Выявление аминокислотных остатков, определяющих специфичность ферментов семейств альфа-бета гидролаз и пенициллин-связывающих белков, методами биоинформатического анализа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат химических наук Суплатов, Дмитрий Андреевич

• Суплатов, Дмитрий Андреевич
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Суплатов, Дмитрий Андреевич

1. Список сокращений.

2. Введение.

3. Литературный обзор.

3.1 Множественное выравнивание - источник информации о структуре и функции гомологичных ферментов: основы построения и анализа.

3.1.1 Динамическое программирование.

3.1.2 Алгоритм глобального выравнивания Нидлмана-Вунша.

3.1.3 Алгоритм локального выравнивания Смита-Ватермана.

3.1.4 Матрицы аминокислотных замен.

3.1.5 ClustalW и T-coffee — современные алгоритмы создания качественного множественного выравнивания аминокислотных последовательностей белков за разумное время.

3.1.6. Mustang - алгоритм выравнивания трехмерных структур белков.

3.2 Консервативные позиции - поиск общих закономерностей в семействе ферментов методами биоинформатики.

3.2.2 Определение функционально-важных аминокислотных остатков по аминокислотным последовательностям ферментов одного семейства.

3.2.3 Использование структурной информации для определения аминокислотных остатков, участвующих в связывании субстрата и каталитическом механизме.

3.3 Вариабельные аминокислоты, ответственные за функциональное разнообразие в семействе ферментов.

3.3.1 Алгоритмы поиска вариабельных функционально значимых аминокислотных остатков методами биоинформатики.

3.3.2 Использование вариабельных аминокислотных остатков для изучения структурно-функциональных взаимосвязей в ферментах.

3.3.3 Биоинформатический анализ вариабельных позиций для изучения молекулярных механизмов структурно-функциональных взаимосвязей в ферментах.

3.4 Общие сведения о суперсемействе ферментов альфа-бета гидролаз.

3.4.1 Основные структурные и функциональные характеристики суперсемейства ферментов альфа-бета гидролаз.

3.4.2 Многообразие каталитической функции суперсемейства альфа-бета гидролаз

3.4.3 Липазы. Структура и функция липазы Б из Candida Antarctica. Функциональное многообразие липазы Б из Candida Antarctica.

3.4.4 Гидролазы пептидов - семейство карбоксипептидаз.

3.4.5 Семейство оксинитрилаз.

3.5 Общие сведения о семействе D-аминопептидаз.

3.5.1 Субстратная специфичность и катализируемые реакции.

3.5.2 Структура фермента и организация его активного центра.

3.5.3 Исследования методами сайт-направленного мутагенеза.

4. Выводы анализа литературы и постановка задачи.

5. Методы и материалы.

5.1 Методика реконструкции эволюционных родственников фермента по первичным и третичным структурам.

5.2 Подготовка множественного выравнивания.

5.3 Визуализация.

5.4 Молекулярное моделирование пространственных структур ферментов.

5.5 Предсказание функционально важных аминокислотных остатков в структуре ферментов.

5.6 Методика компьютерного скрининга каталитических свойств ферментов.

6. Результаты и обсуждение.

6.1 Поиск СПП - специфических позиций подсемейства - аминокислотных остатков, определяющих функциональное разнообразие внутри семейств ферментов, на основе биоинформатического анализа.

6.1.1 Концепция и структура алгоритма поиска.

6.1.2 Алгоритм определения подсемейств ферментов с потенциально разными свойствами.

6.1.3 Оценка функциональной значимости аминокислотных остатков в структуре фермента.

6.1.4 Расчет статистической достоверности полученных результатов.

6.1.5 Использование алгоритма для определения подсемейств ферментов с разными свойствами.

6.1.6 Метод биоинформатического анализа больших семейств ферментов.

6.2 Биоинформатический анализ ферментов семейства пенициллин-связывающих белков. Изучение роли специфических позиций подсемейства в формировании субстратной специфичности Б-аминопептидазы.

6.2.1 Биоинформатический анализ суперсемейства пенициллин-связывающих белков

6.2.2 Моделирование субстратной специфичности В-аминопептидазы из ОскготоЪаагит аЫгорг к Б-фенилаланинамиду путем изменения СПП.

6.3 Биоинформатический анализ ферментов суперсемейства альфа-бета гидролаз на уровне сравнения структурной организации активных центров.

6.3.1 Биоинформатический анализ ферментов альфа-бета гидролаз с липазной, пептидазной и оксинитрилазной активностями.

6.3.2 Изучение роли специфических позиций подсемейства в проявлении липазной и амидазной активностей в альфа-бета гидролазах.

6.3.3 Изучение роли специфических позиций подсемейства в проявлении эстеразной и оксинитрилазной активностей в альфа-бета гидролазах.

6.3.4 Роль специфических позиций подсемейства в проявлении различных активностей в альфа-бета гидролазах.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Суплатов, Дмитрий Андреевич

8. Основные результаты и выводы

1. Разработан алгоритм поиска специфических позиций в структуре белка (специфических позиций подсемейства) на основе анализа геномной и структурной информации; алгоритм, способный функционировать на всех основных операционных системах, реализован в виде программного кода для ЭВМ и использован в программе для работы в параллельном режиме на суперкомпьютере;

2. Разработан метод биоинформатического анализа больших семейств ферментов на уровне аминокислотных последовательностей, полноразмерных структур и уровне структурной организации активных центров;

3. Проведен биоинформатический анализ удаленных гомологов суперсемейства альфа-бета гидролаз с липазной, амидазной и оксинитрилазной активностями. Определен список статистически достоверных консервативных и специфических позиций;

4. Определены специфические позиции суперсемейства альфа-бета гидролаз, ответственные за дискриминацию липазной и амидазной активностей (Тгр104, Ala225, Aspl34, Glnl57 и Leu278 в липазе Б из Candida antarctica);

5. Определены специфические позиции суперсемейства альфа-бета гидролаз, ответственные за дискриминацию эстеразной и оксинитрилазной активностей (Thrl 1, Hisl4 и Lys236 в оксинитрилазе из Hevea brasiliensis);

6. Проведен биоинформатический анализ ферментов семейства пенициллин-связывающих белков. Определены специфические позиции Trp222, Trpl 14 и 11е220, ответственные за формирование специфичности D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi к ацильной части субстрата;

7. Предложена функциональная классификация специфических позиций подсемейства в суперсемействах альфа-бета гидролаз и пенициллинсвязывающих белках.

8. Благодарности

Автор выражает благодарность сотрудникам компании Novozymes A/S Allan Svendsen и Werner Besenmatter за предоставление результатов экспериментального исследования амидазной активности в предсказанных нами мутантных вариациях липазы Б из Candida antarctica, сотрудникам Технического университета г. Дельфта Jianfeng Jin, Linda Otten и Ulf Hanefeld за предоставление результатов экспериментального исследования эстеразной активности в предсказанных нами мутантных вариациях оксинитрилазы из Manihot esculenta, а также проф. А.А.Миронову и М.С.Гельфанду за плодотворные беседы и обсуждения.

7. Заключение

В процессе эволюции белки развиваются от общего предка путем изменения первичной' структуры — аминокислотных замен, вставок и делеций — и, таким образом, дают начало функциональному многообразию семейств гомологичных ферментов. Позиции в структуре белков обладают разной вариабельностью в ходе естественного отбора — некоторые аминокислоты важны для функции, стабильности или структуры и поэтому связаны особыми ограничениями на изменчивость. Установление связи между структурной организацией белков и их функциональными свойствами представляет одну из фундаментальных проблем современной биохимии.

При выполнении диссертации был разработан метод сравнительного биоинформатического анализа эволюционно удаленных гомологов на уровне наиболее важных с функциональной точки зрения элементов структуры - активных центров, т.е. аминокислотных остатков, формирующих участки связывания субстрата и участвующих в механизме каталитического превращения. Это позволяет изучать ферменты, произошедшие от одного предка в результате эволюции, но претерпевшие значительные функциональные изменения в ходе естественного отбора и, таким образом, позволяет охватить большое разнообразие свойств. Были изучены специфические позиции в структурах белков одного семейства, изменчивость которых в процессе эволюции привела к разнообразию их функциональных характеристик. Был разработан и реализован в виде программного кода для ЭВМ алгоритм поиска специфических позиций на основе анализа геномной и структурной информации. Разработан метод биоинформатического анализа больших семейств ферментов. Предложенный подход был применен для анализа удаленных гомологов суперсемейства альфа-бета гидролаз с липазной, амидазной и оксинитрилазной активностями, а также суперсемейства пенициллин-связывающих белков. Были определены специфические позиции суперсемейства альфа-бета гидролаз, ответственные за дискриминацию липазной и амидазной активностей (Тгр104, А1а225, Aspl34, Glnl57 и Leu278 в липазе Б из Candida antarcticá), а также эстеразной и оксинитрилазной активностей (Thrll, His 14 и Lys236 в оксинитрилазе из Hevea brasiliensis). Определены позиции, ответственные за формирование специфичности D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi к ацильной части субстрата (222W, 114W и 2201).

Результаты анализа позволяют классифицировать аминокислотные остатки в специфических позициях подсемейства по следующим функциональным типам:

1. Непосредственное участие в каталитическом механизме или влияние на кислотно-основные свойства аминокислот, принимающих непосредственное участие в каталитическом механизме. (А1а225 в CALB и гомологи в других ферментах, в том числе Lys236 в оксинитрилазах);

2. Стабилизация переходного состояния или интермедиата (Thr40 и GlnlOó в CALB и гомологи в других ферментах)

3. Участие в связывании субстрата (Gly39 и Тгр104 в CALB и гомологи в других ферментах, а также Тгр222, Тгр114 и 11е220, в D-аминопептидазе из Ochrobactrum anthropi)

4. Структурная роль - образование сети стабилизирующих взаимодействий

Thr40, GlnlOó, Asn79 и Met72 в CALB и гомологи в других ферментах)

Можно также предположить участие СПП в процессах, не относящихся напрямую к катализу - поддержание активной конформации структуры белка за счет образования стабилизирующих взаимодействий, участие во взаимодействии белка с внешними объектами, например мембраной, и т.д.

Программа поиска специфических позиций подсемейств и метод биоинформатического анализа могут быть использованы при изучении эволюции ферментов, особенностей структурной организации их активных центров и механизма действия. Сравнение удаленных гомологов позволяет изучать ферменты различных классов и охватить широкое разнообразие свойств. Информация о специфических позициях подсемейства может быть использована для получения ферментов с заданными свойствами и открывает принципиально новые возможности дизайна биокатализаторов. J

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Суплатов, Дмитрий Андреевич, 2011 год

1. Radzicka A, Wolfenden R // A proficient enzyme // Science, 1995, 267, 90-93

2. Варфоломеев С.Д. // Химическая энзимология // М.: Издательский центр «Академия»,2005, 472 стр.

3. Todd АЕ, Orengo СА, Thornton JM // Evolution of function in protein superfamilies, from a structural perspective // Journal of Molecular Biology, 2001, 307, 1113-1143

4. Nobeli I, Spriggs RV, George RA, Thornton JM // A ligand-centric analysis of the diversity and evolution of protein-ligand relationship in E.coli // Journal of Molecular Biology, 2005, 347,415-436

5. Devos D, Valencia A // A practical limits of function prediction // Proteins, 2000,41, 98-107

6. Gerlt JA, Babbit PC // Divergent evolution of enzymatic function: mechanistically diverse superfamilies and functionally distinct superfamilies //Annu. Rev. Biochem., 2001, 70,209246

7. Sylvestre J, Chautard H, Cedrone F, Delcourt M // Directed evolution of biocatalysts // Org

8. Process Res Dev, 2006, 10, 562-571

9. Dalby PA // Optimising enzyme function by directed evolution // Curr Opin Struct Biol, 2003,13,500-505

10. Turner NJ // Directed evolution of enzymes for applied biocatalysis // Trends Biotech, 2003,21,474-478

11. Glieder A, Farinas ET, Arnold FH // Laboratory evolution of a soluble, self-sufficient, highly active alkane hydroxylase //Nat Biotechnol, 2002, 20, 1135-1139

12. Yoshikuni Y, Ferrin ТЕ, Keasling JD // Designed divergent evolution of enzyme function // Nature, 2006,440,1078-1082

13. Reetz MT, Zonta A, Schimossek K, Liebeton K, Jaeger KE // Creation of enantioselective biocatalysts for organic chemistry by in vitro evolution //Angew Chem Int Edit, 1997,36, 2830-2832

14. May O, Nguyen PT, Arnold FH // Inverting enantioselectivity by directed evolution of hydantoinase for improved production of Lmethionine //Nat Biotechnol, 2000, 18, 317-320

15. Carr R, Alexeeva M, Enright A, Eve TSC, Dawson MJ, Turner NJ // Directed evolution of an amine oxidase possessing both broad substrate specificity and high enantioselectivity // Angew Chemlnt Edit, 2003,42, 4807-4810

16. Merz A, Yee MC, Szadkowski H // Improving thecatalytic activity of a thermophilic enzyme at low temperatures // Biochemistry, 2000, 39, 880-889

17. Miyazaki K, Wintrode PL, Grayling RA, Rubingh DN, Arnold FH// Directed evolution study of temperature adaptation in a psychrophilic enzyme // J Mol Biol, 2000, 297, 1015-1026

18. Cherry JR // Directed evolution of microbial oxidative enzymes // Current Opin Biotech, 2000, 11,250-254

19. Moore JC, Arnold FH // Directed evolution of a para-nitrobenzyl esterase for aqueous-organic solvents // Nat Biotechnol, 1996, 14, 458-467

20. Hao JJ, Berry A// A thermostable variant of fructose bisphosphate aldolase constructed by directed evolution also shows increased stability in organic solvents // Protein Eng Des Sel, 2004, 17, 689-697

21. Chen K, Arnold FH // Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide // Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90, 5618-5622

22. Stemmer WPC // Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling // Nature, 1994, 370, 389-391

23. Zhao H, Giver L, Shao Z, Affholter JA, Arnold FH // Molecular evolution by staggered extension process (StEP) in vitro recombination // Nat Biotechnol, 1998, 16,258-261

24. Coco WM, Levinson WE, Crist MJ // DNA shuffling method for generating highly recombined genes and evolved enzymes // Nat Biotechnol, 2001, 19, 354-359

25. Кормен T, Лейзерсон Ч, Ривест P, Штайн К. // АЛГОРИТМЫ: построение и анализ // Москва-Санкт-Петербург-Киев, 2007, второе издание

26. Needleman SB, Wunsch CD''// A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins // Journal of molecular Biology, 1970,48,443-53

27. Smith T, Waterman M // Identification of Common Molecular Subsequences // Journal of molecular biology, 1980,147,195-197

28. Dayhoff MO, Schwartz RM, Orcutt BC // A model of evolutionary change in proteins // Atlasof protein sequence and structure, 1978, 5 345-352

29. Schwartz RM, DayhoffMO // Matrices for detecting distant relationship // Atlas of protein sequence and structure, 1978, 5 353-358

30. Henikoff S, Henikoff JG // Aminoacid substitution matrices from protein blocks // PNAS, 1992, 89,10915- 10919

31. Henikoff S, Henikoff JG, Pietrokovski S // Blocks+: a non-redundant database of protein alignment blocks from multiple compilations // Bioinformatics, 1999,15, 471-479

32. Henikoff JG , Greene EA, Pietrokovski S, Henikoff S // Increased coverage of protein families with the blocks database servers // Nucleic Acids Research, 2000,28,228-230

33. Henikoff S, Henikoff JG, Alford WJ, Pietrokovsky S // Automated construction and graphical presentation of protein blocks from unaligned sequences // Gene, 1995, 163, 17-26

34. Henikoff S, Henikoff JG // Performance evaluation of amino acid substitution matrices // Proteins, 1993,17,49-61

35. Henikoff S, Henikoff JG // Embedding strategies for effective use of information from multiple sequence alignments // Protein Science, 1997, 6, 698-705

36. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ // ClustalW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting? Position-specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Research, 1994, 22, 4673-4680

37. Notredame C, Higgins DG, Heringa J // T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment // J Mol Biol, 2000,302,1,205-217

38. Dutta S, Zardecki C, Goodsell DS, Berman HM // Promoting a structural view of biology for varied audiences: an overview of RCSB PDB resources and experiences // Journal of Applied Crystallography, 2010,43, 5,1224-1229

39. Koehl P// Protein structure similarities // Curr Opin Struct Biol, 2001, 11, 348 -353

40. Caprara A, Carr R, Istrail S, Lancia G, Walenz B //1001 optimal pdb structure alignments: integer programming methods for finding the maximum contact map overlap // J Comput Biol, 2004, 11,27-52

41. Konagurthu AS,Whisstock JC, Stuckey PJ, Lesk AM // MUSTANG: A Multiple Structural

42. Alignment Algorithm // PROTEINS, 2006,64,559 -574

43. Pazos F, Bang J-W // Computational prediction of functionally important regions in proteins // Current bioinformatics, 2006, 1, 15-23

44. Venter JC, Remington K, Heidelberg JF // Environmental genome shotgun sequence of the Sargasso Sea// Science, 2004, 304, 66-74

45. Sali A // 100 000 protein structures for the biologist // Nature structural biology, 1998, 5, 1029-1032

46. Devos D, Merino E, Pazos F, Valencia A// Multiple sequence alignments information in structure and function prediction // Artificial Intelligence and Heuristic Methods for Bioinformatics, 2002, 83-94

47. Zuckerlandl E, Pauling L // Evolutionary divergence and convergence in proteins // В книге "Evolving genes and proteins", Academic press, NY: 1965, 97-166

48. Villar HO, Kauvar LM // Amino-acid preferences at protein binding sites // FEBS Letters, 1994, 349,125-130

49. Valdar WSJ // Scoring residue conservation // Proteins, 2002, 48, 227-241

50. Shannon CE // A mathematical theory of communication. The Bell System Technical J // 1948, 27, 379^423, 623-656

51. Sander C, Schneider R // Database of homology-derived protein structures and the structural meaning of sequence alignment // Proteins 1991, 9, 56-68

52. Shenkin PS, Erman B, Mastrandrea LD // Information-theoretical entropy as a measure of sequence variability // Proteins, 1991, 11,297-313

53. Taylor WR // The classification of amino acid conservation // J Theor Biol, 1986,119, 205218

54. Zvelibil MJ, Barton GJ, Taylor WR, Sternberg MJ // Prediction of protein secondary structure and active sites using the alignment of homologous sequences // J Mol Biol, 1987, 195, 957961

55. Armon A, Graur D, Ben-Tal N // ConSurf: an algorithmic tool for the identification of functional regions in proteins by surface mapping of phylogenetic information // J Mol Biol, 2001, 307, 447—463

56. Miyata T, Miyazawa S, Yashunaga T // Two types of amino acid substitutions in protein evolution// J Mol Evol, 1979, 12,219-236

57. Altschul SF, Lipman-DM Equal animals //Nature, 1990, 348, 493^194

58. May AC // Optimal classification of protein sequences and selection of representative sets from multiple alignments: application to homologous families and lessons for structural genomics // Protein Eng, 2001, 14, 209-217

59. Pupko T, Bell RE, Mayrose I, Glaser F, Ben-Tal N // Rate4Site: an algorithmic tool for the identification of functional regions in proteins by surface mapping of evolutionary determinants within their homologues // Bioinformatics, 2002, 18, S71-S77

60. Ota M, Kinoshita K, Nishikawa K // Prediction of catalytic residues in enzymes based on known tertiary structure, stability profile, and sequence conservation // J Mol Biol, 2003, 327, 1053-1064

61. Innis CA, Anand AP, Sowdhamini R // Prediction of functional sites in proteins using conserved functional group analysis // J Mol Biol, 2004, 337, 1053-1068

62. Fariselli P, Pazos F, Valencia A, Casadio R // Prediction of protein-protein interaction sites in heterocomplexes with neural networks // Eur J Biochem, 2002,269, 1356-1361

63. Zhou HX, Shan Y // Prediction of protein interaction sites from sequence profile and residue neighbor list // Proteins, 2001,44, 336-343

64. Koike A, Takagi T // Prediction of protein-protein interaction sites using support vector machines // Protein Eng Des Sel, 2004, 17, 165-173

65. Di Gennaro JA, Siew N, Hoffman BT // Enhanced functional annotation of protein sequences via the use of structural descriptors // J Struct Biol, 2001,134, 232-245

66. Wallace AC, Borkakoti N, Thornton JM // TESS: A geometric hashing algorithm for deriving 3D coordinate templates for searching structural databases. Application to enzyme active sites // Protein Sci, 1997, 6, 2308-2323

67. Stark A, Russell RB //Annotation in three dimensions. PINTS: Patterns in Non-homologous Tertiary Structures //Nucl Acids Res, 2003, 31, 3341-3344

68. Orengo CA, Thornton JM // Protein families and their evolution — a structural perspective // Annu. Rev. Biochem., 2005, 74, 867-900

69. Cheng ZQ, McFadden BA// A study of conserved in-loop and out-of-loop glycine residues in the large subunit of ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase by directed mutagenesis // Protein Eng., 1998, 6, 457-465

70. Wajant H, Pfizenmaier K // Identification of Potential Active-site Residues in the Hydroxynitrile Lyase from Manihot esculenta by Site-directed Mutagenesis // The Journal of Biological Chemistry, 1996, 271, 42, 25830-25834

71. Lichtarge O, Bourne HR, Cohen FE // An Evolutionary Trace method defines binding surfaces common to protein families // Journal of Molecular Biology, 1996, 257, 342-358

72. Pazos F, Rausell A, Valencia A // Phylogeny-independent detection of functional residues // Bioinformatics, 2006,22,12,1440-1448

73. Shaw E, Dordick JS // Predicting amino acid residues responsible for enzyme specificity solely from protein sequences // Biotechnology and Bioengineering, 2002, 79, 3, 295-300

74. Capra JA, Singh M // Characterization and prediction of residues determining protein functional specificity // Bioinformatics, 2008,24, 13,1473-1480

75. Mayer KM, McCorkle SR, Shanklin J // Linking enzyme sequence to function using conserved property difference locator to identify and annotate positions likely to control specific functionality // BMC Bioinformatics, 2005, 6, 284-293

76. Hannenhalli SS, Russel RB //Analysis and prediction of functional sub-types from protein sequence alignments // J.Mol.Biol., 2000,303,61-76

77. Chakrabarti S, Bryant SH, Panchenko AR // Functional specificity lies within the properties and evolutionary changes of amino acids // J.MoLBiol., 2007, 373, 801-810

78. Mimy L, Gelfand M // Using orthologous and paralogous proteins to identify specificity-determining residues in bacterial transcription factors // J.Mol.Biol., 2002, 321,7-20

79. Kalinina OV, Mironov AA, Gelfand MS, Rakhmaninova AB //Automated selection of positions determining functional specificity of proteins by comparative analysis of orthologous groups in protein families // Protein Science, 2004, 13,443-456

80. Donald JE, Shakhnovich EI // Predicting specificity-determining residues in two large eukaryotic transcription factor families // Nucleic Acids Research, 2005, 33, 14,4455-4465

81. Lichtarge O, Yamamoto KR, Cohen FE // Identification of functional surfaces of the zinc binding domains of intracellular receptors // J.Mol.Biol., 1997,274, 325-337

82. Kalinina OV, Gelfand MS, Russel RB // Combining specificity determining and conserved residues improves functional site prediction // BMC Bioinformatics, 2009, 10, 174-198

83. Good P // Permutation tests: A practical guide to resampling methods for testing hypotheses // Springer series in statistics, Springer, 2000, New York

84. Vinogradov, DV, Mironov, AA // Siteprob: Yet another algorithm to find regulatory signals in nucleotide sequences // Proceedings 3rd Int. Conf. On Bioinformatics of Genome Regulation and Structure BGRS'2002, 2002, Novosibirsk, Russia, July 1, 28-30

85. Pavelka A, Chovancova E, Damborsky J // HotSpot Wizard: a web server for identification of hot spots in protein engineering // Nucleic acids research, 2009, 37, W376-W383

86. Kretz,KA, Richardson,TH, Gray,KA, Robertson,DE, Tan,X, Short,JM // Gene site saturation mutagenesis: A comprehensive mutagenesis approach // Methods. Enzymol., 2004, 388, 3-11

87. Bosma,T, Damborsky,J, Stucki,G, Janssen,DB // Biodégradation of 1,2,3-trichloropropane through directed evolution and heterologous expression of a haloalkane dehalogenase gene // Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68,3582-3587

88. Broun, P, Shanklin, J, Whittle, E, and Somerville, C // Catalytic plasticity of fatty acid modification enzymes underlying chemical diversity of plant lipids // Science, 1998, 282, 1315-1317

89. Cook PD, Kubiak RL, Toomey DP, Holden HM // Two site-directed mutations are required for the conversion of a sugar dehydratase into an aminotransferase // Biochemistry, 2009, 48, 5246-5253

90. Zhang ZR, Bai M, Wang XY, Zhou JM, Perrett S // "Restoration" of glutathione transferase activity by single-site mutation of the yeast prion protein Ure2 // J Mol Biol, 2008, 384, 641651

91. Xiang, H, Luo, L, Taylor, KL, and Dunaway-Mariano, D // Interchange of catalytic activity within the 2-enoyl-coenzyme A hydratase/isomerase superfamily based on a common active site template // Biochemistry, 1999, 38, 7638-7652

92. Seebeck, FP, Hilvert, D // Conversion of a PLP-dependent racemase into an aldolase by a single active site mutation // J. Am. Chem. Soc., 2003, 125,10158-10159

93. Bakker, M, van Rantwijk, F, Sheldon, R A // Metal substitution in thermolysin: Catalyticproperties of tungstate thermolysin in sulfoxidation with H202 // Can. J. Chem., 2002, 80, 622625.

94. Seelig, B., Szostak, J. W. // Selection and evolution of enzymes from a partially randomized non-catalytic scaffold // Nature, 2007, 448, 828-831

95. Ollis D.L., Cheah E., Cygler M., Dijkstra B., Frolow F., Franken S.M., Harel M., Remington S.J., Silman L, Schräg J., Sussman J.L., Verschueren K.H.G., Goldman A. // The a/b hydrolase fold // Protein Engineering, 1992, 5,197-211

96. Bornscheuer U.T., Kazlauskas R.J. // Hydrolases in organic synthesis, 2nd edition // Willer-VCH, Weinheim, 2005

97. Patel R.N. // Biocatalysis: synthesis of chiral intermediates for drugs // Curr Opin Drug Discov Devel, 2006, 9(6), 741-64.

98. Edited by Bornscheuer U.T. // Enzymes in Lipid Modification // Wiley-VCH, Weinheim, 2000

99. Pleiss J., Scheib H., Schmid R.D. // The his gap motif in microbial lipases: a determinant of stereoselectivity toward triacylglycerols and analogs // Biochimie, 2000, 82, 1043-1052

100. Holmquist M. //Alpha/Beta-hydrolase fold enzymes: structures, functions and mechanisms // Curr Protein Pept Sei, 2000, 1 (2), 209-35

101. Fujii R., Nakagawa Y., Hiratake J., Sogabe A., Sakata K. // Directed evolution of Pseudomonas aeruginosa lipase for improved amide-hydrolyzing activity // Protein Eng Des Sei, 2005, 18(2), 93-101

102. Henke E., Bornscheuer U.T. // Fluorophoric assay for the high-throughput determination of amidase activity //Anal Chem, 2003, 75(2), 255-60

103. Reetz M.T., Carballeira J.D., Vogel A. // Iterative saturation mutagenesis on the basis of B factors as a strategy for increasing protein thermostability // Angew Chem Int Ed Engl, 2006, 45(46), 7745-51

104. Bartsch S., Kourist R., Bornscheuer U.T. // Complete inversion of enantioselectivity towards acetylated tertiary alcohols by a double mutant of a Bacillus subtilis esterase //Angew Chem Int Ed Engl, 2008,47(8), 1508-11

105. Ivancic M., Valinger G., Gruber K., Schwab H. // Inverting enantioselectivity of Burkholderia gladioli esterase EstB by directed and designed evolution // J Biotechnol. 2007, 29(1), 109-22

106. Koga Y., Kato K., Nakano H., Yamane T. // Inverting enantioselectivity of Burkholderia cepacia KWI-56 lipase by combinatorial mutation and high-throughput screening using single-molecule PCR and in vitro expression IIJ Mol Biol, 2003, 331(3), 585-92

107. Jochens H., Stiba K., Savile C., Fujii R., Yu J.G., Gerassenkov T., Kazlauskas R.J., Bornscheuer U.T. // Converting an esterase into an epoxide hydrolase // Angew Chem Int Ed Engl, 2009,48(19), 3532-5

108. Yin D.L., Bernhardt P., Morley K.L., Jiang Y., Cheeseman J.D., Purpero V., Schrag J.D., Kazlauskas R.J. // Switching catalysis from hydrolysis to perhydrolysis in Pseudomonas fluorescens esterase // Biochemistry, 2010,49(9), 1931-42

109. Kazlauskas R.J., Bornscheuer U.T. // Finding better protein engineering strategies // Nat Chem Biol, 2009, 5(8), 526-9

110. Blow D.M., Birktoft J. J., Hartley B.S. // Role of a buried acid group in the mechanism of action of chymotrypsin// Nature, 1969, 221, 337-339

111. Wright C.S., Alden R.A., Kraut J. // Structure of subtilisin BPN' at 2.5 angstrom resolution // Nature, 1969,221,235-242

112. Heikinheimo P., Goldman A., Jeffries C., Ollis D.L. // Of barn owls and bankers: a lush variety of alpha/beta hydrolases // Structure, 1999, 7, 141-146

113. Hotelier T, Renault L, Cousin X, Negre V, Marchot P, Chatonnet A // ESTHER, the database of the alpha/beta-hydrolase fold superfamily of proteins // Nucleic Acids Research, 2004, 32, D145-7

114. Rogalska E., Cudrey C., Ferrato F., Verger R. // Stereoselective hydrolysis of triglycerides by animal and microbial lipases // Chirality, 1993,5, 24-30

115. Schmid R.D., Verger R. // Lipases: Interfacial Enzymes with Attractive Applications II Angew. Chem. Int. Ed., 1998,37,12, 1608-1633

116. Rubin B., Dennis E.A. // Lipases Part B: Enzyme Characterization and Utilization // Methods in Enzymology, 1997, 286, 1-563

117. Rubin B., Dennis E.A. // Lipases, Part A: Biotechnology // Methods in Enzymology, 1997, 284, 1-408

118. Sh0nheyder F., Volqvartz K. // On the Affinity of Pig Pancreas Lipase for Tricaproin in Heterogeneous Solution//Acta Physiol. Scand., 1945, 9, 1, 57-67

119. Sarda L., Desnuelle P. //Actions of pancreatic lipase on esters in emulsions // Biochim. Biophys. Acta, 1958, 30, 513-521

120. Derewenda U., Brzozowski A.M., Lawson D.M., Derewenda Z.S. // Catalysis at the interface: the anatomy of a conformational change in a triglyceride lipase // Biochemistry, 1992,31,1532-1541

121. Holmquist M., Clausen I.G., Patkar S., Svendsen A., Hult K. // Probing a functional role of Glu87 and Trp89 in the lid of Humicola lanuginosa lipase through transesterification reactions in organic solvent // J. Protein Chem., 1995,14,217-224

122. Uppenberg J., Hansen M.T., Patkar S., Jones T.A. // The sequence, crystal structure determination and refinement of two crystal forms of lipase B from Candida Antarctica // Current Biology, 1994, 2, 293-398

123. Frykman«H., Ohmer N., Norin T., Hult K. // S-ethyl thiooctanoate as acyl donor in lipase catalysed resolution of secondary alcohols // Tetrahedron let., 1993, 34, 1367-1370

124. Adelhorst K., Bjorkling F., Godtfrcdscn S., Kirk 0. // Enzyme catalyzed preparation of 6-0*acylglucopyranosides // Synthesis, 1990,2, 112-115

125. Kim J., Copley S.D. // Why methabolic enzymes are essential or nonessential for growth of Escherichia coli on glucose // Biochemistry, 2007, 46, 12501-12511

126. Babtie A., Tokuriki N., Hollfelder F. // What makes an enzyme promiscuous? // Current Opinion in Chemical Biology, 2010, 14, 200-207

127. Torre O., Alfonso I., Gotor V. //Lipase catalysed Michael addition of secondary amines to acrylonitrile // Chem. Commun., 2004, 1724-1725

128. Svedendahl M., Hult K., Berlung P. // Fast carbon-carbon bond formation by a promiscuous lipase // J. Am. Chem. Soc., 2005, 127,17988-17989

129. Endrizzi J. A., Breddam K., Remington S.J. // 2.8-A structure of yeast serine carboxypeptidase // Biochemistry, 1994, 33, 11106-11120

130. Shilton B., Thomas D.Y., Cygler M. // Crystal structure of Kexldeltap, a prohormonev processing carboxypeptidase from Saccharomyces cerevisiae // Biochemistry, 1997,36, 90029012

131. Rudenko G., Bonten E., d'Azzo A., Hoi W.G.J. // Three-dimensional structure of the human 'protective protein': structure of the precursor form suggests a complex activation mechanism // Structure, 1995,3, 1249-1259

132. Stennicke H.R., Mortensen U.H., Breddam K. // Studies on the hydrolytic properties of (serine) carboxypeptidase Y// Biochemistry, 1996, 35, 7131-7141

133. Jung G., Ueno H., Hayashi R. // Proton-relay system of carboxypeptidase Y as a solecatalytic site: studies on mutagenic replacement of his 397 // J. Biochem., 1998, 124,446-450

134. Breddam K., Soren S.B., Svendsen I. // Determination of C-terminal sequences by digestion with serine carboxypeptidases: the influence of enzyme specificity // Carlsberg Research Communications, 1987, 52, 297-311

135. Bullock T.L., Branchaud В., Remington S.J. // Structure of the complex of L-benzylsuccinate with Wheat Serine carboxypeptidase II at 2.0-A resolution // Biochemistry, 1994,33, 11127-11134

136. Byers L.D., Wolfenden R. // A potent reversible inhibitor of carboxypeptidase A // J Biol Chem, 1972, 247,2,606-608

137. Knowles J.R. // Enzyme catalysis: not different, just better // Nature, 1991, 350, 6314, 121124

138. Johnson F. A., Lewis S.D., Shafer J. A. // Perturbations in the free energy and enthalpy of ionization of histidine-159 at the active site of papain as determined by fluorescence spectroscopy // Biochemistry, 1981, 20, 1, 52-58

139. Hickel A, Hasslacher M, Griengl H. // Hydroxynitrile lyases: Functions and Properties //

140. Physiol Plant, 1996, 98, 891-898i

141. Kruse CG. // Chiral cyanhydrins—Their manufacture and utility as chiralbuilding blocks //

142. В книге Collins AN, Sheldrake GN, Crosby J, eds. Chirality in industry, 1992, London, John Wiley and Sons Ltd

143. Klempier N, Griengl H, Hayn M. // Aliphatic (S)-cyanhydrins by enzyme catalysed synthesis // Tetrahedron Lett, 1993, 34, 4769-4772

144. Johnson DV, Griengl H. // Biocatalytic applications of hydroxynitrile lyases //Adv Biochem Eng Biotechnol, 1999, 63, 31-55

145. EfFenberger F. // Synthesis and reactions of optically-active cyanohydrins //Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1994, 33, 1555-1564

146. Kuroki GW; Conn EE. // Mandelonitrile lyase from Ximenia americana L.: Stereospecificity • and lack of flavin prosthetic group // Proc Natl Acad Sci, 1989, 86, 6978-6981

147. Xu L-L, Singh BK, Conn EE. // Purification and characterization of acetone cyanhydrin lyase from Linum usitatissimum II Arch Biochem Biophys, 1988, 263, 256-263

148. Hughes J, Carvalho FJPDC, Hughes MA// Purification, characterization, and cloning о a-hydroxynitrile lyase from cassava (Manihot esculenta Crantz) // Arch Biochem Biophys, 1994,311,496-502

149. Wajant H, Mundry KWII Hydroxynitrile lyase from Sorghum bicolor: A glycoprotein heterotetramer//Plant Science, 1993, 89, 127-133

150. Wagner UG, Hasslacher M, Griengl H, Schwab H, Kratky С // Mechanism of cyanogenesis: The crystal structure of hydroxynitrile lyase from Hevea brasiliensis // Structure, 1996, 4, 811-822

151. Hasslacher M, Kratky C, Griengl H, Schwab H, Kohlwein SD // Hydroxynitrile lyase from Hevea brasiliensis: Molecular characterization and mechanism of enzyme catalysis // Proteins Struct Funct Genet, 1997,27,438-449

152. Wharton CW. // The serine proteinases // В книге Sinnott M, ed. Comprehensive biological catalysis, 1998, London, Academic Press

153. Zuegg J, Gruber K, Gugganig M, Wagner UG, Kratky C. // Three-dimensional structures of enzyme-substrate complexes of the hydroxynitrile lyase from Hevea brasiliensis // Protein Science, 1999, 8, 10,1990-2000

154. Asano Y, Nakazawa A, Kato Y, Kondo К // Properties of a novel D-stereospecific aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi // J Biol Chem, 1989,264,24,14233-14239

155. Kato Y, Asano Y, Nakazawa A, Kondo К // Synthesis of D-Alanine Oligopeptides

156. Catalyzed by D-Aminopeptidase in Non-Aqueous Media // Biocat. Biotrans, 1990,3,3 ,207-215156

157. Asano Y, Kato Y, Yamada A, Kondo K. // Structural similarity of D-aminopeptidase to carboxypeptidase DD and beta-lactamases // Biochemistry, 1992, 31,8, 2316-28

158. Okazaki S, Suzuki A, Komeda H, Asano Y, Yamane T // Deduced catalytic mechanism of D-amino acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3 // J Synchrotron Radiat, 2008, 15, 3, 250-253

159. Massova I, Kollman PA // pKa, MM, and QM studies of mechanisms of beta-lactamases andpenicillin-binding proteins: acylation step // J Comput Chem, 2002, 23, 16, 1559-1576

160. Ke YY, Lin TH // A theoretical study on the activation of Ser70 in the acylation mechanism of cephalosporin antibiotics // Biophys Chem, 2005, 114, 2-3, 103-113

161. Khaliullin I.G., Suplatov D.A., Shalaeva D.N., Otsuka M., Asano Y., Svedas V.K. // Bioinformatic Analysis, Molecular Modeling of Role of Lys65 Residue in Catalytic Triad of D-aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi // Acta Naturae, 5, 66-70

162. Doerr A. // Unnatural design //Nature methods, 2010, 7, 671

163. Wolfenden R., Snider M.J. // The depth of chemical time and the power of enzymes as catalysis //Acc. Chem. Res., 2001, 34, 938-945

164. Zuckerkandl E., Pauling L. // Molecules as documents of evolutionary history // J. Theoret.1571. Biol., 1965, 8,357-366

165. Varfolomeev S.Dl, Gurevich K.G. // Enzyme active sites: bioinformatics, architecture, and? mechanisms of:action // Russian chemical-bulletin; 2001, 50, 10; 1709-1717

166. Altschul S., Madden T., Schaffer A;, Zhang Ji, Zhang Z., Miller W., Lipman D. // Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Research, 1997, 25, 3389-3402

167. The UniProt Consortium // Ongoing and future developments at the Universal Protein Resource // Nucleic Acids Res., 39, D214-D219,2011

168. Lee M.M., Chan M., Bundschuh R. // Simple is beautiful: a straightforward approach to improve the delineation of true and false positives in PSI-BLAST searches //Bioinformatics, 2008, 24 1339-1343

169. Soding J., Biegert A., Lupas A.N. // The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction //Nucleic Acids Research, 2005, 33, W244-W248

170. The PyMOL Molecular Graphics System, Version l.Orl, Schrodinger, LLC

171. Waterhouse A., Procter J., Martin D., Clamp-M;, Barton G. // Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench // Bioinformatics, 2009, 25, 1189-1191

172. Sali A., Blundell T.L. // Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints // J. Mol. Biol., 1993,234j 779-815

173. Rodriguez R, Chinea G, Lopez N, Pons T, Vriend G // Homology modeling, model and software evaluation: three relatedresources // CABIOS, 1998, 14, 523-528

174. Laskowski R A, MacArthur M W, Moss D S & Thornton J M // PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures // J. Appl. Cryst., 1993,26,283-291

175. Dolinsky TJ, Czodrowski P, Li H, Nielsen JE, Jensen JH, Klebe G, Baker NA. // PDB2PQR: Expanding and upgrading automated preparation of biomolecular structures for molecular simulations // Nucleic Acids Res, 35, W522-5, 2007

176. Li H, Robertson AD, Jensen JH // Very Fast Empirical Prediction and Interpretation of Protein pKa Values // Proteins, 2005, 61, 704-721

177. Hunter AD //ACD/ChemSketch 1.0 (freeware); ACD/ChemSketch 2.0 and its Tautomers, Dictionary, and 3D Plug-ins; ACD/HNMR 2.0; ACD/CNMR 2.0 // J. Chem. Educ., 1997, 748., 905

178. Stewart JJP // MOPAC2009, Stewart Computational Chemistry, Colorado Springs, CO, USA, http://OpenMOPAC.net (2008)

179. Huey R, Morris GM, Olson AJ, Goodsell DS // A Semiempirical Free Energy Force Field with Charge-Based Desolvation//J. Computational Chemistry, 2007, 28, 1145-1152'

180. Valdar W.S .J., Thornton J.M.: Protein-protein interfaces: analysis of amino acid conservation in homodimes . Proteins, 2001, 42:108-124

181. Vingron M., Argos P.: A fast and sensitive multiple sequence alignment algorithm. Comput.Appl.Biosci., 1989, 5:115-121

182. Eckstein F, Romaniuk PJ, Heideman W, Storm DR.: Stereochemistry of the mammalian adenylate cyclase reaction. J Biol Chem., 1981,256(17):9118-9120

183. Gerlt JA, Coderre JA, Wolin MS.: Mechanism of the adenylate cyclase reaction. Stereochemistry of the reaction catalyzed by the enzyme from Brevibacterium liquefaciens. J Biol Chem., 1980,2552:331-334

184. Tucker C.L., Hurley J.H., Miller T.R., Hurley J.B.: Two amino acid substitutions convert a guanylyl cyclase, RetGC-1, into an adenylyl cyclase. Prot.Natl.Acad.Sci. USA, 1998, 59935997

185. Lauble H, Miehlich B, Förster S, Wajant H, Effenberger F.: Crystal structure of hydroxynitrile lyase from Sorghum bicolor in complex with the inhibitor benzoic acid: a novel cyanogenic enzyme. Biochemistry, 2002, 41(40):12043-12050

186. Boersma YL, Pijning T, Bosma MS, van der Sloot AM, Godinho LF, Dröge MJ, Winter RT, van Pouderoyen G, Dijkstra BW, Quax WJ.: Loop grafting of Bacillus subtilis lipase A: inversion of enantioselectivity. Chem.Biol., 2008,15(8):782-789

187. Morley K., Kazlauskas R.J. // Improve enzyme properties: when are closer mutations better //TRENDS in Biotechnology, 2005,23(5):231-237

188. Pearl FM, Bennett CF, Bray JE, Harrison AP, Martin N, Shepherd A, Sillitoe I, Thornton J, Orengo CA// The CATH database: an extended protein family resource for structural and functional genomics //Nucleic Acids Research, 2003, 31,452-455

189. Koonin E., Galperin M. // Sequence-Evolution-Function // Kluwer Academic Publishers,2003

190. Porter C.T., Bartlett G.J., Thornton J.M. // The Catalytic Site Atlas: a resource of catalytic sites and residues identified in enzymes using structural data // Nucl. Acids. Res., 2004, 32, D129-D133.

191. Dundas J., Ouyang Z., Tseng J., Binkowski A., Turpaz Y., Liang J. // CASTp: computed atas of surface topography of proteins with structural and topographical mapping of functionally annotated residues // Nucl. Acids Res., 2006, 34, W116-W118

192. Winkler FK, D'Arcy A, Hunziker W. // Structure of human pancreatic lipase // Nature, 1990, 343, 6260, 771-4

193. Jaeger KE, Liebeton K, Zonta A, Schimossek K, Reetz MT // Biotechnological application of Pseudomonas aeruginosa lipase: efficient kinetic resolution of amines and alcochols // Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996, 46, 99-105

194. Zerner B., Bond R. P. M., Bender M. L. // Kinetic evidence for the formation of acyl-enzyme intermediates in the a,-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis of specific substrates // J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 3674

195. Bonneau PR, Graycar TP, Estell DA, Jones JB // Alteration of the specificity of subtilisin BPN'by site-directed mutagenesis in its SI and Sl'binding sites // J. Am. Chem.

196. Soc., 1991, 113, 1026-1030

197. Pleiss J, Fischer M, Peiker M, Thiele C, Schmid RD // Lipase engineering database Understanding and exploiting sequence-structure-function relationships // J. Mol. Catal. B-Enzym., 2000, 10,491-508

198. Lauble H, Miehlich B, Förster S, Kobler C, Wajant H, Effenberger F. // Structure determinants of substrate specificity of hydroxynitrile lyase from Manihot esculenta // Protein Sei, 2002,11,1,65-71

199. Lauble H, Miehlich B, Förster S, Wajant H, Effenberger F // Mechanistic aspects of cyanogenesis from active-site mutant Ser80Ala of hydroxynitrile lyase from Manihot esculenta in complex with acetone cyanohydrins // Protein Sei, 2001,10, 5,1015-22.

200. Padhi S.K., Fujii R., Legatt G.A., Fossum S.L., Berchtold R., Kazlauskas R.J. // Switching from an esterase to a hydroxynitrile lyase mechanism requires only two amino acid substitutions // Chemistry & Biology, 2010, August 27, 17, 863-871

201. Hedstrom L. // Serine protease mechanism and specificity // Chem Rev, 2002, 102, 12, 4501-24.

202. Wang Q, Yang G, Liu Y, Feng Y. // Discrimination of esterase and peptidase activities of acylaminoacyl peptidase from hyperthermophilic Aeropyrum pernix K1 by a single mutation // J Biol Chem, 2006, 281,27, 18618-25

203. Fersht A.R. //Acyl-transfer reactions of amides and esters with alcohols and thiols. Reference system for the serine and cysteine proteinases. Nitrogen protonation of amides and amide-imidate equilibriums //J Am Chem Soc, 1971, 93, 14, 3504-15

204. Bott RR, Chan G, Domingo B, Ganshaw G, Hsia CY, Knapp M, Murray CJ. // Do enzymes change the nature of transition states? Mapping the transition state for general acid-base catalysis of a serine protease // Biochemistry, 2003,42, 36,10545-53

205. Liao D.-I., Breddam K., Sweet R.M., Bullock T., Remington S.J. // Refined atomic model of Wheat serine carboxypeptidase II at 2.2-A resolution // Biochemistry, 1992, 31, 9796-9812

206. Breddam K. // Chemically modified carboxypeptidase Y with increased amidase activity // Carlsberg Res Commun, 1984,49, 535-554

207. Argiriadi MA, Morisseau C, Goodrow MH, Dowdy DL, Hammock BD, Christianson DW // Binding of alkylurea inhibitors to epoxide hydrolase implicates active site tyrosines in substrate activation // J Biol Chem, 2000, 275, 20, 15265-70