Создание рекомбинантных плазмид, содержащих ген нуклеокапсидного белка вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом и изучение экспрессии вирусного белка в про- и эукариотической системах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Чубукова, Ольга Вячеславовна

• Чубукова, Ольга Вячеславовна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Чубукова, Ольга Вячеславовна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Общие сведения о геморрагической лихорадке с почечным синдромом.

1.2. Молекулярная зоогеография, биология, филогения хантавирусов.

1.2.1. Зоогеография хантавирусов.

1.2.2. Особенности организации генома хантавирусов

1.2.3. Синтез вирусной РНК и созревание вирионов.

1.3. Вакцины.

1.3.1. Генно-инженерные вакцины.

1.3.2. ДНК-вакцины. Особенности генетической иммунизации.

1.3.3. Способы доставки ДНК-вакцин.

1.3.4. Возможность модуляции иммунного ответа при ДНК-вакцинации.

1.3.5. Преимущества ДНК-вакцин и возможные ограничения в их применении.

1.3.6. Вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом.

Глава 2. Объекты и методы исследований.

2.1. Краткая характеристика объектов исследований.

2.2. Выделение и очистка РНК из аутопсийных материалов.

2.3. Выделение и очистка тотальной ДНК из мышечной ткани.

2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.5. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

2.6. Получение одноцепочечной ДНК фагмид, пригодной для секвенирования.

2.7. Аналитический гель-электрофорез ДНК в не денатурирующих условиях.

2.8 Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях

2.9. Синтез кДНК.

2.10. Полимеразная цепная реакция.

2.11. Элюция ДНК из агарозных гелей.

2.12. Подготовка компетентных клеток.

2.13. Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной

2.14. Секвенирование ДНК.

2.15. Электрофоретическое фракционирование ДНК в денатурирующих условиях.

2.16. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

2.17. Индукция LacZ-промотора.

2.18. Электрофорез полипептидов Е. coli.

2.19. Твердофазный иммуноферментный анализ.

2.20. Реактивы и материалы.

2.21 Составы использованных стандартных растворов.

Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение.

3.1. Анализ первичной структуры РНК хантавируса, обнаруженного в органах погибших от ГЛПС больных в республике Башкортостан.

3.2. Создание генно-инженерных конструкций, пригодных для репродукции нуклеокапсидного белка вируса ГЛПС в прокариотической системе

3.3 .Иммунизация мышей ДНК плазмиды pcDNA-3 S.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание рекомбинантных плазмид, содержащих ген нуклеокапсидного белка вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом и изучение экспрессии вирусного белка в про- и эукариотической системах»

Актуальность темы. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) - широко распространенное в странах Евразии вирусное природно-очаговое заболевание. Возбудителями ГЛПС являются представители рода Хантавирус, относящиеся к семейству Буньявириде.

По данным литературы в настоящее время насчитывается более 10 различных серотипов хантавирусов. Из них патогенными для человека являются хантавирусные серотипы Dobrava (DOB), Hantaan (HTN), Seoul (SEO), Puumala (PUU), из которых первые два вызывают тяжелую форму ГЛПС, остальные, соответственно, среднюю и легкую формы. Также патогенными являются серотипы Sin Nombre (SN), Black Crek Canal (BCC), которые вызывают недавно обнаруженное в США заболевание, получившее название "хантавирусный пульмонарный синдром" (Schmaliohn et al., 1985; Chu et al., 1994; Xiao et al., 1994; Schmaliohn et al., 1995; Avsic-Zupanc et al., 1995; Vapalahti, 1996).

Основными переносчиками ГЛПС являются мышевидные грызуны. Передача вируса от грызуна к человеку происходит, в основном, воздушно-капельным путем. Ежегодно по всему миру фиксируется более 150 тысяч случаев заболевания ГЛПС. Причем смертность от данного заболевания в разные годы составляет от 1 до 22%.

К сожалению, на сегодняшний день еще не получены эффективные специфические средства для профилактики и лечения ГЛПС. Особенно актуальна данная проблема для республики Башкортостан, на территории которой расположен один из крупнейших природных очагов ГЛПС. Динамика заболеваемости ГЛПС в республике характеризуется эпидемическими вспышками каждые 3-4 года. Полагают, что подобные вспышки, вероятно, связаны с массовым размножением рыжих полевок и высоким уровнем инфицированности грызунов хантавирусным серотипом PUU, основным возбудителем ГЛПС в Башкортостане (Фазлыева и др., 1995). Кроме того, мы предполагаем, что подъем заболеваемости ГЛПС в 6 годы с низкой численностью полевок, а также отличия в тяжести инфекционного процесса могут быть вызваны, в том числе и антигенной вариабельностью и разной степенью патогенности циркулирующих на территории республики Башкортостан штаммов хантавирусов, возбудителей ГЛПС. Самый высокий подъем заболеваемости ГЛПС за 40 лет с начала регистрации инфекции в Башкортостане пришелся на эпидемический сезон 1997-1998 гг., когда было зарегистрировано 10 057 случаев заболевания ГЛПС, из них 34 случая (0,4%) смертельного исхода (Нургалеева и др., 1999). Серологическими методами была установлена принадлежность возбудителя данной вспышки к серотипу PUU, однако большой интерес представляла именно генетическая характеристика данного вируса.

Эффективность лечения любого заболевания определяется его правильной и ранней диагностикой. Для диагностики ГЛПС наиболее широко используются методы, основанные на детекции специфических антител. В данных методиках используется фиксированный ацетоном антиген, полученный из культуры клеток Vero Е6, инфицированных патогенным хантавирусом. (Lee et al., 1985). Получение подобного препарата является весьма трудоемкой и опасной процедурой. Альтернативой традиционному антигену может стать рекомбинантный вирусный белок, синтезированный в про- или эукариотической системе экспрессии. При наличии эффективных штаммов-продуцентов получение рекомбинантного белка потребует значительно меньше времени, кроме того, отсутствует необходимость работы с патогеном.

Разработанные и лицензированные на сегодняшний день вакцинные препараты для профилактики ГЛПС представляют собой "живые" аттенюированные вакцины, созданные на основе вирусов серотипов HTN и SEO, циркулирующих преимущественно в странах Азии - Китае и Южной Корее (Song et al., 1998; Lee et al, 2001). На территории России основным возбудителем ГЛПС является вирус серотипа PUU и поэтому, нет оснований ожидать, что данные вакцины окажут эффективное профилактическое действие. К тому же, по ряду сообщений, указанные вакцинные препараты индуцируют низкий уровень синтеза нейтрализующих антител у иммунизированных людей (Vapalahti, 1996). Альтернативой обычным вакцинам, возможно, уже в недалеком будущем, станут ДНК-вакцины. Принцип ДНК-вакцинации основан на введении в организм векторной ДНК, несущей гены белков, к которым необходимо получить иммунный ответ. Данный подход позволил получить антитела к множеству антигенов инфекционных и вирусных патогенов (Dertzbaugh et al, 1997). В настоящее время, в разных странах активно ведутся исследования, направленные на создание ДНК-вакцины для лечения и профилактики ГЛПС. Однако, до введения ДНК-вакцин в медицинскую практику необходимо провести длительные эксперименты для того, чтобы подтвердить их эффективность и безопасность.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании первичной структуры РНК хантавируса, возбудителя ГЛПС в Башкортостане в 1997-1998 гг. и создание генетических конструкций, содержащих полноразмерный ген нуклеокапсидного (N) белка хантавируса серотипа PUU, способных к его экспрессии в про- и эукариотической системах.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Клонирование и секвенирование фрагментов S- и М-сегментов генома хатавируса, выделенного из органов больных, погибших от ГЛПС.

2. Создание генно-инженерной конструкции, содержащей фрагмент S-сегмента, кодирующего полноразмерный белок N хантавируса серотипа PUU и исследование экспрессии данного белка в прокариотической системе на основе штамма XL-Blue Е. coli.

3. Клонирование последовательности S-сегмента вирусной РНК, кодирующей полноразмерный белок N хантавируса серотипа PUU в эукариотическом экспрессирующем векторе pcDNA-3 и использование ДНК данной плазмиды для иммунизации лабораторных мышей. 4. Исследование иммунного ответа, возникающего в результате инъекции ДНК плазмиды pcDNA-3 S в мышечную ткань лабораторных животных. Научная новизна и практическая значимость. В результате проведенных исследований нами установлено, что выделенный во время вспышки ГЛПС 1997-98 гг. на территории Республики Башкортостан хантавирусный изолят Р-Л9/Уфа-97имеет генетически общее происхождение со штаммом CG 1820, изолированного из рыжей полевки Clethrionomys glareolus в 1983 г. Определена первичная структура фрагментов генома хантавирусного изолята Р-Л9/Уфа-97.

Создана генно-инженерная конструкция на основе клонирующего вектора pGEM-T Easy, включающая в себя ген нуклеокапсидного белка хантавируса серотипа PUU, экспрессия которого регулируется бактериальным lac промотором. Показана возможность экспрессии полноразмерного белка N хантавируса в Е. coli.

Сконструирована рекомбинантная плазмида pcDNA-3 S, содержащая ген нуклеокапсидного белка вируса под контролем CMV промотора, на основе эукариотического экспрессирующего вектора pcDNA-3. Иммунизация лабораторных мышей плазмидой pcDNA-3 S индуцировала в клетках мышечной ткани последних синтез антител к белку N.

Полученные результаты дополняют и расширяют представления о структуре нуклеотидной и белковой последовательностей хантавируса, циркулирующего на территории республики Башкортостан и являющегося этиологическим агентом самой крупной вспышки ГЛПС за весь период наблюдения. Созданные плазмидные конструкции, pGS2 и pcDNA-3 S, могут быть использованы в дальнейшем, соответственно, в качестве штамма-продуцента вирусного нуклеокапсидного белка и прототипа ДНК-вакцины.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на конференции " Актуальные проблемы медицинской вирусологии" (Москва,

1999); на конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Уфа,

2000); на школе-конференции " Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000); на V Международной конференции "Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, хантавирусный пульмонарный синдром и хантавирусы" (Лион, 2001).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и тезисов научных сообщений.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), результатов исследования и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающей 157 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 122 страницах и содержит 13 рисунков, 3 таблицы.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Чубукова, Ольга Вячеславовна

ВЫВОДЫ:

1. Во время вспышки ГЛПС 1997-98 гг. на территории Республики Башкортостан выделен хантавирусный изолят Е-Л9/Уфа-97, генетически имеющий общее происхождение со штаммом CGI 820. Определена первичная структура фрагментов S - и M -сегментов генома данного изолята.

2. Хантавирусный изолят Б-Л9/Уфа-97 может быть выделен в качестве нового геноварианта вируса серотипа PUU, который может иметь отличающиеся антигенные характеристики по сравнению с известными штаммами вирусов данного серотипа.

3. Созданы генно-инженерные конструкции, содержащие полноразмерный ген нуклеокапсидного белка вируса ГЛПС под контролем бактериального промотора lac. Показана возможность экспрессии соответствующего вирусного белка в Е. coli.

4. На основе эукариотического вектора pcDNA3 создана генно-инженерная конструкция pcDNA-3S, содержащая ген белка N вируса ГЛПС под контролем CMV промотора. Иммунизация лабораторных мышей плазмидной конструкцией pcDNA-3S индуцировала в последних синтез антител к белку. N.

5. Методом ПЦР показано присутствие плазмиды pcDNA-3S в мышечной ткани иммунизированных животных через 30 дней после последней иньекции ДНК рекомбинантной плазмиды pcDNA-3S, что свидетельствует о ее относительной стабильности в течение времени, достаточным для выработки антител к нуклеокапсидному белку хантавируса.

6. Конструкция pcDNA-3S может рассматриваться как прототип ДНК-вакцины против ГЛПС.

Заключение

Актуальность проблемы ГЛПС обусловлена постоянным ростом заболеваемости, увеличением числа тяжелых клинических форм и, соответственно, сохраняющейся смертностью. Особую озабоченность вызывает отсутствие в России вакцин, разработанных на основе региональных штаммов-возбудителей. Также актуальной является разработка и внедрение в медицинскую практику новых эффективных методов ранней диагностики ГЛПС.

Нами была определена первичная структура фрагментов S- и М-сегментов геномной РНК хантавирусов из органов больных, погибших от ГЛПС во время эпидемической вспышки этой инфекции в 1997-1998 гг. в республике Башкортостан. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что хантавирусный РНК-изолят Р-Л9/Уфа-97 генетически имеет общее происхождение со штаммом СС-1820/Уфа-83 серотипа PUU, выделенного в Башкортостане из рыжей полевки в 1983 году. Однако, в нуклеотидной последовательности исследованных фрагментов РНК-изолята Р-Л9/Уфа-97 был выявлен ряд отличий от соответствующих участков первичной структуры S- и М-сегментов штамма С0-1820/Уфа-83, наиболее примечательной из которых является делеция в 45 нуклеотидов с сохранением рамки считывания в кодирующей области М-сегмента. Возможно, что вследствие антигенных различий, вирусный изолят Р-Л9/Уфа-97, явившийся причиной самой крупной за последние 40 лет вспышки ГЛПС в Башкортостане, обладает большей степенью патогенности, по сравнению с другими циркулирующими в республике штаммами вируса ГЛПС.

Диагностика ГЛПС основана, прежде всего, на иммунологических методах, в которых используется вирусный антиген из культуры клеток Vero Е6, зараженных патогенным хантавирусом. Созданные нами плазмидные конструкции могут служить прототипами штаммовпродуцентов рекомбинантного белка N серотипа Рии в системе Е.соН. Известно, что антитела к белку N начинают вырабатываться уже в самом начале заболевания, в отличие от антител к вирусным гликопротеинам. Данный факт позволяет использовать белок N для диагностики ГЛПС на раннем этапе заболевания. В отличие от упомянутого традиционного вирусного антиген, получение рекомбинантного белка N представляет собой относительно простую процедуру, не требующую контакта с патогенным вирусом. Однако, при этом возникает необходимость проведений иммунологических свойств синтезируемого рекомбинантного белка N.

Вакцинация лабораторных мышей созданной нами плазмидной конструкцией pcDNA-ЗS, несущей ген нуклеокапсидного белка хантавируса серотипа Р1Ш вызывала у последних синтез ^антител. Если дальнейшие исследования покажут, что иммунизация данной плазмидой защищает животных от последующего заражения хантавирусом серотипа Р1Д1, то можно рассматривать конструкцию pcDNA-ЗS как прототип ДНК-вакцины против ГЛПС.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чубукова, Ольга Вячеславовна, 2002 год

1. Магазов Р.Ш., Кулагин В.Ф., Хайбуллина С.Ф. ГЛПС некоторые современные аспекты лечения и профилактики // в сборнике статей "Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом - пути решения проблемы". - Уфа. - 1995. - С. 5-9.

2. Д. Дж., Рэмиг Р. Ф., Шоуп Р., Кауфман Р., Пенмен Ш., Грин М., Лоуи Д.Р: Вирусология. М.:" Мир". 1989. С. 492.

3. Alexeyev О., Elgh F., Zhestkov A., Wadell G., Juto P. Hantaan and Puumala vitus antibodies in blood donors in Samara, an HFRS-endemic region in European Russia // Lancet. 1996. - V. 347. - P. 1483.

4. Antic D., Lim B.-U., Kang C.Y. Nucleotide seqvuence and coding capacity of the large (L) genomic RNA segment of Seoul 80-39 virus a mamber of the hantavirus genus//Virus Res. 1991. - V. 19.-P. 59-66.

5. Antic D., Wright К. E., Kang C.Y. Maturation of Hantaan virus glicoprotein G1 and G2 // Virology. 1992a. - V. 189. - P. 324-328.

6. Antic D., Yong Kang C., Kristin S., Schamaljohn C., Vapalahti O., Vaheri A. Comparison of the deduced gene of the L, M, S genom segments of hantaviruses // Virus Res. 1992b. - V. 24. - P. 35-46.

7. Avsic-Zupanc Т., Toney A., Anderson K., Chu Y.K., Schmaliohn C. (1995). Genetic and antigenetic properties of Dobrava virus: a unique member of the

8. Hantavirus genus, family Bynyaviridae // J. Gen. Virol. 1995. - V. 76. - P. 2801-2808.

9. Babiuk L. A., Lewis J., Suradhat S., Baca-Estrada M., Foldvari M., Babiuk S. Polynucleotide vaccines: potential for inducing immunity in animals // J. Biotechnol. 1999.-V. 73. - P. 131-140.

10. Babiuk L.A., Lewis P.J., Cox G., van Drunen Little-van den Hurk S., Baca-Estrada M., Tikoo S. DNA immunization with bovine herpesvirus-1 genes // Ann. New York Acad. Sci. 1995. - V. 772. - P.47-63.

11. Barry M., Johnston S. Biological features of genetic immunization // Vaccine. -1997.-V. 15.-P. 788-791.

12. Bowen M.D., Kariwa H., Rollin P.E., Peters C.J., Nichol S.T. Genetic charaterization of a human isolate of Puumala hantavirus from France // Virus Res. 1995. - V. 38. - P. 279-89.

13. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium-thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 1987. -V. 162.-P. 156-159.

14. Collett M.S. Messenger RNA of the M segmeent RNA of Rift Vallay fever vurus //Virology. 1986,-V. 151.-P. 151-156.

15. Donelly J., Ulmer J., Shiver J., Margaret A. DNA vaccines // Annu. Rev. Immunol. 1997.-V. 15.-P. 617-648.

16. Donnelly J.J., Friedman A, Martinez D, Montgomery DL, Shiver JW, Motzel SL, Ulmer JB, Liu MA. Preclinical efficacy of a prototype DNA vaccine-enhanced protection against antigenic drift in influenza-virus // Nature Med. 1995. - V. 1. — P. 583-87.

17. Elliot R. M. Molecular biology of the Buniaviridae // J. Gen. Virol. 1990. - V. 71 - P. 501-522.

18. Geissler E. K., Wang J., Fecher J. H., Burlingham W. J., Knechtle S. J. Immuniti to MHC class-1 antigen after direct DNA transfer into skeletal-muscle // J. Immunol. -1994. V.152. - P. 413-421.

19. Giulian G.G. et al. Resolution of low molecular weight polypeptides in a non-urea sodium dodecyl sulfate slab Polyacrylamid gel system// Fed. Proc. 1985. -V. 44. - P. 686.

20. Gonzalez-Scarano F., Janssen R., Najjar J. A., Pobjecky N., Nathanson N. An avirulent Gl glycoprotein variant of La Crosse bunyavirus with defective fusion function // J. Virol. 1985. - V. 54. - P. 757-763.

21. Gorman O. T., Mandlerr J., Scholtissek C. Evolution of influenza A virus nucleoprotein genes: implications for the origins of H1N1 human and classical swine viruses // J. Virol. 1991. - V.65. - P.3704-3714.

22. Gott P., Stohwasser R., Schnitzler P., Darai G., Bauts E.K. RNA binding of recombinant nucleocapsid proteins of hantaviruses // Virology. 1993. - V. 194. -P. 332-337.

23. Hielle B., Chavez G., Torrez N., Yates S., Sarisky J., Webb J., Ascher M. Genetic identification of a novel hantavirus of the harvest mouse Reithrodontomys megalotis // J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 6751-6754

24. Hoiseth S., Stocker B. A. D. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines // Nature. 1980. - V. 291. - P. 238-239.

25. McAleer W. J, Buynak E. B, Maigetter R. Z, Wampler D. E, Miller W.J, Hilleman M. R. Human hepatitis B vaccine from recombinant yeast // Nature. -1984. V.307. - P.178-180.

26. Parrington M.A, Lee P.-W, Kang C.Y. Molecular characterization of the Prospect Hill virus M RNA segment: a camparison with the M RNA segment of other hantaviruses // J. of Gen. Virol. 1991. - V. 72. - P. 1845-1854.

27. Philpott M., Hioe C., Sheerar M., Hinshaw V.S. Hemagglutinin mutations related to attenuation and altered cell tropism of a virulent avain influenza A virus // J. Virol. 1990. - V. 64. - P. 2941-2947.

28. Pisetsky D. S. Immune activation by bacterial DN: a new genetuc code // Immunity. 1996. - V. 5.-P. 303-310.

29. Pisetsky D. S. Immunostimulatory DNA: a clear and present danger? // Nat. Med. 1997.-V. 3.- P. 829-831.

30. Poch O., Sauvaget I., Delarue M., Tordo N. Identification of four conserved motif among the RNA-dependent polymerare encoding elements // Embo. 1989. - V. 8.-P. 3867-3879.

31. Polo J. M., Belli B. A., Driver D. A., Frolov I., Sherrill S., Hariharan M. J. et al. Stable alphaavirus packaging cell lines for Sindbis virus and Semliki Forest virus -derived vectors // Prot. Natl. Acad. Sci USA. 1999. - V. 96. - P.4598-4603.

32. Porter D. C., Wang J., Moldoveanu Z., McPherson S., Morrow C. D. Immunization of mice with poliovirus replicons expressing the C-fragment of tetatus toxin protects agains lethal challenge with tetanus toxin // Vaccine. -1997. V. 15. - P. 257-264.

33. Pozzi G., Oggioni M. R., Manganelli R., Fischettii V. A. Expression of M6 protein gene of Stretococcus pyogenes in Stretococcus gordoni after chromosomal integretion and transcriptional fusion // Res. Microbiol. 1992. -V. 143. - P. 449-457.

34. Prince A.M., Whalen R., Brotman B. Successful nucleic acid based immunization of newborn chimpanzees against hepatitis B virus // Vaccine. 1997. - V. 15. -P. 916-919.

35. Rodriguez F., Whitton J. Enhancing DNA immunization // Virology. 2000. - V. 268.-P. 233-238.

36. Roman M., Martin-Orozco E., Goodman J.S., Nguyen M.-D., Sato Y., Ronaghy A., Kornbluth R.S., Richman D.D., Carson D.A., Raz E. Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants // Nat. Med. 1997. -V. 3. - P.849-854.

37. Rowe J. E., St. Jeor S.C., Riolo J., Otteson E. W., Monroe M.C., Henderson W.W., Ksiazek T. G., Rollin P. E., Nichol S.T. Coexistence of several novel hantaviruses in rodents indigenousto North America // Virology. 1995. - V. 213.-P. 122-130.

38. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Gold Spring Harbor. ~ 1989.

39. Schmaljohn C., Chu Y., Schamaljohn A., Dalrymple J. Antigenic subunits of Hantaan virus expressed by baculovirus and vaccinia virs recombinants // J. Virol. 1990. - V. 64. -P. 3162-3170.

40. Schmaljohn C.S., Schmaliohn A., Dalrymple J.M. Hantaan virus M RNA coding strategy nucleotide sequence and gene order // Virology. 1987. - V. 157. - P. 31-39.

41. Song J. W., Baek L.J., Nagle J. W., Schlitter D., Yanagihara R. Genetic and pathogenetic hantavirus from white-footed mouse (Peromyscus leucopus) latter // Lancet. 1996. V. 344. - P. 1637.

42. Spiropoulou C.F., Morzunov S., Feldmann H., Sanchez A., Peters C.J., Nichol S.T. Genome structure and variability of a virus causing Hantavirus pulmonary syndrome // Virology. 1994. - V. 200. - P. 715-723.

43. Sundin D. R., Beaty B. J., Nathanson N., Gonzalez-Scarano F. A Gl glycoprotein epitope of La Crosse virus: a determinant of infection of Aedes triseriatus // Science. 1987. - V. 235. - P. 591-593.

44. Ulmer J.B., Deck R.R., Dewitt C.M., Friedman A., Donnelly J.J., Liu M.A.

45. Protective immunity by intramuscular injection of low-doses of influenza-virus

46. DNA vaccines // Vaccine. 1994. - V. 12. - P. 1541-1544.

47. Ulmer J.B., Liu M.A., Montgomery D.L., Yawman A.M., Deck R.R., DeWitt

48. C.M., Content J., Huygen K. Expression and immunogenicity of Mycobacteriumtuberculosis antigen 85 by DNA vaccination // Vaccine. 1997. - V. 15. - P.792.794.

49. Valenzuela P., Medina A., Rutter W., Ammerer G., Hall B. D.Synthesis and assembly of hepatitis B virus surface antigen particles in yeast // Nature. 1982. - V.298. - P.347-350.

50. Vapalahti O. Dis. Genetic and antigenic properties of Puumala and Tula viruses d-r. Helsinki: 1996. 90 P.

51. Wang R., Doolan D.L., Le T.P., Hedstrom K.M., Coonan K.M., Charoenvit Y., Joenes T.R., Hobart P., Margalith M., Ng J., Weiss W.R., Sedegah M., Taisne C.,

52. Xiang Z., Ertl H. Manipulation of the immune response to a plasmid-encoded viral antigen by co-inoculation with plasmids expressing cytokines // Immunity. -1995.-V. 2. P.129-135.

53. Xiao S.Y., Liang M., Schmaliohn C.S. Molecular and antigenic characterization of HV114, a hantavirus isolated from a patient with renal syndrom in China // J. Gen. Virol. 1993. - V. 74. - P. 1675-9.

54. Xiao S-Y., Ledus J.W., Chu Y.K., Schmaliohn C.S. Phylogenetic analyses of virus isolates in the genus Hantavirus, family Bunyaviridae // Virology. 1994. -V. 198.-P. 205-217.

55. Yankauckas M. A., Morrow J.E., Parker S. E., Abai A., Rhodes G. H.,Dwarki V. is induced by intramuscular injection of plasmid DNA containing NP gene // DNA Cell Biol. 1993. - V. 12. - P.771-776.