides S.C. (1996) A tightly regulated high level expression vector that utilizes a thermosensitive lac repressor: production of the human T cell receptor V beta 5.3 in Escherichia coli. Gene, 182,101-109.

6. Arora R., Priano C., Jacobson A.B., Mills D.R. (1996) cis-acting elements within an RNAcoliphage genome: fold as you please, but fold you must!! J. Mol. Biol., 258,433-446.

7. Baneyx F. (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol., 10,411-421.

8. Berkhout В., Kastelei R. A., van Duin J. (1985) Translational interference at overlapping reading frames in prokaiyotic messenger RNA Gene, 37,171-179.

9. Berridge M.J. (1984) Inositol triphosphate and diacylglycerol as second messengers. Biochem. J., 220, 345-360.

10. Berridge M.J. (1987) Inositol triphosphate and diacylglycerol: two interacting second messengers. Annu. Rev. Biochem., 56,159-193.

11. Berridge M.J. (1993) Inositol triphosphate and calcium signaling. Nature, 361, 315-325.

12. Birikh K.R., Lebedenko E.N., Boni I.V, Berlin Y.A. (1995) A high-level prokaryotic expression system: synthesis of human interleukin 1 alpha and its receptor antagonist. Gene, 164, 341-345.

13. Birikh K.R., Berlin Y.A., Soreq H., Eckstein F. (1997) Probing accessible sites for ribozymes on human acetylcholinesterase RNA. RNA, 4,429-437.

14. Birikh K.R., Sklan E.H., Shoham S., Soreq H. (2003) Interaction of "readthrough"acetylcholinesterase with RACK1 and PKCbeta II correlates with intensified fear-induced conflict behavior. Proc Natl Acad Sci USA, 100,283-288.

15. Birnboim I.V., Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res., 7,1513-1516.

16. Blum P., Ory J., Bauernfeind J., Krska J. (1992) Physiological consequences of DnaK and DnaJ overproduction in Escherichia coli. J. Bachteriol., 174, 7436-7444.

17. Boni I.V., Isaeva D.M., Musychenko M.L., Tzareva N.V. (1991) Ribosome-messengerrecognition: mRNA target sites for ribosomal protein SI. Nucleic Acids Res., 19,155-162.

18. Botterman J., Hoefte H., Zabeau M. (1987) High-level ezpression of genes under control of cro translation initiation signals in Escharichia coli. J. Biotechnology, 6,71-81.

19. Brinkman U., Mattes R.E. and Buckel P. (1989) High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the drtaY gene product. Gene, 85, 109-114.

20. Buell G., Schulz M.-F., Selzer G., Chollet A., Mowa N.R., Semon D., Escanez S., Kawashima E.1985) Optimizing the expression in E. coli of a synthetic gene encoding Somatomedin-C (EFG-I). Nucleic Acids Res., 13,1923-1938.

21. Buensuceso C.S., Woodside D., Huff JL., Plopper G.E., O'Toole Т.Е. (2001) The WD protein

22. Rackl mediates protein kinase С and integrin-dependent cell migration. J. Cell Sci., 114, 1691-1698.

23. Casadaban M.J., Chou J., Cohen S.N. (1982) Oveiproduction of the Tu3 transposition protein and its role in DNA transposition. Cell, 28,345-354.

24. Chang B.Y., Chiang M., Cartwright C.A. (2001). The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase С and tyrosine phosphorylation of RACK1. J. Biol. Chem., 276,20346-20356.

25. Chen C.S., Nakamoto T. (1978) Translational specificity of Bacillus stearothermophilus ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75,167-171.

26. Choi J.H, Lee S.Y. (2004) Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol., 14, Epub ahead of print.

27. Chopra A.K., Brasier A.R., Das M., Xu X.J., Peterson J.W. (1994) Improved synthesis of Salmonella typhimurium enterotoxin using gene fusion expression systems. Gene, 144, 81-85.

28. Cloney L.P., Bekkaoui D.R., Hemmingsen S.M. (1993) Co-expression of plastid chaperonin genes and a synthetic plant Rubisco operon in Escherichia coli. Plant. Mol. Biol., 23, 1285-1290.

29. Cole P.A. (1996) Chaperone-assisted protein expression. Structure, 4, 239-242.

30. Cone K.C., Steege D.A. (1985) Overexpression of HIV-1 proteins in Escherichia coli by a modified expression vectors and their one-step purification. Protein Expr. Perif., 4,367-372.

31. Cornelis P. (2000) Expressing genes in different Escherichia coli compartments. Curr Opin Biotechnol., 11,450-454.

32. Curry K.A., Tomich C.-S.C. (1988) Effect of ribosome binding site on gene expression in Escherichia coli. DNA,7,173-179.

33. Dalboge H., Carlsen S., Jensen E.B., Christensen Т., Dahl H.-H.M. (1988) Expression of recombinant growth hormone in Escherichia coli: Effect of the region between the shine-Dalgarno sequence and the ATG codon. DNA, 7,399-405.

34. Davis R.W. (1980) DNA sequence of the int-xis-pi region of the bacteriophage lambda: Overlap of the int and xis genes. Nucleic Acids Res., 8,1765-1782.

35. Dieter P., Fitzke E. (1993) Formation of diacylglycerol, inositol phosphates, arachidonic acid and its metabolites in macrophages. Eur. J. Biochem., 218, 753-758.Щ

36. Di Guan C., Li P., Riggs P.D., Inouye H. (1988) Vectors that facilitate the expression and purification of foreign peptides in Escherichia coli by fusion to maltose-binding protein. Gene, 67,21-30.

37. Dunn J., Studier F. (1981) Nucleotide sequence from the genetic left end of bacteriophage T7 DNA to the beginning of gene 4. J. Mol. Biol, 148, 303-330.

38. Erlich H.A. (1979) Levinson J.R., Cohen S.N., McDevitt H.O. (1979) Filter affinity transfer. A new Techniqe for the in situ identification of proteins in gels. J. Biol. Chem., 254,1224012247.

39. Protein Sci. 3,1953-1960. Georgiou G. and Valax P. (1996) Expression of correctly folded proteins in Escherichia coli.

40. Goloubinoff P., Gatenby A.A., Lorimer G.H. (1989) GroE heat-shock proteins promoteassembly of foreign prokaryotic ribulose bisphosphate carboxylase oligomers in Escherichia coli. Nature, 337,44-47.

41. Golshani A., Kolev V., Mironova R., AbouHaidar M.G., Ivanov I.G. (2000) Enhancing activity of epsilon in Escherichia coli and Agrobacterium tumefaciens cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2,508-512.

42. Gren EJ. (1984) Recognition of messenger RNA during translation initiation in Escherichia coli. Biochimie, 66,1-29.

43. Grundstroem Т., von Gabain A., Nilsson G., Anderson M., Lundstroem M., Lund В., Lundgren E.1987) Expression of an interferon-a gene variant in Ecoli using tandemly repeated synthetic ribosomal binding sites. DNA, 6,41-46.

44. Guzman L-M., Belin D., Garson M.J., Beckwith J. (1995) Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol., 177,4121-4130.

45. Hall M.N., Gabay J., Debarbouille M., Schwartz M. (1982) A role for mRNA secondary structure in the control of translation initiatin. Nature, 295,616-618.

46. Hanning G., Makrides S.C. (1998) Strategies for optimizing heterologous protein expression in Escherichia coli. Trends Biotechnol., 16, 54-60.

47. Hartl F.U., Hlodan R., Langer T. (1994) Molecular chaperones in protein folding: the art of avoiding sticky situations. Trends. Biochem. Sci., 19,20-25.

48. Hasan N., Szybalski W. (1995) Construction of /aclts and /aclqts expression plasmids and evaluation of the thermosensitive lac repressor. Gene, 163, 35-40.

49. He D.Y., Vagts A.J., Yaka R., Ron D. (2002) Ethanol induces gene expression via nuclear compartmentalization of receptor for activated С kinase 1. Mol. Pharmacol., 62, 272-280.

50. Hockney R.C. (1994) Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli. Trends Biotechnol., 12,456-463.

51. Humphreys D.P., Weir N. Mountain A. and Lund. P.A.- (1995) Human protein disulfide isomerase functionally complements a dsbA mutation and enhances the yield of pectate lyase С in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 270,28210-28215.

52. Jay E., Seth A.K., Rommens J., Sood A., Jay G. (1982) Gene expression: Chemical synthesis of E.coli ribosome binding sites and their use in directing the expression of mammalian proteins in bacteria. Nucleic Acids Res., 10, 6319-6329.

53. Jones I.M., Brownlee G.G. (1985) Differential expression of influenza N protein and neuraminidase antigenic determinants in Escharichia coli. Gene, 35, 333-342.

54. Johnson J.E., Giorgione J., Newton A.C. (2000) The CI and C2 domains of protein kinase С are independent membrane targeting modules, with specificity for phosphatidylserine conferred by the CI domain. Biochemistry, 39, 11360-11369.

55. Joyce G.F. (1996) Building the RNA world. Ribozymes. Curr. Biol., 6, 965-967.

56. Kidwell J., Valentin H.E., Dennis D. (1995) Regulated expression of the Alcaligenes eutrophus pha biosynthesis genes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 61, 1391-1398

57. Kiely P.A., Sant A., O'Connor R. (2002) RACK1 is an insulin-like growth factor 1 (IGF-1) receptor-interacting protein that can regulate IGF-1-mediated Akt activation and protection from cell death. J. Biol. Chem., 277,22581-22589.

58. Kimura S., Iyanagi T. (2003) High-level expression of porcine liver cytochrome P-450 reductase catalytic domain in Escherichia coli by modulating the predicted local secondary structure of mRNA. J. Biochem., 134,403-413.

59. Kleerebezem M., Heutink M., Tommassen J. (1995) Characterization of an Escherichia coli rot A mutant, affected in periplasmic peptidyl-prolyl cis/trans isomerase. Mol. Microbiol., 18, 313-320.

60. Klovins J., van Duin J., Olsthoorn R.C. (1997) Rescue of the RNA phage genome from RNase III cleavage. Nucleic Acids Res., 25, 4201-4208.

61. Klovins J., TsarevaN.A., de Smit M.H., Berzins V., van Duin J. (1997) Rapid evolution of translational control mechanisms in RNA genomes. J. Mol. Biol., 265,372-384.

62. Kolkova K., Novitskaya V., Pedersen N., Berezin V., Bock E. (2000). Neural cell adhesionmolecule-stimulated neurite outgrowth depends on activation of protein kinase С and the Ras-mitogen-activated protein kinase pathway. J. Neurosci., 20,2238-2246.

63. Vallie E.R., DiBlasio E.A., Kovacic S., Grant K.L., Schendel P.F., McCoy J.M. (1993) A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology N-Y, 11,187-193.

64. MacBeath G., Kast P., Hilvert D. (1998) Probing enzyme quaternary structure by combinatorial mutagenesis and selection. Protein Sci., 7,1757-1767.

65. Makrides S.C. (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev., 60, 512 538.

66. Marquis D.M., Smolec J.M., Katz D.H. (1986) Use of portable ribosome binding site for maximizing expression of a eukaiyotic gene in Escherichia coli. Gene, 42, 175-183.

67. Marrtin J. and Hartl F.U. (1997) Chaperone-assisted protein folding. Curr.Opin. Struct. Biol., 7, 41-52.

68. Matteucci M.D., Heynecker H.L. (1983) Targeted random mutagenesis: the use of ambiguouslysynthesized oligonucleotides to mutagenise sequences immediately 5' of an ATG initiation codoa Nucleic Acids Res., 11,3113-3121.

69. Mayer M, Buchner J. (2004) Refolding of inclusion body proteins. Methods Mol Med., 94,239254.

70. McCarthy J.E.G., Schairer H.U., Sebald W. (1985) Translational initiation frequency of atp operon from Escherichia coli: identification of an intercistronic sequence that enhances translation. EMBO J., 4,519-526.

71. McCarthy J.E.G., Sebald W., Gross G., Lammers R. (1986) Enhancment of translational efficiency by the Escherichia coli atpE translational initiation region: its fusion with two human genes. Gene, 41,201-216.

72. McCarthy J.E.G. (1988) Expression of the unc genes in Escharichia coli. J. Bioen. Biomemb., 20,19-39.

73. McCarthy J.E.G., Bokelman C. (1988) Determinants of translational initiation efficiency in the atp operon of Escherichia coli. Mol. Microbiol., 2,455-465.

74. McCarthy J.E.G., Schauder В., Ziemke P. (1988) Post-translational control in Escharichia coli: translation and degradation of tha atp operon mRNA. Gene, 72,131-139.

75. McLeod M., Shor В., Caporaso A., Wang W., Chen H., Hu L. (2000) Cpc2, a fission yeast homologue of mammalian RACK1 protein, interacts with Rani (Patl) kinase To regulate cell cycle progression and meiotic development. Mol. Cell Biol., 20,4016-4027.

76. Mertens N., Remaut E. Fiers W. (1995a) Tight transcriptional control mechanism ensures stable high-level expression from T7 promoter-based expression plasmids. Biotechnology (N Y), 13,175-179.

77. Mertens N., Remaut E., Fiers W. (19956) Versatile, multi-featured plasmids for high-level expression of heterologous genes in Escherichia coli: overproduction of human and murine cytokines. Gene, 164,9-15.

78. Missiakas D., Georgopoulos C., Raina S. (1994) The Escherichia coli dsbC (xprA) gene encodes a periplasmic protein involved in disulfide bond formation. EMBO J., 13,2013-2020.

79. Mochly-Rosen D., Khaner H., Lopez J. (1991) Identification of intracellular rcepror proteins for activated protein kinase C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 3997-4000.

80. Mochly-Rosen D. (1995) Compartmentalization of protein kinase С by anchoring proteins: a theme in signal transduction. Science, 268,247-251.

81. Mochly-Rosen D., Gordon A.S. (1998) Anchoring proteins for protein kinase C: a means for isozyme selectivity. FASEBJ., 12, 35-42.

82. Moore J.T., Uppal A., Maley F., Maley G.F. (1993) Overcoming inclusion body formation in a high-level expression system. Protein Expr. Purif, 4,160-163.

83. Mowa N.R., Nakamura K., Inouye M. (1980) Gene structure of the OmpA protein, a major surface protein of Escherichia coli required for cell-cell interaction. J. Mol. Biol., 177,663-683.

84. Nilsson В., Abrahmsen L. (1990) Fusions to staphylococcal protein A. Methods Enzymol., 185, 144-161.

85. Nishizuka Y. (1984) The role of protein kinase С in cell surface signal transduction and tumor promotion. Nature, 308, 693-698.

86. Nishizuka Y. (1986) Studies and perspectives of protein kinase C. Science, 233,305.

87. Nishizuka Y. (1988) The molecular heterogeneity of protein kinase С and its implications for cellular regulation. Nature, 334, 661-665.

88. Nishizuka Y. (1992) Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Sciense, 258, 607-614.

89. Nishizuka Y. (1995) Protein kinase С and lipid signaling for sustained cellular responses. FASEB J., 9,484-496.

90. O'Connor, M. and Dahlberg, A.E. (2001) Enhancement of translation by the epsilon element is independent of the sequence of the 460 region of 16S rRNA. Nucleic Acids Res., 29, 1420-1425.

91. Ohno S., Nishizuka Y. (2002). Protein kinase С isotypes and their specific functions: prologue. J Biochem. (Tokyo), 132, 509-11.

92. Olins P.O., Devine C.S., Rangwala S.H., Kavka K.S. (1988) The T7 phage gene 10 leader RNA, a ribosome-binding site that dramatically enhances the expression of forein genes in Escherichia coli. Gene, 73, 227-235.

93. Olsen M.K., Rockenbach S.K., Curry K.A., Tomich C.-S.C. (1989) Enhancement ofheterologous polypeptide expresson by alterations in the ribosome binding-site sequence. J. Biotechnol., 9,179-190.

94. Olsthoorn R.C., Licis N., van Duin J. (1994) Leeway and constraints in the forced evolution of a regulatory RNA helix. EMBOJ., 13, 2660-2668.

95. Olsthoorn R.C., Zoog S., van Duin J. (1995) Coevolution of RNA helix stability and Shine-Dalgarno complementarity in a translational start region. Mo I. Microbiol., 15, 333-339.

96. Olsthoorn R.C., van Duin J. (1996) Random removal of inserts from an RNA genome: selection against single-stranded RNA. J. Virol., 70, 729-36.

97. Ostermeier M and Georgiou G. (1994) The folding of bovine pancreatic trypsin inhibitor in the Escherichia coli periplasm. J. Biol. Chem., 269,21072-21077.

98. Ostermeier M., De Sutter K., Georgiou G. (1996) Eukaryotic protein disulfide isomerase complements Escherichia coli dsbk mutants and increases the yield of a heterologous secreted protein with disulfide bonds. J. Biol. Chem., 271,10616-10622.

99. Pedersen-Lane J., Maley G.F., Chu E., Maley F. ( 1997) High-level expression of human thymidylate synthase. Protein Expres. Purif., 10,256-262.

100. Perez-Perez J., Gutierrez J. (1995) An arabinose-inducible expression vector, pAR3, compatible with ColE 1-derived plasmids. Gene, 185,141-142.

101. Poole E.S., Brown C.M. and Tate W.P. (1995) The identity of the base following the stop codon determines the efficiency of in vivo translational termination in Escherichia coli. EMBO J., 14,151-158.

102. Pugsley A.P., Francetic О., Possot O.M., Sauvonnet N., Hardie K.R. (1997) Recent progress and future directions in studies of the main terminal branch of the general secretory pathway in Gram-negative bacteria--a review. Gene, 52, 13-19.

103. Pugsley A.P., Francetic O., Driessen A.J., de Lorenzo V. (2004) Getting out: protein traffic in prokaryotes. Mol Microbiol., 1,3-11.

104. Puri N., Appa Rao K.B., Menon S., Panda A.K., Tiwari G., Garg L.C., Totey S.M. (1999) Effect of the codon following the ATG start site on the expression of ovine growth hormone in Escherichia coli. Protein Expr Purif., 17,215-23.

105. Ringquist S., Shinedling S., Barrick D., Green L., Binkley J., Stormo G.D. Gold L. (1992) Translation initiatin in Escherichia coli: sequences within the ribosome-binding site. Mol. Microbiol., 6, 1219-1229.

106. Ron D., Chen C.-H., Caldwell J., Jamieson L.,Orr E., Mochly-Rosen D. (1994) Cloning of an intracellular receptor for protein kinase C; a homo log of the P subunit of G proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 839-843.

107. Ron D., Jiang Z., Yao L., Vagts A., Diamond I., Gordon A. (1999) Coordinated movement of RACK1 with activated betallPKC. J. Biol. Chem., 274,27039-27046.V

108. Russ W.P., Engelman D.M. (1999) TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 96, 863-868.

109. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, p.A12.

110. Sambrook J., Russel D.W. (2001) Molecular Cloning. A laboratory manual. Gold Spring Harbor, New York.

111. Sandkvist M. and Bagdasarian M. (1996) Secretion of recombinant proteins by Gram-negativebacteria. Curr. Opin. Biotechnol., 7, 505-511.

112. Schechtman D., Mochly-Rosen D. (2001) Adaptor proteins in protein kinase C-mediated signal transduction. Oncogene, 20,6339-6347.

113. Scherer G., Walkinshaw M., Amott S., Moore D. (1980) The ribosome binding sites recognized by Escherichia coli ribosomes have regions with signal character in both the leader protein coding segments. Nucleic Acids Res., 8,3895-3907.

114. Schine J., Dalgarno L. (1974) The 3' terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: Complementarity to nonsence triplets and ribosome binding sites. Proc Natl. Acad. Sci. USA, 71,1342-1346.

115. Schoner B.E., Hsiung H.M., Belagaje R.M., Mayne M.G., Schoner R.G. (1984) Removal of aterminator structure by RNA processing regulates int gene expression. J. Mol. Biol., \16,39-53.

116. Schottel J.L., Shinsky J. J., Cohen S.N. (1984) Effects of alterations in the translation control region on bacterial gene expression: Use of cat gene constructs transcribed from the lac promoter as a model system. Gene, 28,177-193.

117. Shepard H.M., Yelverton E., Goeddel D. (1982) Increased synthesis in E.coli of fobroblast and leukocyte interferons through alterations in ribosome binding sites. DNA, 1,125-131.

118. Shigesada K., Itamura S., Kato M., Hatanaka M, Imai M., Tanaka M., Masuda N., Nagai J., Nakashima K. (1987) Construction of a new plasmid vector that can express cloned cDNA in all translational reading frames. Gene, 53, 163-172.

119. Singer B.S., Gold L., Shinedling S.T., Colkitt M., Hunter L.R., Prinow D., Nelson M.A. (1981) Analysis in vivo of translational mutants or the rllB cistron in bacreriophage T4. J. Mol. Biol, 149,405-432.

120. Smith D.B. and Johnson K.S. (1988) Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene, 67,31-40.

121. Sosnick T.R., Mayne L., Hiller R., Englander S.W. (1994) The barriers in protein folding. Struct. Biol., 1, 149-156.

122. Sprengart M.L., Fatsher H.P., Fuchs E. (1990) The initiation of translation in E.coli: apparent base pairing between the 16S rRNA and downstream sequences of the mRNA. Nucleic Acids Res., 18, 1719-1723.

123. Stader J.A. and Silhavi T.J. (1990) Engineering Escherichia coli to secrete heterologous gene products. Methods Enzymol., 185,166-187.

124. Steitz J. A. (1969) Polypeptide chain initiation: nucleotide sequences of the three ribosomal binding sites in bacteriophage R17 RNA. Nature, 224,957-964.

125. Stenstrom C.M., Isaksson L.A., (2002) Influences on translation initiation and early elongation by the messenger RNA region flanking the initiation codon at the 3' side. Gene, 288,1-8.

126. Stormo G., Schneider Т., Gold L. (1982a) Characterization of translation initiation sites in Escherichia coli. Nucleic Asids Res., 10,2971-2996.

127. Stormo G., Schneider Т., Gold L., Ehrenfeucht A. (19826) Characterization of translation initiation sites in Escherichia coli. Nucleic Asids Res., 10,2997-3011.

128. Stormo G.D. (1986) Translation initiation. Maximizing gene expression / Eds Reznikoff W., Gold L. Boston: Butterworths, pp 196-212.

129. Studier F.W., Moffat B.A. (1986) Use of bacteriophage T7 polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol., 189,113-130.

130. Suissa M., Altuvia S., Koby S., Giladi H., Oppenheim. (1988) Translational signals of a major head protein gene og bacterophage lambda. Mol. Gen. Genet., 214, 570-573.

131. Tessier L.-H., Sondermeyer P., Faure Т., Dreyer D., Benavente A., Villaval D., Courtney m., Lecocq j.-p. (1984) Yhe influence og mRNA primary and secondary structure on human gamma interferon gene expression in E.coli. Nucleic Acids Res., 12,1663-1615.

132. Thomas J.G., Ayling A., Baneyx F. (1997) Molecular chaperones, folding catalysts, and therecovery of active recombinant proteins from E. coli. To fold or to refold. Appl. Biochem. Biotechnol., 66,197-238.

133. Tomich C.-S.C., Olson E.R., Olsen M.K., Kaytes P.S., Rockenbach S.K., Hatzenbuhier N.T. (1989) Effect of nucleotide sequences directly downstream from the AUG on the expression of bovine somatotropin in E.coli. Nucleic Acids Res., 17, 3179-3197.

134. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. (1979) Electrophoresis transfer of proteins frompolyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedures and some applications. Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 76,4350-4354.

135. Vize P.D., Wells J.R.E. (1987) Spacer alterations wich increase the expression of porcine growth hormone in E.coli. FEBSLett., 213,155-158.

136. Wall J.G. and Pluckthun A. (1995) Effects of overexpressing folding modulators on the in vivo folding of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol., 6, 507-516.

137. Warburton N., Boseley P.G., Porter A.G., (1983) Increased expression of a cloned gene by local mutagenesis of its promoter and ribosome binding site. Nucleic Acids Res., 11,5837-5854.

138. Weikert M.J., Doherty D.H., Best E.A., Olins P.O. (1996) Optimization of heterologous protein production in Escherichia coli. Current. Opinion in Biotechnology, !, 494—499.

139. Wetzel R. (1994) Mutations and off-pathway aggregation of proteins. Trends Biotechnol, 12, 193-198.

140. WhiteholnN., Livak K.J., Pettewey S.R. (1985) The effects of hybrid ribosome binding site variants on the expression of human interferon-B in E.coli. Gene, 36,375-379.

141. Wilkinson D.L. and Harrison R.G. (1991) Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnology N-Y., 9,443-448.

142. Wood D.W., Wu W., Belfort G., Derbyshire V, Belfort M. (1999) A genetic system yields self-cleaving inteins for bioseparations. Nat. Biotechnol, 17, 889-892

143. Wulfing С: and Pluckthun A. (1994) Correctly folded T-cell receptor fragments in the periplasm of Escherichia coli. Influence of folding catalysts. J. Mol. Biol., 242,655-669.

144. Yabuta M., Miura-Onai S., Ohsuye K. (1995) Thermo-inducible expression of a recombinant fusion protein by Escherichia coli lac repressor mutants. J. Biotechnol., 39, 67-73.

145. Yaka R., Thornton C., Vagts A J., Phamluong K., Bonci A., Ron D. (2002) NMDA receptorfunction is regulated by the inhibitory scaffolding protein, RACK1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99,5710-5715.

146. Yasukawa Т., Kanei-Ishii C., Maekawa Т., Fujimoto J., Yamamoto Т., Ishii S. (1995) Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin. J. Biol. Chem270,25328-25331.

147. Yoon S. K., Kang W.K., Park Т.Н. (1996) Regulation of trp promoter for production of bovine somatotropin in recombinant Escherichia coli fed-batch fermentation. J. Ferment. Bioeng., 81, 153-157.

148. Zabeau M., Stanley K.K. (1982) Enhanced expression of cro-P-galactosidase fusion proteins under the control of the Pr promoter of bacteriophage lambda. EMBO J., 1,1217-1224.

149. Гуревич А.И., Есипов P.C., Качалина Т.А., Каюшин A.JI. (1995) Зависимость уровня экспрессии гена в E.coli от структуры участка инициации трансляции (TIR). I. Первичная структура TIR. Биоорган, химия, 20,117-123.

150. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. (1992а) Метаболизм фосфоинозитидов и формирование кальциевого сигнала в клетках. Цитология, 34,26-44.

151. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. (1984) Молекулярное клонирование. М. «Мир».

152. Остерман Л.А. (1985) Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультраценрифугирование. М., Наука.