Разработка оптогенетических инструментов на основе опсинов первого и второго типа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Иджилова Ольга Степановна

• Иджилова Ольга Степановна
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Иджилова Ольга Степановна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Цель и задачи исследования

Научная новизна исследования

Теоретическая ценность и практическая значимость диссертации

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация диссертации

Публикации

Личный вклад

Структура и объем диссертации

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Значение оптогенетической методики в физиологии

1.2 Микробные опсины (опсины первого типа) и их применение в оптогенетике

1.3 Опсины животных (опсины второго типа) и их применение в оптогенетике

1.4 Способы доставки генетических векторов и принципы генетического таргетирования

1.5 Флуоресцентные сенсоры и полностью оптические (all-optical) подходы в физиологии

1.6 Дегенеративные заболевания сетчатки и ее оптогенетическое протезирование

1.7 Заключение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Животные

2.2 Вирусные и плазмидные векторы

2.3 Приготовление первичных нейрональных культур гиппокампа

2.4 Приготовление первичных нейрональных культур неокортекса и электропорация in vitro

2.5 Вирусная трансдукция культивированных нейронов

2.6 In utero электропорация головного мозга мышиных эмбрионов

2.7 Методика интравитреальной инъекции вирусных векторов

2.8 Растворы для электрофизиологических экспериментов

2.9 Электрофизиологическая регистрация активности культивированных нейронов гиппокампа

2.10 Полностью оптический электрофизиологический эксперимент

2.11 Приготовление переживающих корональных срезов неокортекса мышей

2.12 Электрофизиологическое картирование искусственных светочувствительных полей нейронов на переживающих срезах мышиного неокортекса

2.13 Обучение животных в трапециевидном водном лабиринте Морриса

2.14 Приготовление фиксированных препаратов соматосенсорной коры

2.15 Морфологический анализ препаратов соматосенсорной коры

2.16 Морфологический анализ препаратов сетчатки

2.17 Статистический анализ данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Исследование функциональных свойств канального родопсина из водоросли P. subcordiformis

3.1.1 Быстрые и медленные компоненты фототоков в культивированных нейронах, экспрессирующих опсины

3.1.2 Импульсная световая стимуляция нейронов

3.1.3 Фототоки при стимуляции светом зеленой области спектра

3.1.4 Оценка эффекта краткосрочной инкубации культур с полностью транс-ретиналем

3.2 Пилотный полностью оптический электрофизиологический эксперимент

3.3 Применение таргетирующего мотива калиевого канала Kv2.1 для обеспечения центральной локализации опсинов

3.3.1 Нарушение таргетирующих свойств мотива калиевого канала Kv2

3.3.2 Оптогенетическое картирование светочувствительных полей нейронов

3.4 Оптогенетическое протезирование дегенеративной сетчатки с использованием неселективной экспрессии опсина колбочек

3.4.1 Тестирование протезированных мышей в трапециевидном водном лабиринте

3.4.2 Результаты морфологического анализа трансфицированных сетчаток

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 Канальный родопсин из водоросли P. subcordiformis как перспективный оптогенетический инструмент

4.2 Механизмы нарушения таргетирующих свойств мотива калиевого канала Kv2

4.3 Перспективы для применения коротковолнового колбочкового опсина в оптогенетическом протезировании дегенеративной сетчатки

ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

Тезисы

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Список рисунков

Список таблиц

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка оптогенетических инструментов на основе опсинов первого и второго типа»

Актуальность темы исследования

Оптогенетика представляет собой метод, позволяющий управлять при помощи света активностью клеток, в которых экспрессированы те или иные светоактивируемые белки. Однако существует также более позднее и широкое определение этого термина, когда в оптогенетику включают оптическую регистрацию активности нейронов или изменения их биохимических показателей при помощи генетически-кодируемых флуоресцентных зондов (например, кальциевых зондов).

Оптогенетика относится к тем методам, появление которых кардинальным образом расширило возможности экспериментальной нейрофизиологии. В основе оптогенетики лежит сочетание оптических и генетических технологий, которое позволяет с помощью света возбуждать или тормозить нейронные популяции, выделенные в соответствии с паттернами их активности, молекулярным фенотипом, либо схемой морфологических проекций в определенные структуры нервной системы. Ключевые свойства этой методики - популяционная селективность, высокое пространственное (отдельные клетки и даже их части) и временное (миллисекунды) разрешение стимулов и малая инвазивность (за счет того, что стимуляция осуществляется с помощью света) [44]. Избирательно модулируя активность нейронных сетей и одновременно регистрируя электрический ответ мозга и/или поведение животного, экспериментатор обретает уникальную возможность детально изучить функциональную роль той или иной популяции нейронов [40].

Основным инструментом оптогенетики в первоначальном ее смысле являются трансмембранные белки опсины, которые активируются под воздействием света определенной длины волны и ретранслируют этот сигнал в клетку - либо в виде трансмембранного ионного тока, либо путем активации внутриклеточных молекулярных каскадов. Опсинов, как природного происхождения, так и генномодифицированных, существует большое множество. Различают микробные опсины (опсины первого типа), которые представлены ионными каналами или насосами с определенной ионной специфичностью и проницаемостью, а также опсины позвоночных (опсины второго типа), которые являются О-белок-связанными фоторецепторами. Опсины также различаются по форме хромофора, спектральной светочувствительности, кинетическим и другим параметрам [87].

Существующий в настоящее время широкий набор оптогенетических инструментов позволяет подобрать оптимальные светоактивируемые белки и их комбинации для каждой конкретной задачи.

Например, можно подобрать пары опсинов со слабо перекрывающимися спектрами возбуждения, что позволяет осуществлять разнонаправленную стимуляцию в одном эксперименте [54] или подобрать опсин с высокой скоростью срабатывания для обеспечения высокочастотной стимуляции нейронов [94]. Часто для решения конкретных задач возникает необходимость в целенаправленном конструировании усовершенствованных мутантных форм опсинов или в поиске новых вариантов этих белков методами геномного скрининга. В связи с этим, постоянное пополнение арсенала оптогенетических инструментов представляет собой один из основных факторов прогресса в данной области. В данной работе мы занимались исследованием функциональных свойств нового опсина PsChR2, спектр возбуждения которого смещен в коротковолновую область, что открывает возможности для проведения полностью оптических нейрофизиологических экспериментов, в которых и стимуляция нейронов и регистрация их активности осуществляется при помощи оптических методов.

Помимо этого, для успешного решения той или иной экспериментальной задачи ключевую роль играет способ экспрессии светоактивируемых белков в нервной ткани, что включает в себя различные способы доставки генетических векторов в живую ткань, использование специфических промоторов, а также белковых мотивов, обеспечивающих необходимое субклеточное таргетирование продукта [52]. Здесь необходимо отметить, что термин «таргетирование» (от англ. «targeting») имеет как минимум два устоявшихся значения в научной лексике. В своем первом значении таргетирование означает нацеливание на определенную популяцию клеток-мишеней. Например, использование Cre-рекомбиназы под промотором парвальбумина позволяет селективно экспрессировать целевой белок в парвальбумин-экспрессирующих интернейронах (иначе говоря, таргетировать интернейроны этого подтипа) [203]. Второе значение термина «таргетирование» отсылает к использованию аминокислотных сигнальных последовательностей внутриклеточного транспорта, которые обеспечивают необходимую субклеточную локализацию экспрессии (субклеточное таргетирование) продукта [52]. Такие аминокислотные последовательности иначе называют таргетирующими, или нацеливающими. В данной работе мы будем употреблять термин «таргетирование» и однокоренные «таргетировать», «таргетирующий» именно в этом втором значении.

В рамках этой проблематики в настоящей работе было проведено исследование функциональных свойств мотива калиевого канала Kv2.1, обеспечивающего центральное соматодендритное таргетирование канального родопсина при образовании белка слияния с последним [79].

Наряду с фундаментальной наукой, благодаря вышеперечисленным уникальным свойствам оптогенетика имеет широкие перспективы для новых клинических применений, таких как медицинские исследования и терапия нейродегенеративных, неврологических, онкологических, метаболических и сердечно-сосудистых заболеваний. В качестве примеров, не связанных с нейробиологией, отметим успехи, достигнутые в локальной оптогенетической регуляции возбудимости сердечной ткани и оксигенации ишемических очагов, а также светоиндуцибельные системы Сге-1охР для локальной сайт-специфичной рекомбинации ДНК [202].

Одним из перспективных подходов клинического применения оптогенетики является протезирование дегенеративной сетчатки. Идея этого подхода заключается в том, чтобы при гибели фоторецепторов при том или ином дегенеративном заболевании наделить светочувствительностью выжившие элементы сетчатки - биполярные или ганглионарные нейроны - путем экспрессии в них светочувствительных белков [6]. Одним из широко распространенных дегенеративных заболеваний сетчатки является пигментный ретинит. Пигментный ретинит объединяет группу наследственных палочко-колбочковых дистрофий сетчатки с разнообразным генетическим бэкграундом и средней распространенностью 1:4000 [151]. Такие дистрофии являются ведущей причиной полной потери зрения среди населения трудоспособного возраста, по той причине, что до сих пор отсутствуют терапевтические подходы, которые позволили бы остановить или замедлить дегенерацию. Сетчатка очень уязвима по отношению к воздействию любых негативных факторов; дегенерация палочек по принципу домино приводит к гибели колбочек и патологическому ремоделированию остальных структурных слоев сетчатки.

Для отдельных, наиболее распространенных моногенных наследственных дегенераций сетчатки целесообразна разработка генной терапии, направленной на внесение рабочей копии того или иного мутировавшего гена в клетки сетчатки [18], однако этот подход применим далеко не всегда. Поэтому развиваются и принципиально иные подходы, в частности оптогенетическое протезирование, которое предполагает с помощью опсинов придать фоторецепторную функцию тем клеткам сетчатки, которые изначально ею не обладали, - например, биполярным или ганглионарным. Таким образом, после гибели палочек и колбочек остается шанс восстановить не только чувствительность сетчатки к свету, но и некоторые аспекты первичной обработки ею светового потока. Потенциально, такой подход еще и позволит замедлить процессы хаотического образования новых связей между клетками, лишенными своих основных входов, и предотвратить их гибель [5]. В рамках данного подхода в настоящей работе мы исследовали возможность использования неселективной экспрессии коротковолнового опсина колбочек для оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является анализ особенностей функционирования микробных опсинов (первого типа) и опсинов позвоночных (второго типа) при их эктопической экспрессии в нервных клетках, в частности для целей оптогенетического протезирования сетчатки. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать функциональные свойства нового микробного опсина PsChR2, выделенного из одноклеточной водоросли Platymonas subcordiformis, экспрессируемого в культивированных нейронах гиппокампа, в сравнении с классическим канальным родопсином-2 из Chlamydomonas гвткаМШ.

2. Определить потенциал микробного опсина PsChR2 для применения в полностью оптических экспериментах.

3. Изучить особенности субклеточной локализации конструкции, состоящей из мотива калиевого канала ку2.1 и канального родопсина-2, экспрессируемой в нейронах 2/3 слоев неокортекса мыши.

4. Оценить эффективность оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки модельных слепых мышей с помощью неселективной экспрессии коротковолнового опсина колбочек.

Научная новизна исследования

Впервые были оценены предельные частоты генерации светоиндуцированных потенциалов действия у нейронов, экспрессирующих опсин PsChR2, на широком диапазоне частот световой стимуляции.

Впервые было показано, что в нейронах сома-таргетирующая способность мотива канала ку2.1 может нарушаться при оверэкспрессии белкового продукта, причем в этом случае продукт распространяется безадресно по всей клетке.

Впервые продемонстрирована возможность проведения полностью оптического эксперимента, при котором стимуляция нейронов производится за счет опсина PsChR2, а регистрация активности - при помощи кальциевого зонда RGECO1.

Впервые была осуществлена неселективная экспрессия коротковолнового опсина колбочек в нейронах дегенеративной сетчатки мышей, являющихся моделью пигментного ретинита, и показано значимое улучшение зрительной функции у протезированных животных в поведенческом тесте.

Теоретическая ценность и практическая значимость диссертации

Полученные нами данные могут быть полезны исследователям при проведении экспериментов с экспрессией различных генетических конструкций, в том числе несущих мотивы, обеспечивающие субклеточное таргетирование целевого белка. Результаты нашей работы могут быть использованы при проведении оптогенетических экспериментов, в частности полностью оптических, в фундаментальной и прикладной нейробиологии. Данные, полученные в данной работе, могут быть применены также для разработки инновационных методик терапии наследственных дистрофий сетчатки при помощи ее оптогенетического протезирования.

Положения, выносимые на защиту

1. Бактериальный опсин PsChR2 является перспективным оптогенетическим инструментом, который обеспечивает высокую частоту светоиндуцированных потенциалов действия в нейронах, в сочетании с возможностью одновременной оптической регистрации их активности при помощи генетически кодируемых красных кальциевых индикаторов (полностью оптический эксперимент).

2. При оверэкспрессии бактериального опсина с мотивом ку2.1 в нейронах нарушение таргетирования носит дискретный характер: большинство клеток либо сохраняет центральную локализацию продукта, либо продукт равномерно распределяется по всем дендритам; количество нейронов, демонстрирующих промежуточный паттерн, при этом минимально.

3. Коротковолновый колбочковый опсин может быть использован в качестве оптогенетического инструмента для протезирования дегенеративной сетчатки при ее наследственной дистрофии.

Степень достоверности и апробация диссертации

Материалы диссертации были представлены на Всероссийской конференции «Оптогенетика+ 2023» (ИЭФБ РАН, г. Санкт-Петербург, 2023), на XXV, XXVI, XXVII и XXIX научных школах-конференциях молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии (ИВНД и НФ РАН, г. Москва, 2021, 2022, 2023, 2025).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки

Российской Федерации и индексируемых международными базами данных научного цитирования Scopus и Web of Science Core Collection.

Личный вклад

Автор принимала участие в разработке протоколов всего исследования. Автор лично участвовала в этапах исследования, включающих работу с животными и поведенческое тестирование; процедуру in utero электропорации; интравитреальную трансдукцию вирусных векторов; приготовление и ведение первичных нейрональных культур; электрофизиологические эксперименты на первичных культурах нейронов и переживающих срезах головного мозга; подготовку и морфологический анализ препаратов; обработку и статистический анализ данных. Автор не участвовала в создании плазмидных и вирусных векторов.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы, включающего 212 наименований, списка публикаций по теме диссертации, списка иллюстративного материала. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 5 таблицами.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Значение оптогенетической методики в физиологии

Оптогенетическая методика была создана всего четверть века назад. Спустя недолгий срок она произвела революцию в физиологических исследованиях, вошла в число нейробиологических методик «золотого стандарта» [1, 145], а также нашла применение в медицине (биомедицинские направления) [212]. Оптогенетические подходы, в первую очередь, являются технологией и продуктом научно-технологического прогресса и продолжают активно расширяться по мере того, как развиваются смежные области - фотоника и оптические интерфейсы, технологии генной инженерии, флуоресцентная микроскопия и другие.

Основная идея и непревзойденное преимущество оптических методик - дистанционное управление активностью особых светочувствительных белков-мишеней с помощью светового излучения. Нередко с помощью света производится и регистрация активности клеток - по сигналу флуоресцентных молекул-индикаторов [132]. Благодаря использованию света в качестве канала передачи информации, обеспечивается, во-первых, малая инвазивность и минимальное повреждение окружающих тканей, а во-вторых, высокое временное и пространственное разрешение стимуляции и регистрации, ограниченное лишь скоростью отклика клеток и их пространственной конфигурацией. Последнее крайне существенно в электрофизиологических исследованиях клеток нервной системы и миокарда, поскольку паттерны их активности разыгрываются на временных масштабах порядка нескольких миллисекунд [42, 26].

Вторая основа термина оптогенетика - «генетика» - означает, что основные используемые инструменты (светоактивируемые белки) являются генетически кодируемыми. Также «генетика» обозначает способ доставки оптогенетических инструментов при помощи внедрения в клетки кодирующей специфической ДНК. Кроме того, «генетика» - это еще и стратегии генетического таргетирования, то есть адресной доставки генетических векторов в клетки определенного типа, а также организация транспорта белковых продуктов в определенные компартменты или субкомпартменты этих клеток.

Оптогенетические методы позволяют в подробностях изучать, как функционируют живые системы на разных уровнях организации [1]. Манипулировать биохимическими процессами отдельно взятой клетки можно, например, таким образом:

- регулировать проницаемость клеточной мембраны (особенно востребованно в электрофизиологических экспериментах) и проницаемость мембран внутриклеточных органелл [193];

- модулировать активность ключевых участников внутриклеточных сигнальных каскадов [177];

- управлять процессами рекрутирования скаффолдных [172] и транспортных [19] белков

- и даже светозависимо регулировать транскрипцию [76].

В дальнейшем мы более подробно опишем оптогенетические молекулярные инструменты, которые применяются в электрофизиологических исследованиях, на которых в том числе базируется данная работа. В первую очередь, это белки опсины, которые представляют собой светоуправляемые ионные каналы или насосы, либо рецепторы, связанные с G-белком; генетически кодируемые индикаторы кальция (genetically encoded calcium indicators, GECI) и генетически кодируемые индикаторы трансмембранного потенциала (genetically encoded voltage indicators, GEVI); а также другие генноинженерные химерные белки, у которых один из доменов является специфически чувствительным к воздействию светового излучения определенного спектра. Тем или иным путем генетическая последовательность такого белка может быть интродуцирована в клетку как in vitro, так и in vivo, после чего в этой клетке начинает экспрессироваться искомый продукт.

Для того чтобы оптически стимулировать отдельные клетки, применяют многомодовое оптоволокно, которое вводится в стеклянную пэтч-пипетку параллельно с электродом. Более продвинутые наследники этой конструкции - оптроды, в которых оптоволокно и электрод интегрированы в единый компактный элемент [50]. Кроме того, некоторые типы оптродов позволяют параллельно вести регистрацию сигнала флуоресценции.

Если объектом исследования являются организованные популяции клеток, такие как нейронные ансамбли [174] или функциональный синцитий сердечной ткани [53], то генетические методы позволяют нацелиться на интересующие клеточные популяции, а оптические - избирательно и независимо модулировать активность этих популяций, одновременно регистрируя возникающие эффекты. Хотя необходимо сказать, что практически в любом случае масштаб исследования будет ограничен полем зрения объектива микроскопа либо областью воздействия оптрода.

В зависимости от постановки задачи, «популяцией» могут считаться присутствующие в наблюдаемой области мозга клетки определенного молекулярно-функционального типа (например, пирамидные нейроны определенного слоя коры) или подтипа (например, парвальбумин-

положительные интернейроны). Иной подход представлен системами маркировки популяций клеток в зависимости от их активности.

Маркировка клеток, обусловленная активацией непосредственно ранних генов, реализуется на трансгенных животных с тамоксифен-индуцируемой Cre-Lox-системой, где последовательность Сге-рекомбиназы стоит под промотором непосредственно раннего гена, а Lox-кассета содержит последовательность флуоресцентного белка, который и выполняет роль метки [133]. Маркировка уровня кальциевой активности осуществляется с помощью интегративных сенсоров внутриклеточной концентрации кальция: их спектр флуоресценции может переключаться за счет фотоиндуцируемой кальций-зависимой конверсии [58].

Благодаря таким исследованиям in vivo удается вычленить роль отдельных нейронных ансамблей в различных аспектах поведения, в приобретении опыта [72], в сенсорной обработке [203], в процессах онтогенеза нервной системы [24] и т.д.

Незаменим вклад оптогенетики в функциональное картирование связей между различными зонами неокортекса, а также между структурами мозга, в том числе in vivo [105]. Один из вариантов заключается в избирательной фотостимуляции или, что может быть не менее ценным, фотоингибировании входов в структуру из определенной другой структуры мозга, в которую была произведена трансдукция белка-фотоактюатора.

В арсенале оптогенетики имеется множество средств для прецизионного управления клеточными и молекулярными процессами, что потенциально представляет ценность для ряда клинических применений, таких как, например, восстановление зрения при пигментном ретините; регуляция иммунного ответа во время иммунной терапии рака; контролируемая регуляция уровня глюкозы в крови при диабете; моделирование, диагностика и компенсация сердечных аритмий; различные биоэлектрические импланты и др. [212]. В ближайшей перспективе ожидается завершение клинических испытаний оптогенетического протеза сетчатки, безопасность которого уже подтверждена [ 162]. Однако, в отличие от сетчатки, большинство органов млекопитающих не обладают иммунной привилегией, поэтому сохраняется риск нежелательного иммунного ответа, как и другие риски, характерные для генной терапии [53].

1.2 Микробные опсины (опсины первого типа) и их применение в оптогенетике

Светочувствительные белки опсины распространены в разнообразных живых организмах, начиная с архей и бактерий, заканчивая позвоночными животными. По происхождению и функции эти белки подразделяют на две большие группы: микробные опсины, которые являются

светоактивируемыми ионными каналами или насосами, и опсины животного происхождения, которые являются G-белок-связанными рецепторами.

Светоуправляемые белки, которые применяются в оптогенетике, - это натуральные, а также генноинженерные и химерные варианты различных встречающихся в природе светочувствительных белков, чаще всего бактериальных опсинов. Именно с бактериальных опсинов, таких как канальный родопсин-2, начиналась оптогенетика [57]. Они представляют собой ионный канал или насос, связанный со светочувствительным хромофором ретиналем - производным витамина А. При физиологических условиях основные переносимые ионы - натрий и хлор. Благодаря такому строению бактериальные опсины реагируют на свет быстро, и за счет одновременного открытия множества таких каналов изменяется мембранный потенциал клетки. Поэтому их используют для того, чтобы напрямую модулировать нейронную активность с помощью света, путем деполяризации или гиперполяризации мембраны. На данный момент существует большое количество канальных родопсинов, адаптированных под разнообразные применения [124, 9].

До настоящего времени наиболее широко применяемым в нейробиологии оптогенетическим инструментом остается канальный родопсин-2 Он, как и канальный родопсин-1, был

клонирован из зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii и является типичным родопсином микробного типа. Это трансмембранный белок, который активируется видимым светом определенного спектра (максимум поглощения составляет 470 нм [134, 171, 179]), поглощая фотоны с помощью ковалентно связанного с ним хромофора ретинальдегида (ретиналя). Конформация ретиналя изменяется в процессе обратимой фотоизомеризации полностью-транс-изоформы в 13-цис-изоформу, и это напрямую приводит к движению ионов через клеточную мембрану [144]. Именно благодаря этому ChR2 при освещении функционирует как ионный канал. А именно, он является катионным каналом с низкой селективностью (Н+, №+, в меньшей степени Са2+), чем и объясняются его деполяризующие свойства в большинстве случаев [134].

Канальный родопсин-2 стал инструментом первой линии и практически синонимом оптогенетики. Он был применен в бесчисленном множестве исследований разной направленности, например для картирования нейронных сетей [194, 150], для управляемой индукции процессов синаптической пластичности [210], изучения нейро-глиальных взаимодействий [34, 211], восстановления зрительной функции у грызунов с дегенеративной сетчаткой [23, 154], в исследованиях свободного поведения животных [78, 199] и т.д. Тем не менее, в естественном виде у этого микробного опсина был ряд особенностей, которые в определенных условиях являлись недостатками. К ним можно отнести уже упомянутую неселективную проницаемость по отношению к катионам. Кроме того, максимум светочувствительности приходится на синий свет, который

плохо проникает в живые ткани. Эти и другие особенности побуждали исследователей, с одной стороны, искать новые опсины в геномах живых существ, а с другой - заниматься генетическими модификациями уже известных опсинов. И то, и другое направления оказались вполне успешными.

Со времен открытия естественно существовавших ChR1 и СИЯ2 исследователи вывели ряд вариантов и мутантов канального родопсина с измененными свойствами [209, 108, 21, 94, 152]. Например, были созданы мутанты канального родопсина-2, под названиями Т159С, L132C и L132C/T159C: первый - с улучшенной операционной светочувствительностью (то есть генерировал высокие фототоки при низком уровне освещенности) [21], второй - с более высокой общей светочувствительностью [94], а последний по этому параметру превосходил оба первых [152].

Стоит отметить, что во всех этих случаях повышение операционной светочувствительности сопровождалось снижением кинетики работы каналов [147]. Предположительно, скорость деактивации канала влияет на временное разрешение сигналов. А при более коротком времени открытия канала частотный ответ улучшается, но ценой меньшего количества перенесенных ионов и снижения чувствительности к свету. Улучшить чувствительность, не жертвуя кинетикой, можно было бы, если бы нашлись мутации, благодаря которым повышается проводимость каналов. В течение длительного времени таких мутаций не обнаруживалось. У различных изученных канальных родопсинов значения проводимости одиночных каналов мало отличались друг от друга [93].

Одно из возможных решений проблемы заключалось в том, чтобы создать мутанты с оптимальным временем закрытия, иначе говоря, попытаться достигнуть максимально возможной операционной чувствительности с оптимальным балансом между величиной фототока и скоростью кинетики активации. Например, в одной из работ был описан такой мутантный вариант родопсина CoChR, при создании которого придерживались стратегии укорочения и оптимизации времени закрытия канала с помощью точечных мутаций [59]. У него больше фототок, чем у ChR2 (выше проводимость отдельного канала), но все еще относительно быстрая кинетика закрытия. Тем не менее типичная квантовая эффективность микробных опсинов около 0,5; при увеличении этого значения можно ожидать лишь ограниченного повышения чувствительности к свету [43]. Поэтому приходится искать компромисс между операционной светочувствительностью и временным разрешением.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Иджилова Ольга Степановна, 2026 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Брежестовский П. Д., Зефиров А. Л. Оптогенетика и фотофармакология - эффективные инструменты управления активностью клеток с помощью света // Казанский медицинский журнал. 2019. - Т. 100. - N 1. - С. 158-169.

2. Ермолаева М. Э., Ротов А. Ю., Сопова Ю. В., Фирсов М. Л., Леонова Е. И. Механизмы дегенерации сетчатки при пигментном ретините - роль ответа на несвернутый белок. В сб.: Рецепторы и внутриклеточная сигнализация. Под редакцией А. В. Бережнова, В. П. Зинченко. Пущино: ФГБУН ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований РАН». 2021. - С. 525-530.

3. Иджилова О. С., Колотова Д. Е., Смирнова Г. Р., Абонакур А., Долгих Д. А., Петровская Л. Е., Кирпичников М. П., Островский М. А., Малышев А. Ю. Неселективная экспрессия коротковолнового колбочкового опсина улучшает обучение мышей с дегенерацией сетчатки в задаче с восприятием зрительных стимулов // ДАН: науки о жизни. 2023. - Т. 510. - N 1. - С. 297302.

4. Иджилова О. С., Смирнова Г. Р., Петровская Л. Е., Колотова Д. А., Островский М. А., Малышев А. Ю. Катионный канальный родопсин из водоросли Platymonas subcordiformis как перспективный оптогенетический инструмент // Биохимия. 2022. - Т. 87. - N 11. - С. 1625-1633.

5. Кирпичников М. П., Островский М. А. Оптогенетика и зрение // Вестник Российской Академии наук. - 2019. - Т. 89. - N 2. - C. 125-130.

6. Островский М. А., Кирпичников М. П. Перспективы оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки глаза // Биохимия. 2019. - Т. 84. - N 5. - С. 634-647.

7. Фирсов М. Л. Перспективы оптогенетического протезирования сетчатки // Журнал высшей нервной деятельности. 2017. - Т. 67. - N 5. - С. 53-62.

8. Adam Y. All-optical electrophysiology in behaving animals // Journal of neuroscience methods. 2021. - Т. 353. - С. 109101.

9. Alekseev A., Gordeliy V., Bamberg E. Rhodopsin-Based Optogenetics: Basics and Applications // В сб.: Gordeliy V. (ред.) Rhodopsin. Methods in Molecular Biology. - Т. 2501. Humana, New York, NY.

10. Ameline B., Tshilenge K. T., Weber M., Biget M., Libeau L., Caplette R., Mendes-Madeira A., Provost N., Guihal C., Picaud S., Moullier P., Pichard V., Cronin T., & Isiegas C. Long-term expression of melanopsin and channelrhodopsin causes no gross alterations in the dystrophic dog retina // Gene therapy. 2017. - Т. 24. - N 11. - С. 735-741.

11. Anderson E. E., Greferath U., Fletcher E. L. Changes in morphology of retinal ganglion cells with eccentricity in retinal degeneration // Cell Tissue Research. 2016. - Т. 364. - С. 263-271.

12. Antonucci D. E., Lim S. T., Vassanelli S., & Trimmer J. S. Dynamic localization and clustering of dendritic Kv2.1 voltage-dependent potassium channels in developing hippocampal neurons // Neuroscience. 2001. - Т. 108. - N 1. - С. 69-81.

13. Artemyev V., Gubaeva A., Paremskaia A. I., Dzhioeva A. A., Deviatkin A., Feoktistova S. G., Mityaeva O., & Volchkov P. Y. Synthetic Promoters in Gene Therapy: Design Approaches, Features and Applications // Cells. 2024. - Т. 13. - N 23. - С. 1963.

14. Baker C. A., Elyada Y. M., Parra A., & Bolton M. M. Cellular resolution circuit mapping with temporal-focused excitation of soma-targeted channelrhodopsin // eLife. 2016. - Т. 5. - С. e14193.

15. Baker C. K., & Flannery J. G. Innovative Optogenetic Strategies for Vision Restoration // Frontiers in cellular neuroscience. 2018. - Т. 12. - С. 316.

16. Batabyal S., Cervenka G., Birch D., Kim Y., Mohanty S. Broadband activation by white-opsin lowers intensity threshold for cellular stimulation // Scientific Reports. 2015. - Т. 5. - С. 17857.

17. Bellotti A., Murphy J., Lin L., Petralia R., Wang Y. X., Hoffman D., & O'Leary T. Paradoxical relationships between active transport and global protein distributions in neurons // Biophysical journal. 2021. - Т. 120. - N 11. - С. 2085-2101.

18. Bennicelli J., Wright J. F., Komaromy A., Jacobs J. B., Hauck B., Zelenaia O., Mingozzi F., Hui D., Chung D., Rex T. S., Wei Z., Qu G., Zhou S., Zeiss C., Arruda V. R., Acland G. M., Dell'Osso L. F., High K. A., Maguire A. M., & Bennett J. Reversal of blindness in animal models of leber congenital amaurosis using optimized AAV2-mediated gene transfer // Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2008. - T. 16. - N 3. - C. 458-465.

19. van Bergeijk P., Adrian M., Hoogenraad C., Kapitein L. C. Optogenetic control of organelle transport and positioning // Nature. - 2015. - T. 518. - C. 111-114.

20. Berndt A., Deisseroth K. OPTOGENETIC S. Expanding the optogenetics toolkit // Science. 2015. -T. 349. - N 6248. - C. 590-1.

21. Berndt A., Schoenenberger P., Mattis J., Tye K. M., Deisseroth K., Hegemann P., & Oertner T. G. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011. - T. 108. - N 18. - C. 7595-7600.

22. Berry M. H., Holt A., Salari A., Veit J., Visel M., Levitz J., Aghi K., Gaub B. M., Sivyer B., Flannery J. G., & Isacoff E. Y. Restoration of high-sensitivity and adapting vision with a cone opsin // Nature communications. 2019. - T. 10. - N 1. - C. 1221.

23. Bi A., Cui J., Ma Y. P., Olshevskaya E., Pu M., Dizhoor A. M., & Pan Z. H. Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration // Neuron. 2006. - T. 50. - N 1. - C. 23-33.

24. Bitzenhofer S., Ahlbeck J., Wolff A., Wiegert J. S., Gee C. E., Oertner T. G., & Hanganu-Opatz I. L. Layer-specific optogenetic activation of pyramidal neurons causes beta-gamma entrainment of neonatal networks // Nature Communications. 2017. - T. 8. - C. 14563.

25. Bloomfield S. A., Dacheux R. F. Rod vision: pathways and processing in the mammalian retina // Progress in Retinal and Eye Research. 2001. - T. 20. - C. 351-384.

26. Boyle P. M., Karathanos T. V., & Trayanova N. A. Cardiac Optogenetics: 2018 // JACC. Clinical electrophysiology. - 2018. - T. 4. - N 2. - C. 155-167.

27. Busskamp V., Duebel J., Balya D., Fradot M., Viney T. J., Siegert S., Groner A. C., Cabuy E., Forster V., Seeliger M., Biel M., Humphries P., Paques M., Mohand-Said S., Trono D., Deisseroth K., Sahel J.-A., Picaud S., Roska B. Genetic reactivation of cone photoreceptors restores visual responses in retinitis pigmentosa // Science. 2010. - T. 329. - N 80. - C. 413-417.

28. Butterwick A., Huie P., Jones B. W., Marc R. E., Marmor M., Palanker D. Effect of shape and coating of a subretinal prosthesis on its integration with the retina // Experimental Eye Research. 2009. - T. 88. - C. 22-29.

29. Carpentiero E., Hughes S., Rodgers J., Xhaferri N., Biswas S., Gilhooley M. J., Hankins M. W., & Lindner M. Interaction between native and prosthetic visual responses in optogenetic visual restoration // JCI insight. 2025. - T. 10. - N 11. - C. e190785.

30. Cehajic-Kapetanovic, J., Eleftheriou, C., Allen, A. E., Milosavljevic, N., Pienaar, A., Bedford, R., Davis, K. E., Bishop, P. N., & Lucas, R. J. Restoration of Vision with Ectopic Expression of Human Rod Opsin // Current biology : CB. 2015. - T. 25. - N 16. - C. 2111-2122.

31. Cepko C. Neuroscience. Seeing the light of day // Science.2010. - T. 329. - C. 403-404.

32. Chemi G., Brindisi M., Brogi S., Relitti N., Butini S., Gemma S., Campiani G. A light in the dark: state of the art and perspectives in optogenetics and optopharmacology for restoring vision // Future Medicinal Chemistry. 2019. - T. 11. - N 5. - C. 463-487.

33. Cheong S. K., Strazzeri J. M., Williams D. R., & Merigan W. H. All-optical recording and stimulation of retinal neurons in vivo in retinal degeneration mice // PloS one. 2018. - T. 13. - N 3. - C. e0194947.

34. Cho W. H., Noh K., Lee B. H., Barcelon E., Jun S. B., Park H. Y., & Lee S. J. Hippocampal astrocytes modulate anxiety-like behavior // Nature communications. 2022. - T. 13. - N 1. - C. 6536.

35. Chow B. Y., Han X., Dobry A. S., Qian X., Chuong A. S., Li M., Henninger M. A., Belfort G. M., Lin Y., Monahan P. E., and Boyden E. S. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps // Nature. 2010. - T. 463. - C. 98-102.

36. Chuong A. S., Miri M. L., Busskamp V., Matthews G. A. C., Acker L. C., S0rensen A. T., Young A., Klapoetke N. C., Henninger M. A., Kodandaramaiah S. B., Ogawa M., Ramanlal S. B., Bandler R. C., Allen B. D., Forest C. R., Chow B. Y., Han X., Lin Y., Tye K. M., Roska B., Cardin J. A., Boyden E. S. Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin // Nature Neuroscience. 2014. - T. 17. - C. 1123-1129.

37. Clark B. D., Kurth-Nelson Z. L., Newman E. A. Adenosine-evoked hyperpolarization of retinal ganglion cells is mediated by G-protein-coupled inwardly rectifying K+ and small conductance Ca2+-activated K+ channel activation // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2009. - T. 29. - N 36. - C. 11237-11245.

38. Csillag V., Bizzozzero M. H., Noble J. C., Reinius B., & Fuzik J. Voltage-Seq: all-optical postsynaptic connectome-guided single-cell transcriptomics // Nature methods. 2023. - T. 20. - N 9. - C. 1409-1416.

39. Dana H., Mohar B., Sun Y., Narayan S., Gordus A., Hasseman J. P., Tsegaye G., Holt G. T., Hu A., Walpita D., Patel R., Macklin J. J., Bargmann C. I., Ahrens M. B., Schreiter E. R., Jayaraman V., Looger L. L., Svoboda K., Kim D. S. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity // eLife. 2016. - T. 5. - C. e12727.

40. Davidson C. J., Mascarin A. T. , Yahya M. A. , Rubio F. J. , Gheidi A. Approaches and considerations of studying neuronal ensembles: a brief review // Frontiers in Cellular Neuroscience. - 2023.

- T. 17.

41. De Silva S. R., Barnard A. R., Hughes S., Tam S. K. E., Martin C., Singh M. S., Barnea-Cramer A. O., McClements M. E., During M. J., Peirson S. N., Hankins M. W., MacLaren R. E. Long-term restoration of visual function in end-stage retinal degeneration using subretinal human melanopsin gene therapy // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2017. - T. 114. - N 42.

- C. 11211-11216.

42. Deisseroth K. Optogenetics // Nature Methods. - 2011. - T. 8. - C. 26-29.

43. Deisseroth K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience // Nature Neuroscience. 2015. - T. 18. - C. 1213-1225.

44. Deisseroth K., Feng G., Majewska A. K., Miesenböck G., Ting A., Schnitzer M. J. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits // Journal of Neuroscience. - 2006.

- T. 26. - N 41. - C. 10380.

45. Doroudchi M. M., Greenberg K. P., Liu J., Silka K. A., Boyden E. S., Lockridge J. A., Arman A. C., Janani R., Boye S. E., Boye S. L., Gordon G. M., Matteo B. C., Sampath A. P., Hauswirth W. W., & Horsager A. Virally delivered channelrhodopsin-2 safely and effectively restores visual function in multiple mouse models of blindness // Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2011. - T. 19. - N 7. - C. 1220-1229.

46. Dreosti E., Odermatt B., Dorostkar M. M., & Lagnado L. A genetically encoded reporter of synaptic activity in vivo // Nature methods. 2009. - T. 6. - N 12. - C. 883-889.

47. Driessen C. A., Winkens H. J., Hoffmann K., Kuhlmann L. D., Janssen B. P., Van Vugt A. H., Van Hooser J. P., Wieringa B. E., Deutman A. F., Palczewski K., Ruether K., & Janssen J. J. Disruption of the 11-cis-retinol dehydrogenase gene leads to accumulation of cis-retinols and cis-retinyl esters // Molecular and cellular biology. 2000. - T. 20. - N 12. - C. 4275-4287.

48. Dryja T. P., Berson E. L., Rao V. R., Oprian D. D. Heterozygous missense mutation in the rhodopsin gene as a cause of congenital stationary night blindness // Nature Genetics. 1993. - T. 4. - N 3. - C. 280283.

49. Duan X., Nagel G., & Gao S. Mutated Channelrhodopsins with Increased Sodium and Calcium Permeability // Applied Sciences. 2019. - T. 9. - N 4. - C. 664.

50. Dufour S., & De Köninck Y. Optrodes for combined optogenetics and electrophysiology in live animals // Neurophotonics. - 2015. - T. 2. - N 3. - C. 031205.

51. Emiliani V., Cohen A. E., Deisseroth K., & Häusser M. All-Optical Interrogation of Neural Circuits // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2015. - T. 35. - N 41.

- C. 13917-13926.

52. Emiliani V., Entcheva E., Hedrich R., Hegemann P., Konrad K. R., Lüscher C., Mahn M., Pan Z. H., Sims R. R., Vierock J., & Yizhar O. Optogenetics for light control of biological systems // Nature Reviews Methods Primers. - 2022. - T. 2. - C. 55.

53. Entcheva E., Kay M.W. Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment // Nature Reviews Cardiology. - 2021. - T. 18. - C. 349-367.

54. Fan L. Z., Kheifets S., Böhm U. L., Wu H., Piatkevich K. D., Xie M. E., Parot V., Ha Y., Evans K. E., Boyden E. S., Takesian A. E., & Cohen A. E. All-Optical Electrophysiology Reveals the Role of Lateral Inhibition in Sensory Processing in Cortical Layer 1 // Cell. 2020. - T. 180. - N 3. - C. 521-535.e18.

55. Fan L. Z., Kim D. K., Jennings J. H., Tian H., Wang P. Y., Ramakrishnan C., Randles S., Sun Y., Thadhani E., Kim Y. S., Quirin S., Giocomo L., Cohen A. E., & Deisseroth K. All-optical physiology resolves a synaptic basis for behavioral timescale plasticity // Cell. 2023. - T. 186. - N 3. - C. 543-559.e19.

56. Farah N., Reutsky I., & Shoham S. Patterned optical activation of retinal ganglion cells // Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2007. - C. 6368-6370.

57. Fenno L., Yizhar O., Deisseroth K. The Development and Application of Optogenetics // Annual Review of Neuroscience. 2011. - T. 34. - N 1. - C. 389-412.

58. Fosque B. F., Sun Y., Dana H., Yang C. T., Ohyama T., Tadross M. R., Patel R., Zlatic M., Kim D. S., Ahrens M. B., Jayaraman V., Looger L. L., & Schreiter E. R. Neural circuits. Labeling of active neural circuits in vivo with designed calcium integrators // Science (New York, N.Y.). 2015. - T. 347. - N 6223.

- C. 755-760.

59. Ganjawala T. H., Lu Q., Fenner M. D., Abrams G. W., Pan Z. H. Improved CoChR variants restore visual acuity and contrast sensitivity in a mouse model of blindness under ambient light conditions // Molecular Therapy. 2019. - T. 27. - C. 1195-1205.

60. Gargini C., Terzibasi E., Mazzoni F., Strettoi E. Retinal organization in the retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse: a morphological and ERG study // Journal of Comparative Neurology. 2007. - T. 500. - C. 222-2238.

61. Garrido J. J. A targeting motif involved in sodium channel clustering at the axonal initial segment // Science. 2003. - T. 300. - N 5628. - C. 2091-2094.

62. Gaub B. M., Berry M. H., Holt A. E., Isacoff E. Y., & Flannery J. G. Optogenetic Vision Restoration Using Rhodopsin for Enhanced Sensitivity // Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2015. - T. 23. - N 10. - C. 1562-1571.

63. Geething N. C., & Spudich J. A. Identification of a minimal myosin Va binding site within an intrinsically unstructured domain of melanophilin // The Journal of biological chemistry. 2007. - T. 282. -N 29. - C. 21518-21528.

64. Govorunova E. G., Gou Y., Sineshchekov O. A., Li H., Lu X., Wang Y., Brown L. S., St-Pierre F., Xue M., Spudich J. L. Kalium channelrhodopsins are natural light-gated potassium channels that mediate optogenetic inhibition. Nature Neuroscience. 2022. - T. 25. - C. 967-974.

65. Govorunova E. G., Sineshchekov O. A., Janz R., Liu X., & Spudich J. L. Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics // Science (New York, N.Y.). 2015.

- T. 349. - N 6248. - C. 647-650.

66. Govorunova E. G., Sineshchekov O. A., Li H., Janz R., & Spudich J. L. Characterization of a highly efficient blue-shifted channelrhodopsin from the marine alga Platymonas subcordiformis // The Journal of biological chemistry. 2013. - T. 288. - N 41. - C. 29911-29922.

67. Govorunova E. G., Sineshchekov O. A., Li H., Wang Y., Brown L. S., & Spudich J. L. RubyACRs, nonalgal anion channelrhodopsins with highly red-shifted absorption // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2020. - T. 117. - N 37. - C. 22833-22840.

68. Gradinaru V., Thompson K. R., Zhang F., Mogri M., Kay K., Schneider M. B., & Deisseroth K. Targeting and readout strategies for fast optical neural control in vitro and in vivo // The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 2007. - T. 27. - N 52. - C. 1423114238.

69. Greenberg K. P., Pham A., Werblin F. S. Differential targeting of optical neuromodulators to ganglion cell soma and dendrites allows dynamic control of center-surround antagonism // Neuron. 2011. -T. 69. - C. 713-720.

70. Grubb M. S., & Burrone J. Channelrhodopsin-2 localised to the axon initial segment // PloS one. 2010. - T. 5. - N 10. - C. e13761.

71. Gu S. M., Thompson D. A., Srikumari C. R., Lorenz B., Finckh U., Nicoletti A., Murthy K. R., Rathmann M., Kumaramanickavel G., Denton M. J., & Gal, A. Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy // Nature genetics. 1997. - T. 17. - N 2. - C. 194-197.

72. Gutzeit V. A., Ahuna K., Santos T. L., Cunningham A. M., Sadsad Rooney M., Muñoz Zamora A., Denny C. A., & Donaldson Z. R. Optogenetic reactivation of prefrontal social neural ensembles mimics social buffering of fear // Neuropsychopharmacology: official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 2020. - T. 45. - N 6. - C. 1068-1077.

73. Hart W. L., Needham K., Richardson R. T., Stoddart P. R., Kameneva T. Dynamic optical clamp: A novel electrophysiology tool and a technique for closed-loop stimulation // Biomedical Signal Processing and Control. 2023. - T. 85.

74. Heckenlively J. R., Yoser S. L., Friedman L. H., Oversier J. J. Clinical findings and common symptoms in retinitis pigmentosa // American Journal of Ophthalmology. 1988. - T. 105. - N 5. - C. 504511.

75. Herlitze S., Landmesser L. T. New optical tools for controlling neuronal activity // Current opinion in neurobiology. 2007. - T. 17. - N 1. - C. 87-94.

76. Hernández-Candia C. N., & Tucker C. L. Optogenetic Control of Gene Expression Using Cryptochrome 2 and a Light-Activated Degron // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). - 2020. -T. 2173. - C. 151-158.

77. Hori T., Fukutome M., Koike C. Adeno Associated Virus (AAV) as a Tool for Clinical and Experimental Delivery of Target Genes into the Mammalian Retina // Biological and Pharmaceutical Bulletin. 2019. - T. 42. - N 3. - C. 343-347.

78. Huber D., Petreanu L., Ghitani N., Ranade S., Hromádka T., Mainen Z., & Svoboda K. Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice // Nature. 2008. -T. 451. - N 7174. - C. 61-64.

79. Idzhilova O.S., Roshchin M.V., Smirnova G.R., Malyshev A. Y. Central Targeting of Channelrhodopsin2 by the Motif of Potassium Channel Kv2.1 Can be Altered Due to Overexpression of the Construct // BioNanoScience. 2021. - T. 11. - C. 408-416.

80. Inoue M. Genetically encoded calcium indicators to probe complex brain circuit dynamics in vivo // Neuroscience research. 2021. - T. 169. - C. 2-8.

81. Ivanova E., Pan Z. H. Evaluation of the adeno-associated virus mediated long-term expression of channelrhodopsin-2 in the mouse retina // Molecular Vision. 2009. - T. 15. - C. 1680-9.

82. Jacobs G. H., Williams G. A., Cahill H., Nathans J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment // Science (New York, N.Y.). 2007. - T. 315. - N 5819. - C. 1723-1725.

83. Jarczewska K., Kopec M., Abramczyk H., Surmacki J. M. Monitoring alterations of all-trans-retinal in human brain cancer cells by label-free confocal Raman imaging: regulation of the redox status of cytochrome c // RSC Advances. 2024. - T. 14. - N 29. - C. 20982-20991.

84. Jones B. W., Kondo M., Terasaki H., Lin Y., McCall M., & Marc R. E. Retinal remodeling // Japanese journal of ophthalmology. 2012. - T. 56. - N 4. - C. 289-306.

85. Jones B. W., Pfeiffer R. L., Ferrell W. D., Watt C. B., Marmor M., Marc R. E. Retinal remodeling in human retinitis pigmentosa // Experimental Eye Research. 2016. - T. 150. - C. 149-165.

86. Kakumoto T., Nakata T. Optogenetic control of PIP3: PIP3 is sufficient to induce the actin-based active part of growth cones and is regulated via endocytosis // PloS one. 2013. - T. 8. - N 8. - C. e70861.

87. Kandori H. Biophysics of rhodopsins and optogenetics // Biophysical Reviews. 2020. - T. 12. - C. 355-361.

88. Karunarathne W. K., Giri L., Kalyanaraman V., Gautam N. Confined optical activation of GPCRs in a cell // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2013. - T. 110. - N 17. - C. E1565-E1574.

89. Khabou H., Garita-Hernandez M., Chaffiol A., Reichman S., Jaillard C., Brazhnikova E., Bertin S., Forster V., Desrosiers M., Winckler C., Goureau O., Picaud S., Duebel J., Sahel J. -A., Dalkara D. Noninvasive gene delivery to foveal cones for vision restoration // JCI Insight. 2018. - T. 3. - C. 1-18.

90. Kim C. K., Adhikari A., & Deisseroth K. Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience // Nature reviews. Neuroscience. 2017. - T. 18. - N 4. - C. 222235.

91. Kishi K. E., Kim Y. S., Fukuda M., Inoue M., Kusakizako T., Wang P. Y., Ramakrishnan C., Byrne E. F. X., Thadhani E., Paggi J. M., Matsui T. E., Yamashita K., Nagata T., Konno M., Quirin S., Lo M., Benster T., Uemura T., Liu K., Shibata M., ... Kato H. E. Structural basis for channel conduction in the pump-like channelrhodopsin ChRmine // Cell. 2022. - T. 185. - N 4. - C. 672-689.e23.

92. Klapoetke N. C., Murata Y., Kim S. S., Pulver S. R., Birdsey-Benson A., Cho Y. K., Morimoto T. K., Chuong A. S., Carpenter E. J., Tian Z., Wang J., Xie Y., Yan Z., Zhang Y., Chow B. Y., Surek B., Melkonian M., Jayaraman V., Constantine-Paton M., Wong G. K. -S., Boyden E. S. Independent optical excitation of distinct neural populations // Nature Methods. 2014. - T. 11. - C. 338-346.

93. Klapper S. D., Swiersy A., Bamberg E., Busskamp V. Biophysical properties of optogenetic tools and their application for vision restoration approaches // Frontiers in Systems Neuroscience. 2016. - T. 10. - N 74.

94. Kleinlogel S., Feldbauer K., Dempski R. E., Fotis H., Wood P. G., Bamann C., & Bamberg E. Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh // Nature neuroscience. 2011. - T. 14. - N 4. - C. 513-518.

95. Kouyama T., Kouyama A. N., Ikegami A. Bacteriorhodopsin is a powerful light-driven proton pump // Biophysical journal. 1987. - T. 51. - N 5. - C. 839-841.

96. Koyanagi M., Terakita A. Diversity of animal opsin-based pigments and their optogenetic potential // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 2014. - T. 1837. - N 5. - C. 710-716.

97. Lafferty C. K., Christinck T. D., Britt J. P. All-optical approaches to studying psychiatric disease // Methods. 2022. - T. 203. - C. 46-55.

98. Lagali P. S., Balya D., Awatramani G. B., Muench T. A., Kim D. S., Busskamp V., Cepko C. L., Roska B. Light-activated channels targeted to ON bipolar cells restore visual function in retinal degeneration // Nature Neuroscience. 2008. - T. 11. - C. 667-675.

99. Lewis T. L. Jr, Mao T., & Arnold D. B. A role for myosin VI in the localization of axonal proteins // PLoS biology. 2011. - T. 9. - N 3. - C. e1001021.

100. Lewis Jr. T. L., Mao T., Svoboda K., & Arnold D. B. Myosin-dependent targeting of transmembrane proteins to neuronal dendrites // Nature Neuroscience. 2009. - T. 12. - N 5. - C. 568-576.

101. Li H., Govorunova E. G., Sineshchekov O. A., & Spudich J. L. Role of a helix B lysine residue in the photoactive site in channelrhodopsins // Biophysical journal. 2014. - T. 106. - N 8. - C. 1607-1617.

102. Li X., Gutierrez D. V., Hanson M. G., Han J., Mark M. D., Chiel H., Hegemann P., Landmesser L. T., Herlitze S. Fast noninvasive activation and inhibition of neural and network activity by vertebrate rhodopsin and green algae channelrhodopsin // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2005. -T. 102. - N 49. - C. 17816-17821.

103. Li Z. Y., Kljavin I. J., Milam A. H. Rod photoreceptor neurite sprouting in retinitis pigmentosa // Journal of Neuroscience. 1995. - T. 15. - C. 5429-5438.

104. Lim S. T., Antonucci D. E., Scannevin R. H., & Trimmer J. S. A novel targeting signal for proximal clustering of the Kv2.1 K+ channel in hippocampal neurons // Neuron. 2000. - T. 25. - N 2. - C. 385-397.

105. Lim D. H., Ledue J., Mohajerani M. H., Vanni M. P., & Murphy T. H. Optogenetic approaches for functional mouse brain mapping // Frontiers in neuroscience. 2013.- T. 7. - C. 54.

106. Lin J. Y., Knutsen P. M., Muller A., Kleinfeld D., Tsien R. Y., Sengupta A., Chaffiol A., Mace E., Caplette R., Desrosiers M., Lampic M., Forster V., Marre O., Sahel J. -A., Picaud S., Dalkara D., Duebel J. ReaChR: A red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation // Nature Neuroscience. 2013. - T. 16. - C. 1499-1508.

107. Lin B., Koizumi A., Tanaka N., Panda S., Masland R. H. Restoration of visual function in retinal degeneration mice by ectopic expression of melanopsin // Proceedings of the National Academy of Sciences. 2008. - T. 105. - N 41. - C. 16009-16014.

108. Lin J. Y., Lin M. Z., Steinbach P., & Tsien R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics // Biophysical journal. 2009. - T. 96. - N 5. - C. 1803-1814.

109. Liu W., Liu M., Liu Y., Li S., Weng C., Fu Y., He J., Gong Y., Liu W., Zhao C., & Yin Z. Q. Validation and Safety of Visual Restoration by Ectopic Expression of Human Melanopsin in Retinal Ganglion Cells // Human gene therapy. 2019. - T. 30. - N 6. - C. 714-726.

110. Liu P. W., Zhang H., Werley C. A., Pichler M., Ryan S. J., Lewarch C. L., Jacques J., Grooms J., Ferrante J., Li G., Zhang D., Bremmer N., Barnett A., Chantre R., Elder A. E., Cohen A. E., Williams L. A., Dempsey G. T., McManus O. B. A phenotypic screening platform for chronic pain therapeutics using all-optical electrophysiology // Pain. 2024. - T. 165. - N 4. - C. 922-940.

111. Lorca-Câmara A., Blot F. G. C., & Accanto N. Recent advances in light patterned optogenetic photostimulation in freely moving mice // Neurophotonics. 2024. - T. 11. npan. 1. - C. S11508.

112. Lundstrom K. Viral Vectors in Gene Therapy // Diseases. 2018. - T. 6. - N 2. - C. 42.

113. Luongo F. J., Liu L., Ho C. L. A., Hesse J. K., Wekselblatt J. B., Lanfranchi F. F., Huber D., Tsao D. Y. Mice and primates use distinct strategies for visual segmentation // eLife. 2023. - T. 12. - C. e74394.

114. MacLaren R. E., Pearson R. A., MacNeil A., Douglas R. H., Salt T. E., Akimoto M., Swaroop A., Sowden J. C., Ali R. R. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors // Nature. 2006. - T. 444. - C. 203-207.

115. Maeda A., Maeda T., Imanishi Y., Golczak M., Moise A. R., Palczewski K. Aberrant metabolites in mouse models of congenital blinding diseases: formation and storage of retinyl esters // Biochemistry. 2006.

- T. 45. - N 13. - C. 4210-4219.

116. Maguire A. M., Simonelli F., Pierce E. A., Pugh E. N. Jr, Mingozzi F., Bennicelli J., Banfi S., Marshall K. A., Testa F., Surace E. M., Rossi S., Lyubarsky A., Arruda V. R., Konkle B., Stone E., Sun J., Jacobs J., Dell'Osso L., Hertle R., Ma J. X., u gp. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis // The New England Journal of Medicine. 2008. - T. 358. - C. 2240-2248.

117. Maiseli B., Abdalla A.T., Massawe L.V., Mbise M., Mkocha K., Nassor N. A., Ismail M., Michael J., Kimambo S. Brain-computer interface: trend, challenges, and threats // Brain Informatics. 2023. - T. 10.

- C. 20.

118. Malyshev A., Goz R., LoTurco J. J., & Volgushev M. Advantages and limitations of the use of optogenetic approach in studying fast-scale spike encoding // PloS one. 2015. - T. 10. - N 4. - C. e0122286.

119. Mao T., O'Connor D. H., Scheuss V., Nakai J., & Svoboda K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators // PloS one. 2008. - T. 3. - N 3. - C. e1796.

120. Marc R. E., Jones B. W. Retinal remodeling in inherited photoreceptor degenerations // Molecular Neurobiology. 2003. - T. 28. - C. 139-147.

121. Marshel J. H., Kim Y. S., Machado T. A., Quirin S., Benson B., Kadmon J., Raja C., Chibukhchyan A., Ramakrishnan C., Inoue M., Shane J. C., McKnight D. J., Yoshizawa S., Kato H. E., Ganguli S., &

Deisseroth K. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception // Science (New York, N.Y.). 2019. - T. 365. - N 6453. - C. eaaw5202.

122. Masseck O. A., Rubelowski J. M., Spoida K., & Herlitze S. Light- and drug-activated G-protein-coupled receptors to control intracellular signaling // Experimental physiology. 2011. - T. 96. - N 1. - C. 51-56.

123. Masseck O. A., Spoida K., Dalkara D., Maejima T., Rubelowski J. M., Wallhorn L., Deneris E. S., Herlitze S. Vertebrate cone opsins enable sustained and highly sensitive rapid control of G i/o signaling in anxiety circuitry // Neuron. 2014. - T. 81. - C. 1263-1273.

124. Mattis J., Tye K. M., Ferenczi E.A., Ramakrishnan C., O'Shea D. J., Prakash R., Gunaydin L. A., Hyun M., Fenno L. E., Gradinaru V., Yizhar O., Deisseroth K. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins // Nature Methods. 2012. - T. 9. - C. 159172.

125. Mazzoni F., Novelli E., Strettoi E. Retinal ganglion cells survive and maintain normal dendritic morphology in a mouse model of inherited photoreceptor degeneration // Journal of Neuroscience. 2008. -T. 28. - C. 14282-14292.

126. McClements M. E., MacLaren R. E. Adeno-associated Virus (AAV) Dual Vector Strategies for Gene Therapy Encoding Large Transgenes // Yale Journal of Biology and Medicine. 2017. - T. 90. - N 4. - C. 611-623.

127. Miesenböck G., De Angelis D., Rothman J. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins // Nature. 1998. - T. 394. - C. 192-195.

128. Mitsui S., Saito M., Hayashi K., Mori K., & Yoshihar, Y. A novel phenylalanine-based targeting signal directs telencephalin to neuronal dendrites // The Official Journal of the Society for Neuroscience. 2005. - T. 25. - N 5. - C. 1122-1131.

129. Mohapatra D. P., Siino D. F., & Trimmer J. S. Interdomain cytoplasmic interactions govern the intracellular trafficking, gating, and modulation of the Kv2.1 channel // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2008. - T. 28. - N 19. - C. 4982-4994.

130. Mohapatra D. P., & Trimmer J. S. The Kv2.1 C terminus can autonomously transfer Kv2.1-like phosphorylation-dependent localization, voltage-dependent gating, and muscarinic modulation to diverse Kv channels // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2006. - T. 26. - N 2. - C. 685-695.

131. Morshedian A., Fain G. L. The evolution of rod photoreceptors // Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 2017. - T. 372. - N 1717. - C. 20160074.

132. Muir J., Anguiano M., & Kim C. K. Neuromodulator and neuropeptide sensors and probes for precise circuit interrogation in vivo // Science (New York, N.Y.). - 2024. - T. 385. - N 6716. - C. eadn6671.

133. Nagahama K., Jung V. H., & Kwon H. B. Cutting-edge methodologies for tagging and tracing active neuronal coding in the brain // Current opinion in neurobiology. 2025. - T. 92. - C. 102997.

134. Nagel G., Szellas T., Huhn W., Kateriya S., Adeishvili N., Berthold P., Ollig D., Hegemann P., Bamberg E. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 2003. - T. 100. - C. 13940-13945.

135. Nakanishi K., Crouch R. Application of Artificial Pigments to Structure Determination and Study of Photoinduced Transformations of Retinal Proteins // Israel Journal of Chemistry. 1995. - T. 35. - C. 253272.

136. Nakazawa M. Therapy options for retinitis pigmentosa // Expert Opinion on Orphan Drugs. 2014. -T. 2. - N 1. - C. 37-52.

137. Naso M. F., Tomkowicz B., Perry III W. L., & Strohl W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy // BioDrugs. 2017. - T. 31. - C. 317-334.

138. Ni T. -H., McDonald W. F., Zolotukhin I., Melendy T., Waga S., Stillman B., Muzyczka N. Cellular proteins required for adeno-associated virus DNA replication in the absence of adenovirus coinfection // Journal of Virology. 1998. - T. 72. - C. 2777-2787.

139. Nishiguchi K. M., Carvalho L. S., Rizzi M., Powell K., Holthaus S. M., Azam S. A., Duran Y., Ribeiro J., Luhmann U. F., Bainbridge J. W., Smith A. J., & Ali R. R. Gene therapy restores vision in rd1 mice after removal of a confounding mutation in Gpr179 // Nature communications. 2015. - T. 6. - C. 6006.

140. Nunez J. Primary Culture of Hippocampal Neurons from P0 Newborn Rats // JoVE. 2008. T. 19. -C.e895.

141. O'Brien E. E., Greferath U., Fletcher E. L. The effect of photoreceptor degeneration on ganglion cell morphology // Journal of Comparative Neurology. 2014. - T. 522. - C. 1155-1170.

142. O'Connell K. M., Rolig A. S., Whitesell J. D., & Tamkun M. M. Kv2.1 potassium channels are retained within dynamic cell surface microdomains that are defined by a perimeter fence // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2006. - T. 26. - N 38. - C. 9609-9618.

143. O'Connell K. M., & Tamkun M. M. Targeting of voltage-gated potassium channel isoforms to distinct cell surface microdomains // Journal of cell science. 2005. - T. 118. - N 10. - C. 2155-2166.

144. Oesterhelt D. The structure and mechanism of the family of retinal proteins from halophilic archaea // Current Opinion in Structural Biology. 1998. - T. 8. - C. 489-500.

145. Ovechkina V. S., Andrianova S. K., Shimanskaia I. O., Suvorova P. S., Ryabinina A. Y., Blagonravov M. L., Belousov V. V., & Mozhaev A. A. Advances in Optogenetics and Thermogenetics for Control of Non-Neuronal Cells and Tissues in Biomedical Research // ACS chemical biology. - 2025. - T. 20. - N 3. - C. 553-572.

146. Pacary E., Haas M. A., Wildner H., Azzarelli R., Bell D. M., Abrous D. N., & Guillemot F. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation // Journal of visualized experiments : JoVE. 2012. - T. 65. - C. 4163.

147. Pan Z. H., Ganjawala T. H., Lu Q., Ivanova E., Zhang Z. ChR2 Mutants at L132 and T159 with Improved Operational Light Sensitivity for Vision Restoration // PLoS ONE. 2014. - T. 9. - N 6. - C. e98924.

148. Papaioannou S., & Medini P. Advantages, Pitfalls, and Developments of All Optical Interrogation Strategies of Microcircuits in vivo // Frontiers in neuroscience. 2022. - T. 16. - C. 859803.

149. Pawar Y. B., & Thool A. R. Navigating the Genetic Landscape: A Comprehensive Review of Novel Therapeutic Strategies for Retinitis Pigmentosa Management // Cureus. 2024. - T. 16. - N 8. - C. e67046.

150. Petreanu L., Huber D., Sobczyk A., & Svoboda K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections // Nature neuroscience. 2007. - T. 10. - N 5. - C. 663-668.

151. Pfeiffer R.L., Jones B.W. Current perspective on retinal remodeling: Implications for therapeutics // Frontiers in Neuroanatomy. - 2022. - T. 16. - C. 355-361.

152. Prigge M., Schneider F., Tsunoda S. P., Shilyansky C., Wietek J., Deisseroth K., & Hegemann P. Color-tuned channelrhodopsins for multiwavelength optogenetics // The Journal of biological chemistry. 2012. - T. 287. - N 38. C. 31804-31812.

153. Prusky G., West P., Douglas R. Behavioral assessment of visual acuity in mice and rats // Vision Research. 2000. - T. 40. - N 16. - C. 2201-2209.

154. Reh M., Lee M.-J., Zeck G. Expression of Channelrhodopsin-2 in Rod Bipolar Cells Restores ON and OFF Responses at High Spatial Resolution in Blind Mouse Retina // Advanced therapeutics. 2022. - T. 5. - C. 2100164.

155. Rivera J. F., Ahmad S., Quick M. W., Liman E. R., & Arnold D. B. An evolutionarily conserved dileucine motif in Shal K+ channels mediates dendritic targeting // Nature Neuroscience. 2003. - T. 6. - N 3. - C. 243-250.

156. Rosales C. R., Osborne K. D., Zuccarino G. V., Scheiffele P., & Silverman M. A. A cytoplasmic motif targets neuroligin-1 exclusively to dendrites of cultured hippocampal neurons // European Journal of Neuroscience. 2005. - T. 22. - N 9. - C. 2381-2386.

157. Rost B. R., Wietek J., Yizhar O., & Schmitz D. Optogenetics at the presynapse // Nature neuroscience. 2022. - T. 25. - N 8. - C. 984-998.

158. Ruberti F., & Dotti C. G. Involvement of the proximal C terminus of the AMPA receptor subunit GluRl in dendritic sorting // The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 2000. - Т. 20. - N 11. - С. RC78-RC78.

159. Russell S., Bennett J., Wellman J. A., Chung D. C., Yu Z. F., Tillman A., Wittes J., Pappas J., Elci O., McCague S., Cross D., Marshall K. A., Walshire J., Kehoe T. L., Reichert H., Davis M., Raffini L., George L. A., Hudson F. P., Dingfield L., ... Maguire A. M. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial // Lancet (London, England). 2017. - Т. 390. - N 10097. - С. 849-860.

160. Russell L. E., Dalgleish H. W. P., Nutbrown R., Gauld O. M., Herrmann D., Fi§ek M., Packer A. M., & Hausser M. All-optical interrogation of neural circuits in behaving mice // Nature protocols. 2022. -Т. 17. - N 7. - С. 1579-1620.

161. Sakamoto M., & Yokoyama T. Probing neuronal activity with genetically encoded calcium and voltage fluorescent indicators // Neuroscience research. 2025. - Т. 215. - С. 56-63.

162. Sahel J. A., Boulanger-Scemama E., Pagot C., Arleo A., Galluppi F., Martel J. N., Esposti S. D., Delaux A., de Saint Aubert J. B., de Montleau C., Gutman E., Audo I., Duebel J., Picaud S., Dalkara D., Blouin L., Taiel M., & Roska B. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy // Nature medicine. 2021. - Т. 27. - N 7. - С. 1223-1229.

163. Saito T. In Utero Electroporation of the Mouse Embryo. В сб.: Saito T. (ред.) Electroporation Methods in Neuroscience // Neuromethods. 2015. - Т. 102. Humana Press, New York, NY.

164. Saito T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system // Nature Protocols. 2006. - Т. 1. - С. 1552-1558.

165. Sarmiere P. D., Weigle C. M., & Tamkun M. M. The Kv2.1 K+ channel targets to the axon initial segment of hippocampal and cortical neurons in culture and in situ // BMC neuroscience. 2008. - Т. 9. - С. 112.

166. Sartori F., Hafner A. S., Karimi A., Nold A., Fonkeu Y., Schuman E. M., & Tchumatchenko T. Statistical Laws of Protein Motion in Neuronal Dendritic Trees // Cell reports. 2020. - Т. 33. - N 7. - С. 108391.

167. Sengupta A., Chaffiol A., Mace E., Caplette R., Desrosiers M., Lampic M., Forster V., Marre O., Lin J. Y., Sahel J. -A., Picaud S., Dalkara D., Duebel J. Red-shifted channelrhodopsin stimulation restores light responses in blind mice, macaque retina, and human retina // EMBO Molecular Medicine. 2016. - Т. 8. - С. 1248-1264.

168. Shah P. T., Valiante T. A., & Packer A. M. Highly local activation of inhibition at the seizure wavefront in vivo // Cell reports. 2024. - Т. 43. - N 5. - С. 114189.

169. Shemesh O. A., Tanese D., Zampini V., Linghu C., Piatkevich K., Ronzitti E., Papagiakoumou E., Boyden E. S., & Emiliani V. Temporally precise single-cell-resolution optogenetics // Nature neuroscience. 2017. - Т. 20. - N 12. - С. 1796-1806.

170. Simon C. J., Sahel J.-A., Duebel J., Herlitze S., Dalkara D. Opsins for vision restoration // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2020. - Т. 527. - N 2. - С. 325-330.

171. Sineshchekov O. A., Jung K. H., Spudich J. L. Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii // Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 2002. - Т. 99. - С. 8689-8694.

172. Sinnen B. L., Bowen A. B., Forte J. S., Hiester B. G., Crosby K. C., Gibson E. S., Dell'Acqua M. L., & Kennedy M. J. (2017). Optogenetic Control of Synaptic Composition and Function // Neuron. - 2017. -Т. 93. - N 3. - С. 646-660.e5.

173. Slijkerman R. W., Song F., Astuti G. D., Huynen M. A., van Wijk E., Stieger K., & Collin R. W. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies // Progress in retinal and eye research. 2015. - Т. 48. - С. 137-159.

174. Smith K.M., Graham B.A. Channelrhodopsin-2 Assisted Circuit Mapping in the Spinal Cord Dorsal Horn // В сб.: Seal R.P. (ред.) Contemporary Approaches to the Study of Pain. Neuromethods. 2022. - Т. 178. Humana, New York, NY.

175. Stefanov A., Flannery J. G. A Systematic Review of Optogenetic Vision Restoration: History, Challenges, and New Inventions from Bench to Bedside // Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2023. - Т. 13. - С. a041304.

176. Strettoi E., Pignatelli V. Modifications of retinal neurons in a mouse model of retinitis pigmentosa // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2000. - Т. 97. - С. 11020-11025.

177. Strickland D., Lin Y., Wagner E., Hope C. M., Zayner J., Antoniou C., Sosnick T. R., Weiss E. L., & Glotzer M. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology // Nature methods. 2012. - Т. 9. - N 4. - С. 379-384.

178. Surosky R. T., Urabe M., Godwin S. G., McQuiston S. A., Kurtzman G. J., Ozawa K., & Natsoulis G. Adeno-associated virus Rep proteins target DNA sequences to a unique locus in the human genome // Journal of virology. 1997. - Т. 71. - N 10. - С. 7951-7959.

179. Suzuki T., Yamasaki K., Fujita S., Oda K., Iseki M., Yoshida K., Watanabe M., Daiyasu H., Toh H., Asamizu E., Tabata S., Miura K., Fukuzawa H., Nakamura S., Takahashi T. Archaeal-type rhodopsins in Chlamydomonas: model structure and intracellular localization // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2003. - Т. 301. - С. 711-717.

180. Szundi I., Li H., Chen E., Bogomolni R., Spudich J. L., & Kliger D. S. Platymonas subcordiformis Channelrhodopsin-2 Function: I. THE PHOTOCHEMICAL REACTION CYCLE // The Journal of biological chemistry. 2015. - Т. 290. - N 27. - С. 16573-16584.

181. Terakita A. The opsins // Genome Biology. 2005. - Т. 6. - С. 213.

182. Thaler L., Milne J. L., Arnott S. R., Kish D., Goodale M. A. Neural correlates of motion processing through echolocation, source hearing, and vision in blind echolocation experts and sighted echolocation novices // Journal of neurophysiology. 2014. - Т. 111. - N 1. - С. 112-127.

183. Ting J. T., Daigle T. L., Chen Q., Feng G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics // Methods in Molecular Biology. 2014. - Т. 1183. - С. 221-242.

184. Tomita H., Sugano E., Fukazawa Y., Isago H., Sugiyama Y., Hiroi T., Ishizuka T., Mushiake H., Kato M., Hirabayashi M., Shigemoto R., Yawo H., & Tamai M. Visual Properties of Transgenic Rats Harboring the Channelrhodopsin-2 Gene Regulated by the Thy-1.2 Promoter // PLoS ONE. 2009. - Т. 4. -N 11. - С. e7679.

185. Tomita H., Sugano E., Murayama N., Ozaki T., Nishiyama F., Tabata K., Takahashi M., Saito T., Tamai M. Restoration of the majority of the visual spectrum by using modified Volvox channelrhodopsin-1 // Molecular Therapy. 2014. - Т. 22. - С. 1434-1440.

186. Tomita H., Sugano E., Yawo H., Ishizuka T., Isago H., Narikawa S., Kugler S., Tamai M. Restoration of Visual Response in Aged Dystrophic RCS Rats Using AAV-Mediated Channelopsin-2 Gene Transfer // Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2007. - Т. 48. - С. 3821-3826.

187. Ullrich S., Gueta R., Nagel G. Degradation of channelopsin-2 in the absence of retinal and degradation resistance in certain mutants // Journal of Biological Chemistry. 2013. - Т. 394. - С. 271-280.

188. Umino Y., Pasquale R., Solessio E. Visual Temporal Contrast Sensitivity in the Behaving Mouse Shares Fundamental Properties with Human Psychophysics // eNeuro. 2018. - Т. 5. - N 4. - С. ENEURO.0181-18.2018.

189. Umino Y., Solessio E., Barlow R. B. Speed, spatial, and temporal tuning of rod and cone vision in mouse // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2008. - Т. 28. -N 1. - С. 189-198.

190. Van Rossum G., Drake F. Python 3 Reference Manual // Scotts Valley, CA: CreateSpace. 2009.

191. Verbakel S. K., van Huet R. A. C., Boon C. J. F., den Hollander A. I., Collin R. W. J., Klaver C. C. W., Hoyng C. B., Roepman R., & Klevering B. J. Non-syndromic retinitis pigmentosa // Progress in retinal and eye research. 2018. - T. 66. - C. 157-186.

192. Vierock J., Shiewer E., Grimm C., Rozenberg A., Chen I. W., Tillert L., Castro Scalise A. G., Casini M., Augustin S., Tanese D., Forget B. C., Peyronnet R., Schneider-Warme F., Emiliani V., Beja O., & Hegemann P. WiChR, a highly potassium-selective channelrhodopsin for low-light one- and two-photon inhibition of excitable cells // Science advances. 2022. - T. 8. - N 49. - C. eadd7729.

193. Vlasova A. D., Bukhalovich S. M., Bagaeva D. F., Polyakova A. P., Ilyinsky N. S., Nesterov S. V., Tsybrov F. M., Bogorodskiy A. O., Zinovev E. V., Mikhailov A. E., u gp. Intracellular microbial rhodopsin-based optogenetics to control metabolism and cell signaling // Chemical Society Reviews. - 2024. - T. 53.

- C. 3327-3349.

194. Wang H., Peca J., Matsuzaki M., Matsuzaki K., Noguchi J., Qiu L., Wang D., Zhang F., Boyden E., Deisseroth K., Kasai H., Hall W. C., Feng G., & Augustine G. J. High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2007. - T. 104. - N 19. - C. 8143-8148.

195. Wietek J., Wiegert J. S., Adeishvili N., Schneider F., Watanabe H., Tsunoda S. P., Vogt A., Elstner M., Oertner T. G., & Hegemann P. Conversion of channelrhodopsin into a light-gated chloride channel // Science (New York, N.Y.). 2014. - T. 344. - N 6182. 409-412.

196. Wood E. H., Tang P. H., De la Huerta I., Korot E., Muscat S., Palanker D. A., & Williams G. A. STEM CELL THERAPIES, GENE-BASED THERAPIES, OPTOGENETICS, AND RETINAL PROSTHETICS: Current State and Implications for the Future // Retina (Philadelphia, Pa.). 2019. - T. 39.

- N 5. - C. 820-835.

197. Wu C., Ivanova E., Zhang Y., Pan Z. H. rAAV-mediated subcellular targeting of optogenetic tools in retinal ganglion cells in vivo // PLoS One. 2013. - T. 8. - N 6. C. e66332.

198. Wyk M., Pielecka-Fortuna J., Loewel S., Kleinlogel S. Restoring the ON switch in blind retinas: opto-mGluR6, a next-generation, cell-tailored optogenetic tool // PLoS Biology. 2015. - T. 13. - C. e1002143.

199. Xiong T., Tsuchida L., Inutsuka A., Onaka T., Yamada K., & Orikasa C. Novel aspect of oxytocin neurons mediating parental behavior and aversive burying behavior under the control of melanin-concentrating hormone neurons // Frontiers in behavioral neuroscience. 2024. - T. 18. - C. 1459957.

200. Xu J., Zhu Y., & Heinemann S. F. Identification of sequence motifs that target neuronal nicotinic receptors to dendrites and axons // The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 2006. - T. 26. - N 38.

201. Yau K. W., Hardie R. C. Phototransduction motifs and variations // Cell. 2009. - T. 139 - C. 246264.

202. Ye H., Fussenegger M. Optogenetic Medicine: Synthetic Therapeutic Solutions Precision-Guided by Light // Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. - 2019. - T. 9. - N 9. - C. a034371.

203. Yeganeh F., Knauer B., Guimaräes Backhaus R., Yang J. W., Stroh A., Luhmann H. J., & Stüttgen M. C. Effects of optogenetic inhibition of a small fraction of parvalbumin-positive interneurons on the representation of sensory stimuli in mouse barrel cortex // Scientific reports. 2022. - T. 12. - N 1. - C. 19419.

204. Yizhar O., Fenno L. E., Prigge M., Schneider F., Davidson T. J. et al. Neocortical excitation/inhibition balance in information processing and social dysfunction // Nature. 2011. - T. 477. -C.171-178.

205. Yonehara K., Shintani T., Suzuki R., Sakuta H., Takeuchi Y., Nakamura-Yonehara K., Noda M. Expression of SPIG1 reveals development of a retinal ganglion cell subtype projecting to the medial terminal nucleus in the mouse // PLoS ONE. 2008. - T. 3. - C. e1533.

206. Young P., & Feng G. Labeling neurons in vivo for morphological and functional studies // Current opinion in neurobiology. 2004. - T. 14. - N 5. - C. 642-646.

207. Zhang Z., Feng J., Wu C., Lu Q., & Pan Z.-H. Targeted expression of channelrhodopsin-2 to the axon initial segment alters the temporal firing properties of retinal ganglion cells // PLoS One. 2015. - T. 10. - N 11. - C. e0142052.

208. Zhang Y., Ivanova E., Bi A., & Pan Z. H. Ectopic expression of multiple microbial rhodopsins restores ON and OFF light responses in retinas with photoreceptor degeneration // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2009. - T. 29. - N 29. - C. 9186-9196.

209. Zhang F., Prigge M., Beyriere F., Tsunoda S. P., Mattis J., Yizhar O., Hegemann P., & Deisseroth K. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri // Nature neuroscience. 2008. - T. 11. - N 6. - C. 631-633.

210. Zhang Y. P., Oertner T. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel // Nature Methods. 2007. - T. 4. - C. 139-141.

211. Zhao Q., Yokomizo S., Perle S. J., Lee Y. F., Zhou H., Miller M. R., Li H., Gerashchenko D., Gomperts S. N., Bacskai B. J., & Kastanenka K. V. Optogenetic targeting of cortical astrocytes selectively improves NREM sleep in an Alzheimer's disease mouse model // Scientific reports. 2024. - T. 14. - N 1. -C. 23044.

212. Zhou Y., Wei Y., Li L., Yan T., & Ye, H. Optogenetics in medicine: innovations and therapeutic applications // Current opinion in biotechnology. - 2025. - T. 92. - C. 103262.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Idzhilova O. S., Roshchin M. V., Smirnova G. R., Malyshev A. Y. Central Targeting of Channelrhodopsin2 by the Motif of Potassium Channel Kv2.1 Can be Altered Due to Overexpression of the Construct // BioNanoScience. 2021. - Т. 11. - N 2. - С. 408-416.

2. Иджилова О. С., Смирнова Г. Р., Петровская Л. Е., Колотова Д. А., Островский М. А., Малышев А. Ю. Катионный канальный родопсин из водоросли Platymonas subcordiformis как перспективный оптогенетический инструмент // Биохимия. 2022. - Т. 87. - N 11. - С. 1625-1633.

3. Иджилова О. С., Колотова Д. Е., Смирнова Г. Р., Абонакур А., Долгих Д. А., Петровская Л. Е., Кирпичников М. П., Островский М. А., Малышев А. Ю. Неселективная экспрессия коротковолнового колбочкового опсина улучшает обучение мышей с дегенерацией сетчатки в задаче с восприятием зрительных стимулов // ДАН: науки о жизни. 2023. - Т. 510. - N 1. - С. 297302.

Тезисы

1. Иджилова О. С., Смирнова Г. Р., Малышев А. Ю. Характеристика канального родопсина из водоросли Platymonas subcordiformis, экспрессированного в культивируемых нейронах гиппокампа // Сборник тезисов XXVI научной школы-конференции молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии. - Москва, 2022. - С. 113-118.

2. Иджилова О. С., Смирнова Г. Р., Малышев А. Ю. Электрофизиологическое исследование свойств катионного канального родопсина из водоросли Platymonas subcordiformis // Оптогенетика+ 2023. Сборник научных трудов. Тезисы докладов III Всероссийской научной конференции с международным участием и Школы по современным методам неинвазивного контроля нейрональной активности / под общей редакцией М. Л. Фирсова. - Санкт-Петербург, 2023. - С. 44.

3. Колотова Д. Е., Иджилова О. С., Смирнова Г. Р., Островский М. А., Малышев А. Ю. Оптогенетическое восстановление зрения при эктопической экспрессии опсинов животного происхождения в клетках сетчатки // Оптогенетика+ 2023. Сборник научных трудов. Тезисы докладов III Всероссийской научной конференции с международным участием и Школы по современным методам неинвазивного контроля нейрональной активности / под общей редакцией М.Л. Фирсова. - Санкт-Петербург, 2023. - С. 56.

4. Иджилова О. С., Колотова Д. Е., Смирнова Г. Р., Абонакур А., Малышев А. Ю. Коротковолновый колбочковый опсин как инструмент для оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки // XXVII научная школа-конференция молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии, посвященная 300-летию РАН. Тезисы участников конференции. - Москва, 2023. - С. 54-55.

5. Иджилова О. С., Смирнова Г. Р., Абонакур А., Малышев А. Ю. Бицистронная конструкция, содержащая канальный родопсин Р8СЬЯ2 и кальциевый зонд Я0БС01, для проведения полностью оптических электрофизиологических экспериментов // XXIX научная школа-конференция молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии. Тезисы участников конференции. - Москва, 2025. - С. 10-11.

СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Список рисунков

Рисунок 1 - Калибровочные кривые для светодиодов 470 нм, 530 нм и 550 нм.................................49

Рисунок 2 - Схема стимуляции дендритного дерева нейрона по сетке...............................................52

Рисунок 3 - Трапециевидный водный лабиринт Морриса....................................................................54

Рисунок 4 - Снимок флуоресценции пирамидных нейронов, экспрессирующих конструкцию,

содержащую сигнальный мотив Kv2.1, при исходной концентрации плазмиды 0,35 мкг/мкл.........57

Рисунок 5 - Обработка данных от одной клетки....................................................................................58

Рисунок 6 - Характеристики трансмембранных фототоков в культивируемых нейронах гиппокампа,

которые экспрессируют родопсины CrChR2 и PsChR2.........................................................................61

Рисунок 7 - (А) Генерация ПД культивируемыми нейронами, экспрессирующими родопсины CrChR2 и PsChR2, в ответ на импульсную стимуляцию вспышками, следующими с разной частотой (от 20 до 50 Гц). Световые импульсы схематически показаны синими вертикальными черточками. (Б) Процентная доля сгенерированных ПД, рассчитанная относительно общего количества

поданных световых стимулов...................................................................................................................64

Рисунок 8 - Трансмембранные токи, индуцированные в культивируемых нейронах гиппокампа, экспрессирующих канальные родопсины CrChR2 и PsChR2, световыми стимулами на длине волны

470, 530 и 550 нм одинаковой оптической плотности мощности.........................................................65

Рисунок 9 - Практическая реализация полностью оптического эксперимента с использованием

опсина PsChR2 и красного кальциевого сенсора RGECO1 ...................................................................68

Рисунок 10 - Красный флуоресцентный белок RFP выступал в роли контрольного морфологического маркера (плазмида pCAG-RFP была котрансфицирована in utero с плазмидой

pCAG-ChR2-Venus-Kv2.1).........................................................................................................................70

Рисунок 11 - Снимки флуоресценции Venus после трансфекции in utero плазмидой pCAG-ChR2-

Venus-Kv2.1 в двух разных концентрациях, а также контрольной плазмидой...................................71

Рисунок 12 - Графики распространения флуоресценции Venus вдоль апикального дендрита нейронов 2/3 слоя соматосенсорной коры после трансфекции мозга in utero плазмидой pCAG-ChR2-

Venus-Kv2.1 или контрольной плазмидой pCAG-ChR2-Venus.............................................................73

Рисунок 13 - Диаграммы рассеяния, иллюстрирующие корреляцию между длиной флуоресцентного участка апикального дендрита и яркостью флуоресценции соматической мембраны нейрона после трансфекции in utero плазмидой pCAG-ChR2-Venus-Kv2.1 в концентрации 0,35 мкг/мкл (синие

маркеры) и 1 мкг/мкл (красные маркеры)................................................................................................74

Рисунок 14 - Карты светоиндуцированного входящего тока, полученные во время световой стимуляции по решетке, построенные для нейронов из трех экспериментальных групп, а также

статистические данные по характерному размеру светочувствительных полей.................................75

Рисунок 15 - Результаты поведенческого тестирования мышей после интравитреальной инъекции.

......................................................................................................................................................................77

Рисунок 16 - Экспрессия коротковолнового колбочкового опсина, детектируемая по флуоресценции mCherry, в сетчатке мышей после интравитреальной инъекции вируса AAV2-CAG-SWOpsin-mCherry........................................................................................................................................................79

Список таблиц

Таблица 1 - Экспериментальные животные............................................................................................41

Таблица 2 - Вирусные и плазмидные векторы.......................................................................................42

Таблица 3 - Перечень растворов для электрофизиологии.....................................................................47

Таблица 4 - Статистическая обработка данных......................................................................................59

Таблица 5 - Относительная величина компонентов фототока после краткосрочной инкубации культур нейронов с ретиналем ^ - стационарный компонент фототока, р - пиковый компонент, t -весь ответ)...................................................................................................................................................66