Технология замороженного растительного полуфабриката с функциональной биокомпозицией, полученной ферментированием R. oligosporus и P. shermanii тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Жернякова Анастасия Валерьевна

• Жернякова Анастасия Валерьевна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Жернякова Анастасия Валерьевна

Реферат

Synopsis

Введение

Глава 1. Состояние проблемы по производству функциональных растительных полуфабрикатов

1.1 Растительные полуфабрикаты с применением текстуратов

1.2 Использование пробиотиков в пищевых продуктах

1.2.1 Влияние пробиотических бактерий на организм человека

1.2.2 Механизмы действия пробиотиков

1.3 Инкапсулирование

1.4 Биокомпозиция

1.4.1 Ферментированные продукты

1.4.2 Микробные сообщества и ферментация

1.4.3 Изменение свойств продукта

1.4.4 Влияние ферментации на органолептические свойства пищи

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1 Анализ летучих соединений биокомпозиции ферментированной B.

subtilis методом ГХ/МС

2.2 Исследование содержания молочной и пропионовой кислот в биокомпозиции при последовательной ферментации

2.3 Определение антимикробной активности биокомпозиции диск-диффузионным методом

2.4 Выбор сырья

2.5 Оценка органолептических показателей растительных полуфабрикатов

2.6 Определение микробиологических показателей полуфабрикатов

2.7 Инкубирование пробиотической культуры

2.8 Инкапсулирование микроорганизмов

2.9 Определение эффективности инкапсулирования

2.10 Термостабильность инкапсулированных пробиотиков в составе продукта

2.11 Анализ жизнеспособности пробиотических микроорганизмов при низкотемпературном хранении

2.12 Анализ жизнеспособности L. rhamnosus GG в составе растительного полуфабриката в свободной форме, альгинатных капсулах и капсулах с экстрактом брокколи в симулированных условиях ЖКТ in vitro

2.13 Анализ содержания глюкозинолатов в экстракте брокколи

2.14 Исследование пребиотического потенциала экстракта брокколи и биокомпозиции в отношении Lactobacillus rhamnosus GG

2.15 Расчет себестоимости растительных полуфабрикатов

2.16 Статистическая обработка данных

Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1 Разработка биокомпозиции

3.2 Сравнительный анализ метаболитных профилей биокомпозиций

3.3 Антимикробные свойства биокомпозиции

3.4 Разработка рецептуры и выбор ингредиентов для растительных полуфабрикатов

3.5 Органолептическая оценка биокомпозиций в составе продукта

3.6 Микробиологические показатели растительных полуфабрикатов

3.7 Обоснование способа инкапсулирования Lactobacillus rhamnosus GG

3.8 Эффективность инкапсулирования пробиотических микроорганизмов

3.9 Стабильность пробиотических микроорганизмов при термообработке и хранении в составе продукта

3.10 Оценка выживаемости L. rhamnosus GG в составе полуфабриката при моделировании ЖКТ in vitro

3.11 Пребиотическая активность экстрактов брокколи и биокомпозиции

3.12 Себестоимость разработанных растительных полуфабрикатов

3.13 Технология производства функциональных растительных полуфабрикатов

Заключение

Список литературы

Список публикаций по теме диссертации

Приложение А

Приложение Б

Тексты публикаций

Реферат

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Технология замороженного растительного полуфабриката с функциональной биокомпозицией, полученной ферментированием R. oligosporus и P. shermanii»

Актуальность темы

На фоне устойчивого роста интереса к здоровому питанию и экологически ориентированному производству особую актуальность приобретают продукты на растительной основе. Они сочетают длительный срок хранения, минимальную потерю питательных веществ и возможность замены мясных продуктов, что особенно важно для потребителей, снижающих потребление животного белка.

Текстурированные растительные белки представляют собой перспективную основу для таких полуфабрикатов благодаря способности имитировать структуру и вкус мяса. Однако актуальной задачей остаётся расширение их функциональных свойств за счёт включения биологически активных компонентов.

Одним из таких компонентов являются пробиотики — живые микроорганизмы, оказывающие положительное влияние на здоровье человека при достаточном уровне потребления. Наиболее часто используются молочнокислые бактерии и бифидобактерии. Их внедрение в рецептуру требует обеспечения жизнеспособности на всех этапах технологического цикла. Эффективным решением данной задачи является инкапсулирование с использованием защитных матриц на основе альгината, хитозана, желатина и других биополимеров. Применяемые методы — эмульгирование, коацервация, распылительная и сублимационная сушки — подбираются в зависимости от специфики продукта.

Еще одной важной задачей является формирование вкусоароматических характеристик, сопоставимых с мясными изделиями. Одним из решений выступает использование ферментированных биокомпозиций, обеспечивающих летучие соединения, аминокислоты и другие метаболиты, формирующие сложный вкусовой профиль.

Дополнительно, в рамках оценки функциональности компонентов растительного происхождения, был проведён эксперимент по изучению пребиотического потенциала экстракта брокколи как природного стимулятора роста Lactobacillus rhamnosus GG.

Таким образом, при разработке растительных полуфабрикатов, обогащённых пробиотиками, остаются нерешёнными ключевые научно-технологические задачи. К ним относятся обеспечение стабильности и жизнеспособности пробиотических культур в условиях замораживания и хранения, а также создание вкусоароматического профиля, сопоставимого с мясной продукцией. Решение этих проблем требует комплексного подхода к подбору состава, технологии инкапсулирования и интеграции биокомпозиций в структуру продукта.

Цель диссертационной работы - разработка технологии замороженного растительного полуфабриката с функциональной биокомпозицией, полученной ферментированием R. oligosporus и P. shermanii.

На основании поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

- Обосновать выбор способа инкапсулирования микроорганизмов для включения в растительные замороженные полуфабрикаты;

- Исследовать выживаемость инкапсулированных пробиотиков после термической обработки и хранении продукта;

- Разработать способ получения биокомпозиции с R. oligosporus и P. shermanii;

- Оценить антимикробную и пребиотическую активность биокомпозиции;

- Разработать технологию производства растительных полуфабрикатов;

- Проанализировать органолептические показатели качества замороженных растительных полуфабрикатов;

- Обосновать сроки годности замороженных и охлажденных растительных полуфабрикатов.

Научная новизна работы

Установлена эффективность способа инкапсулирования пробиотических микроорганизмов методом экструзии в альгинатные микрокапсулы, обеспечивающего сохранение жизнеспособности Lactobacillus rhamnosus GG в замороженных растительных полуфабрикатах после замораживания (до -18 °C) и термической обработки (до 70 °C) на уровне не ниже 106 КОЕ/г.

Обоснована возможность использования инкапсулированного пробиотического штамма Lactobacillus rhamnosus GG сохраняющего жизнеспособность клеток на уровне не менее 76 % после замораживания и термической обработки совместно с функциональной биокомпозицией, полученной последовательной ферментацией R. oligosporus и P. shermanii, формирующей вкусоароматический профиль в технологии замороженных растительных полуфабрикатов.

Установлена антимикробная активность ферментированной R. oligosporus и P. shermanii биокомпозиции по отношению к Bacillus subtilis, а также подтверждена её пребиотическая активность в отношении Lactobacillus rhamnosus GG.

Теоретическая и практическая значимость

Определены параметры ферментации для получения биокомпозиции: ферментация соевой смеси штаммом R. oligosporus при температуре 35 °С в течение 24 ч с последующей ферментацией штаммом P. shermanii при температуре 30 °С в течение 24 ч, обеспечивающие накопление молочной и пропионовой кислот, а также формирование выраженных вкусоароматических свойств готового продукта.

Разработанная рецептура растительных полуфабрикатов обеспечивает содержание пробиотических клеток Lactobacillus rhamnosus GG на уровне не менее 106 КОЕ/г, что соответствует рекомендованному уровню ежедневного потребления пробиотиков.

По результатам исследования микробиологических показателей

безопасности, физико-химических и органолептических показателей качества разработанного продукта установлен его срок годности - 6 мес при температуре -18 °С, в течение которого сохраняется жизнеспособность пробиотиков на уровне не ниже 76 %, стабильность вкусоароматических и сенсорных характеристик на уровне не менее 90 % от исходных значений.

Технология производства ферментированной биокомпозиции на основе изолята соевого белка и микроорганизмов R. oligosporus и P. shermanii прошла апробацию в опытно-промышленных условиях ООО «Нордена».

Основные положения выносимые на защиту

- параметры технологии инкапсулирования клеток пробиотического штамма Lactobacillus rhamnosus GG методом экструзии, обеспечивающие сохранение жизнеспособности микроорганизмов в замороженных растительных полуфабрикатах после термической обработки;

- условия ферментации биокомпозиции с R. oligosporus и P. shermanii;

- технология производства растительных полуфабрикатов с пробиотическими свойствами.

Степень достоверности и апробация результатов работы

Достоверность полученных результатов подтверждается не менее чем трехкратной повторностью получения и обработки данных. Полученные результаты подвергали статистическому анализу в пакете Microsoft Excel (доверительный интервал P = 0,95). В качестве литературных данных использовались статьи, опубликованные в высокорейтинговых журналах, индексируемых ведущими научными базами данных.

Апробация полученных в диссертационном исследовании результатов проводилась на конференциях: Пятидесятая (L) научная и учебно- методическая конференция Университета ИТМО (01- 04.02.2021 г.), Пятьдесят вторая (LII) научная и учебно- методическая конференция Университета ИТМО (31 -03.02.2023 г.), Пятьдесят третья (LIII) научная и учебно- методическая конференция Университета ИТМО (29 - 02.02.2024 г.), Пятьдесят четвертая

(LIV) научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО (27 Января - 31 Января 2025 г.), X Конгресс молодых ученых ИТМО (14 - 17.04.2021 г.), XI Конгресс молодых ученых ИТМО (04 - 08.04.2022 г.), .), XII Всероссийский конгресс молодых ученых (Санкт-Петербург, 3-6 апреля 2023 г.), XIII Конгресс молодых ученых ИТМО (08 - 11.04.2024 г.).

Работа выполнена в рамках государственного задания (проект FSER-2025-

0008).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 3 работы, из которых одна в изданиях перечня ВАК, две - в журналах, индексируемом базами Scopus и Web of Science.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах (введение, три главы, заключение, список литературы и приложения) и содержит: 13 рисунков, 14 таблиц, 2 приложения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении изложены современное состояние исследуемой проблемы и обоснование её актуальности, сформулированы цель и задачи работы, а также раскрыты теоретическая и практическая значимость, научная новизна исследования и ключевые положения, выносимые на защиту.

В первой главе представлен аналитический обзор отечественных и зарубежных источников, освещающих вопрос применения растительных продуктов в качестве функциональных продуктов питания. Рассмотрены особенности применения текстурированных растительных белков, их роль в формировании структуры и улучшении органолептических свойств растительных продуктов. Проанализированы механизмы действия пробиотиков, их влияние на здоровье человека и эффективность технологических подходов к их введению в состав растительных продуктов. Особое внимание уделено методам инкапсулирования пробиотических микроорганизмов (распылительная сушка, экструзия, эмульгирование, коацервация, сублимационная сушка) для

сохранения жизнеспособности пробиотических микроорганизмов при термической обработке и хранении. Рассмотрены принципы создания биокомпозиции на основе ферментированных растительных субстратов, в том числе влияние ферментации на питательные, антиоксидантные и органолептические свойства продуктов. Отмечена роль микробных сообществ — молочнокислых бактерий, дрожжей и плесневых грибов — в формировании структуры, вкуса и функциональной ценности ферментированных продуктов. Отдельно обсуждена роль комплексного применения технологий текстурирования, ферментации и инкапсулирования для получения растительных функциональных полуфабрикатов с улучшенными потребительскими и биологическими характеристиками.

Объекты настоящего исследования и методы проведения исследования представлены во второй главе. Исследования проводились на базе лабораторий МНЦ «Биотехнологии третьего тысячелетия» факультета биотехнологий Университете ИТМО и «National and Local Joint Engineering Laboratory for Synthesis Transformation and Separation of Extreme Environmental Nutrients» института питания и охраны окружающей среды Харбинского политехнического университета. Объектами исследования являлись: пробиотические культуры микроорганизмов Lacticaseibacillus rhamnosus GG, Rhizopus oligosporus NRLL 2710 и Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii - КМ 186 в виде суспензии и в виде функционального инкапсулированного пищевого ингредиента; растительный полуфабрикат, изготовленный из пшеничного и горохового текстуратов; биокомпозиция, ферментированная с помощью R. oligosporus и P. shermanii;

Представлены результаты комплексных экспериментальных исследований, направленных на разработку технологии растительных полуфабрикатов с функциональной биокомпозицией, содержащих инкапсулированные пробиотические микроорганизмы. Проведено сравнительное изучение методов инкапсулирования, установлен способ,

обеспечивающий высокую степень сохранности клеток LacticaseibacШus rhamnosus GG при термической обработке и низкотемпературном хранении. Определены физико-химические и морфологические характеристики полученных капсул, их термостабильность и выживаемость пробиотических культур при воздействии температуры. Показано, что применение альгинатной матрицы обеспечивает поддержание жизнеспособности микроорганизмов на уровне 59 % после термообработки. Определены параметры ферментации для получения биокомпозиции: ферментация соевой смеси штаммом Я. oligosporus при температуре 35 °С в течение 24 ч с последующей ферментацией штаммом Р. shermanii при температуре 30 °С в течение 24 ч, обеспечивающие накопление молочной и пропионовой кислот, а также формирование выраженных вкусоароматических свойств готового продукта. Дополнительно исследованы пребиотические и антимикробные свойства биокомпозиции. По результатам исследования микробиологических показателей безопасности, физико-химических и органолептических показателей качества разработанного продукта установлен его срок годности - 6 мес при температуре -18 °С.

Разработка биокомпозиции

Для сравнительного анализа эффективности различных подходов к получению функциональных биокомпозиций с заданными свойствами был разработан экспериментальный дизайн, включающий четыре варианта ферментации, различающиеся по типу субстрата, составу микробного консорциума и технологическим параметрам (Таблица А.1).

При получении функциональных биокомпозиций с различными биологически активными свойствами применяли два альтернативных подхода к ферментации растительного сырья: последовательную ферментацию с использованием Я. oligosporus и Р. shermanii на примере с соевой смесью (рисунок 1) и ферментацию с В. subtШs на примере с соевым шротом (рисунок 2).

Для последовательной ферментации подготавливали соевую смесь из изолята соевого белка, 352 г соевого изолята смешивали с 646 мл воды, дополнительно вносили глюкозу (0,5 %), KH2PO4 (0,2 %), MgSO4 (0,05 %), затем смесь стерилизовали в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. Перед ферментацией P. shermanii культивировали в жидкой среде YEL при 30 °C в течение 24 ч в анаэробных условиях, а R. oligosporus культивировали на агаровых пластинах YMP при 35 °C в течение 24 ч; после споруляции споры промывали раствором глицерина (10%, v/v) и Tween80 (0,05%, v/v). После подготовки соевой смеси в конические колбы объёмом 200 мл добавляли 100 мл соевой смеси и 1 мл суспензии спор R. oligosporus. Ферментация проходила в термостате при температуре 35 °C в течение 24 ч, после чего смесь гомогенизировали до 10% сухих веществ и стерилизовали. На втором этапе ферментации в соевую смесь вносили P. shermanii — на 100 мл напитка 1 мл суспензии спор; ферментация проходила в термостате при температуре 30 °C в течение 24 ч, анаэробные условия обеспечивались с помощью эксикатора. На последнем этапе биокомпозицию стерилизовали и хранили при 4 °C. Схема последовательной ферментации биокомпозиции представлена на рисунке 1.

Рисунок 1. Схема последовательной ферментации биокомпозиции

Для ферментации биокомпозиции с В. subtШs использовали 5 г соевого шрота, увлажняли дистиллированной водой в соотношении 1:2 до достижения влажности 67%, затем смесь стерилизовали в автоклаве при температуре 121 °С в течение 15 мин. После охлаждения до комнатной температуры в субстрат добавляли L-лизин (2,5% от массы субстрата) и L-треонин (2,5% от массы субстрата), тщательно перемешивали и выдерживали 30 минут. В. suЫШs N^£7144 культивировали на питательном агаре при 27 °С в течение 24 ч, после чего клетки смывали 5 мл стерильной дистиллированной воды. В конические колбы объёмом 250 мл помещали 5 г подготовленного субстрата и вносили 1 мл бактериальной суспензии В. suЫШs. Ферментация проходила в термостате при

температуре 27 °С в течение 72 ч. После завершения ферментации 20 г ферментированного субстрата помещали в коническую колбу с 250 мл дистиллированной воды, перемешивали на тефлоновой мешалке при 60 °С для дальнейшего детектирования летучих соединений. Схема ферментации биокомпозиции с B. suЫШs представлена на рисунке 2.

Смешивание Соевый шрот + вода

содержание с.в. 33%

Стерилизация 121 °С, 15 мин

Ферментация с В. эиЫШз 27 "С, 72 ч

Перемешивание 60 °С

Стерилизация 121 "С 15 мин

Хранение 4 °С

Рисунок 2. Схема ферментации соевого шрота

Соевая смесь (соевый изолят + вода) выбрана как основной субстрат благодаря высокому содержанию белка (85-90%) и хорошей растворимости. Содержание сухих веществ 35% обеспечивает необходимые реологические свойства для твердофазной ферментации при сохранении достаточной влагоудерживающей способности. Соевый шрот использовался как

альтернативный, экономически более доступный субстрат. Несмотря на более низкое содержание белка (45-48%), шрот содержит значительные количества изофлавонов (даидзеин, генистеин), которые могут быть трансформированы в процессе ферментации в биологически активные агликоны, обладающие выраженными антиоксидантными свойствами [95, 96].

Для первого варианта последовательной ферментации Rhizopus oligosporus NRRL 2710 выбран для первой стадии как продуцент протеолитических ферментов. Данный штамм способен гидролизовать белки сои до свободных аминокислот и коротких пептидов, обеспечивая питательную среду для второй стадии ферментации. Температура культивирования 35°C соответствует оптимуму роста и ферментативной активности R. oligosporus. Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii - КМ 186 используется на второй стадии для синтеза пропионовой кислоты. Выбор данного штамма обусловлен его способностью сбраживать лактат в пропионат [97, 98].

Bacillus subtilis NRCZ144 выбран для третьего и четвертого вариантов как альтернативный продуцент вкусоароматических соединений. Согласно литературным данным [85], штамм способен синтезировать широкий спектр летучих соединений, включая эвкалиптол, пиразины и терпены, формирующие комплексный ароматический профиль. Температура 27°C выбрана как подходящая для проявления ароматобразующей активности штамма при твердофазной ферментации [85].

Глюкоза (0,5%) вносится в первый и второй варианты как легкоусвояемый источник углерода. KH2PO4 (0,2%) выполняет функцию буферной системы, предотвращая резкое закисление среды на начальных этапах ферментации. MgSO4 (0,05%) необходим как кофактор ферментативных реакций, включая активацию протеаз R. oligosporus и ферментов пропионовокислого брожения P. shermanii [97].

L-лизин участвует в образовании пиразинов через реакции Майяра и L-треонин (по 2,5%) служит предшественником альдегидов и эфиров, формирующих комплексный аромат ферментированного продукта.

Представленные варианты ферментации позволяют провести комплексную оценку влияния типа субстрата (соевая смесь и соевый шрот), микробиологического профиля (одностадийная и двухстадийная ферментация) и целевой направленности процесса (синтез органических кислот и формирование ароматических соединений) на функциональные свойства получаемых биокомпозиций. Такой экспериментальный дизайн обеспечивает возможность выбора технологического решения в зависимости от требований к конечному продукту.

Выбор режимов ферментации

Проведена сравнительная характеристика разработанных биокомпозиций с оценкой их технологических и функциональных свойств.

При сравнении вариантов ферментации .№1 и .№2 (Таблица А.1), ключевым отличием является характер субстрата и его подготовка. В варианте №1 использован соевый изолят с содержанием сухих веществ 35%, что обеспечило однородную, легко фильтруемую среду с достаточной буферной ёмкостью и равномерным распределением питательных веществ. Первая фаза ферментации с R. oligosporus проходила в условиях оптимальной консистенции субстрата, что способствовало быстрому росту микромицета. После стерилизации (121 °С, 15 мин) и разведения до 10% сухих веществ среда оставалась стабильной и однородной, подходящей для второй фазы с P. shermanii. Вариант ферментации №2 с соевым шротом обладал схожим составом питательных добавок, но из-за наличия крупнодисперсных нерастворимых волокон и антипитательных факторов наблюдалась неравномерность суспензии, осаждение частиц и локальные дефициты питательных компонентов. Ингибирующее действие антинутриентов приводило к снижению активности ключевых ферментов, а неоднородная среда затрудняла контакт микроорганизмов с субстратом, что

существенно уменьшало выход биомассы и снижало функциональную ценность конечного продукта.

Сопоставление вариантов ферментации №3 и №4 показывает значимость состава и предварительной подготовки субстрата даже при одинаковом виде микроорганизма (В. subШis). Хотя температура ферментации (27 °С, 72 ч) и последующее перемешивание при 60 °С обеспечивали размножение бактерий, ограниченная буферная ёмкость приводила к резким колебаниям рН, замедляя метаболизм и увеличивая лаг-фазу. К тому же этап перемешивания при 60 °С усложнял технологическую схему и повышал энергозатраты. Вариант 4, где в качестве субстрата использован соевый шрот с аналогичным содержанием сухих веществ и теми же аминокислотами, не только сохранял ключевые источники углеводов и белка, но и, благодаря волокнистой структуре шрота, способствовал равномерному удержанию влаги и умеренному высвобождению питательных веществ. Это обеспечивало стабильный рН, равномерное распределение бактерий и устойчивый рост В. suЫШs без излишних технологических операций.

В связи с изложенными ограничениями дальнейшие исследования были сосредоточены на вариантах ферментации № 1 и № 4.

Сравнительный анализ метаболитных профилей биокомпозиций

Для выбора биокомпозиции был проведен сравнительный анализ метаболитных профилей двух вариантов ферментации: биокомпозиции на основе В. subtШs и биокомпозиции последовательной ферментации Я. oligosporus и Р. shermanii. Основными критериями сравнения являлись содержание органических кислот, определяющих вкусовой профиль и консервирующие свойства, а также характер летучих соединений, формирующих аромат продукта.

Биокомпозиция на основе В. subШis

В результате анализа методом ГХ/МС в биокомпозиции фементируемой В. subtШs N^£7144 были идентифицированы следующие основные метаболиты,

представленные в таблице 1.

Таблица 1. Состав летучих соединений биокомпозиции фементируемой B.

subtШs

Вещество Группа Процентное содержание (%)

Эвкалиптол Алифатические 31,25

3-этил-2,5-диметилпиразин Алифатические 26,14

Бутилгидрокситолуол Фенолы 15

Карриофиллен Терпены 8,25

Альфа-терпинилацетат Эфиры 11,3

Терпинеол Спирты 2,55

Копаен Терпены 1,75

Пропандиовая к-та фенилового ряда Кислоты 0,64

Алифатическая группа соединений составила 68,63% от общего количества летучих веществ, при этом эвкалиптол являлся доминирующим компонентом, представляя 31,25% всего экстракта и формируя характерный камфорный аромат. Вторым по значимости компонентом стал 3-этил-2,5-диметилпиразин, составивший 26,14%. Бутилгидрокситолуол, относящийся к фенольной группе, составил 15% экстракта и является третьим по содержанию компонентом, обладающим выраженной антиоксидантной активностью. Карриофиллен составил 12,02% от алифатической группы, что соответствует примерно 8,25% от общего содержания, и вносит пряные ароматические ноты. Группа эфиров была представлена альфа-терпинилацетатом (11,3%). Терпинеол из группы спиртов составил 2,55%. Группа кислот была представлена фенилпропандиовой кислотой (0,64%), а соединения кислородсодержащей группы (тауролин и таурултам) составили в сумме 1,85%. Эвкалиптол, как основной компонент, синтезируется при участии борнилдифосфатсинтазы, продуцируемой штаммом B. suЫШs в процессе ферментации соевого жмыха.

Биокомпозиция последовательной ферментации Я. о1що$рогт и Р. ь/ктшапИ

Проведена количественная оценка содержания молочной и пропионовой кислот как основных метаболитов используемых микроорганизмов для сравнительного анализа трёх вариантов ферментации (монокультура Р. яИегтапИ, монокультура Я. о1що$рогт, последовательная ферментация Я. о1що$рогт и Р. зИегтапи) и выбора оптимального биотехнологического процесса. Полученные результаты позволили установить биохимические основы формирования качественных показателей биокомпозиций (рисунок 3).

н

о

ч

о

к

Ьй

X

Ьй

о

к

ЕГ

X ч

ей и

а

о

и

к

X

а

*

а

и

ч

о

и

1,2

1

0,8 0,6 0,4

*

1

0,9

°-5

0,2 I

0,3

0,1 0,07 °>2

0

Ферментация Ферментация Последовательная

монокультурой Р. монокультурой И. ферментация И.

БИегтапИ о1^озропш о1^озропш + Р.

эИегтагш

молочная кислота ■ пропионовая кислота

Рисунок 3. Содержание молочной и пропионовой кислот в биокомпозициях

Молочная кислота, являясь основным продуктом метаболизма бактерий и мицелевых грибов, оказывает влияние на органолептические характеристики и физико-химические свойства ферментированных продуктов. Снижение рН молочной кислотой влияет на текстуру продукта, повышая его густоту и вязкость. В исследуемых образцах содержание молочной кислоты варьировалось от 0,1 г/л до 0,3 г/л (рисунок 3). При избыточном накоплении молочной кислоты

(выше 0,3 г/л) развивается чрезмерная кислотность, что приводит к снижению вкусовых качеств и приемлемости продукта [83].

Пропионовая кислота, продуцируемая P. shermanii, обеспечивает характерный вкус и аромат ферментированных продуктов, а также обладает антимикробным эффектом. Содержание пропионовой кислоты в образцах варьировалось от 0,07 г/л до 0,9 г/л (рисунок 3). Наибольшее содержание (0,9 г/л) было зафиксировано в образце с последовательной ферментацией, что свидетельствует о выраженной активности P. shermanii в данном варианте. Пропионовая кислота в высоких концентрациях снижает активность микрофлоры порчи, повышая срок хранения продукта [83].

Сравнение трех вариантов ферментированных соевых смесей показало, что последовательная ферментация обеспечивала уровни молочной и пропионовой кислот, позволяющие добиться высоких текстурных и вкусовых характеристик. Этот вариант демонстрировал сбалансированное содержание молочной (0,2 г/л) и пропионовой кислот (0,9 г/л) (рисунок 3). В этом варианте наблюдается синергизм между двумя видами микроорганизмов, что способствует не только повышению кислотности и улучшению вкуса, но и продлению срока хранения продукта за счет комбинированного действия молочной и пропионовой кислот. На основании полученных результатов для дальнейших исследований и сравнений была выбрана биокомпозиция последовательной ферментации R. oligosporus и P. shermanii.

Сравнение биокомпозиций

Сравнительная характеристика метаболитов биокомпозиций представлена в таблице 2.

Таблица 2. Сравнительная характеристика метаболитных профилей биокомпозиций

Показатель Ферментация с В. subtilis Последовательная ферментация (К. oligosporus+ Р. shermanii)

Ключевые метаболиты Эвкалиптол (31,25%), 3-этил-2,5 -диметилпиразин (26,14%), БГТ (15%) Пропионовая кислота (0,9 г/л), молочная кислота (0,2 г/л)

Функциональные свойства Антиоксидантная активность (БГТ -синтетический) Антимикробная активность (пропионовая кислота), улучшение текстуры (молочная кислота)

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Жернякова Анастасия Валерьевна, 2025 год

Список литературы

1. Baune M.C. et al. Textured vegetable proteins (TVP): Future foods standing on their merits as meat alternatives // Future Foods. 2022. Vol. 6

2. Hidayat B.T., Wea A., Andriati N. Physicochemical, sensory attributes and protein profile by SDS-PAGE of beef sausage substituted with texturized vegetable protein // Food Res. 2018. Vol. 2, № 1

3. Samard S., Ryu G.H. A comparison of physicochemical characteristics, texture, and structure of meat analogue and meats // J Sci Food Agric. 2019. Vol. 99, № 6

4. Bakhsh A. et al. Characteristics of beef patties substituted by different levels of textured vegetable protein and taste traits assessed by electronic tongue system // Foods. 2021. Vol. 10, № 11

5. Bakhsh A. et al. A novel approach for tuning the physicochemical, textural, and sensory characteristics of plant-based meat analogs with different levels of methylcellulose concentration // Foods. 2021. Vol. 10, № 3

6. Zhang J. et al. Changes in conformation and quality of vegetable protein during texturization process by extrusion // Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 2019. Vol. 59, № 20

7. Hong S., Shen Y., Li Y. Physicochemical and Functional Properties of Texturized Vegetable Proteins and Cooked Patty Textures: Comprehensive Characterization and Correlation Analysis // Foods. 2022. Vol. 11, № 17

8. Ku5ukgoz K., Trz^skowska M. Nondairy Probiotic Products: Functional Foods That Require More Attention // Nutrients. 2022. Vol. 14, № 4

9. Sharifi-Rad J. et al. Probiotics: Versatile bioactive components in promoting human health // Medicina (Lithuania). 2020. Vol. 56, № 9

10. Munekata P.E.S. et al. Functional fermented meat products with probiotics— A review // Journal of Applied Microbiology. 2022. Vol. 133, № 1

11. Aboulfazli F., Baba A.S., Misran M. Replacement of bovine milk with vegetable milk: Effects on the survival of probiotics and rheological and physicochemical properties of frozen fermented dessert // Int J Dairy Technol. 2016. Vol. 69, № 1

12. Pimentel T.C. et al. Probiotic non-dairy frozen dessert: Technological and sensory aspects and industrial challenges // Trends in Food Science and Technology. 2021. Vol. 107

13. Li Z. et al. Effects of Lactobacillus acidophilus on the growth performance and intestinal health of broilers challenged with Clostridium perfringens // J Anim Sci Biotechnol. 2018. Vol. 9, № 1

14. Yan Y. et al. Mixed fermentation of blueberry pomace with L. rhamnosus GG and L. plantarum-1: Enhance the active ingredient, antioxidant activity and health-promoting benefits // Food and Chemical Toxicology. 2019. Vol. 131

15. Kumperscak H.G. et al. A Pilot Randomized Control Trial With the Probiotic Strain Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) in ADHD: Children and Adolescents Report Better Health-Related Quality of Life // Front Psychiatry. 2020. Vol. 11

16. Plaza-Diaz J. et al. Mechanisms of Action of Probiotics // Advances in Nutrition. 2019. Vol. 10

17. McFarland L. V., Evans C.T., Goldstein E.J.C. Strain-specificity and disease-specificity of probiotic efficacy: A systematic review and meta-analysis // Frontiers in Medicine. 2018. Vol. 5, № MAY

18. Liu Y., Wang J., Wu C. Modulation of Gut Microbiota and Immune System by Probiotics, Pre-biotics, and Post-biotics // Frontiers in Nutrition. 2022. Vol. 8

19. De Keersmaecker S.C.J. et al. Strong antimicrobial activity of Lactobacillus rhamnosus GG against Salmonella typhimurium is due to accumulation of lactic acid // FEMS Microbiol Lett. 2006. Vol. 259, № 1

20. Lemos Junior W.J.F. et al. Safety and Stability of Two Potentially Probiotic Lactobacillus Strains After In Vitro Gastrointestinal Transit // Probiotics Antimicrob Proteins. 2020. Vol. 12, № 2

21. Capurso L. Thirty Years of Lactobacillus rhamnosus GG A Review // Journal of Clinical Gastroenterology. 2019. Vol. 53

22. Mendes A.C., Chronakis I.S. Electrohydrodynamic encapsulation of probiotics: A review // Food Hydrocolloids. 2021. Vol. 117

23. Jacobsen C. et al. Use of Electrohydrodynamic Processing for Encapsulation of Sensitive Bioactive Compounds and Applications in Food // Annual Review of Food Science and Technology. 2018. Vol. 9

24. Mahmoodi Pour H., Marhamatizadeh M.H., Fattahi H. Encapsulation of Different Types of Probiotic Bacteria within Conventional/Multilayer Emulsion and Its Effect on the Properties of Probiotic Yogurt // J Food Qual. 2022. Vol. 2022

25. Zhu Y. et al. Biomaterial-based encapsulated probiotics for biomedical applications: Current status and future perspectives // Mater Des. 2021. Vol. 210

26. Susanti D. et al. Optimisation of Vitamin B12 Extraction from Green Edible Seaweed (Ulva lactuca) by Applying the Central Composite Design // Molecules. 2022. Vol. 27, № 14

27. Kumudha A. Effect of Different Extraction Methods on Vitamin B12 from Blue Green Algae, Spirulina Platensis // Pharm Anal Acta. 2015. Vol. 06, № 02

28. Wang Z., Zhang X. Isolation and identification of anti-proliferative peptides from Spirulina platensis using three-step hydrolysis // J Sci Food Agric. 2017. Vol. 97, № 3

29. Bartosiak M., Jankowski K., Giersz J. Determination of cobalt species in nutritional supplements using ICP-OES after microwave-assisted extraction and solid-phase extraction // J Pharm Biomed Anal. 2018. Vol. 155

30. Bertrand E.M. Quantification of Vitamin B12-Related Proteins in Marine Microbial Systems Using Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry // Methods in Molecular Biology. Humana Press Inc., 2018. Vol. 1849. P. 87- 98

31. Penfield M.P., Campbell A.M. MEAT // Experimental Food Science. Elsevier, 1990. P. 184-223

32. Kim T.K. et al. Drying-induced restructured jerky analog developed using a combination of edible insect protein and textured vegetable protein // Food Chem. 2022. Vol. 373

33. Wi G. et al. Evaluation of the physicochemical and structural properties and the sensory characteristics of meat analogues prepared with various non- animal based liquid additives // Foods. 2020. Vol. 9, № 4

34. Sha L., Xiong Y.L. Plant protein-based alternatives of reconstructed meat: Science, technology, and challenges // Trends Food Sci Technol. Elsevier Ltd, 2020. Vol. 102. P. 51-61

35. Hong S., Shen Y., Li Y. Physicochemical and Functional Properties of Texturized Vegetable Proteins and Cooked Patty Textures: Comprehensive Characterization and Correlation Analysis // Foods 2022, Vol. 11, Page 2619. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2022. Vol. 11, № 17. P. 2619

36. Alamu E.O., Busie M.D. Effect of textured soy protein (TSP) inclusion on the sensory characteristics and acceptability of local dishes in Nigeria // Cogent Food Agric. 2019. Vol. 5, № 1

37. Chavarri M. et al. Microencapsulation of a probiotic and prebiotic in alginate- chitosan capsules improves survival in simulated gastro-intestinal conditions

// Int J Food Microbiol. 2010. Vol. 142, № 1-2

38. Gandomi H. et al. Effect of chitosan-alginate encapsulation with inulin on survival of Lactobacillus rhamnosus GG during apple juice storage and under simulated gastrointestinal conditions // LWT. 2016. Vol. 69

39. Ding W.K., Shah N.P. Acid, bile, and heat tolerance of free and microencapsulated probiotic bacteria // J Food Sci. 2007. Vol. 72, № 9

40. Никифорова, А. П. Перспективы производства ферментированных рыбных продуктов с использованием молочнокислых бактерии / А. П. Никифорова // ТППП АПК. - 2020. - № 2. - C. 17-24

41. Wronkowska, M. Physical properties of buckwheat water biscuits formulated from fermented flours by selected lactic acid bacteria / M. Wronkowska, T. Jelinski, A. Majkowska, H. Zielinski // Polish Journal of Food and Nutrition Sciences. - 2018. -№ 68 (1)

42. Ashaolu, T. J. A review on selection of fermentative microorganisms for functional foods and beverages: the production and future perspectives / T. J. Ashaolu // International Journal of Food Science and Technology. - 2019. - № 54 (8). - C. 25112519

43. Sahu, A. Potential application of cashew apple (Anacardium Occidentale L.) as a probiotic beverage fermented with Lactobacillus / A. Sahu, K. C. Samal // Vigyan Varta. - 2020. - № 1 (6). - C. 48-54

44. Matejcekova, Z. Application of Lactobacillus plantarum in functional products based on fermented buckwheat / Z. Matejcekova, F. Solteszova, P. Acai, D. Liptakova, E. Valik // Journal of Food Science. - 2018. - № 83 (4). - C. 1053-1062

45. Phiri, S. How processing methods affect the microbial community composition in a cereal-based fermented beverage / S. Phiri, S. E. Schoustra, J. van den Heuvel, E. J. Smid, J. Shindano, A. R. Linnemann // LWT. - 2020. - № 128. - C. 109451

46. Лисицын, А. Б. Современные тенденции развития индустрии функциональных пищевых продуктов в России и за рубежом / А. Б. Лисицын, И. М. Чернуха, О. И. Лунина // Теория и практика переработки мяса. - 2018. - № 1. С. 29-45

47. Tangyu, M. Fermentation of plant-based milk alternatives for improved flavour and nutritional value / M. Tangyu, J. Muller, C. J. Bolten, C. Wittmann // Applied Microbiology and Biotechnology. - 2019. - № 103 (23-24). - C. 9263-9275

48. Krizanova, J. Happy but vegetarian? Understanding the relationship of vegetarian subjective well-being from the nature-connectedness perspective of university students / J. Krizanova, J. Guardiola // Applied Research in Quality of Life. - 2021. - № 16. -C. 2221- 2249

49. Wickramasinghe, K. The shift to plant-based diets: are we missing the point? / K. Wickramasinghe, J. Breda, N. Berdzuli, H. Rippin, C. Farrand, A. Halloran // Global Food Security. - 2021. - № 29. - C. 100530

50. Чуракова, А. С. Растительное молоко как современная альтернатива животному молоку: изучение рынка, преимущества для потребителя, технология производства / А. С. Чуракова // Материалы XXIV Всероссийского Экономического Форума Молодых Ученых и Студентов. - 2021. - C. 113-115

51. Егорова, Е. Ю. «Немолочное молоко»: обзор сырья и технологий / Е. Ю. Егорова // Ползуновский Вестник. - 2019. - № 3. - С. 25-34

52. Питкин, В. А. Сравнительная характеристика социального одобрения феномена

вегетарианства в России и Великобритании / В. А. Питкин, Л. А. Холодная // Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. - 2020. - № 3. - C. 110-116

53. Terefe, N., & Augustin, M. (2020). Fermentation for tailoring the technological and health related functionality of food products. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 60, 2887 - 2913

54. Campbell-Platt, G. (1994). Fermented foods — a world perspective. Food Research International, 27, 253-257

55. Rezac, S., Kok, C., Heermann, M., & Hutkins, R. (2018). Fermented Foods as a Dietary Source of Live Organisms. Frontiers in Microbiology, 9

56. Louw, N., Lele, K., Ye, R., Edwards, C., & Wolfe, B. (2023). Microbiome Assembly in Fermented Foods.. Annual review of microbiology, 77, 381-402

57. Wolfe, B., & Dutton, R. (2015). Fermented Foods as Experimentally Tractable Microbial Ecosystems. Cell, 161, 49-55

58. Maria L Marco, Health benefits of fermented foods: microbiota and beyond, Current Opinion in Biotechnology, Volume 44, 2017, 94-102

59. Guarda A, Rubilar JF, Miltz J, Galotto MJ. The antimicrobial activity of microencapsulated thymol and carvacrol. Int J Food Microbiol. 2011 Mar 30;146(2):144-50

60. Handoyo, T., & Morita, N. (2006). Structural and Functional Properties of Fermented Soybean (Tempeh) by Using Rhizopus oligosporus . International Journal of Food Properties, 9(2), 347-355.

61. Steensels J, Verstrepen KJ. Taming wild yeast: potential of conventional and nonconventional yeasts in industrial fermentations. Annu Rev Microbiol. 2014;68:61-80

62. Katekan Dajanta, , Volatile profiles of thua nao, a Thai fermented soy product, Food Chemistry, Volume 125, Issue 2, 2011, 464-470

63. Sharma, R., Garg, P., Kumar, P., Bhatia, S., & Kulshrestha, S. (2020). Microbial Fermentation and Its Role in Quality Improvement of Fermented Foods. Fermentation,

6, 106

64. Liu, C.F.; Pan, T.M. In vitro effects of lactic acid bacteria on cancer cell viability and antioxidant activity. J. Food Drug Anal. 2010, 18, 77-86

65. Abubakar, M.A.S.; Hassan, Z.; Imdakim, M.M.A.; Sharifah, N.R.S.A. Antioxidant activity of lactic acid bacteria (L.A.B.) fermented skim milk as determined by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (D.P.P.H.) and ferrous chelating activity (F.C.A.). Afr. J. Microbiol. Res. 2012, 6, 6358-6364

66. Chettri, R.; Tamang, J.P. Functional properties of Tungrymbai and Bekang, naturally fermented soybean foods of North East India. Int. J. Fermented Foods 2014, 3, 87-103

67. Park, J.M.; Shin, J.H.; Gu, J.G.; Yoon, S.J.; Song, J.C.; Jeon, W.M.; Suh, H.J.; Chang, U.J.; Yang, C.Y.; Kim, J.M. Effect of antioxidant activity in kimchi during a short-term and over-ripening fermentation period. J. Biosci. Bioeng. 2011, 112, 356-359

68. Zhang, Y.; Hu, P.; Lou, L. Antioxidant activities of lactic acid bacteria for quality improvement of fermented sausage: Antioxidant activities of lactic acid bacteria. J. FoodSci. 2017, 82, 2960-2967

69. Tamang, J.P.; Shin, D.H.; Jung, S.J.; Chae, S.W. Functional properties of microorganisms in fermented foods. Front. Microbiol. 2016, 7, 578

70. Omolara, B.O. Cyanide content of commercial gari from different areas of Ekiti State, Nigeria. World J. Nutr. Health 2014, 2, 58-60

71. Lambri, M.; Fumi, M.D.; Roda, A.; De Faveri, D.M. Improved processing methods to reduce the total cyanide content of cassava roots from Burundi. Afr. J. Biotechnol. 2013, 12

72. Bamidele, O.P.; Fasogbon, M.B.; Oladiran, D.A.; Akande, E.O. Nutritional composition of fufu analog flour produced from Cassava root (Manihot esculenta) and Cocoyam (Colocasia esculenta) tuber. Food Sci. Nutr. 2015, 3, 597-603

73. Leeuwendaal, N., Stanton, C., O'Toole, P., & Beresford, T. (2022). Fermented Foods, Health and the Gut Microbiome. Nutrients, 14

74. Zhang, K., Zhang, T., Guo, R., Ye, Q., Zhao, H., & Huang, X. (2023). The regulation of key flavor of traditional fermented food by microbial metabolism: A review. Food

Chemistry: X, 19

75. Z. Song, H. Du, Y. Zhang, Y. Xu Unraveling core functional microbiota in traditional solid-state fermentation by high-throughput amplicons and metatranscriptomics sequencing Frontiers in Microbiology, 8 (2017), p. 1294

76. A.T. Adesulu-Dahunsi, S.O. Dahunsi, A.Olayanju Synergistic microbial interactions between lactic acid bacteria and yeasts during production of nigerian indigenous fermented foods and beverages Food Control, 110 (2020), Article 106963

77. O. McAuliffe, K. Kilcawley, E. Stefanovic Symposium review: Genomic investigations of flavor formation by dairy microbiota Journal of Dairy Science, 102 (1) (2019), pp. 909-922

78. H. Wang, W. Su, Y. Mu, C. Zhao Correlation between microbial diversity and volatile flavor compounds of suan zuo rou, a fermented meat product from guizhou, china Frontiers in microbiology, 12 (2021), Article 736525

79. M. Saarela, G. Mogensen, R. Fonden, J.Matto, T. Mattila-Sandholm Probiotic bacteria: Safety, functional and technological properties Journal of Biotechnology, 84 (3) (2000), pp. 197-215

80. X. Zhou, T. Guo, Y. Lu, H. Hadiatullah, P. Li, K. Ding, G. Zhao Effects of amino acid composition of yeast extract on the microbiota and aroma quality of fermented soy sauce Food Chemistry, 393 (2022), Article 133289

81. Л. Н. Борщевская, Т. Л. Гордеева, А. Н. Калинина, С. П. Синеокий / СпектрофотометричесКОЕ/мл определение молочной кислоты // Журнал аналитической химии. - 2016. - Т. 71, № 8. - С. 787-790

82. Nikita Tyutkov, Anastasia Zhernyakova, Artyom Birchenko, Elmira Eminova, Liudmila Nadtochii, Denis Baranenko, Probiotics viability in frozen food products, Food Bioscience, Volume 50, Part A, 2022

83. Di Cagno R, Minervini G, Rizzello CG, De Angelis M, Gobbetti M. Effect of lactic acid fermentation on antioxidant, texture, color and sensory properties of red and green smoothies. Food Microbiol. 2011 Aug;28(5):1062-71

84. Elhalis H, See XY, Osen R, Chin XH, Chow Y. Significance of Fermentation in Plant-

Based Meat Analogs: A Critical Review of Nutrition, and Safety-Related Aspects. Foods. 2023 Aug 27;12(17):3222

85. Abd-Alrahman AM, Ramadan MM, Maraay MF, Salem R, Saleh FM, Hashim MA, Zhernyakova A, El-Messery TM. Production of natural flavor compounds using Bacillus subtilis-fermented soybean meal extract and their biological potential: a comprehensive in vitrostudy. Front Nutr. 2024

86. Hanschen F., Klopsch R., Oliviero T., Schreiner M., Verkerk R., Dekker M. Optimizing isothiocyanate formation during enzymatic glucosinolate breakdown by adjusting pH value, temperature and dilution in Brassica vegetables and Arabidopsis thaliana // Sci Rep. 2017. Т. 7. № 1. С. 40807

87. Эминова Эльмира Рамазановна, Хашим Махмуд Ахмед, Лунёва Ольга Фёдоровна, Жернякова Анастасия Валерьевна, Бараненко Денис Александрович ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ЭКСТРАКТАХ СЕМЯН БРОККОЛИ // Ползуновский вестник. 2022. №3

88. M. Abotaleb, S.M. Samuel, E. Varghese, S. Varghese, P. Kubatka, A. Liskova, D. Büsselberg, Flavonoids in Cancer and Apoptosis, Cancers 11 (2018) 28

89. ГОСТ 10444.15-94 Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. - Введ. 01.01.1996

90. Latrofa, V., Kaleda, A., De Angelis, D. et al. Effect of Durum Wheat Meal Protein on the Techno-functional, Textural, Volatile, and Sensory Properties of Low-Moisture Texturized Vegetable Proteins. Food Bioprocess Technol (2025)

91. Yang, C.; Leong, S.Y.; King, J.; Kim, E.H.-J.; Morgenstern, M.P.; Peng, M.; Agyei, D.; Sutton, K.; Oey, I. Texture Evaluation and In Vivo Oral Tactile Perceptions of Cooked Wheat Pasta Sheets Partially Substituted with Pea Protein. Foods 2024, 13, 3798

92. Hong S, Shen Y, Li Y. Physicochemical and Functional Properties of Texturized Vegetable Proteins and Cooked Patty Textures: Comprehensive Characterization and Correlation Analysis. Foods. 2022

93. O Flynn TD, Hogan SA, Daly DFM, O Mahony JA, McCarthy NA. Rheological and Solubility Properties of Soy Protein Isolate. Molecules, 2021

94. Zhenzhen Zhang, Qiannan Liu, Liang Zhang, Wei Liu, Aurore Richel, Ruixuan Zhao, Honghai Hu, Potato dietary fiber effectively inhibits structure damage and digestibility increase of potato starch gel due to freeze-thaw cycles, International Journal of Biological Macromolecules, Volume 279, Part 1, 2024

95. Han C, Ren X, Shen X, Yang X, Li L. Improvement of physicochemical properties and quercetin delivery ability of fermentation-induced soy protein isolate emulsion gel processed by ultrasound. Ultrason Sonochem. 2024 Jul

96. Hwan-Hee Jang, Hwayoung Noh, Heon-Woong Kim, Su-Yeon Cho, Hyeon-Jeong Kim, Seon-Hye Lee, Sung-Hyen Lee, Marc J. Gunter, Pietro Ferrari, Augustin Scalbert, Heinz Freisling, Jung-Bong Kim, Jeong-Sook Choe, Oran Kwon, Metabolic tracking of isoflavones in soybean products and biosamples from healthy adults after fermented soybean consumption, Food Chemistry, Volume 330, 2020

97. Zhang Y, Wei R, Azi F, Jiao L, Wang H, He T, Liu X, Wang R, Lu B. Solid-state fermentation with Rhizopus oligosporus RT-3 enhanced the nutritional properties of soybeans. Front Nutr. 2022 Sep 8

98. Tripathi A, Pandey VK, Panesar PS, Taufeeq A, Mishra H, Rustagi S, Malik S, Kovacs B, Suthar T, Shaikh AM. Fermentative production of vitamin B12 by Propionibacterium shermanii and Pseudomonas denitrificans and its promising health benefits: A review. Food Sci Nutr. 2024 Sep 30

99. ГОСТ Р 70224-2022. Добавки пищевые. Метод определения пропионат-ионов в комплексных пищевых добавках. - Введ. 2023-01-01. - М. : Стандартинформ, 2022. - 12 с

100. Федорук Диана Вадимовна, Борисова Анна Викторовна ПРОБЛЕМА ФОРМИРОВАНИЯ МЯСНОГО ПРОФИЛЯ ВКУСА И АРОМАТА В РАСТИТЕЛЬНЫХ АНАЛОГАХ. Журнал Все о мясе. 2021. №5

101. Nagy K, Iacob BC, Bodoki E, Oprean R. Investigating the Thermal Stability of Omega Fatty Acid-Enriched Vegetable Oils. Foods. 2024 Sep 19

102. Teresa Witczak, Mariusz Witczak, Rafal Ziobro, Effect of inulin and pectin on rheological and thermal properties of potato starch paste and gel, Journal of Food Engineering, Volume 124, 2014, 72-79

103. Kakuda L, Jaramillo Y, Niño-Arias FC, Souza MF, Concei?äo EC, Alves VF, Almeida OGG, De Martinis ECP, Oliveira WP. Process Development for the Spray-Drying of Probiotic Bacteria and Evaluation of the Product Quality. J Vis Exp. 2023 Apr 7

104. Oberoi K, Tolun A, Altintas Z, Sharma S. Effect of Alginate-Microencapsulated Hydrogels on the Survival of Lactobacillus rhamnosus under Simulated Gastrointestinal Conditions. Foods. 2021 Aug 26

105. Udo T, Mummaleti G, Qin Z, Chen J, Singh RK, Jiao Y, Kong F. Survival of Lactobacillus rhamnosus GG in Chitosan-Coated Alginate Beads: Effects of Food Matrices (Casein, Corn Starch, and Soybean Oil) and Dynamic Gastrointestinal Conditions. Foods. 2025 Jun 13

106. Zhang C, Zhou Y, Zhang L, Wu L, Chen Y, Xie D, Chen W. Hydrogel Cryopreservation System: An Effective Method for Cell Storage. Int J Mol Sci. 2018 Oct 25

107. Li R, Zhang Y, Polk DB, Tomasula PM, Yan F, Liu L. Preserving viability of Lactobacillus rhamnosus GG in vitro and in vivo by a new encapsulation system. J Control Release. 2016 May

108. Sanam MUE, Detha AIR, Rohi NK. Detection of antibacterial activity of lactic acid bacteria, isolated from Sumba mare's milk, against Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, and Escherichia coli. J Adv Vet Anim Res. 2022 Jan 15

109. Purwanti T, Melani H D, Rosita N, Made P N, Siti Nafisah S. Characteristics and in vitro antibacterial activity of lactobacillus acidophilus fncc-0051 probiotic microspheres against propionibacterium acnes atcc 11827. Tropical Journal of Natural Product Research. 2021 Aug

110. Chakoosari Mohammad, Faezi Ghasemi Mohammad, Darsanaki, Reza. Antimicrobial effect of lactic acid bacteria against common pathogenic bacteria. mljgoums. 9, 2016.

111. Sanam MUE, Detha AIR, Rohi NK. Detection of antibacterial activity of lactic acid

bacteria, isolated from Sumba mare's milk, against Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, and Escherichia coli. J Adv Vet Anim Res. 2022 Jan 15

Список публикаций по теме диссертации В международных изданиях, индексируемых в базах данных Scopus и Web of Science:

1) Tyutkov N., Zhernyakova A., Birchenko A., Eminova E., Nadtochii L., Baranenko D. Probiotics viability in frozen food products//Food Bioscience, 2022, Vol. 50, pp. 101996

2) Abd-Alrahman A.M., Ramadan M., Maraay M.F., Salem R., Saleh F.M., Hashim M., Zhernyakova A., El-Messery T.M. Production of natural flavor compounds using Bacillus subtilis-fermented soybean meal extract and their biological potential: a comprehensive in vitro study // Frontiers in Nutrition - 2024, Vol. 10, pp. 1280209

В изданиях, представленных в перечне ВАК РФ:

1) Эминова Э.Р., Хашим М.А., Лунева О.Ф., Жернякова А.В., Бараненко Д.А. Исследование содержания фенольных соединений в экстрактах семян брокколи // Ползуновский вестник - 2022. - № 3. - С. 123-129

Приложение А

Таблица А.1. Варианты ферментации биокомпозиций

№ Вариант ферментации Подготовка субстрата 1 этап 2 этап 3 этап Стерилизация Хранение

1 Последовательная Смесь соевый изолят + вода Ферментация с R. Стерилизация Внесение 121 °С, 4 °С

ферментация (содержание с.в. 35%). oligosporus (35 °С, (121 °С, 15 мин) воды 15 мин

соевой смеси R. Внесение глюкозы (0,5 %), 24 ч) (содержание

oИgospoms и Р. КН2РО4 (0,2 %), MgSO4 с.в. 10%).

sheImami (0,05 %) Ферментация

2 Последовательная ферментация соевого шрота R. oИgospoms и Р. sheImami Соевый шрот (содержание с.в. 35%). Внесение глюкозы (0,5 %), КН2РО4 (0,2 %), MgSO4 (0,05 %) с Р. shermanii (30 °С, 24 ч)

3 Ферментация соевой смеси В. subtilis Смесь соевый изолят + вода (содержание с.в. 33%). Внесение L-лизина + L-треонина (2,5%) Ферментация с В. subtilis (27°С, 72 ч) Перемешивание при 60 °С

4 Ферментация соевого шрота В. subtilis Соевый шрот (содержание с.в. 33%). Внесение L-лизина + L-треонина (2,5%)

Приложение Б

Акты, подтверждающие внедрение и использование результатов

Диссертации

О производственном внедрении результатов диссертационной работы Жерняковой A.B., выполненной по теме «Технология замороженного растительного полуфабриката с функциональной биокомпозицией, полученной ферментированием R. oligosporus и Р. shermanii».

Настоящим актом подтверждается, что результаты диссертационной работы Жерняковой A.B. внедрены и апробированы на ООО «Нордена» с марта 2025 г.

УТВЕРЖДАЮ

АКТ

Главный технолог, к.т.н.

Овсюк Е.А.

УТВЕРЖДАЮ

/^х^&В^ЫыЬ 1 й директор

Sf facf^M

I £ / х^л^ври <М1ордена», I! а "Нор^г-^ ~ I

m^Jir^

2025 г.

АКТ

Производственных испытаний применения технологии производства ферментированной биокомпозиции на основе изолята соевого белка и микроорганизмов R. oligosporus и Р. shermanii.

Акт составлен главным технологом, к.т.н. ООО «Нордена» Овсюк ЕА. и аспирантом Университета ИТМО Жерняковой A.B. о результатах испытания технологии производства ферментированной биокомпозиции на основе изолята соевого белка и микроорганизмов R. oligosporus и Р. shermanii.

В испытаниях использовались следующие компоненты:

• Изолят соевого белка (3,52 кг)

• Глюкоза (0,5%) . КН2Р04 (0,2%) . MgS04 (0,05%)

• Вода питьевая (СанПиН 2.1.3684-21)

• Микроорганизмы: Rhizopus oligosporus NRLL 2710 и Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii (KM 186)

Все сырье, направляемое для производства, сопровождалось сопроводительной документацией, подтверждающей его качество и безопасность.

Процесс производства биокомпозиции включал следующие этапы:

1. Подготовка соевой смеси:

Для приготовления соевой смеси изолят соевого белка (3,52 кг) растворяли в 6,46 л воды с добавлением глюкозы (0,5%), КН2Р04 (0,2%), и MgS04 (0,05%). Смесь стерилизовали в автоклаве при температуре 121 °С в течение 15 минут. Процесс

стерилизации проводился в промышленной установке с автоматическим контролем температуры и времени.

2. Подготовка культуры микроорганизмов:

о Р. shermanii культивировали в промышленной биореакторной системе в жидкой среде YEL при температуре 30 °С в течение 24 часов в анаэробных условиях с использованием автоматизированной системы контроля газа, о R. oligosporus культивировали на специальных агаровых пластинах YMP в условиях термостатированного инкубатора при температуре 35 °С в течение 24 часов. После этого споры из культуры промывали раствором глицерина (10%, v/v) и Tween 80 (0,05%, v/v) с использованием промышленного оборудования для перераспределения и подготовки спор.

3. Ферментация с участием R. oligosporus:

После подготовки соевой смеси она подавалась на ферментационную установку, где происходила инокуляция R. oligosporus. Для этого на 100 литров соевой смеси добавляли 1 л суспензии спор. Процесс ферментации проводился в промышленных ферментерах при температуре 35 °С в течение 24 часов с контролем микроклимата и показателей pH. После окончания ферментации смесь гомогенизировалась до 10% сухих веществ и стерилизовалась в специализированном стерилизаторе.

4. Ферментация с участием Р. shermanii:

I-Ia втором этапе ферментации в уже подготовленную смесь из соевого белка и R. oligosporus вносили 1 л суспензии спор Р. shermanii на 100 литров. Процесс ферментации проводился в термостатических камерах при температуре 30 °С в течение 24 часов. Анаэробные условия обеспечивались с помощью эксикаторов в условиях закрытого цикла.

5. Завершающая стерилизация и хранение:

На последнем этапе готовая биокомпозиция подвергалась стерилизации в промышленной стерилизационной установке при 121 °С в течение 15 минут. После стерилизации продукт охладился до температуры 4 °С в холодильной системе с автоматизированным контролем температуры, после чего был упакован для хранения и транспортировки.

Производственными испытаниями показано, что использование предложенной технологии позволило:

1. Обеспечить стабильные свойства продукции, что способствует улучшению пищевых характеристик и биологической ценности сосвого белка.

2. Получить органолептические характеристики, соответствующие стандартам качества и безопасности.

Рекомендуется использовать предложенную технологию для производства биокомпозиции полученной ферментированием Я. oligosporus и Р. зИегтапп. Применение биокомпозиции возможно для производства широкого ассортимента пищевой продукции.

Аспирант Университета ИТМО

Жернякова А.В.

Главный технолог ООО «Нордена», к.т.н.

Овсюк Е.А.

Тексты публикаций

Fcod Bloeciencc 5«J (20221 НМЛ*

Contents lists available at >

Food Bioscience

journal homupage:

Probiotics viability in frozen food products

Nikita Tyutkov, Anastasia Zhcrnyakova, Artyom Birchenko, Elmira Eminova, Liudmila Nadtochii, Denis Baranenko

IntemGtioital Rmarch Centre Betirahnologie.t of the Purd Millennium , Fachby of Bvttechnokigifj iBwledt), ITMO Uimwity, Saint Petenbvr& Lammasava sir.. 9, 191002, Ruuitt

ARTICLE INFO

Keywantt: Prolnolic Fruzen food Prubiulk viability Encapsulation Cryoprotectani

ABSTRACT

Improving sasuointestina! flora with probiotics is a promising method of treating and preventing many diseases. However, in food industry1, introduction of probiotics is limited by the shelf life of products, as well as by the reduction of bacterial viability during storage. Thus, introduction of probiotics into foods to be frozen is a promising method to extend the shelf life of probiotic products. However, the storage of living cells in frozen products involves their damage during freezing and subsequent storage at temperatures below 0 C. Therefore, some technological solutions are required to protect probiotics during storage at sub-zero. Today, encapsulation, addition of cryoprotectants and prebiotics. as well as adaptation of microorganisms are widely used techniques of protecting probiotics. The combinauon of various protection methods is a promising way to improve the viability of probiotics during storage. Studies aimed at investigating various combinations of hurdle methods and their effect on bacterial survival are of great interest

This review compiles the most common methods of preserving probiodes in frozen foods, describing their effects, variety of approaches, and effectiveness- The mam mechanisms of bacterial cell damage by freezing are described. Further trends in probiodc protection in frozen foods are also discussed.

1. Introduction

Ihese days the Issue of probiotics, prebiotics and food products fortified with them in particular is of great interest, not only Lo researchers. but also to consumers, as evidenced by the increasing number of pro- and prebiotic products on the market. Healthy microflora of gastrointestinal (Gl) tract has a proven positive effect on many systems of human body, fi) It acts as an antagonist for pathogenic microflora, releasing bacteriotoxins; (it) it increases bioavailability of food components, destroying compounds that are not amenable to enzymatic cleavage; (Hi) it synthesizes micronutnenls (amino adds, vitamins); (iv) it improves the absorption of microelements through the intestinal walls; (vj It trains Immune system. ( 'an : j1 20J0. Fthru ir \). It has also been suggested thai poor gut roicrobiota may lead lo the development of food allergies (: unyu vamih «c Bertn, ii > t). It is due to the fact that the ratio of microflora cells to human own cells is on average 1:1 (s( n.i •- -> aJ.. Ui'lii), that the microflora has such a great Influence on many biological processes in the body. Regular consumption of adequate foods including those fortified by proteins, is one of Ihe factors contributing lo healthy microflora.

FAO. v\|in i !(.>(.• i defines probiotics as 'living microorganisms which, when consumed in adequate amounts as part of food, confer a health benefit on the host'. According to Oelschiaccl •■( 120 1j, the three main ways of probiotics are: modulation of the immune system; suppression of pathogcnic microflora; inactivation of toxins. Probiotics are used In the treatment of pathogcnic microorganisms associated infections CttpflariOc?i>n»-H!imof)k tmv:> .-i 2007), C difficile ( .'/> 1-enfteq? r )), irritable bowel syndrome ( M I; n et al.

2IJ1 i), cancer (tk'-JjUd m jJ.. L't)'J0), urogenital tract disorders (Hiu.tM lUtmli. l ! al. 2l'S ) and other diseases. In addition, probiotics provide immunomodulator>' effects (Aslir.il * - ..ih 1\ U'V).

Probiotics are administered via medications (as dietary supplement) or by adding (hem lo a food product ( \:i t^acu jI. '.-'.'..'I 2). The question of the best probiotic administration method remains open. i.Mtui.vurd .•! ai i _:>! -\ have collected some data concerning Ihe effects of probiotics delivered both as supplements and as part of a food product. The authors note thai in fact, liltic research has been conducted to compare medical and food formulations as a delivery matrix for probiotics. It is generally assumed that the preference for probiotics in foods rather than in medicines may be due to the prebiotic effect and better matrix

* Corresponding author. E-msal address : : ли ^ l

<j n* CD.

httf* •/dfjt.olgf' 10. i Olii /jXaic Jil'Zi MJ10«*j

Received 9 June 2022; Received In revised form 18 August 2022; Accepted 22 August 2022

Available online 26 August 2022

2212-4292/© 2022 Elsevier Ltd. All rights reserved.

fowl mûidence so (2022) ¡01996

n. Tjiaka* m ol

properties oi the food product (lloma von , . Nl«:). It can also be mentioned that consumers prefer food products to medicines. Fir t shows the number of publications containing the term 'probiotlcs' in the SOOPUS system between 2000 and 2021. Ifce graph demonstrates that the number of publications on the topic is steadily growing, which advocates the relevance of the topic

For a product to be considered probiotic, it must contain an adequate amount of living microorganisms. The number of living bacteria, essential for the product to be considered as a probiotic, varies, but the generally accepted level is 10M08 CFU/g (M„> u i P-.. uv;

i i i i . i'). However, during storage, the quantity

of living bacteria can decrease dramatically. Therefore, an Important factor in the production of a probiotic product is the survival of microorganisms during storage (! ripuiJi: ^ Gin -t).

The factors that affect the viability of microorganisms include temperature, humidity, waler activity, osmotic pressure, pH. nutrient composition of the product, and competitive microflora. Low Lernpera-ture storage provides a better viability of microorganisms ( 1 < .101 -i). However, low temperature storage of probiotic products is usually limited by 4-6 weeks (ManoilOvn: el ii.. In tliis regard, the introduction of probiotics into products Lo be frozen and stored at negative temperatures is of great interest Such products Include ice cream, frozen desserts, and frozen semi-finished foods. Frozen products have good prospects In terms of administering functional components (e.g.. probioUcs. vitamins, and mlcronuirients) into the human body. In recent years, microcapsules, nanoemulsions, and oleugels have been increasingly used (o enrich frozen products with functional ingredients. The effects of added components on the consistency, taste, smell, storage capacity of finished products, as well as on their physiological properties arc being actively Studied ( . l\""-). Frozen foods are effective as a reservoir for probioUcs, mainly due lo their storage at negative (below 0 C) temperatures leading to increased viability of microorganisms jilht-r^ di. JlHO). Further research In this direction may be needed to expand the range of frozen probiotic products and lo provide a belter understanding of technological challenges Involved.

On the other hand, production of frozen foods has a number of features to be considered. At room temperature probioUcs In food products are able to proliferate, which helps lo partially compensate for losses of living bacteria during production and storage (Maiv and 1 iir.. .'J'i4)r whereas storage of probiotlcs at sub-zero temperatures leads to the state of suspended animution, which prevents them from replenishing. It makes it necessary to preserve them as much as possible during storage. Frozen storage technology is also hampered by the increased lethality of microorganisms during the freezing process. In addition, once in the human body, probiotic cultures must survive in the hostile environment of the gastrointestinal tract and, having reached the large Intestine, remain active enough to attach to Its epithelium.

Fig. I. Quantity of die articles containing the term 'probioucs in die SCOPUS system in the period between 2000 and 2021

In view of the above, it is the vulnerability of probiotic bacteria when introduced into frozen foods that remains a challenge. Thus, the purpose of this review is to summarize and compare the existing techniques for protecting probiotic bacteria introduced into frozen food products and suggest their further development.

2. Methodology

Electronic databases and search engines, including PubMed, Scopus. Science Direct, and Google Scholar up !o April 2022 were searched. Subject Inquiries Included srientiftc articles, reviews, and book chapters on probioUcs, their survival in frozen foods, and techniques to improve their survival. It was only publications in English that were considered. Although most of the 156 publications died are dated later than 2000. there are 21 publications dated before 2000, 4 of which belong to the 1980s, 1 article was published in 1978 and the oldest one dates back 1961, the remaining 15 refer lo the 1990s. The following search terms and their combinations were used: "probiotics'", "frozen food products'', "viability", "encapsulation", 'cryoprotection", 'freezing", "prebiotics', "plant extract".

3. ProbioUcs used today

Ihc most common genera of bacteria currently used as probiotics arc Lactobacilli and Bifidobacteria (M:l • ti ul. ..nti a ii.

>'17; TantHKk l HJ7). Bacillus genus (i r<: el jOiD), some yeasts (l.'iiA ti al., JUH>), and other microorganisms ( < m _l*)0) arc also used as probiotics 0 1 !). Lactobacilli are a genus of Gram-posf Uve, non-spore-forming microaerophilic bacteria ('».,.< i > !). Lac-

tobacilli process hexosc with the release of lactic acid. They can convert glucose acung as a homofermentative with the prevailing production of lactic acid, or a heicrofcrmentativc, producing lacUc acid as well as COj, ethanol, and aceUc acid. In the presence of oxygen, the balance is shifted towards the increased release of acetate (llamnic- . " . . . • f ).

Lactobacilli are widely present as a part of dairy products, fermented foods, plants, intestines, and mucous membranes of animals and humans. These bacteria secrete organic adds (]'<,. - v. et -d. __) as wdl as fatty adds, hydrogen peroxide, diacetyl, reuterln, and reuter-icyctin and other products (VanrltnlHr^h, ,; !:-i)), which control the growth of pathogenic microflora.

Lactic acid bacteria arc present in many foods, are part of the normal microflora of the gastrointestinal tract and oral cavity, and have also been used since ancient times for the fermentaUon of foods (Aol-uu \ Marcau, ¿v>5 ).

Bifidobacteria are gram-positive, non-sporc-forming, non-motile anaerobes. They process sugar with the formaUon of lactic and acetic adds (M -i.-jiI -r 31. N95). Bifidobacteria produce several vitamins (Bl, B6, B9. B12, and PP), amino adds (alanine, valine, aspartic add, and threonine), L + lactic add, and also may suppress lactose intolerance (Bh3 ■ ■ -_ui -i '). Despite the GRAS (generally regarded as safe) status of the majority of probiotics, they should be used with caution and GRAS status should be obtained for each specific use (i < >.v, h r-,).

4. Effect of the freezing process on the survival of probiotics

Cells can suffer greater damage during the freezing process than during the storage period (R«inrjdli>v:r:j j : i"! :). This is mainly associated with active ice crystal growth during freezing, which causes medianical damage of the cell membrane. In the freezing process, the probiotlcs cell Is exposed Lo several destructive factors (I iy, ), Lhe most significant of which are the following (DpoJ a h nv H".

1. Thermal stress. 11 leads to denaturation of cell proteins and disturbances in the structure of the cell membrane.

2. Formation of ice crystals. Ice crystals are capable of causing mechanical damage to the cell membrane.

N. Tyutkov a aL

including probiotics. as well as on lipid organization, and membrane fluidity (Balasubruraariuin et al„ 2009).

In addition to the influence of external factors, the type of probiotk culture must also be considered, as different types and even strains react differently to freezing conditions, -'aga: os >;t al. showed a

greater survival rate of Lactobacillus acidophilus La-5 bacteria compared to Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12 bacteria, 'lite authors note that the decrease in the number of cultures was observed during freezing and was insignificant during the storage. Rsu't ai <2007 obtained data on the number of damaged and dead ccOs of the genus Lactobacillus when stored for 1 month at -80 CI Notably, strains of the same type (L bulgaricus CNRZ20HT, L bulgaricus CFL1, L bulgancus C1P 101027T) reacted differently to storage in a frozen state.

In the research by i iommn ouib r ,J (2uD8D i, the authors state that L casei bacteria survive better at low temperatures than B. longunt B. Bifulum and L. acidophilus bacteria. The findings also showed a better survival rale of B. bifidum than L acidophilus, which is consistent with itekiDiii Mc.S' diun ll'mi, Majiarlnos .-i uL (2007), and SuieOi ei a!

.In the research of >-l.radt .an.! M< .Malum • 1 '■•■J.> Bifidobacteria showed stabibty in frozen food for the first 9 weeks, after which a significant drop in survival (1 log cycle) occurred between 9 and 13 weeks. Lactobacilli, cm the other hand, intensively lost viability in the first 9 weeks, after which they remained relatively stable. By the 17th week, the lotal number of Lactobacilli had decreased by 2 log cycles (J t»-} :rru i .V M.MaW, IS'JJ).

It has been reported thai the survival rate of L. bulguricus L2 strain during freezing is significantly higher than that ofl. bulgurfcus rr ( i

• Marshall . 1 ' 0. The authors suggest that is due to the larger size of the latter, which increases their sensitivity lo mechanical damage. These results are consistent with those of t urn*» a d aL 12tHUlJ, in which the authors linked the better survival rate of Str. (hemophilus to a smaller cell size than that of Lactobacillus. In a mure recent study, : mavtnait

• a! • Ji ii <■■• also attributes the belter survival rate of B. lactis compared lo L easel to the larger size of the latter (0.S-1.5 ura and 1.5-3 jim respectively).

tiujyi.unl m di : Ji Of. I. suggest that Lactobacillus gene is more tolerant to high sucrose concentrations than Bacillus. Studies on culti vability of pro bio tic bacteria (Lacldophtlus, Lcasa, B.Bifuhim, B. lonpan) and their dependence on such factors as storage temperature, sucrose concentration, and oxygen scavengers showed that both strains of Lactobacillus species grow well in the presence of sucrose. The addition of oxygen scavengers (ascorbic acid, cysteine) also leads to the maintenance o (Lactobacilli cell growth at a high level, while the culti vability of Bifidobacteria, especially B. hmgum. decreases.

A study of the viability of Lactobacillus rhamnosus In a frozen cheesecake (J lusgucmen i ,V ny;un. 2020) showed that probiotics had a high survival rate during storage at -20 C for 120 days. Notably, storage at 4 C for 5 days has led to reduced viability compared lo - 20 C/l 20 days. As the number of CPU was higher than 6 log CFU/g at the end of both cold (4 C) and frozen ( - 20 "C) periods of storage, it may be concluded that L rhamnosus has a good cold resistance. The findings arc also supported by the study of 1 jmpmv_ i al. |2( I CI, which showed good survival of L rhamnosus GG during storage at -16 and -28 C for one year, and the study by > ! n et al. U'J" i, In which L rhamnosus B-445 also showed strong stability when su)red for 12 months al -26 C.

There is evidence of a lower survival rate of yeast probiotics. :-H :

li ' ! -W7 introduced L acidophilus MJLA1. S. boulardii 74012, L rhamnosus 100-C, L panic asa ssp. paracasei Lp-01, B. lactis BDBB2, and B. lactis Bb-12 into a frozen soy-based vegetarian dessert. All probiotk strains, apart from L rhamnosus and S. boulardii did not show a significant decrease in survival after product preparation. The study showed that S. boulardii demonstrated the lowest survival rate, both immediately after freezing and during storage, indicating that probiotics of a non-bacterial nature are more vulnerable to freezing. In the study, B. lactis showed the best survival rate, which the authors attribute to its

Fcm*1 Bioscience 50 (2022) 101996

relatively increased resistance to oxygen. (Mziic et al. . ■•'7). 5. Hurdle methods to improve probiotk survival during freezing

Drying techniques are commonly used to extend the shelf life of probiotics ('■ I di. ' ). In particular, freeze drying (lyophili-

sation) of bacteria is widely applied. 'Ihc method consists of freezing the bacterial cells followed by lowering the medium pressure, resulting in sublimation of solvents, bypassing the liquid phase (Hcl1»1\ !'.'• l).The method is Commonly used for the preservation of probiotics in pharmaceuticals. However, reactivation of dried probiotics may require special techniques (Iri Mitu Gin. - Jl4). Moreover, the incorporation of dried probiotics directly into a food product may be associated with the alteration of the organoleptic profile due to cell proliferation and the consequeni accumulation of their metabolites (more relevant for unfrozen products). In addition, the data on the effectiveness of dried probiotics is rather scarce. Therefore, all these aspects need further research.

In addition to crystal growth during freezing, such factors as oxygen exposure and product composition (e.g., acidity (ShuL S if ula. 2(>o0)) may also have a significant effect on the celL Mosl probiotic cultures arc sensitive lo oxygen, which affects the cell both directly and indirectly through free radicals that are released during the oxidation of food components (e.g., fats) (Tnpoih. v _»UM). Selection of appropriate packaging provides effective protection of probiotics from oxidative effects of atmospheric air. Modified packages that include oxygen-scavenging agents are able to protect probiotic cultures (i at: u -•! tiL. 2lw ). Such packages can be used for both refrigerated and frozen products.

Today (here is a variety of hurdle methods to protect bacteria, however, for probiotics m frozen products (he must significant are encapsulation, addition of prebiotics and cryoprotectants, adaptation, and High Pressure Low Temperature freezing method. Each of these methods will be discussed in more detail below.

5.1. Encapsulation

In order to protect cells and prolong their shelf life, encapsulation tcchniquc can be used 0 1 ilfvu ^ i ah, This is a promising

method, which can be used both at room and negative temperatures. Encapsulation is a physico-chemical or mechanical process that involves the incorporation of a target active ingredient inlo a coating that protects it from environmental influences (' lien X 1 > i'} ). Encapsulation prevents die pathogenic effects of competitive microflora, osmotic pressure, oxidative and acidic stress (Qvu & Una. JO') '; Mao .1 ul 1S8S). The capsules can be reservoir-like (form a continuous shell around the encapsulate) or matrix-like (the encapsulate is distributed in matrix volume, including the surface) (Zaidoin X Sbtmonl 2010). Today, there are many different encapsulation techniques that allows one to obtain the desired capsule size (Table ')•

The following materials are used as the capsule shell: (I) proteins (gelatin (amvor •.! al,, 2008), milk proteins (H ..J.-'-di d.. 200'.'), wheat protein (>mi, J al 2010)), (ii) lipids (milk fat 0 J .• J'in ilvj •'! al. 2J22))t (Hi) polysaccharides (alginate (Unwlev -it id., i V"), xanLhan and gellan gum (,'.uo & tirlfl'itiu. 2:100), chitosan (Calbiuiu " al., 2( i! »0, k-carrageenan (Date et ai, 2017), starch and Its derivatives (Ylng ,.•«. aj., 2iML')), and (iv) polymers (polyvinyl alcohol (y«u, K. & Amelnw A.. L 202 i)). 1he mosl common are polysaccharide and protein materials, In particular sodium alginate and carrageenan-based capsules (a£*jo: -a 2019; Chen el ill. 2017).

The combination of different agents and biopolymers can improve cryoprotection properties of the capsules. For example, the comblnaUon of hydrocollolds, such as sodium alginate and methoxyl pectin in certain proportions provides a higher degree of cryoprotection for the probiotic than the usage of these biopolymers alone (Sandoval-Co»Ulltj r\ al 20'i ). Another study (Xins l-i aL, 2 ¡ .r) shows the unproved capsule

Food Biuicienct SO (2022) 101996

Table 1

Encapsulation techniques.

Encapsulation technique

Reservoir Fluidized bed coating

Electros-praying

QydlTOîioci

Eilniuui

trniiliiticjlicin

Spray C Spray- Freexe drying

Wma. tatty adds and specially oils, cellulose and iu derivatives, carrageenart. slatch derivatives, gluten, casein, alginate Proteins, polyvinyl alcohol (PVAj, polyethylene oxide (PEO). pol)vinvlpytrulidotie (PVP), dutosnn/FV'A.

Pally acids, carlxibydrutes. peptides

Arabic gum, pectin, alginate, xanthan gum. csmgeenan.

carbaxym ethyl cellulose, wrhey protein, gelatin, albumin, milk

proleins. casein, b lactoglobuliu. milk wiun, egg prolans.

lipoproteins

Alginate -T

Calcium chloride, dtitusan, pectin, poly < lysine, locus! tiean gum Alginate, calcium chloride, xanlhan gum. gellan gum, starch, pectin, wbey protein, diilosan. poly i.-lysine, gelatin, collagen Arabic gum, locust bean gum. alginate, j-carrageenan, ciJIulos*

maltudextnn. whey prolein. chickpea protein, gelatin, modified starches. slum milk powder, resmet

Skim milk powder, nonfat dry milk solids, tttiey protein, say protein isolates, gelatin, gum arable, pectin, (modified) starch, cellulose acetate phlhalale. tnaltodexirui and sugars Proteins ur amino adds, maltodextrin. muoosacdiarides, trehalose, sorbitol, gums

Sesame oil, ialerextertfied fal with palm and palm kernel alginate, k catTageenati. gellan/xanlltan, mallodexlrin. trehalose

"AWetal 2Uat>0totfA Bung 1*030; Mutini ti *L, 20Z1 ULIMIU-S 4t (Clin l FtnkoiiikJ «• jl *Uk3i i

llbWc ..L ,'Jflfitti Frakukua.1 rf 4L i:»f2i I FtakutaJtl et sL VDî i

Fralutaid et 4L 30M J

FrakuMkl d 4L i2U2»i

Fsn*um«i e! sl « 3A3! i Senrum» a Ai I2D1G >

0.01 10000

lso aooo

25D 2500 OJL 5000

24.8

53.99 105.07 100 1900

rnnuuiniry el «I CUUUi Finfruiukl 0 al inCD i

Cliawtliusy ei Sl ' 111'.. i

HjmUi_e 41

mm>

Qiuuuliury el «I UUUCIl

DUrjrain e al J2011

tjuiidlutrv et aL . 202. )

talikwia iuul SliliuUli (3010)

..uldjti, ii«id SIOmtMii OOLOi Visiuliel kl, 3019; HAM ii.. 201S;

201 Si

SetllyOntfV el td. 12010>

Abbreviation: nd - not determined.

properties of die combination: porous starch (10%) + mannitol (3%) + glycerol (2%).

Inclusion of cryoprotectants in the encapsulation matrix can promote cellular protection against freezing. They induce cold tolerance, reduce osmotic pressure, and may also provide additional prebiotic effects in case of some mctabolizablc cryoproteclanls, such as glucose (Chen •« al. ZD 17). Such cryoprotectants as polyols. mono-, di- and polysaccharides, vitamins, amino acids, peptides, and proteins are mainly used (Bral A

! un^eca j.'J! 5). When choosing a material for encapsulating probiotic microorganisms, it is necessary to consider the possible antimicrobial effect of some food polymers, for example, some types of chitosan (Hanm-nko >.•'. al. 2u! J), and to avoid such components In the composition (i-h*n el til., 2U17). One promising method to prevent the harmful effects of oxygen on probiotics is Lo include antioxidants such as guarana extracts (ill v«. el aL 2t)22) in the encapsulation formulation. The results of multiple studies show a positive effect of microencapsulation of

Table 2

Effects of microencapsulation on the viability of probioUcs in frozen products.

Encapsulation method Encapsulation material Product Storage period. Days Temperature at storage, °C Strains Viability ul 1rs cells, M Viability ot encapsulated cells, % Reference

Em ids iii cation Sodium alginate Ice cream 14 -20 (hardening L btdgoriau \L2. 45 02). 90 (L2), Soeu .mil MAatAii

al -29) rr) 5(rr) 25 (rr) 11993:

Emukifi cation Sodium alginate Frozen 12 -IB L acidophilus 40 69 (approximate) SOitfi and ttjvul?

diary M J LAI (aj>pcuxiniaie I fiOfXfr

Lmuls ifï cation SA - Hi-maize Ice cream ISO -20 L. casa (Lc-OI). 66.4 (t. COKO 86.1 (L Casa) M0ifi4)'uuiil el Al

rcdsiani starch B. lactis (flb-12) 71.1 (Utoctii) 92.7 (B.Inctû) (2QUhai

Spray drying Éin milk, tnulin Frozen 90 -IB B. tactil BB 12 65.8 99J iskirn milk), lUfluica al. i3012(

yogurt 98.7 (skim

milk »-Dud in).

104.7 (intdin)

Emulsification Sodium alginate Frozen ISO -IB L cacei Oc-01), 76.7 (L Coiei). 75 J2 (L Cam), SotullMfchkfc. Gbciran

yogurt B. lactis (Bb 12) B9.5 taiaciil) 89.2 (B.lactii) ^nUU«rl. « QriUMVi.

2012. J«.u»rr

Emulsiiicaiion Sodium alginate yog-Ice 60 -IB L. acidophilus 70 90 (approximate) AJumidl n ai 1*2014)

cream (approximate)

Extrusion Sodium alginate. Ice cream 130 -20 L. acidophilus 61.7 88.2 (alginate) Ataoil el hI. 120191

CarTageenan A TTC-4356 84 8 (carrageen»

Emulsifi cation Gelatin Ice-cream 1BO -20 Lactobacilli!* spp. 72.0 93.9 ¡■BÇEauiJMnLg el*l

maltodextrin ¡train 21C2 10 OuteilVkl.it CUHj

Extrusion udium alginate Ice cream 120 -20 L. adtkjp fnlla 39.3 87 7 (SA). 7,eio.luin a *J ISU»I>

(SA), soy protein A TTC -4356 83 J (SP1>.

isolate (SPt) 94.to (5A-SP1)

N. Tyudunr el aL

probiotics on their survival after frozen storage (I'able _). Viability of free and encapsulated cells was calculated via proportion method, log CPU/g of bacteria at the beginning and at the end of the experiment were used.

Another criterion that affects the survival rate of the encapsulated bacteria is the size of the capsules. For example, Lactoabacillus survives better in frozen storage in alginate capsules larger than 30 pm in size than in capsules with an average diameter of 15 pm (Slui- i Marshall 1 ). On the other hand. It should be considered that the increased capsule size may have a negative effect on the scnsoric characteristics of the product (MmioJlo"ir et at, 11009).

slu and Miirb'iall ; l'1 showed a significant improvement in the survival rate of the encapsulated (alginate) L bulgaricus L2 frozen in water. However, a comparison of the survival rate of free and immobilized bacteria in milk showed no significant difference. This could be explained by the high concentration of dry residue (including proteins) in milk, which provides cryoprotection. Similar results were obtained by Iwiiljiidi'u' hj anil KulLmii '.20 ' I J. I'-u/ufi, ana Fl.iyu- t20 compared the survival of probiotic cultures L. acidophilus LAFTl L10, B. lac Us BLC-1 and L casei subsp parucusei LCS-1 in fatty and low-fat ice cream. No improvement in viabdily was observed in high-fat ice cream, suggesting that the cryoprotective properties offal in frozen dairy products may be excluded (Manndo- u al 200-J).

When selecting the material for encapsulation, additional conditions should be taken into consideration. For example, if a product containing bacteria in alginate capsules is subjected lo heat treatment, there is a high probability of bacterial death, associated with high porosity of alginate capsules. Possible solutions lo that could be changing the concentration of sodium alginate (4% provides belter stability (Manila! et al . ; IX»)), adding additional biopolymers lo the capsules (Prokul-Ja i' al '¿1121), coating the capsules with an additional layer (l >.-i- • el .J., aoaij MuLarrawi -i u'. 2lXjy), and changing the encapsulation type to reservoir.

The addition of preblotics (fructooligosaccharides (Chen Ch-t. l- a! starch (Sultan • j oL. 204)0), Inulin (Akin aL. 2007;

'.n ku> j >•■. id. ."1! "), etc.) lo the encapsulated bacteria can increase their viabdily during freezing. However, the encapsulation of probiotics has an Impact on the cost of the producL In addition, it is also important to consider possible changes in the organoleptic characteristics of the product ((jur. et id.. 2000).

5.2. Prebiotics

Prebiotics are defined as non-digestible food components that can stimulate the growth and activity of normal intestinal microflora, thus having a positive effect oo host health (01b'jt<n Huberipjid, t'i =;). The addition of prebiotics is a promising technology in probiotic protection. Since the function of prebiotics is often achieved mainly through the addition of probiotic bacterial populations lo the GI tract, the protective effects of prebiotics may be due to synergies in the Interaction between prebiotics and probiotics (synblolics) (In rt aL 2U0'j). Sorting into protective prebiotics is necessary because prebiotics may differ in their ability lo enrich certain groups of probiotic bacleria in a particular area of the stomach (Chen aL, 2017). Akaltn Hid t'rly.r I200M noted that the addition of oligofructose to Lhe ice cream formulation significantly Increased the thermal stability of L. acidophilus La-5 and B. ummulis Bb-12 during freezing. The authors also nole thai oligofructose shows a belter cryoprotective effect compared lo inulin, which is attributed to the positive effect of the latter on the ice cream overrun (increased oxvgenaOon, which reduces the survival of aerophobic bacteria). In addition, oligofructose, having a shorter chain, is easier lo digest for bacleria, thus having a better prebiotic effect. Inulin did not prove lo be a suitable cryoprolcctant when applied at 6.5% and 8.0% (hd i oL 2011).

However, Van a J. 12' 1 reported a positive effect on the survival of L acidophilus and B. lactis when 2% inulin was added lo ice cream, in

Food Шаа'слсс 50 (2022) 101996

addition, the authors analyzed the effect of 15%, 18% and 21% sucrosc concentration in the product on bacterial survival. The best results were obtained with 18% of sucrose and 2% of Inulin.

The introduction of apple, orange, bamboo and oat fiber Into the product slightly reduced the survival of probiotic cultures (Bifidobacterium lactis Bbl2 and Lactobacillus acidophilus) (Akatui et al., 2018). Wheat fiber had no significant effect on probiotics survival, (he reason for the reduced survival rate, when fiber was added, may have also been an increase in product overrun, accompanied by an increase in oxidative stress, lhe prebiotic activity of b-cyclodextrin showed a positive effect on bacterial survival (I la':> ct al 2021).

Viabdily of L. acidophilus La-5 and B. animalis Bb-12 with the addition of oligofructose lo the ice cream was 73.4% and 80.4% respectively, while without oligofructose those numbers were lowered to 67.6% and 75.4% as reported by Л> Jul urn! L'r!>u > 2'" ). Viability of L acidophilus and B. lactis with addition of 2% inulin lo lhe ice cream was 106 cfu g ' and without 105 cfu g 1 as reported by mui. ft id i zwpt. Thus, the effectiveness of prebiotics is significant, though less when compared lo probiotics encapsulation as previously shown in lalili i

5.3. Cryoprotcctants

It Is possible to add cryoprotcctants and lyoprotectants to probiotic cultures before freezing. Cryoprotcctants can increase the viscosity of the solution, preventing icc crystal growth by creating a viscous, glassy mass (btmlthdiarya. 2018; SuntlvtiiungUnu ei al., 2008) as well as stabilizing osmotic pressure (Kcts c\ al.. l J'">). In turn, lyoprotectants stabilize the lipid layer of the cell membrane (1 enjiei al. 2i . 9).

Cryoprotcctants are classified into two groups based on their molecular weight. Low molecular weight cryoprotectants are mainly sugars (glucoee (Сшсю et al.. 2015), sucrose (Chnvam et al., 1088; К mm an i •:t о!.. 2011; biatcrbs л al.. 2<KN), trehalose (Nanrr.ani ■-; di.. 2011;

К ). lactoec (GuiVBirl et й. ЮУ8), mannose {V0d d ii.. 2022), sorbitol (Staterlts ei ii.. 200У), glycerol (Kainnaut u 2('l 1)), betaine(iwi-c n ti al,, 200 S),sodhmglutamte(Forncci m л\.. 200 5). and dimethyl sulfoxide с I, « 2006). The mechanism of

action of low molecular weight cryoprotcctants is explained by the stabilisation of the phospholipid layer of the cell membrane, which protects it from damage (Washvlmcjud с al -020). High molecular weight cryoprotectants mainly include polysaccharides and proteins (c. g.. ma hod ex t rin { ), alginate ( ).

wheal protein ( ), gelatin (l ). xan-

ihan gum (Alvore -i jI : »)) This group of cryoproleclanLs creates a viscous coating on die cell surface, preventing ice crystal growth (L ».-vim H. Alaav 1УИУ; RMllidliititad et aL 2020).

Based on their ability lo penetrate the cell wall, cryoproleclanls can also be classified into penetrating, non-penetrating and partially penetrating (Curvalhu i al.. 2004) (Их 4). Penetrating cryoprotcctants reduce intracellular water content, preventing damaging effccts of highly concentrated solutions, while non-penelrating agents squeeze' water out of cells during the Initial freezing stage (fvkOaiui. IV 7a). Usually, non-penetrating cryoprotectants have a higher molecular weight (generally >1000 Da) and act oulslde lhe cell. Acting inside the cell, penetrating cryoprotectants have an increased toxicity (All i dl 2021). The permeation ability of some agents (e.g., glycerol) depends on temperature and cell type (Hubtdek. 200 J).

lhe number of Lactobacillus delbrueckti subsp. bufcarfcus DSM20081 remained almost unchanged after freezing in the presence of trehalose, which indicates that the trehalose has a good cryoprotective effect on this strain (l> Giuli'i i , ZOOiS), The effect of trehalose is on the one hand explained by the replacement of water molecules, which leads Lo a reduction in the number of crystals; on the other hand, trehalose forms a vitreous substance during freezing, which reduces cell mobibty, preventing their functional conformation. The authors also nole that the presence of trehalose has a greater effect on probiotic viability than sodium alginate Immobilization (: ч1 c-iuln« dl. 2ШБ).

Fond Mmcience SO (2022) 101996

NaU-JMNCirMfeg udiahi*. <ii .rrwni, (V«.^» .iw, patlowjqw*«"*"» fcMlimp«i.« .«M-n^vkll—- —1U>4 «Ok IE « al.....1 l>>Wkltkvtai- uub, Mlwi «llAJtwl

iM.r«l,l.,.(k>n.l<. *■>•» l-Jf^..».

ft**/.

I'xiUl CriMnUn .>licnMMvfur«lc>. inroaoa

■milwr^nr ftiuhi iwm^itf >

Pig. 4. Types of cryoprotcctaocs according to their ability to penetrate cell membrane.

• iiuanuni! ,<r«5 M.. i ) ( 2011 demonstrated that the addition of 4% glycerol to yogurt significantly improves the survival of probiotic cultures after frozen storage. The authors also obtained some data on a significant improvement in survival when oligofruclose at 5% was added to the formulation, with the main protective effect occurring during freezing. -t al t J.'>Ur-. show that Unipectine,M RS 150

cryoprotectant applied at 2.5% increased survival rate of I. easel 1520 by 7% In frozen yogurt. Some ciyoprotectants have a bacterial origin. For example, poly-y-glutamic acid produced by Bacillus bacteria can be used as a cryoprotectant (Bhai >•! uJ. 20 IS). The results of scanning electron microscopy analysis showed that B Ionium cells with 10% poly-y-glutamlc acid solution after freeze drying appear to be encapsulated within a material. This allowed Bivat «1 ;n., 201 suggest a clusterization of cells within a poJy-y-glutamic acid matrix.

5.4. Adaptation

Adaptation of probiotic cells to storage at reduced temperatures has been reported (Baati -i 2/100). Exposing cells to 10 C before the freezing process significantly increases their survival during storage at - 20 C (: i v ii. ). This phenomenon is attributed to a change in the cell membrane composition during cell growth in a modified environment (i.e., cell adaptability) and is traceable to strains of L acidophilus and Pediococcus pentosaceus Cltr. x Dunn, 1997). It is also notable, that the survival rate of bacteria incubated in a medium with reduced pH Is higher (Foster * lall, which Is attributed to an

Increase In protein synthesis and, as a result, Increased thermostability of the cell. -Sui ;,' al. i2l)i 1) studied the synthesis of the cold stress proteins genes (CSP) of Lactobacillus plantarum L67 cells after repeated cold stress. The study showed a significant improvement in the survival of cells previously subjected to repeated cold stress.

5.5. Cryoprotective properties of food ingredients

As stated earlier, the composition of the product has a major Impact on the preservation of probiotics during storage. On tlie other hand, the Ingredients in a food product can also have a protective effect Thus, some food additives used to Impart certain organoleptic or structural properties to the product can protect probiotic bacteria from the effects of negative temperatures and stimulate their growth. For example, some sweeteners such as sugar (. W. -i al. .'t l'CK :i 1 *n & Chen, 2MH.), galactose (Chen Lin. A: Chen. 2fl0<j), trehalose (De oiullo el i! 2005; Ll I and turanose I SI) show

good cryoprotective properties.

Many food stabilizers can have a positive effect on the survival of probiotics during freezing. For example, we have already mentioned the cryoprotective properties of well-known and widely used stabilizers such as xanthan gum. gelatin and alginate. In addition, some stabilizers (pectin, agar and gelatin) have prebiotic properties, providing probiotic microorganisms a substrate for growth.

Plant extracts added to products for various technological purposes can also affect the survival of probiotic bacteria. /Vluuail -i. oi 120211'' showed that 5% apple peel polyphenol extract added In yogurt ice cream resulted in the highest viabdily uf Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis compared to control without extract and lower concentration samples. Although there Is currently little Information on the effect of plant extracts on the viabdity of probiotics in frozen foods, there arc numerous studies of their effect in refrigerated dairy products such as yogurt. These studies demonstrate not only the absence of a negative effect of spices, herbal extracts and essential oils on probiotic cultures, but also an increase in their survivabdity by reducing probiotic oxidative stress (AkU el al. 20! 7; (Jraruilu ul 2.018; llulkun el oL 2022; lllu papalayam m si . 2014; MUuilnovk n j! , 202J; Shchata et al. 2019).

5.6. Higfi Pressure Low Temperature

Pressure shift freezing is also of interest in the preparation of functional products, in particular probiotic enriched products (S .ukuults

u 2014). The metliud imphes subcoollng the product below the cryoscopic temperature al high pressure. When the pressure Is released, ice crystals grow rapidly and the size of crystals depends on the process conditions (temperature and pressure) ("ChelM -i al _'<>.)J). This method can be used to improve the structure of frozen products and Lo minimize the lethality of probiotic cultures (T wil ,.j i J _.';>)-

6. Discussion

Each of the presented hurdle methods has proven to be an effective means to improve the survival of probiotic bacteria In frozen products. Ihe use of encapsulation requires a careful selection of both the encapsulation method and the appropriate material. As shown In i i :■ .. emulsification and extrusion are the most common encapsulation techniques. The combination of encapsulating materials helps lo increase the percentage of microbial survival during freezing up lo 55% (Zeashun el <d., 2020). The Incorporation of cryoprotectants into the product formulation has also been shown lo be an effective means of protecting probiotics, and In some cases, it has proven to be even better than encapsulation (Di* C.iuil.j <-■! a!. 2005). Since some cryoprotectants are used as direct ingredients in food products, it Is possible lo Introduce diem Into them without any significant Implications for the product flavor. Plant extracts would potentially contribute to the survival of probiutics In frozen products, but this topic has not been developed enough yet and requires further research. As for prebiotics, dieir impact appears to be ambiguous. While symbiotic products have a higher potential than using probiotics alone, prebiotics as a single component lo protect probiotic bacteria during freezing are less effective (up lo 5.8%) than the use of barrier faclors such as cryoprotection and encapsulation. Pre-adaptation of microorganisms lo cold stress may also improve the effectiveness of these barrier methods.

Food Bioscience 50 (2022) J01!W6

N. Tmtfcuv ci oL

7. Conclusion

Introduction of probiotics in frozen foods is a current technological challenge. Frozen probiotic foods can significantly expand the range of functional food products and make them available and attracuvc for new groups of consumers. However, there are several issues that complicate manufacturing of such products due to the increased lethality of probiotic bacteria during both freezing and frozen storage. They include oxidation of anaerobic bacteria, mechanical damage due to ice crystal growth, osmotic pressure and protein denaturation induced by cold stress. Adjustment of freezing conditions, application of barrier factors, selection of the most psychrophilic microbial species, and their adaptation are used nowadays to meet those challenges. A combination of the existing probiotic protection techniques is a promising approach. For example, adaptation of probiotic cultures could be followed by their incorporation in microcapsules along with cryoprotectant agents. However, this area still needs further research and optimization, lhe use of Ingredients with antioxidant properties including plant extracts to increase the viability of probiotics when frozen docs not seem lo be fairly understood at present. In addition, in vivo studies are required to confirm the positive effect of hurdle techniques for probiotic protection against low temperature stress on the viabUity of microorganisms in Intestinal conditions. Research in these directions is needed in order lo expand the variety of frozen probiotic products and to a better understanding of technological challenges.

Author statement

Nikita Tyutkov: Conceptualization, Investigation. Writing - Original Draft; An astasia Zhernyakova: Conceptualization, Writing - Original Draft; Artyom Birchenko: Conceptualization; Visualization; Elmira Erainova: Writing - Review &. Editing; Liudmila Nadtochii: Writing -Review & Editing; Denis Baranenko: Writing - Review & Editing, Supervision.

Declaration of competing interest

The authors confirm that they have no conflicts of interest with respect to the work described in this manuscript.

Data availability

Data will be made available on request.

Acknowledgments

This study was supported by the Russian Science Foundation (grant No. 21-16-00124, i, :-. /r*J.ru/fln/|i:' )

References

Afltii'. M It, tl Uufieuu. f 11945) On lilt uifm uf lii-im ,n ImcbU tram liiuil.

lutmatuuiul JvunmJ uf Axm/ MiatitMogy. 2 A2 5 . 26? Al/aat. M.. Saeed, F_ Anhad. M. U.. Nadeem, M. T.. Saeed. M.. & Tuiail, T. (2019). The effect oi encapsulation an tile stability of probiotic bacleria in ice cream and simulated gastrointestinal conditions. Probioucr and Antimicrobial Proteins. JIM), 1348 1354. H|- . ....^M/Hrl? .1 lilt.'".' Mil r-t'r. V Ahmadi. A.. Milanl. E.. Madadlou. A., Muriazavi. S. A. Mokarram, R. R.. ft Salarbashi. D. (2014). Synbiulic yogurt-ice cream produced via in corporation ot microencapsulated Lactobacillus acidophilus (la 5) and froctooligosacdiaride- Journal of Food Science and Technology, 51(8). 1568 1574 AluK.nl I.. KhaJui.it A . IuqumX, M . «luhitl. M. Q . 'mrai, M , ft Hull*.- A A 12020,. Clt=Jl al polyphenol Insra 3ftwc peel esrratl an Uie aurvlvui til pmhUi'i^s in yujjhur» Us jirnt- 'nie-nuBanal Jmnnil r»/ Ami Sdmte a TfedMulngy, 55<ti> 2580 251UL Akalin. A. S.. a Eripr, D. (2)008). Effects ot inulin and oiigofruclcne on the theological characteristics and probiooc culture survival in low-Iat probiotic ice cream. Journal of Food Science. 73(4). Ml B4 Ml 88. ..if.: ¿...u. h' : l!M 17br ■3ft4l-200a0072Ji .

Akalin, A. S., Kestmkax. IL, Dinkri, N.. Unai. G., Ozer. E.. ft Kimk. O. (2018). Enrichment of probiotic ice cream with different dietary fibers: Structural characteristics and

cuiiure viability. Journal of Dairy Science. 101(1), 37 -46. .иг.: . jlgij, . l-f ►<1*201? 13468

Akin. М- В.. Akin. S.. & Китае. Z. (2007). Effects ol inulin and sugar level» un Ute viability ol yogurt and probiotic bacteria and the physical and se usury characteristics in ice creson. Food Chemistry, 104(1). 93-99. i : .i . • 01016« ImaIi rusn,a0««611 ISO Alamprese, C, Foschino, R_. Rossi, M . Pompei, C, & Savani, L. (2002). Survival of ¿¿vtobadttus jahnximii Lai and influence of its addition ш retail-manufactured ice cream produced with dliferent sugar and fat concentrations. International Daily Journal, 12(2 3), 201 208. Ali. P., Fucich. D.. Shah. A. A, Hasan. F.. & Chen. P. (2021). Ciyopreservation oi

cyanobacteria and eukaryaUc microalgae using exu polysaccharide a tract ed hum a glacier bacterium. Microor^imums, 9(2), 395 Jt i . - ^ •I u.. M

uiKiLvryaiiUrat902(n45 Alvare. M. D.. Г-emandez. C. & Cane!. W. (2009). Enhancement i>1 freezing stability in mashed potatoes by the incorporation of lappa-carrageenan and xanthan gum blends Science of Food and AgrKiilnirc. 89(12). 2115 2127. ■n iГ„2.уЖ ЭТЛ2

Annan, N. Т.. Bona. A. D.. & Hansen. L. T. (2006). Encapsulation in algmate-cuated gelatin microspheres imprwes survival of the probiotic BifiAibocieruan adolesce«« 157Q3T during exposure to simulated gastrointestinal conditions. Food Research International. 41(2), 184-193. I utv d.i ;: !ч !• .t • Шла.20и.' . I Oul Arshady, R. (2008). Microcapsules for food. Journal of Microencapsulation. 10(4),

413 435. и I-. i- ... JU. ill»!). . нп-.-Г S2.'

Ash rat. R., ft Shah. N. P. (2014). Immune system stimulalioa by probiotic

microorganisms. Critical Review■% in Food Science and Nutrition. 54(7). 938 956. hope- //itotutg.' 10 1 (WQ 10ЛШ139в.2011 ЬЬа71 AlU. M. V. Xlwahldlan. N , Muitiuavtan. A. M 4 I losselm, II. Ш17.1 A rrvic«v as the •ii«|miJ iA liesOki uur.it.ti «iul >9ii=iUai ulls un vliitiililv mi tH>M>Mttc» к <еттел1№ etllhs. ^wrrrnr Vumuun Л ! jul ieuaii.« <Л1), о 15. Baarien. P.v.. Weib. J. M.. & ЮеегсЬегет. M. (2013). Regulation ol intestinal

homeostasis and immunity »villi probiotic lactobadlli. Trends in Immunology. 34(5),

208 215. ' : . ..... кц JO.IO: t ■ J.1_!UJ J 01 ни:

Baati. L, Fabre-Gea. t, Auriol. D.. & Blanc, P. J. (2000). Study ol the cryotolerance at Lactobacillus acidophilus: Eflect oi culture and (reezing coaditiora on the viabdily and cellular protein levels, /titernoifonal Journal of Food Wcrcbiolagy. 59(3), 241 247. 1Ш,. .U.ur^ HMI»l6 s010e l6O5I0nin03<ii-5 Baiasubr amain an. S. K_. WoUcers. W. F-, & Bischol. X С (2009). Membrane hydraUan currelates to cellubr biophysics during (reeling in mammalian cells. Biochimica et

ШорЬужкаАоа, J78S(5).945 »53. i i •• .....re 1-4. -с. M пю^М':

BaJUingiUi. J 12004). nUklubmJeria und pfiblutlcaclUHi. in 5. Sahiuiter.. A V. Wrighl. ft A. Ojv«i:hiiad I Eil» i, ' jrti.' add rtc-nntj MiayJiiaLiffcai end fan-ttrrut? arerr. lid ed.. |»p. 67 1241, New York. USA Ren«*! „,нЗ E^Mivdcd Umsri lAAAei. rnc. 21КИ. Bamidele. O. P.. & Emmambux. M N. (2021). Encapsulation oi bioaciive compounds by "extrusion" technologies: A review. Crittcal Reviews in Food Science and Nutrition. 61

(18), 3100 3118. , • ......... iO.tCit.0 J'.

Bangar. S. P., Suri. S., Trif. M.. & Oiogul, F. (2022). Organic acids production from lactic acid bacteria: A preservation approach. Food Biataeoce, 46. Hi ц

10.1016/ J.itUf.2022.101615 Banik, A, Haider, S. IL, Ghosh, C.. & Mondal. К. C. (2019). Fungal probiotics: Opportunity, challenge, and prospects. In S. Singh. A. N. Yadav. S. Mistan. & A. Gupta (Ed».). Recent Adwincemenl in white biotechnology through Volume 2: Perspective for value added products and em'ironmena (pp. 101 117). Cham. Switorriand: Springer. ISBN 978 3413025506-0 Jul -iv/10.1007, ЯП j

0»» iAWfr . 3.

Uaranertlui U. Knludwunai'e^ /»,4 ¿Mim, N. К '2013». fcituci ut ccimpmUian аш1 l/rupeiiiej ill UlilOMii-0Ma< o3№ ouunjp an nucruUdrn oi men and msil t/RhlucU. A Ju .MlUuram РШишгыи. .SWmenlunu 13!2i, 14^ 157.