Совместная сорбционная иммобилизация гидролитических ферментов α-амилазы, протеазы BACILLUS SUBTILIS и витамина B12 на полимерном носителе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Григорьева, Екатерина Павловна

• Григорьева, Екатерина Павловна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Григорьева, Екатерина Павловна

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Современные подходы к созданию иммобилизованных форм лекарственных веществ.

1.2. Практическое применение сорбентов в биотехнологии.

1.2.1. Сорбционные технологии для выделения и очистки биологически активных веществ.

1.2.2. Сорбенты - полимерные носители биологически активных веществ.

2.Экспериментальная часть.

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Структура и свойства гидролитических ферментов и витамина B!2.

2.1.2. Физико-химические характеристики сорбентов.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Определение концентрации белка по методу Лоури.

2.2.2. Определение активности а-амилазы.

2.2.3. Определение протеолитической активности.

2.2.4. Определение концентрации витамина В12.

2.2.5 Гельхроматографический анализ.

2.3. Методики проведения сорбционных экспериментов.

2.3.1 Исследование сорбции белков в статических условиях рН -зависимость и изотермические процессы сорбции).

2.3.2. Исследование кинетики сорбции белков.

2.3.3. Проведение процесса сорбции и десорбции в динамических условиях.

2.4. Математические методы обработки результатов.

3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Выбор эффективного сорбента для выделения и очистки гидролитических ферментов из технического препарата Амилосубтилина ГЗХ.

3.1.1. Сорбция гидролитических ферментов на модифицированных и ^модифицированных молекулярных сорбентах.

3.1.2. Сорбция гидролитических ферментов на карбоксильном катионите Биокарб.

3.1.3. Сорбция гидролитических ферментов на сверхсшитых сорбентах марки Стиросорб.

3.1.4. Сравнительная оценка методов очистки а-амилазы и протеазы Bacillus subtilis с использованием различных сорбентов.

3.2. Исследование процессов соиммобилизации а-амилазы, протеазы Bacillus subtilis и витамина В12 на полимерном носителе.

3.3. Технологическая схема получения субстанции иммобилизованных на Биокарбе а-амилазы, протеазы и витамина В^.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Совместная сорбционная иммобилизация гидролитических ферментов α-амилазы, протеазы BACILLUS SUBTILIS и витамина B12 на полимерном носителе»

До последнего времени остается актуальным разработка эффективных лекарственных препаратов для лечения заболеваний, связанных с ферментативной и витаминной недостаточностью. Изучено более 500 дефектов обмена веществ у человека, в основе которых лежит нарушение синтеза определенного фермента. Исследования показывают, что до 10% населения в какой-то степени страдает различными желудочно-кишечными заболеваниями из-за нехватки или отсутствия необходимых ферментов в организме. Кроме того, по мере старения увеличивается количество людей с энзимными дефектами [15; 100]. Поэтому среди ферментов в медицинской практике наиболее часто применяются гидролазы (протеазы, липазы, амилазы).

Основным источником ферментов медицинского назначения остается животное сырье, в частности, поджелудочная железа крупного рогатого скота. Ограничение животного сырья не позволяет полностью удовлетворять потребности практической медицины. Неограниченным источником получения ферментов являются микроорганизмы. Многочисленные работы отечественных и зарубежных исследователей показали, что ферменты из микроорганизмов сравнительно недороги, универсальны по своей субстратной специфичности, обладают меньшим сродством к ингибиторам плазмы крови и тканей человека и поэтому могут заменить практически все выпускаемые промышленностью ферменты, получаемые из животного сырья.

Применение нативных ферментов и некоторых витаминов затруднено из-за их инактивации во внутренних средах макроорганизма, ингибирования соответствующими системами крови и тканей. Эти проблемы могут быть решены путем применения различных методов иммобилизации.

Наиболее распространенными являются капсулированные или покрытые кислотостойкой оболочкой лекарственные формы ферментов и других биологически активных веществ.

Однако такие формы препаратов обладают существенными недостатками: 1) не могут использоваться для лечения грудных детей и ослабленных больных, неспособных глотать таблетки или капсулы; 2) не могут быть разделены на части при дозировании без потери активности; 3) не обладают регулируемостью высвобождения действующего начала. Кроме того, успешное применении капсулированных препаратов зависит от индивидуальной кислотности желудочного сока, возраста пациента, а также других причин, определяющих время перемещения капсулы в организме.

Эти недостатки могут быть устранены при использовании метода обратимой сорбционной иммобилизации лекарственных веществ на специально подобранном мелкодисперсном носителе. На его основе может быть получена готовая лекарственная форма в виде легкораспадающихся таблеток, пригодных для применения в педиатрии и гериатрии. Перспективность применения нековалентно иммобилизованных биологически активных веществ в медицине показана как за рубежом [176], так и в России [8; 49]. Исследована сорбционная иммобилизация а-амилазы Bacillus subtilis на карбоксильных полиэлектролитах-сополимерах метакриловой кислоты и этиленгликольдиметакрилата [19; 24]. Разработан лабораторно-технологический регламент [52] и опытно-промышленный регламент [74] на производство Амилокарба - препарата содержащего иммобилизованную на полимерной матрице сорбента а-амилазу. На сегодняшний день актуальным является расширение спектра действия разработанного препарата. Это может быть достигнуто путем совместной модификации нескольких ферментов, витаминов и других соединений, обладающих выраженным терапевтическим действием.

Цель работы: разработка метода выделения и очистки а-амилазы и протеазы Bacillus subtilis из технического препарата и подбор условий сорбционной со-иммобилизации очищенных ферментов и витамина В\2 на карбоксильном ка-тионите. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• Изучение сорбционных свойств гидролитических ферментов а-амилазы и протеазы на ионогенных и молекулярных сорбентах.

• Разработка эффективного способа очистки а-амилазы и протеазы при выделении их из раствора технического препарата Амилосубтилина.

• Выбор оптимальных условий для соиммобилизации объектов (амилазы, протеазы, витамина В12) с целью получения кислотостойкого комплекса. Научная новизна. Впервые исследованы равновесные и кинетические параметры сорбции ферментов а-амилазы и протеазы Bacillus subtilis и разработан хроматографический метод их очистки из технического ферментного препарата на сверхсшитом сорбенте Стиросорб. Методом сорбционной иммобилизации на носителе получена новая кислотостойкая форма ферментов и витамина Bi2, которая может применяться в виде порошка или быстрорастворимых таблеток. Практическая значимость: на основании проведенных экспериментальных исследований предложен эффективный способ выделения а-амилазы и протеазы из технического препарата, позволяющий повысить удельную активность ферментов и избавиться от пигментных и других примесей; разработаны технические условия получения пищевой добавки "Амивикарб". Основные положения, выносимые на защиту: 1) эффективность очистки гидролитических ферментов а-амилазы и протеазы Bacillus subtilis из технического препарата обусловлена применением сверхсшитого сорбента Стиросорб; 2) различия в равновесных и кинетических параметрах исследуемых объектов позволяют оптимизировать условия соиммобилизации ферментов и витамина В12 на полимерном носителе; 3) сорбционная иммобилизация дает возможность получить комплекс ферментов и витамина, сравнимый по кислотостойкости с препаратами, содержащими пищеварительные ферменты, покрытые кислотостойкой оболочкой.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Григорьева, Екатерина Павловна

Выводы

1. Предложен способ получения иммобилизованных на носителе Биокарб гидролитических ферментов (а-амилазы, протеазы Bacillus subtilis) и витамина Bi2, на основе которого возможно изготовление кислотостойкой лекарственной формы, пригодной для перорального применения.

2. Изучение равновесных и кинетических закономерностей сорбции ферментов и витамина на карбоксильном катионите Биокарб показало, что оптимальной очередностью соиммобилизации является последовательная сорбция сначала а-амилазы и протеазы, а затем витамина Bi2.

3. Разработан метод хроматографической очистки ферментов из технического препарата Амилосубтилина на сильно сшитом сульфокатионите Стиросорб, позволяющий одновременно с депигментацией увеличить удельную амилолитическую активность в 3,4 раза, а протеолитическую - в 2,2 раза.

4. Разработана технологическая схема получения субстанции иммобилизованных на Биокарбе а-амилазы, протеазы и витамина BJ2.

5. Полученные результаты легли в основу проекта технических условий на комплексную биологическую пищевую добавку, включающую иммобилизованные витамин Bi2, амилазу, протеазу.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Григорьева, Екатерина Павловна, 2001 год

1. Альтшуллер Г.Н., Савельев Е.А. Термодинамика обмена ионов сульфаниламидов пиримидинового ряда на высокоосновных анионитах.// ЖФХ, Т.45, №5, 1971. С.1301-1305.

2. Афиногенов Г.Е., Панарин Е.Ф. Антимикробные полимеры. — СПб, 1993. С. 251.

3. Басин В.Н., Карливан В.П., Соколова Н.А. Экономический эффект от использования новых лекарственных препаратов.// В кн.: Тезисы докладов III Всесоюзной научной конференции "Методы получения и анализа биохимических реактивов". Олайне, 1979. С. 5-6.

4. Башуро Г.С., Ляпунов Н.А. К вопросу о применении катамина при создании готовых лекарственных средств.// Фармация №1, 1998. С. 3538.

5. Белякова Л.Д. Хроматографические и адсорбционные свойства сверхсшитых полистирольных адсорбентов "Стиросорб".//В сб.: Всероссийский симпозиум по теории и практике хроматографии и электрофореза. Самара: Самарский Университет, 1999. С. 151-162.

6. Белякова Л.Д., Василевская О.В., Цюрупа М.П., Даванков В.А. Адсорбционные и хроматографические свойства полимерных сорбентов типа "Стиросорб".//ЖФХ, Т.69, №4, 1995. С.696-700.

7. Белякова Л.Д., Василевская О.В., Цюрупа М.П., Даванков В.А. Адсорбционные и хроматографические свойства микросферических полимерных сорбентов типа "Стиросорб".// ЖФХ, Т.70, №8,1996. С. 14761481.

8. Березин А.В., Егоров A.M., Осипов А.П., Осипова Т.А. Иммобилизованные ферменты и перспективы их использования.// Ж. Всесоюзного хим. обществава им. Д.И. Менделеева, №5,1980. С. 581-588.

9. Березин А.В., Клячко Н.К., Левашов А.В., Можаев В.В., Хмельницкий Ю.Л. Иммобилизованные ферменты. М.: Высшая школа, 1987. - 160 с.

10. Ю.Березин А.В., Ксисов А. А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М.: МГУ, 1976. С. 115.

11. П.Беруин И.В., Клячко М.Л., Левашов А.В. и др. Иммобилизованные ферменты. М.: Высшая школа, 1987. С. 160.

12. Биотехнология.// Под. ред. А.А.Баева. -М.: Наука, 1984. С. 308.

13. Браунштейн А.Е. На стыке химии и биологии. М.: Наука, 1987. С. 239.

14. Валенкевич Л.Н., Морозов К.А. Ферментативная система поджелудочной железы и тонкой кишки человека при старении./ Сб. ст. "Пищев. фермента." Ужгород, 1976. С. 23-25.

15. Воробьёва Л.И. Микробиологический синтез витаминов. -М.: Изд. Моск. Университета, 1982. С. 67-97.

16. Гинодман A.M. и др. Иониты.// БМЭ, 3 изд., Т.9. М., 1978. С. 1125-1134.

17. Глазова Н.В. и др. Сорбция ферментов на ионитах различной структуры.// Ж. Прикл. биохимии и микробиологии, Т.28, №5, 1992. С. 694-697.

18. Глазова Н.В. Сорбционное разделение смесей БАВ в квазиравновесных и неравновесных условиях.// Тезисы докладов Всерос. симпозиума "Биосепарация-96". СПб, 1996. С. 11.

19. Глазова Н.В., Елькин Г.Э., Рудометова Н.В. Оптимизация ионообменных процессов с использованием ПЭВМ. СПХФИ, 1993.С. 19.

20. Государственная фармакопея СССР.// Министерство здравоохранения Рос. Федерации. Вып. 1, 2. М.: ООО "Научный центр медицинских исследований "Тимотек"", 1988. С. 398.

21. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М.: Агропромиздат, 1987. С.335 .

22. Дарбре А. Практическая химия белка.// Пер с англ.- М.: Мир, 1989. 623 с.

23. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.: Мир, 1992.С.1117.

24. Дощицын B.JI. Принципы и тактика лечения аритмии сердца.// Кардиология.,№ 10, 1989. С.125-127.

25. Елькин Г.Э. Концепция регулярности режима сорбции в теории и практике ионного обмена органических ионов.// Межвузовский сборник: Ионный обмен и ионометрия. Вып. 7, 1990. С. 3-15.

26. Елькин Г.Э. Теоретические основы выбора оптимальных режимов сорбции и хроматографии БАВ.// Тезисы докладов Всерос. симпозиума "Биосепарация-96". СПб, 1996. С. 11.

27. Елькин Г.Э., Глазова Н.В., Курдявка Л.В. Модификация свойств поверхности макропористых сополимеров путем адсорбции поверхностно-активных веществ.//ЖФХ.Т.68, №10, 1994. С. 1782-1783.

28. Игонина Л.М. Хроматографическое выделение и изучение свойств фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота.// Диссертация на соискание ученой степени канд.биол.наук. СПб: СПХФА, 1996. С. 134.

29. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы./ Под ред. Дж.Вудворда. -М.: Мир, 1988. С. 215.

30. Иониты. Черкассы: НПО "Пластмассы", 1980.С. 32.

31. Иониты. Сорбенты. Носители./ Научно-произв. объед. "Биохимреакгив". -Черкассы, 1983. С. 17.

32. Кабачный П.Н., Чернобай В.Т. Амилолитические ферменты и их применение в народном хозяйстве и медицине. Мин. мед. пр-ти. Центр, бюро науч.-тех. инфор. медиц. пр-ти, 1982.С. 45.

33. Калунянц К.А. и др. Микробные ферментные препараты: технология и оборудование. -М.: Пищ. пр-ть, 1979. С. 304.

34. Каталог хроматографических материалов для научных исследований.// РАН, Главное Управление материально-технического обслуживания. -М.: Наука, 1992.С. 63.

35. Кокотов Ю.А., Золотарев П.П., Елькин Г.Э. Теоретические основы ионного обмена. Л.: Химия, 1986. С.280.

36. Коликов В.М., Мчедлишвили Б.В. Хроматография белков на макропористых кремнеземах. Л.: Химия, 1986.С. 192.

37. Колодзейская М.В., Пилявская А.С. Пептидазы. Киев, "Наукова думка", 1982. С.176.

38. Контролируемое высвобождение ацетилсалициловой кислоты из таблеток аспроформ./ С.Шопова, В.Томова, К.Радева и др.// Фармация. Т.37. №4. -София, 1987.С. 22-27.

39. Коршак В.В., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. -М.: Наука, 1984. С. 261.

40. Косенко Н.В. Исследование микрокапсулированного этмозина и свойства микрокапсул.// Фармация. № 3, 1986. С. 23-26.

41. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии М.:Высшая школа, 1980. С. 224.

42. Кравченко И.А. Иммобилизация щелочной протеазы и галактозидазы на полимерных носителях. //Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата хим.наук. Одесса: Физико-химический институт им. А.В.Богатского, 1985. С. 19.

43. Кулик Э.А., Севастьянов В.И. Различия в энергиях взаимодействия белок поверхность.//Ж. физ.-хим. Т.65, вып. 8., 1991.

44. Куриненко Б.М., Калачева Н.В., Пензикова Г. А., Скокова И.Ф. Модификация нуклеаз растворимыми производными полисахаридов. //Биохимия, Т.43,№ 11. 1978.С. 1994-2001.

45. Лабораторный технологический регламент на пр-во Амилокарба./ Мин. мед. пр-ти СССР, Ленинградский хим.-фарм. институт, 1979. С. 80.

46. Лебедев Ю.Я. Теория хроматографии медленно диффундирующих веществ. Типы режимов.// ЖФХ. Т.69, №6, 1995. С. 1080-1084.

47. Лебедев Ю.Я. Теория хроматографии медленно диффундирующих веществ. Обращение порядка элюирования компонентов.// ЖФХ, Т.71, №6, 1997. С. 1117-1120.

48. Лекарственные средства: 5000 наименований лекарственных препаратов и их форм: Свойства, применение, взаимодействие, противопоказания./ Сост. М.А.Клюев и др., под ред. М.А.Клюева. 8-е изд., доп. и перераб. -М.: Книжный дом "Локус", 1999. С. 693.

49. Лиходед В.А., Мухамедзянов P.M. Влияние вспомогательных веществ при изготовлении пенообразующих таблеток.// Журнал хим.-фармац. Т.24. №3, 1990. С. 55-58.

50. Лопухин Ю.М., Малоденков М.Н. Гемосорбция. М.: Медицина, 1978. С. 301.

51. Лурье А.А. Хроматографические материалы (справочник). М.: Химия, 1978. С. 440.

52. Макаров К.А., Кибардин С.А. Иммобилизованные биопрепараты в медицине. М., 1980. С. 44.

53. Максимов В.И. Стабильность ферментов при очистке.// В кн.: Кристаллические ферменты: методы получения, их характеристика и использование. Вильнюс, 1975. - С. 22-25.

54. Мартынек К., Березин И.В. Стабилизация ферментов ключевой фактор при внедрении биокатализа в практику.// Успехи химии. Т.49. - М., 1980. С. 737-770.

55. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Т.2. М.: Медицина, 1987. С. 576.

56. Метелица В.И. Справочник кардиолога по клинической фармакологии. -М.: Медицина, 1987. С. 115.

57. Микрокапсулирование активных веществ. Характеристика полимерных покрытий./ С.Шопова и др.// Фармация. Т.39. №5. София, 1989. С. 19-25.

58. Микрокапсулированная форма масляного раствора дибунола./ Л.А.Щедрина, Е.А.Берсенева и др.// Фармация. №4, 1983. С. 24-29.

59. Минделл Э. Справочник по витаминам и минеральным веществам (Энциклопедия витаминов и питания), 1997. С. 317.

60. Можаев В.В. Иммобилизация ферментов как новый подход к решению функциональных проблем энзимологии.// Успехи биологической химии. Т.24, 1983. С.99-134.

61. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука, 1971. С.404.

62. Наджимутдинов Ш., Узаков И. и др. Изучение сополимеризации метакринальных производных сольсолидина с винилпирролидоном.// Журнал хим.-фарм. №2, 1981. С.54-59.

63. Никонова И.Н. Водорастворимые полимерные производные трипсина и пероксидазы хрена с одноточечным связыванием полимера-модификаторас белком.// Автореферат дисс. на соискание уч. степени канд.хим.наук. -Л., 1989.С. 20.

64. Панарин Е.Ф. Синтез, структура и свойства полимеров.// Сб. научных трудов XV научной конференции ИВС АН СССР./ Под ред. М.М.Котан. -Л.: Наука, 1979. С. 275-278.

65. Панарин Е.Ф., Васильев В.К. // Журнал хим.-фарм. №3 , 1976. С. 64-67.

66. Панарин Е.Ф., Копейкин В.В., Афиногенов Г.Е. // Биоорган, химия. №3, 1978. С. 375-381.

67. Панарин Е.Ф., Соловский М.В., Зайкина Н.А. Синтетические полимеры медицинского назначения. Ташкент, 1973. - С. 25.

68. Паписов И.М. Кооперативные полимер-полимерные взаимодействия и их роль в матричных полиреакциях. Автореф. дисс. на соискание ученой степени д.х.н. -М.: МГУ, 1975. С. 31.

69. Писарев О.А., Кручина-Богданов И.В., Глазова Н.В., Быченкова О.В. Хроматографические разделения БАВ в кинетически селективных режимах динамики сорбции.//ЖФХ. Т.73, №9, 1999. С. 750-754.

70. Платтэ Н.А., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. М.: Химия, 1986. С. 296.

71. Полиферментные системы. //Тезисы сообщ. всесоюз. семинара "Перспективы применения полиферментных систем в народ, хоз-ве". Неринга, Литовская ССР, май 1980. чЛ. Вильнюс, 1980. С. 52-80.

72. Полянский Н.Г., Горбунов Г.В., Полянская Г.Л. Методы исследования ионитов. М.: Химия, 1976.С. 208.

73. Потапова Г.И., Попов Е.Г. Влияние блокаторов ?-адренергичесикх рецепторов на агрегационнцю способность тромбоцитов у больных артериальной гипертонией.// Кардиология №3,1982. С. 41-43.

74. Радченко И.Г., Пономаренко М.Н., Глазова Н.В., Йозеп А.А. Исследование полимерных комплексов, включающих ферменты и растворимые полимеры.//ЖФХ. Т.70, №6, 1997. С. 1040-1043.

75. Рудометова Н.В. Разработка сорбционного хроматографического выделения панкреатических ферментов. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. - СПб: СПбТИ, 1994.

76. Рухлядева А.П., Полыгалина Т.В. Методы определения активности гидролитических ферментов. М.: Легкая и пищевая пр-ть, 1981. С. 288.

77. Салдадзе К.М., Пашков А.Б., Титов B.C. Ионообменные высокомолекулярные соединения./ Под ред. К.М.Салдадзе. М.: Госхимиздат, 1960. С. 350.

78. Самсонов Г.В., Тростянская Е.Б., Елькин Г.Э. Ионный обмен. Сорбция органических веществ. Л.: Наука, 1969. С. 333.

79. Самсонов Г.В., Меленевский А.Т. Сорбционно-хроматографические методы физико-химической биотехнологии. Л.: Наука, 1986.

80. Самсонов Г.В., Писарев О. А. Новые принципы ионообменной препаративной хроматографии и их применение для выделения, очистки и суперочистки антибиотиков.// Прикладная химия и микробиология. Т.28, №1, 1992. С. 5-18.

81. Селезнева А.А., Бабенко Г.А., Елькин Г.Э. и др. Кинетика сорбции ферментов в поверхностном слое карбоксильных катеонитов.// Коллоидный Журнал. Т.36, №3., 1974.С. 511-514.

82. Селезнева А.А., Дубинина Н.И., Бабенко Г.А., Лукницкая О.Ф., Самсонов Г.В. Особенности сорбции белков карбоксильным катеонитом.// Коллоидный Журнал. Т.37, №6, 1975. С. 1138-1142.

83. Селезнёва А.А., Поляк М.С., Рабинович И.М., Москвичев Б.В. Ферменты медицинского назначения из микробного сырья. Центральное бюро науч.-технич. информации медицинской пр-ти. - М., 1982.

84. Сенявин М.М. Основные этапы и перспективы исследований ионообменных процессов.// Ионный обмен. -М.: Наука, 1981. С. 5-24.

85. Скоупс Р. Методы очистки белков. М,: Мир, 1985. С.224.

86. ЮО.Сорокин А.Г. Современное состояние исследований в области ферментов медицинского назначения и их производство./ Сб. науч. ст. "Иммобилиз. ферменты в медицине и мед. пр-ти".- Д.: 1982. С. 5-20.

87. Сульдин А.В. Технология препаратов пролонгированного действия на основе сорбции активированными углями и ионитами.// Автореферат дисс. на соискание ученой степени канд.фарм.наук. М., 1981. С. 20.

88. Торчилин В.П. Иммобилизованные ферменты в медицине. //Новое в жизни, науке, технике. Сер. "Химия", № 9- М.: Знание, 1986. С.32.

89. ЮЗ.Тривен М. Иммобилизованные ферменты. М.: Мир, 1983. С. 211.

90. Троицкая В.Б. Электролиты и ферменты поджелудочного сока.// В кн.: Руководство по физиологии. Физиология пищеварения. Д.: Наука, 1974. С.339-359.

91. ТурковаЯ. Аффинная хроматография. М.: Мир, 1980.

92. Юб.Царенко О.В. Хроматографическая очистка ферментов изподжелудочной железы.// Диссертация на соискание ученой степени канд.биол.наук. СПб: СПХФА, 2000. С. 125 .

93. Цюрупа М.П., Ослонович Ю.В., Нистратов А.И., Радченко Л.Г., Даванков В.А., Фазовое расслоение в условиях синтеза сверхсшитых полистирольных сеток в среде циклогексана.// ВМС. Т.37А, №6. , 1995 С. 964-968.

94. Цюрупа М.П., Даванков В.А., Кривоносова Л.Г., Селеменев В.Ф., Чикин Г.А. Поглощение окрашенных веществ из ферментационных растворов лизина сверхсшитым сорбентом.// Прикладная биохимия и микробиология. Т.21, №1,1985. С. 72-77.

95. Ю9.Цюрупа М.П., Панкратов Е.А., Даванков В.А. Влияние среды синтеза на физико-химические свойства макросетчатых изопористых полимеров стирола.// ВМС. Т.22Б, №10, 1980. С. 746-748.

96. О.Цюрупа М.П. Структура и свойства полимерных сорбентов на основе сверхсшитого полистирола.// Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук. Москва, 1988.

97. П.Черкасов А.Н., Пасечник В.А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. -Л.: Химия, 1991.С. 240.

98. Шатаева Л.К., Кузнецова Н.П., Елькин Г.Э. Карбоксильные катиониты в биологии. Л.: Наука, 1979.С. 229.

99. Abrahams A., Binnel R.A. Oral therapy with a new long-acting dexaphetamine salt. //Lancet. V. 11, 1957. P. 1317-1318.

100. Abshagen U., Demmer F. Vor teile und Probleme von Retard preparaten. // Med. Klinik. B. 28. №18, 1981. S. 14-20.

101. Ashihara Y., Kono Т., Yamasaki S., Inada Y. Modification of E. coli-L-asparaginase with polyethilene glycol: disappearance of binding ability to anti-asparaginaze serum. //BBRC. v.83, No 2, 1978. P. 385-391.

102. Atkinson В., Mavituna F. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook.- England: Macmilan Publishes Ltd., 1983.

103. Barker S.A., Kay I. Handbook of Ensyme Biotechnology. Ellis Horwood, 1985. P.85.

104. Becker B.A., Swift T.G. Effective reduction of the acute toxicity of Centain Pharmacologic agents by use of Synthetic Ion Exchange resins. // Toxicol. Appl. Pharmacol. V. 1, 1959. P. 42-60.

105. Bickerstaff G.H. Ensymes in industry and medicine.- London.: Aenold, 1987. P. 74.

106. Biotechnological Applications of Proteins and Enzymes./ Ed. by: Zvi Bohak, Nathan Sharon. N.Y., San-Francisco, London: Academic Press, 1977. P.368.

107. Blackburn P., Moore S. The Enzymes./ Ed. P.D.Boyer. v. 15, 1982. P.317-433.

108. Brooks C.L. Proteins: A theoretical perspective of dynamics, structure and thermodynamics. //Advances in chem. Physics, ХШ, v.71. N.Y. etc.: Wiley and Sons, 1988. P. 259.

109. Bucke C. The biotechnology of enzyme isolation and purification.// In Principles of Biotechnology. Glasgow: Blackie and Son Ltd., 1983. P. 151171.

110. Combes D., Joovidhya Т., Gerbal E. at. Al. Mechanism of Enzyme Stabilization. //Ann. N. J. Acad. Sci. V. 501, 1997. P. 59-62.

111. Corradini D., FilippettI, Corradini C. Salt mediated elution behavior of proteins on a silica-based stationary phase for size exclusion high perfomance liquid chromatography.// J. Liquid Chromatog .v. 16, 1993. P. 3393-3408.

112. Davankov V.A., Tsyurupa M.P. Structure and properties of porous hypercrosslinked polystyrene sorbents styrosorb.// Pure and Appl. Chem. v.61, 1989. P. 1881-1888.

113. Davankov V.A., Tsyumpa M.P. Structure and properties of hypercrosslinked polystyrene the 1st representative of a new class of polymer networks.// Reactive Polymers, v. 13, 1990. P. 27-42.

114. Desilets C.P., Rounds M.A., Regnier F.E. Semipermeable-surface reversedphase media for high-performance liquid chromatography.// J. Chromatogr. v.544, 1991. P. 25.

115. Desnuelle P. In the Enzymes.// 2nd Ed. Academic Press, v.4. New York., 1960. P.93.

116. Enzyme Engineering/ ed. by H.Weetall, G.Royer. N.Y. & London: Plenum Press, 1980. P.5.

117. Enzyme Engineering/ ed. by L.Wingard, J.Berezin, A.Klyosov. N.Y. & London: Plenum Press, 1980.

118. Fritz J.S. et al. Ion chromatography. X .- Heidelberg etc.: Huthig, 1982.P.203.

119. Gebellin Ch. J.//Bioactive Polymeric Systems. Phenumm Press. W-J. v. 5, 1985. P. 1-13.

120. Glazer A.N. The chemical modification of proteins by groupspecific and site-specific reagents. //The Protein. V. 5.- New-York: Academic Press, 1986. P. 1103.

121. Glazova N.V., Igonina L.M, Elkin G.E. Chromatografic purification of enzyme medicines from macromolecular impurities.// Macromolecular Symposia. Bratislava, 1995.

122. Glazova N.V. Sorption technology protein medicines including of non-equilibrium chromatografic effects.// 10-th International Symp. of Chromatograthy in Industry. Bratislava, 1996. P. 173-174.

123. Grimova J., Hrabak F.J. Biomed. Meter. Res. V. 12. №4,1978. P. 525-530.

124. Handbook OF Amylases and related enzymes Their Souries, Isolation Methods, Properties and Applications Edited by the Amylase Research Society of Japan Perdamon Press, 1988. P. 274.

125. Heirzmann V.//Experienta. V. 36. №7, 1980. P. 885-887.

126. Jansen J.C., Hedman P. Large scale chromatograpy of proteins.// Advances in Biochemical Engineering, v.25, 1982. P.43-49.

127. Karlstom В., Vincent J., Jochansson В., Bryno C. A simple purification method of squeezed krill for obtaining high levels of hydrolytic: enzymes.// Prep. Biochem .v.21, №4, 1991. P.237-256.

128. Kato Y. High-performance hydrophobic interaction chromatography of proteins. Advances in chromatography.// Eds. Giddings J.C., Grushka E., Brown P.K. New York, Basel: Marcel Dekker Inc. v.26, 1987. P. 97-115.

129. Khng Hwee Peng, Cunliffe D., Davies S., Turner N.A., Vulfson E.N. The synthesis of sub-micron magnetic particles and their use for preparative purification of proteins.// Biotechnol. and Bioeng. v.60, №4, 1998. P. 419424.

130. Kitara A, Shahani K. The use of immobilized enzymes in the food industry. -CRC Crit. Rev. Food. Sci and Nutr .v.12, No 2, 1979. P. 161-198.

131. Kuhn W., Kirstein D., Mohr P. //Acta biol. Et med. Ger. V. 39. №11-12, 1990. P. 1121-1128.

132. Kunitz M. Cristalline soybean trypsin ingibitor.// J. Gen. Phisiol., 1974. P. 291-300.

133. Leucuta S.E. Controlled release of metronidazole form gelatin microspheres and ethylcellulose coated microcapsules and kinetics of drug release. //Clin. Med. V. 59. №4, 1986. P. 346-352.

134. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr H.L., Randell R.J. J. Chem. T. 193, 1951.

135. Marshall J.J., Humphreys J.D. Experimental enzyme therapy. //J. Appl. Biochem. v. 1, No 1. P. 88-94.

136. Methoden zur Activitatsbestimmung von Proteinases/ Heidrun Kirschke u. Bernd Wiederanders.-Halle (saale), 1984.-(Kongress und Tagundsberichte der Martin-Luther-Universitat Halle-Wittenberd) Wissenschaftliche Beitroge.-DDR, 1984. S. 64.

137. Methods in Enzymology. Et by K. Mosbach.- New York: Academic Press, 1986. P. 563.

138. Methods in Enzymology. Immobilized Enzymes. Et by K. Mosbach.- New York: Academic Press, 1976. P. 999.

139. Net Kenneth E. Cooperativity in enzyme function: equilibrium and kinetic aspects.// Meth. in Enzymol. v.64,1980. P. 139-192.

140. Ngo T.T. Bioanalitical applications of immobilized enzymes. //Int. Biochem. v.ll, No 6, 1980. P. 459-465.

141. Pat. 2119648. Anorexigenic pharmaceutical composition. / Brigga J.H. (G.B.), 1983.

142. Pat. 3342685 (USA). Vitamin-cation exchange resin therapy and method of elimination drug odor. / Stephen Paul Reti et al, 1967.

143. Pat. 4344933 (USA). Pharmaceutical composition with prolonged bronholytic and toxolitic activitys. / Annemarie Siegl, Christian Knopp, Karl Reithmayr, 1982.

144. Pat. 4364928 (USA). Novel salts on ion exchande resins of the asid type. / J. Martel, J. Tessier, P. Girault et al, 1982.

145. Pat. 4369175 (USA). Process for the manufacture of prolonged action vincamine preparations so obtaned and medicaments contaning them. / Satis C.K., 1983.

146. Pat. 4623539 (USA). Pyrilamine resin absorbate with aspirin and (or ascorbic asid). / Sheldon Siegel, Russele H., 1984.

147. Paul A.B., Cussler E.L. Bioseparations: Downstream processing for biotechnology. -N.Y.etc.: Wiley and Sons. XVI, 1988. P.368.

148. Protein Missassembly.// Ed. by R.Wetzel. San Diego etc.: Academic Press. XX, 1997. P. 282.

149. Ravindranath B. Principles and practice of chromatography.// Chichester: Horwood.- N.Y. etc.: Halsted Press, 1989. P.502.

150. Recovery and Purification of Bioproducts.// Ed. M.-R.Kula, Steven M. Cramer. N.Y. etc.: Wiley.,1995. P. 301-427, 429-555.

151. Rosevear A. Immobilized biocatalystsa critical review. //Chem. Technol. Biotechnol. V. 34, 1984. P. 127-150.

152. Savoca K., Abuchowski A., Es T.V. Preparation of a non-immunogenic arginase by the covalent attachment of polyethilene glycol. //BBA .v.578, No 1, 1979. P. 47-53.

153. Sewell P.A., Clarke B. Chromatographic separations. London: Chichester etc.: Wiley and sons on behalf of ACOL. Thames Polytechnic. XX, 1987.P. 333.

154. Shanks R.G. Studes aves le propranolol a action prolongee. //Phisychologie Medicale. №15, 1984. S. 2615-2626/

155. Specht В., Kolb H., Renner R. Preparation and physical-chemical characterization of poly-N-vinylpyrrolidone-insulin. Hoppe-Seyler's Z.Physiol. Chem. v.359, No 2,1978. P. 231-238.

156. Svec F., Frechet J.M.J. Modified poly(glycidyl methacrylate-co-ethylene dimethacrylate) continuous rod columns for preparative scale ion-exchange chromatography of proteins.// J. Chromatogr. v.702 A, 1995. P. 89-95.

157. Swelgart R.D. Industrial applications of immobilized enzymes: a commercial overeview. Appl. Biochem & Bioengin, Acad. Press.v.2, 1979. P. 209-218.

158. Tennjkova T.B., Svec F.// J. Chromatogr. v.590,1992. P. 353.

159. Torchilin V.P., Mazaev A.V., H'ina E.Y. Chemical aspects of enzyme stabilization and modification for use in therapy. Enzyme Engineering/ ed. by L.Wingard, I.Berezin, A.Klyosov. - N.Y. & London: Plenum Press, 1980. P. 219-240.

160. Venkatech R., Arun S., Rajalakshimi N. At al. General Strategies in the Stabilization of Enzymes by Structural Modification. //Ann. N. J. Acad. Sci. V. 750, 1995. P. 130-133.

161. Verter J.C. //Pharm. Rew. V. 34, 1982. P. 153-187.

162. Wang Q.C., Svec F. Frechet J.M.J. Rod of macroporous polymers stationary phase as continuous separation medium for reversed phase chromatography.// Anal. Chem. v.65, 1993. P. 2243-2248.

163. Wang Q.C., Svec F., Frechet J.M.J. Reversed-phase chromatography of small molecules and peptides on a continuous rod of macroporous poly(styrene-co-divinylbenzene).// J. Chromatogr. v.669,1994. P. 230-235.

164. К вопросу об испытании возможного влияния биокарба на репродуктивную функцию

165. Биокарб не всасывается из желудочно-кишечного тракта, в связи с чем его влияние на репродуктивную функцию не изучали.1. Научный руководительмлаборатории ПФИ, доцент1. А.В.Сульдин

166. К вопросу об экспериментальном изучении ^армакокинетикибиокарба

167. Биокарб не всасывается из желудочно-кишечного тракта, в связи с чем его ^армакокинетику не изучали.1. Научны** руководитель

168. К вопросу об изучениям возможных тератогенных свойств биокарба

169. К вопросу об изучении возможных мутагенных свойств биокарба