Разработка питательных сред для индикации санитарно-показательных микроорганизмов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Полосенко, Ольга Вадимовна

• Полосенко, Ольга Вадимовна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Полосенко, Ольга Вадимовна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, 6 ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. САНИТАРНО-ПОКАЗATEЛЬНЫЕ МИКРООРГАНИЗ- 19 МЫ - ПРИОРИТЕТНОЕ НАПРАВЛЕНИЕ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО СОЗДАНИЮ УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫХ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ИХ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ

1.2. СИТУАЦИЯ С ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬЮ И ПРОФИЛАК- 21 ТИКОЙ ОПАСНЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

1.3. НЕОБХОДИМОСТЬ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ СО- 30 ВРЕМЕННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ИНДИКАЦИИ СА-НИТАРНО-ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

1.4. АКТУАЛЬНОСТЬ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГ- 32 НОСТИКИ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РАЗРАБАТЫВАЕМЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

1.5. ПРЕИМУЩЕСТВО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА ИЗ- 35 МЕРЕНИЯ ИМПЕДАНСА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.6. РАДИАЦИОННАЯ СТЕРИЛИЗАЦИЯ И ИНДИВИДУ- 36 АЛЬНАЯ УПАКОВКА

1.7. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ СРЕДЫ НОВОГО ПОКОЛЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. РАЗРАБОТКА ПРОГРАММ СРАВНИТЕЛЬНЫХ ИС- 3 9 ПЫТАНИЙ НОВЫХ И КОНТРОЛЬНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

2.2. МАТЕРИАЛЫ

2.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.4. МЕТОДЫ ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ 43 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

3.1 ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ К КАЧЕСТВУ РАЗРАБА- 45 ТЫВАЕМЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД. ПРОТОТИПЫ И СУЩЕСТВУЮЩИЕ АНАЛОГИ

3.1.1. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ' 45 Е. COLI И КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ ПО ПРИЗНАКУ ФЕРМЕНТАЦИИ ЛАКТОЗЫ (СРЕДА ЭЙКМАНА С ЛАКТОЗОЙ)

3.1.2. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ Е. 46 COLI И КОЛИФОРМНЫХ БАКТЕРИЙ ПО ПРИЗНАКУ ФЕРМЕНТАЦИИ ГЛЮКОЗЫ (СРЕДА ЭЙКМАНА С ГЛЮКОЗОЙ)

3.1.3. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ БАК- 47 ТЕРИЙ ГРУППЫ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ (СРЕДА КЕССЛЕР А-ГРМ)

3.1.4. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕН- 48 ТИФИКАЦИИ ЭНТЕРОБ АКТЕРИЙ (SDS-БУЛЬОН)

3.1.5. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ 50 ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ (ЖЕЛЕЗО-ГЛЮКОЗО-ЛАКТОЗНЫЙ АГАР

С МОЧЕВИНОЙ)

3.1.6. ФЛЮОРОГЕННЫЙ СЕЛЕКТИВНЫЙ БУЛЬОН (ФСБ)

3.2. ВЫБОР БЕЖОВОЙ ОСНОВЫ

3.3. ВЫБОР ШТАММОВ

3.3.1. ТЕСТ-ШТАММЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ СРЕД ЭЙКМАНА 61 С ЛАКТОЗОЙ И ГЛЮКОЗОЙ

3.3.2. ТЕСТ-ШТАММЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ СРЕДЫ КЕССЛЕ- 62 РА-ГРМ

3.3.3. ТЕСТ-ШТАММЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ SDS-БУЛЬОНА

3.3.4. ТЕСТ-ШТАММЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ЖЕЛЕЗО

ГЛЮКОЗО-ЛАКТОЗНОГО АГАРА С МОЧЕВИНОЙ

3.3.5. ТЕСТ-ШТАММЫ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ФЛЮОРОГЕН- 65 НОГО СЕЛЕКТИВНОГО БУЛЬОНА (ФСБ)

3.4. ОПТИМИЗАЦИЯ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТ- 66 ВЕННОГО СОСТАВА ПО СОВОКУПНОСТИ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ, ХАРАКТЕРНЫХ ДЛЯ АНАЛОГИЧНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

3.4.1 .СРЕДА ЭЙКМАНА С ЛАКТОЗОЙ (ГЛЮКОЗОЙ)

3.4.2. СРЕДА КЕССЛЕРА-ГРМ

3.4.3 SDS-БУЛЬОН

3.4.4. ЖЕЛЕЗО-ГЛЮКОЗО-ЛАКТОЗНЫЙ АГАР С МОЧЕ- 83 ВИНОЙ

3.4.5. ФЛЮОРОГЕННЫЙ СЕЛЕКТИВНЫЙ БУЛЬОН (ФСБ) 90 3.5 .ИЗУЧЕНИЕ РОСТОВЫХ И ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХ

СВОЙСТВ РАЗРАБОТАННЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА РАСШИРЕННОМ НАБОРЕ МУЗЕЙНЫХ ТЕСТ-ШТАММОВ

3.5.1. СРЕДА ЭЙКМАНА С ЛАКТОЗОЙ (ГЛЮКОЗОЙ)

3.5.2. СРЕДА КЕССЛЕРА-ГРМ

3.5.3. SDS-БУЛЬОН

3.5.4. ЖЕЛЕЗО-ГЛЮКОЗО-ЛАКТОЗНЫЙ АГАР С МОЧЕ- 106 ВИНОЙ

3.5.5. ФЛЮОРОГЕННЫЙ СЕЛЕКТИВНЫЙ БУЛЬОН (ФСБ)

3.6. ОБОСНОВАНИЕ СРОКОВ ГОДНОСТИ РАЗРАБАТЫ- 111 ВАЕМЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

3.7. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭКСПРЕСС АНАЛИЗАТОРА 118 «БАК ТРАК 4100» ДЛЯ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА РАЗРАБАТЫВАЕМЫХ СРЕД ЭЙКМАНА С ЛАКТОЗОЙ И ГЛЮКОЗОЙ

3.8. ПРИМЕНЕНИЕ РАДИАЦИОННОГО МЕТОДА СТЕРИ- 121 ЛИЗАЦИИ И ИНДИВИДУАЛЬНОЙ УПАКОВКИ ДЛЯ СРЕД ЭЙКМАНА С ЛАКТОЗОЙ И ГЛЮКОЗОЙ

3.9. ИСПЫТАНИЕ ОБРАЗЦОВ РАЗРАБОТАННЫХ ПИТА- 122 ТЕЛЬНЫХ СРЕД В БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЯХ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка питательных сред для индикации санитарно-показательных микроорганизмов»

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Состояние инфекционной заболеваемости по медицинской и социально-экономической значимости остается актуальной проблемой для России и в настоящее время. В 2008 г в Российской Федерации зарегистрировано почти 750 тыс. заболеваний острыми кишечными инфекциями, среди которых почти половину составляет кишечные заболевания неустановленной этиологии [43]. Возникновение очагов холеры, угроза появления и распространения опасных кишечных инфекций вследствие ухудшения экологического состояния поверхностных вод, возможности возникновения в любом регионе эпидемической ситуации и по другим инфекциям, таким как псевдотуберкулез, кишечный иерсиниоз - все это обусловливает необходимость контроля качества объектов внешней среды, пищевых продуктов, причем не только в отношении санитарно-показательных микроорганизмов, но и условно-патогенных энтеробактерий (УПЭ). Так как бактерии рода Escherichia являются постоянными обитателями кишечника человека и животных, обнаружение их в воде, почве, на пищевых продуктах свидетельствует о фекальном загрязнении этих объектов. Обнаружение Е. coli в воде является сигналом об опасности, которое связано с самим фактом попадания фекальных масс, являющихся местом обитания болезнетворных микробов кишечно-тифозной и дизентерийной групп. Эта проблема требует постоянного внимания со стороны работников здравоохранения и медицинской науки, так как инфекционные болезни зачастую принимают характер эпидемии. Выявление и ускоренная идентификация УПЭ - имеют большое значение, как для эпидемиологии, так и при проведении санитарно-микробиологического контроля объектов внешней среды, пищевых продуктов, а также для предупреждения внутрибольничных инфекций [23].

Одной из проблем клинических лабораторий и практических служб Рос-потребнадзора является проблема правильной и своевременной диагностики инфекций, вызываемых санитарно-значимыми микроорганизмами и, как следствие, обеспечение поддержания благополучной санитарно-эпидемической обстановки.

В настоящее время реально существует угроза появления и распространения социально-значимых инфекций, что находит отражение в современных понятиях «новых и возвращающихся» инфекционных болезней, на которые обращено внимание в международных и национальных проектах. На саммите «Группы восьми» в Санкт-Петербурге 15-17 июля 2006 г. по предложению России рассматривались вопросы, связанные с противодействием угрозе инфекционных заболеваний, возможностью проявления биотерроризма и биогенными катастрофами [39]. В этой связи повышается роль обеспечения противоэпидемических мероприятий новыми, высококачественными и стабильными диагностическими препаратами, создание которых основано на использовании методов современной биотехнологии.

Молекулярно-биологические вопросы, патогенез, клинические проявления, диагностика и лечение заболеваний, вызванных кишечными инфекциями, до настоящего времени сохраняют свою актуальность в связи с повсеместным распространением данной нозологии на территории нашей страны и стран ближнего зарубежья, сохранением высокого уровня заболеваемости. В нашей стране рост заболеваемости и изменение клинической картины связывают с новыми социальными и эпидемиологическими условиями, сложившимися в последние несколько лет, и, несомненно, влияющими на ход инфекционного процесса.

В последние годы интегративное использование в микробиологии и ин-фектологии достижений молекулярной биологии и генетики, метода клонирования генов и полимеразной цепной реакции существенно углубили имеющиеся знания о факторах патогенности микроорганизмов различных таксономических групп, в том числе энтеробактерий, и механизмах развития инфекционных болезней [8]. Но, в то же время использование бактериологического метода в проблеме диагностики заболеваний, вызванных кишечными инфекциями, имеет большое практическое значение. Несмотря на «революционную» направленность к автоматизации санитарно-бактериологического контроля, «золотым стандартом» обнаружения, выделения и идентификации микроорганизмов с ти-пированием их родовой и видовой принадлежности остается бактериологический метод с использованием набора питательных сред. Поэтому вопросы расширения номенклатуры, улучшения ростовых и дифференциально-диагностических свойств питательных сред, внедрение в практику клинической микробиологии методик, позволяющих сократить время получения чистой культуры возбудителя, не теряют значимости.

Принимая во внимание указанное выше, остаётся актуальной задача создания эффективных, стандартных, дающих стабильные результаты бактериологических питательных сред для выделения энтеробактерий, позволяющих повысить надежность санитарно-бактериологического мониторинга.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Научно-экспериментальная разработка прописей бактериологических питательных сред, оценка качества и усовершенствование методов их применения для индикации возбудителей кишечных инфекций.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

• Обоснование разработки составов питательных сред для дифференциации коли-бактерий по признакам ферментации глюкозы и лактозы, образования сероводорода, гидролиза мочевины.

• Оценка диагностической ценности новых питательных сред с препаратами сравнения в лабораторных условиях.

• Обоснование разработки состава флюорогенного селективного бульона (ФСБ) для определения колиформных бактерий и E.coli с использованием гидролизата желатина в качестве белковой основы.

• Определение алгоритма использования питательных сред Эйкмана с лактозой и глюкозой в одноразовой индивидуальной^ упаковке, простерилизо-ванных у-облучением, для оценки наличия бактерий группы кишечной палочки в модельных исследованиях водных объектов.

• Определение возможности использования прибора «Бак Трак 4100» для экспресс-исследования показателей качества разработанных накопительных питательных сред.

• Изучение биологических свойств питательных сред на широком наборе музейных штаммов и клиническом материале для определения их диагностической ценности.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

1. Впервые на основе экспериментальных данных о характере роста возбудителей кишечных инфекций разработана промышленная технология производства усовершенствованных питательных сред Эйкмана с лактозой (глюкозой), Кесслера-ГРМ, SDS-бульона, железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной с использованием отечественных белковых основ: панкреатического гид-ролизата рыбной муки, пептонов, гидролизата желатина.

2. Разработаны и экспериментально обоснованы требования к основным показателям качества питательных сред при их серийных выпусках, доказана их высокая диагностическая ценность, стандартизованы методы контроля и сформулированы требования к чувствительности, ингибирующим и дифференцирующим свойствам, определены области их применения в лабораторной практике.

3. Впервые предложена современная методология контроля водоисточников с использованием сухих расфасованных, готовых к употреблению, стерильных сред Эйкмана для применения в полевых условиях. Для стерилизации сред Эйкмана адаптирован, метод радиационной стерилизации у-облучением с целью упрощения их использования.

4. Разработана питательная среда нового поколения - флюорогенный селективный бульон (ФСБ). Получены новые данные о ее преимуществе по чувствительности, скорости роста, интенсивности свечения.

5. Впервые обосновано использование железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной для проведения первичной идентификации представителей родов Yersinia и Vibrio по отношению к углеводам и мочевине.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1. Разработаны и внедрены в производство в ФГУН ГНЦ ПМБ питательные среды Эйкмана с лактозой и глюкозой, среда Кесслера-ГРМ, SDS-бульон, железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной.

2. Внедрение в производство и в практику здравоохранения разработанных и усовершенствованных стандартных сухих питательных сред для дифференциации энтеробактерий (с 2007 по 2009 гг выпущено около 20 тонн) повысило стабильность микробиологических исследований, а также эффективность эпидемиологического мониторинга объектов внешней среды (почвы, воды), пищевых продуктов и др.

3. Предполагаемый промышленный выпуск и внедрение в практику здравоохранения флюорогенного бульона (ФСБ) существенно сократит время исследования по сравнению с классическим методом, обеспечивая высокую точность результатов в условиях чрезвычайных ситуаций и сложной эпидобста-новки.

4. Применение готовых расфасованных сред Эйкмана с лактозой (глюкозой) в одноразовой индивидуальной упаковке, простерилизованных у-излучением, позволяет получать быстрые и надежные результаты в стационарных и передвижных лабораториях.

5. По результатам проведенных исследований разработаны методические рекомендации «Обнаружение колиформных бактерий и Е. coli при санитарно — микробиологическом анализе питьевой воды с использованием питательной среды Эйкмана с лактозой».

ВНЕДРЕНИЕ Разработаны, утверждены ^согласованы ТУ, регламенты производства, инструкции по применению, а также зарегистрированы в установленном порядке и разрешены к применению питательные среды Эйкмана с лактозой (глюкозой), Кесслера-ГРМ, SDS-бульона (регистрационные удостоверения № ФСР 2007/00971, № ФСР 2007/00969, № ФСР 2008/03656,,№ ФСР 2008/03655).

Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке от 18 августа 2009 г, № 2008125457/13 (030956) на № 12-05/838, «Питательная среда для определения общих колиформных бактерий и Е. coli в исследуемых образцах».

Материалы диссертации используются преподавателями в лекциях для магистрантов и аспирантов ФГУН ГНЦ ПМБ, на курсах повышения квалификации Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИ мясной промышленности им. В.М. Горбатова) и Роспотребнадзора (ФГУЗ «Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии»).

Разработаны методические рекомендации по применению среды Эйкмана с лактозой.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Составы отечественных питательных сред промышленного производства для дифференциации коли-бактерий по признаку ферментации глюкозы и лактозы, а также возможность их использования в лабораторной практике.

2. Железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной - эффективная диагностическая среда для дифференциации и идентификации энтеробактарий, в том числе иерсиний и возбудителя холеры.

3. Компонентный состав флюорогенного селективного бульона (ФСБ), содержащий в качестве источника азота панкреатический гидролизат желатина, селективные агенты и флюоресцирующую добавку.

4. Алгоритм подготовки сред Эйкмана для эпидемиологического мониторинга, включающий стадию расфасовки среды в одноразовую индивидуальную упаковку, с последующей стерилизацией у-облучением.

5. Возможность использования прибора «Бак Трак 4100» для экспресс-исследования показателей качества разработанных накопительных питательных сред Эйкмана в сравнении с аналогами.

6. Изучение биологических свойств питательных сред с использованием широкого набора музейных тест-штаммов, образцов продуктов питания, клия 1 нического материала и объектов окружающей среды для определения диагностической ценности разработанных сред.

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА:

Работа выполнена в ФГУН ГНЦ ПМБ в рамках отраслевой программы «Научные аспекты обеспечения санэпидблагополучия в Российской Федерации» по договору № 74-Д от 31.12.2005 г и в рамках программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.) Госконтракт № 128-Д» «Проведение проблемно-ориентированных исследований и разработка комплектов питательных сред для диагностики чумы, сибирской язвы и туляремии».

Настоящая диссертационная работа выполнена при консультативной помощи Главного врача ФГУЗ ФЦГ и Э Роспотребнадзора - Верещагина А.И., зав баклабораторией Калужского ФГУЗ ЦГиЭ- Мироновой З.А., зав. микробиологической лабораторией филиала ФГУЗ ЦГиЭ в МО в г.г. Пущино, Серпухов, Серпуховском и Чеховском районах- Оснач А.А., зав. лабораторией Противочумного Центра МСЧ 164 - Борзенковой Т.Х.

Искренне признательна за содействие в проведении исследований по теме диссертации сотрудникам ГНЦ ПМБ: зав. ООК Н.И. Ажермачевой, зав. научно-производственного отдела питательных сред, к. х. н. М.Н. Мартовецкому, зав. лабораторией микробиологических и физико-химических методов анализа И.И. Марчихиной, н.с. Булатовой Р.Ф., к. б. н., с.н.с. Кравченко Т. Б., к.б.н., зав.сектором лаборатории иммунобиохимии Фирстовой В.В., м.н.с. Подкопае-ву Я.В., за оформление диссертации -вед.инж. Филипповой А.П.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные материалы по теме диссертационной работы доложены на

3-ей Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы- разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем», Махачкала 2001; VII межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» Оболенск 2006; IX Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва 2007; X съезде гигиенистов и санитарных врачей Москва 2007; 9-ой Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ», Волгоград 2008; Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва 2008.

ПУБЛИКАЦИИ. Основное содержание работы отражено в 9 научных работах, включая статью Разработка и использование новой питательной среды для выявления и идентификации санитарно-показательных микроорганизмов.// Журн. Микробиол. Эпидемиол. Иммунобиол. М.: 2008. - №6 - С. 70-72.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Полосенко, Ольга Вадимовна

выводы

1. Разработаны составы отечественных сухих питательных сред промышленного производства с использованием панкреатических гидролизатов рыбной муки, пептона ферментативного в качестве белковых основ. В результате определения сроков годности питательных сред Эйкмана с лактозой и глюкозой, среды Кесслера-ГРМ, SDS-бульона, железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной методом ускоренного хранения доказано, что расчетные сроки могут служить нормативом годности для этих питательных сред.

2. Обосновано использование железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной для проведения первичной идентификации по отношению к углеводам и мочевине представителей родов Yersinia и Vibrio.

3. На основе разработанного панкреатического гидролизата желатина создана новая, высокочувствительная, флюорогенная питательная среда (ФСБ), позволяющая значительно сократить время исследования.

4. Отработана технология изготовления сред Эйкмана в одноразовой индивидуальной упаковке, простерилизованных у-облучением для исследований проб воды. В отличие от коммерческих сред, разработанные среды Эйкмана с глюкозой и лактозой содержат индикатор бромтимоловый синий, что дает возможность более точно интерпретировать результаты анализа.

5. Показана возможность использования приборов типа «Бак Трак» для определения эффективности накопительных сред (на примере сред Эйкмана).

6. По результатам исследования были разработаны, согласованы и утверждены ТУ, промышленные регламенты, инструкции по применению, а также зарегистрированы в установленном порядке и разрешены к применению питательные среды Эйкмана с лактозой (глюкозой), Кесслера-ГРМ, SDS-бульона.

7. В результате проведенных испытаний разработанных питательных сред в бактериологических лабораториях доказана их высокая эффективность. Произведенные с момента внедрения, разработанные питательные среды позволили качественно провести в баклабораториях различного уровня около восьми миллионов бактериологических исследований по обнаружению БГКП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представители семейства Enterobacteriaceao, (энтеробактерии) играют важнейшую роль в патологии человека, вызывая инфекционные процессы различной тяжести. Идет интенсивный процесс детализации таксономического положения отдельных родов и видов, выявление и описание новых. Поэтому, вполне естественно, что и бактериологам, и клиницистам приходится следить за новой информацией. Многие редкие виды не включены в базы данных наиболее распространенных коммерческих тест-систем, что затрудняет идентификацию этих микроорганизмов. Облегчает ситуацию тот факт, что использование бактериологического метода с применением набора питательных сред остается «золотым стандартом» обнаружения, выделения и идентификации микроорганизмов с типированием их родовой и видовой принадлежности.

Наиболее широко известным и распространенным способом решения данной проблемы является применение сред первичной дифференциации.

Целью использования таких сред является накопление чистой культуры и одновременное выявление некоторых свойств бактерий, что позволяет упростить процедуру дальнейшей дифференциации за счет сужения круга подозреваемых микроорганизмов.

Основным результатом диссертационной работы явилась разработка и внедрение в производство новых и усовершенствованных диагностических препаратов для оценки санитарно-эпидемического состояния объектов внешней среды, клинического материала и пищевых продуктов на наличие колиформных микроорганизмов. С этой целью разработаны сухие, стандартные, высокочувствительные, пригодные к использованию как в лабораторных, так и в полевых условиях диагностические питательные среды для- первичной идентификации микроорганизмов: среды Эйкмана с лактозой и глюкозой, среда Кесслера-ГРМ, SDS-бульон, железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной, флюорогенный селективный бульон (ФСБ).

За период с 01.01.07. по 31.10.09. в ФГУН ГНЦ ПМБ произведено SDS-бульона - 7800 кг, среды Кесслера-ГРМ - 8000 кг, железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной — 6000 кг.

Предложена современная методология контроля водоисточников с использованием стерилизованных у-облучением сред Эйкмана в одноразовой индивидуальной упаковке при применении в стационарных и передвижных лабораториях.

В отличие от препаратов сравнения, разработанные среды Эйкмана с глюкозой и лактозой содержат индикатор бромтимоловый синий, что дает возможность более точно интерпретировать результаты анализа.

Применение железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной позволяет дифференцировать микроорганизмы по способности продуцировать сероводород, расщеплять мочевину и утилизировать глюкозу. Дополнительно обосновано использование железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной для проведения первичной идентификации по отношению к углеводам и мочевине представителей родов Yersinia и Vibrio.

Для экспресс индикации и сокращения времени исследования по выявлению колиформных бактерий разработан флюорогенный селективный бульон (ФСБ), принцип действия которого основан на способности E.coli расщеплять флюорогенный субстрат, благодаря наличию Р-клюкуронидазы, с визуальным определением продуктов реакции.

Таким образом, внедрение в производство вышеуказанных питательных сред, разработка методических рекомендаций по их применению, способствует эффективному обнаружению и дифференциации колиформных микроорганизмов в исследуемых материалах.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Полосенко, Ольга Вадимовна, 2009 год

1. Адлер Ю.П., Маркова Е.В., Грановский Ю.В. Планирование эксперимента при поиске оптимальных условий. М: Наука, 1976 - С. 129.

2. Азаров В.Н. Основы микробиологии и пищевой гигиены. М: Экономика, 1981.-С. 208-209.

3. Артюхин В.И., Шепелин А.П. и др. Производство и применение продуктов микробиологических производств //Белковые гидролизаты в производстве питательных сред. М: ВНИИСЭНТИ Минмедпрома СССР. - 1990. Вып. 9-10.-С.11-16.

4. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л: Гос. изд. мед. лит., 1962. - 180 с.

5. Бактериологические исследования с использованием микробиологического экспресс-анализатора «Бак Трак 4100». Метод.указ. М: Минздрав России, 1997-С. 9-11.

6. Бакулина Н.А., Краева Э.Л. Микробиология. 2-е изд. перераб. и доп. — М: Медицина, 1980. С. 422 -442.

7. Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М: Медицина, 1982. — С. 399-441.

8. Бондаренко В.М., Шахмарданов М.З. Шигеллезы: теория и практика. М: БФРГТЗ, 2002. - С. 5.

9. Вейант Р., Мосс У., Уивер Р., Холлис Д.и др. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий. М: Мир, 1999. - С. 27-57.

10. Ю.Вода питьевая. Обнаружение и количественный учет Е. coli и колиформных бактерий. ГОСТ Р 52426-2005 (ИСО 9308-1:2000). Часть 1 М.: 2005 - С. 25-35.

11. Н.Голубева И.В., Килессо В.А., Киселева Б.С. и др. Энтеробактерии: Рук. для врачей. — М: Медицина, 1985. — С. 321.

12. XI Государственная Фармакопея СССР /Вып. 2. М.: 1990 - С. 187.

13. XII Государственная Фармакопея Российской Федерации. М.: 2007. - С. 21-46.

14. ЕфимочкинаН.Р. Эмерджентные бактериальные патогенны в пищевой микробиологии. М: РАМН, 2008. - С. 11-26.

15. Инструкция по микробиологической диагностике кишечных заболеваний, вызванных шигеллами, сальмонеллами и энтеропатогенными кишечными палочками./Под.ред Ю.И. Литинского: МЗ СССР 1966 Б № 629-66. М.: 1966. - С. 25-36.

16. Информация о продукции: Сухие питательные среды и добавки. HiMedia Laboratories Pvt Limited. А-406/ Bhaveshwar Plaza, LBS Marg, Mumbai -400 086, India, 1993. - C. 84-85.

17. Использование метода измерения электрического сопротивления (импеданса) для санитарно-микробиолгического исследования питьевой воды: Метод. указ. МУК 4.2.1111. -02. Инф.-изд.центр Минздрав России, М.: - 2002. -С.59.

18. Клиническая лабораторная аналитика /Под ред.В.В. Меньшикова — М: Агат-Мед, 2003. С. 237-244.

19. Козлов Ю.А. Питательные среды в медицинской микробиологии. М: Мед-гиз, 1960.-С. 155-156.

20. Корнелаева Р.П., Степаненко П.П., Павлова Е.В. Санитарная микробиология сырья и продуктов животного происхождения. М: Медицина, 2006 — С. 118.

21. Лабинская Л.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М: Медицина, 1988 - С.78.

22. Медицинская микробиология. /Гл. ред. В.И.Покровский, O.K. Поздеев. — М: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. С. 987-999.

23. Методы контроля бактериологических питательных сред: Метод, указ. МУК 4.2.2316-08. М: Роспотребнадзор, 2008. - С. 39-41.

24. Методы микробиологического контроля питьевой воды: Метод, указ МУК1005.045.03. Астана, 2003. - С. 23-32.

25. Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов: Метод, указ. МУК 4.2.577-96. М: Госкомсан-эпиднадзор России, 1996. - С. 44-46.

26. Методы микробиологического исследования в клинической микробиологии: Метод, рек. Министерство здравоохранения. М.: 1983. - С. 31.

27. Методы общей бактериологии. /Под ред. Ф.Герхарда и др. М: Мир, 1983. - С. 324-350.

28. Микробиологическая диагностика заболеваний, вызываемых энтеробакте-риями: Метод.указ. Министерство здравоохранения. М.: 1986. - 70 с.

29. Микробиология: Каталог 2004/2005 (MERCK), М: ООО ВИТЭК-ФАРМ, 2005.-С 171-172.

30. Микробиологические нормативы и методы анализа продуктов детского, лечебного и диетического питания и их компонентов: СанПиН № 42-1234940-88. Министерство здравоохранения. - М.: 1988. - 72 с.

31. Мол око и молочные продукты. Методы микробиологического анализа: Госстандарт. ГОСТ 9225-84.- М: Изд.Стандартов, 1984 25 с.

32. Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты птичьи. Методы отбора проб и подготовка к микробиологическим исследованиям ГОСТ Р 50396.0 92 (7702.2.0 - 95). - М.: 1995 - С. 29.

33. Определение колиформных бактерий и E.coli с использованием хромоген-ных и флюорогенных индикаторных сред производства Merck (Германия): Метод.рек. М: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.-С. 16-24.

34. Определение сроков годности сухих микробиологических сред и питательных основ методом "ускоренного старения" при повышенной температуре: Метод, рек. Махачкала, 1987. - 8 с.

35. Острые кишечные инфекции, вызываемые условно-патогенными бактериями: Метод, рек. Министерства здравоохранения. М.: 1984. - 27 с.

36. Поздеев O.K. Медицинская микробиология /Под ред. акад. РАМН В.И.Покровского. М: ГЭОТАР-МЕД, 2001. - С. 351-381.

37. Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб: ЭЛБИ, 2008. - С. 78-96.

38. Проблемы особо опасных инфекций: Сб. науч. тр./Под ред. докт. мед. наук, профессора В.В.Кутырева: Вып. 2(82) ОГУП РИК Саратов: Полиграфия Поволжья, 2001. — С. 5.

39. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий): Госстандарт России. ГОСТ Р. 50474-93. М: Стандарт, 1993. - С. 4-6.

40. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии./Под ред. Н.П. Блинова. М: Медицина, 1988. - С. 149-150.

41. Санитарная микробиология. /Под ред. С.Я. Любашенко М Пищ. пром.,1980.-С. 14-16.

42. Санитарно гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов: СанПин 2.3.2.560-96 - М.: 1996. -С. 35.

43. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды: Метод, указ. МУК 4.2.1018-01. М.:2001 - С. 22-23.

44. Скала Л.З.,. Сидоренко С.В., Нехорошева А.Г. и др. Практические аспекты современной клинической микробиологии. Тверь: Изд. Триада, 2004. — С.31-58.

45. Справочник по микробиологическим питательным средам. /Под ред. М.М. Меджидова. Махачкала: Дагестан, книжн. изд., 1989. - С. 27-51.

46. Среды бактериологические /Каталог 2007/2008 (НЕМ), ООО ГЕМ, 2007 -С. 87-88.

47. Стейниер Р., Эдельберг Э. и др. Мир микробов Т. 3. М: Мир, 1979. - С. 144-166.

48. Фомин Г.С. Вода. Контроль химической,, бактериальной и радиационной безопасности по международным стандартам: Энцикл. Справ. 3-е изд., пе-рераб. и доп. М: Изд. Протектор, 2000. - 496 с.

49. Фролова И.В;, Трошкова Г.П., Камший Л.П. Разработка технологии изготовления сухих стерильных питательных сред для клеток млекопитающих.// Биотехнология 1999. — № 4 - С. 38-43.

50. Храмов М.В., Полосенко О.В. и др. Разработка прописи и процесса производства сухой питательной среды с мочевиной (Агар Олькеницкого-ГРМ)»

51. Межд. научн.-практ. конф. Актуальные вопросы разработки и производства диагностических питательных сред и тест-систем Махачкала 2001, С. 30-31.

52. Шлегель Г. Общая микробиология. М: Мир, 1987. - С. 30.

53. Энтеробактерии: Руководство для врачей. /Под ред. акад. РАМН СССР, проф., В.И. Покровского. М: Медицина, 1985. - С. 57-220.

54. Bacteria and bacteriophages. American type culture Collection. Catalogue 1992, P. 415-604.

55. Bergey's Manual of systematic bacteriology/Eds. NR. Krieg, JG. Holt. Baltimore: Willam& Willcins Co., 1984, 9th ed. V.l: P. 296-603.

56. BioLife Manual, Second edition, printed in Italy, by INGRAF, Milan, 1991, P. 88.

57. Boyce T.G. N.Englm J. Med. 1995; 333:364-368.

58. Brotman M., et al. Gastroenterology 1995; 108:1923-1934.

59. Bryant H.E., et al. J. Infect. Dis. 1989; 160:858-864.

60. Difco, Laboratories PO BOX 331058 Detroit Mi 48232-7058 USA, 1992, P. 3.

61. Doile M.P. Shoeni J. Appl. Environ. Microbiol. 1987; 52:2394-2396.

62. HiMedia. Laboratories Pvt. Limited 1993

63. Holt J.G., editor in ch. Bergey's manual of determinative bacteriology. Baltimor: Williams & Wilkins; 1994

64. Manual of BBL products and laboratory procedures. Sixth Edition 1991.- 52000.1. P. 172.

65. Microbiology Manual, MERCK, LPRO UBA-V. 1996. P. 314-316.

66. Microbiological Media /by Ronald M. Atlas, second edition. 1997. P. 5051523.

67. Microbiology Culture Media for general microbiology, for Food Analisis, For Environmental'Analisis, for molecular Biology (1994), Fluka P. 69.

68. Robson W.L., et al. Curr. Probl. Pediatr. 1993;23: P. 16-33.81 .Ryan M.J., et al. Nngl.J.Med. 1995; 333:1712-1713.

69. The manual of microbiological'culture media Gibco BRL, 1988 — P. 51.

70. The Oxoid manual of culture media, ingredients and other laboratory services

71. Oxoid Limited 1979). 84.Selconis W.C., Winter J.A. Microbes in water.//ASTM Standartization News -1992-№4. P. 50-53.