Разработка и использование флуоресцентных ДНК-зондов для лигазной цепной реакции в режиме реального времени тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Малеев, Григорий Владимирович

• Малеев, Григорий Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Малеев, Григорий Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Лигазная цепная реакция и методы 8 флуоресцентной детекции нуклеиновых кислот

1.1. Лигазная цепная реакция для детекции нуклеиновых кислот

1.1.1. Теоретические основы метода ЛЦР

1.1.2. Практическое применение ЛЦР

1.1.3. Проблемы метода ЛЦР в сравнении с методом ПЦР

1.2. Флуоресцентные методы детекции нуклеиновых кислот

1.2.1. Флуоресцентные методы детекции. Базовые сведения

1.2.2. Методы прямого проявления

1.2.3. Системы детекции, основанные на резонансном переносе 38 энергии флуоресценции

Глава 2. Разработка систем детекции продуктов ЛЦР на основе 47 флуоресцентно меченых олигонуклеотидных зондов

2.1 Олигонуклеотидные зонды на основе полициклических 48 ароматических угледоводородов

2.1.1. Пиреновый бифлуорофор с эксимерной флуоресценцией

2.1.2. Зонды на основе псевдонуклеозидного пиренсодержащего 52 флуорофора

2.1.3. FRET-системы при внедрении пирена и перилена в 59 комплементарные олигонуклеотиды

2.2. Олигонуклеотидные зонды на основе флуоресцеиновых и 64 родаминовых красителей

Глава 3. Новые методы детекции;ДНК и РНК при помощи ЛЦР в режиме, 65 реального времени

3.1. ПЦР и ЛЦР в режиме реального времени: особенности и сферы 65 использования

3.2. Лигазная цепная реакция в режиме реального1 времени:, основные 67 принципы . •

3.3. ЛЦР-РВ, основанная! на- детекции» двуцепочечной ДНК при 71 помощи красителя SYBR Green I.

3.4. Схема детекции продуктов ЛЦР, основанная на эффекте 74 эксимерной флуоресценции

3.5. Схема детекции продуктов ЛЦР, основанная на эффекте 77 изменения анизотропии флуоресценции

3.6. Схемы детекции продуктов ЛЦР, основанные на эффекте 81 резонансного переноса энергии флуоресценции

3.6.1. FRET между полициклическими ароматическими 81 флуорофорами

3.6.2. ЛЦР-РВ, основанная на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции между красителями FAM и ROX

3.7. Оптимизация условий ЛЦР-РВ

3.8. Детекция молекул РНК при помощи ЛЦР-РВ

3.9. Использование разработанных вариантов ЛЦР-РВ в 90 молекулярно-генетических исследованиях

Глава 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1 Реактивы и материалы

4.2. Экспериментальные методы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и использование флуоресцентных ДНК-зондов для лигазной цепной реакции в режиме реального времени»

Решение проблемы эффективной диагностики различных заболеваний относится к числу приоритетных задач мирового и отечественного здравоохранения. В настоящее время системы здравоохранения России и других стран испытывают насущную потребность в развитии и широком использовании систем диагностики, сочетающих высокую эффективность измерений, точность, универсальность, простоту проведения анализа, дешевизну. Приоритетные области применения подобных систем — это диагностика широкого ряда инфекционных заболеваний, по-прежнему являющихся «убийцами номер один» в мире.

Лигазная цепная реакция (ЛЦР) является одним из перспективных методов клинической диагностики, интенсивно развиваемым на практике в последние полтора десятилетия. По своей чувствительности и точности анализа ЛЦР во многих случаях продемонстрировала свое превосходство не только над классическими методами микробиологического анализа, такими как выращивание культур клеток, иммунохимический анализ, но также и над современными вариантами ПЦР-диагностики (ПЦР - полимеразная цепная реакция).

Целью работы является разработка методов синтеза новых флуоресцентных олигонуклеотидных зоднов для ЛЦР и разработка на их основе, новых методов детекции ДНК и РНК при помощи ЛЦР в режиме реального времени. В задачи исследования входило:

1. Разработать новый вариант ЛЦР-РВ, основанный на детекции результатов за счет свечения специфичного к двуцепочечной ДНК красителя SYBR Green I: 2. Разработать новые олигонуклеотидные зонды, на базе полициклических ароматических • флуорофоров пирена и перилена, чувствительных к молекулярному микроокружению и основанных на эффектах эксимерной флуоресценции и изменения анизотропии флуоресценции.

3. Разработать новые схемы детекции продуктов ЛЦР-РВ, основанные на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

4. Оптимизировать условия проведения новых разработанных вариантов ЛЦР-РВ в отношении количества реагентов, состава реакционных смесей, времени и температуры реакций, используемых ферментов.

5. Испытать новые варианты ЛЦР-РВ для решения ряда актуальных практических задач в области молекулярной биологии.

Научная новизна работы заключается в следующем: Разработан дизайн и проведён синтез новых флуоресцентных олигонуклеотидных зондов для ЛЦР. Разработаны новые методы детекции ДНК и РНК при помощи ЛЦР-РВ. Показана возможность эффективной детекции следовых количеств ДНК и РНК с использованием новых методов флуоресцентной детекции в растворе. Предложены оптимальные системы детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени, которые далее применены для решения практически важных задач в молекулярно-биологических исследованиях и при анализе продуктов с генетически-модифицированными компонентами.

В результате проведенных исследований показана возможность эффективной детекции следовых количеств ДНК и РНК с использованием новых методов флуорецсентной детекции в растворе. Всего синтезировано более 20 различных олигонуклеотидных зондов для ЛЦР. Были обнаружены оптимальные системы детекции, которые были применены для решения практически важных задач в сфере детекции специфичных фрагментов ДНК в молекулярно-генетических исследованиях и при анализе продуктов с генетически-модифицированными компонентами. Результаты настоящего исследования могут быть использованы при проведении ДНК-диагностики в медицине, ветеринарии, санитарно-эпидемиологических исследованиях, криминалистике, пищевой промышленности для обнаружения возбудителей опасных инфекций, генетической идентификации личности, выявления продуктов питания из генетически модифицированных организмов, определения качества сырья и т.д.

По материалам данной диссертации опубликовано 5 научных статьей (в том числе в журналах из перечня ВАК — 4), 3 заявки на патент (одна международная и две российских) и 8 тезисов докладов научных конференций. Результаты работы были доложены на научной сессии к 100-летию со дня рождения проф. Н.А. Преображенского (Москва, 21-22 октября 1996), Российском съезде медицинских генетиков (Курск, 17-19 мая 2000 г.), конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоёмким технологиям» (Пущино, 24-26 октября 2001), третьем съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (Москва. 6-12 июня 2004), втором съезде Общества биотехнологов России (Москва 2004), третьем съезде Общества биотехнологов России (Москва 2005), международном конгрессе «Тенденции в химии нуклеиновых кислот» (Москва, 20-26 ноября 2000), международном симпозиуме «Трансгенные растения и проблемы биобезопасности» (Москва 2004), 2-ой международной конференции "Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда" (Пущино, 10-13 мая 2005).

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Малеев, Григорий Владимирович

выводы

1. Разработан новый вариант ЛЦР-РВ, основанный на детекции результатов за счет свечения специфичного к дц-ДНК красителя SYBR Green I, регистрируемого при температуре, при которой одиночные дуплексы, образующиеся в каждом цикле, плавятся, а двойной, представляющий собой целевой продукт - еще нет.

2. Разработан новый, специфичный, чувствительный и универсальный вариант ЛЦР-РВ, основанный на регистрации сигнала присоединенного к одному олигонуклеотиду красителя-акцептора родаминового ряда после безызлучательного переноса на него резонансной энергии красителя-донора флуоресцеинового ряда, причём указанные флуорофоры входят в состав разных олигонуклеотидных праймеров, которые в результате лигирования термостабильной ДНК лигазой становятся единой молекулой.

3. Разработаны новые олигонуклеотидные зонды на основе псевдонуклеозидного пиренсодержащего флуорофора, которые при гибридизации с комплементарной последовательностью способны проявлять эксимерную флуоресценцию при 460-470 нм, существенно отличающуюся от обычной мономерной флуоресценции пиренового флуорофора. С использованием подобных зондов реализована новая схема детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени.

4. Показана реализуемость новых перспективных принципов детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени, основанных на эффектах поляризации флуоресценции. Продемонстрирована возможность реализации новой схемы детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени по изменению анизотропии флуоресценции в амплификате, служащей мерой поляризованности флуоресцентной эмиссии.

5. Разработаны принципиально новые схемы FRET-анализа с использованием полициклических ароматических флуорофоров, пригодные для детекции продуктов ЛЦР в режиме реального времени.

103

6. Оптимизированы условия проведения новых вариантов ЛЦР-РВ в отношении количества реагентов, состава реакционных смесей, времени и температуры реакций, используемых ферментов.

7. Показано, что разработанные варианты ЛЦР-РВ могут быть успешно использованы для решения ряда практических задач в области молекулярной биологии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная вниманию глубокоуважаемой читательской аудитории работа выполнялась в течение последних 10-12 лет в нескольких крупных отечественных научных центрах. Эта работа развивалась и прогрессировала от попыток получения новых флуоресцентных меток, чувствительных к молекулярному микроокружению; переходила затем к современным методам гибридизационного анализа нуклеотидных последовательностей; финальные ее аккорды связаны с применением полученных результатов для создания действенного инструмента высокоэффективной РНК- и ДНК-диагностики на базе лигазной цепной реакции. Главной целью диссертации, какой она видится в настоящее время ее автору, является попытка «синтеза» в широком смысле, как в теоретическом, так и прикладном аспекте, нескольких современных научных дисциплин на стыке молекулярной биологии, молекулярной генетики и биоорганической химии. Главным ее результатом, отраженным в трудах российских и международных конференций, журнальных публикациях, обзорах и патентах, является создание динамичной исследовательской платформы, включающей как развитые медико-диагностические методики, так и передовые идеи на стадии первичных исследований.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю признательность всем своим коллегам, принявшим активное участие в планировании исследований, на разных экспериментальных этапах и в теоретическом обсуждении результатов.

Автор благодарен всем своим руководителям, при непосредственном содействии которых выполнялась работа: значительная часть работ была проведена в ИБХ РАН, в лаборатории генетической инженерии нуклеиновых кислот под руководством Проф. Ю.А. Берлина и к.х.н. В.А. Коршуна; далее ее продолжение связано с непосредственным участием в исследованиях под руководством Проф. Р.Ш. Бибилашвили (Институт экспериментальной

101 кардиологии РКНПК МЗ РФ); Ю.Г.Средина («Биоссет»), Акад. A.JI. Гинцбурга (Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).

Автор благодарен научному консультанту Проф. А.В. Чемерису (Институт биохимии и генетики УНЦ РАН) за многолетнее научное сотрудничество и жизненный оптимизм.

Автор бесконечно благодарен научному руководителю настоящей работы - д.х.н. К.В.Балакину (в настоящее время - ИФАВ РАН) за непосредственное руководство представленной научной тематикой, начиная от курсовой работы (1995 год) до настоящей кандидатской диссертации, а также за многолетнее научное и практическое сотрудничество.

Автор признателен коллективу ИБГ УНЦ РАН; коллективу лаборатории научно-информационных технологий в медицинской химии ИФАВ РАН; коллективу лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН; коллективу лаборатории химии нуклеиновых кислот ИБХ РАН за помощь в работе.

Автор благодарен В.М. Демьянович (МГУ), И.Н.Шишкиной (МГУ), JI.B. Снегур (ИНЭОС РАН), И.В.Сергееву (ГНЦ Институт иммунологии ФМБА), К.Е.Воюшину (Институт канцерогенеза РАМН), Е.А.Асеевой (Гематологический научный центр РАМН), А.А. Луговскому (Biogen Inc, США), А.В.Кривцову (Harvard medical school, Бостон, США), А.А.Смирнову («Хеликон»), А.В.Кузубову («Синтол»), М.А. Ануфриеву («Bio-Rad»), А.В.Петрову («Мастерклон»), А.Л.Зимину, К.А.Ярову, Н.Е.Кирюшину, И.А.Лапшову, С.Г.Фарману, В.В.Лысакову, Ш.А.Фазаилову, Р.Х.Кашапову, А.Ю.Батлуцкому за постоянную дружескую поддержку и позитивное влияние на автора; А.В. Белову и Е.Ю.Сидоровой за помощь в вёрстке текста работы и создании иллюстраций.

Автор также выражает бесконечную признательность своим родителям, родственникам и супруге, помощь и поддержка которых на всех этапах данной работы оказала решающую роль в ее реализации.

102

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Малеев, Григорий Владимирович, 2009 год

1. Landegren, U., Kaiser, R., Sanders, J., Hood, L. / A ligase-mediated gene detection technique// Science. - 1988. -V. 241. - P. 1077-1080.

2. Barany, F. / The ligase chain reaction in a PCR world // PCR Methods Applic. -1991.-V. l.-P. 5-16.

3. Barany, F. / Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 189-193.

4. Reyes, A.A., Carrera, P., Cardillo, E., Ugozzoli, L., Lowery, J.D., Lin, C.-I P., Go, M., Ferrari, M., Wallace, R.B. / Ligase chain reaction assay for human mutations: the Sickle Cell by LCR assay // Clin. Chem. 1997. Vol.43 - P.40-44.

5. Kim, J., Lee, H. J. / Rapid Discriminatory Detection of Genes Coding for SHV p-Lactamases by Ligase Chain Reaction // Antimicr. Agents Chemother. -2000.-V. 44-P. 1860-1864.

6. Osiowy, C. Sensitive detection of HBsAg mutants by a gap ligase chain reaction assay // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40 - P.2566-2571.

7. Bi, W., Stambrook, P.J. / CCR: a rapid and simple approach for mutation detection // Nucl. Acids Res. 1997. - V. 25 - P.2949-2951.

8. Quinn, Т. C., Cates, W. // Epidemiology of sexually transmitted diseases in the 1990's. 1992. Vol. P. 1-37. In Т. C. Quinn (ed.), Advances in host defense mechanisms, V. 8. Raven Press, New York, N.Y.

9. Butt, A., McCartney, R., Walker, A., Scoular, A. / Economic advantages of ligase chain reaction for diagnosis of genital Chlamydia trachomatis infection in GUM clinic attenders // Sex. Transm. Inf. 2001. - V. 77 - P. 227-228.

10. Waites, K.B., Smith, K.R., Crum, M.A., Hockett, R.D., Wells, A.H., Hook, E.W. / Detection of Chlamydia trachomatis endocervical infections by ligase chain reaction versus ACCESS Chlamydia antigen assay // J. Clin. Microbiol. -1999.-V. 37-P. 3072-3073.

11. Winter, A. J., Gilleran, G., Eastick, K., Ross, J.D.C. / Comparison of a ligase chain reaction-based assay and cell culture for detection of pharyngeal carriage of Chlamydia trachomatis // J. Clin. Microbiol. 2000. -V-. 38 - P. 3502-3504.

12. Deguchi, Т., Yasuda, M., Uno, M., Tada, K., Iwata, H., Komeda, H., Maeda, S.-I., Latila, V., Saito, I., Kawada, Y. / Comparison among performances of a ligase chain reaction-based assay and two enzyme immunoassays in detecting

13. Chlamydia trachomatis in urine specimens from men with nongonococcal urethritis // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34 - P. 1708-1710.

14. Kacena, K.A., Quinn, S.B., Hartmann, S.C., Quinn, T.C., Gaydos, C.A. / Pooling of Urine Samples for Screening for Neisseria gonorrhoeae by Ligase Chain Reaction: Accuracy and Application // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36 -P. 3624-3628.

15. Ching, S., Lee, H., Hook, E.W., Jacobs, M.R., Zenilman, J. / Ligase chain reaction for detection of Neisseria gonorrhoeae in urogenital swabs // J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33 - P. 3111-3114.

16. Hook, E.W., Ching S.F., Stephens, J., Hardy, K.F., Smith, K.R., Lee, H.H. / Diagnosis of Neisseria gonorrhoeae infections in women by using the ligase chain reaction on patient-obtained vaginal swabs // J. Clin. Microbiol. 1997. -V. 35-P. 2129-2132.

17. Young, H., Manavi, K., McMillan, A. / Evaluation of ligase chain reaction for the non-cultural detection of rectal and pharyngeal gonorrhoea in men who have sex with men // Sex. Transm. Infect. 2003. - V. 79 - P. 484-486.

18. Stary, A., Ching, S.F., Teodorowicz, L., Lee, H. / Comparison of ligase chain reaction and culture for detection of Neisseria gonorrhoeae in genital and extragenital specimens // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35 - P. 239-242.

19. Heifets, L.B., Good, R.C. // Current laboratory methods for the diagnosis of tuberculosis, 1994. P.85-110. In B. R. Bloom (ed.), Tuberculosis: pathogenesis, protection, and control. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

20. O'Connor, T.M., Sheehan, S., Cryan, В., Brennan, N., Bredin, C.P. / The ligase chain reaction as a primary screening tool for the detection of culture positive tuberculosis // Thorax 2000. V. 55 - P. 955-957.

21. Lindbraten, A., Gaustad, P., Hovig, В., Tonjum, T. / Direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex in clinical samples from patients in Norway by ligase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35 - P. 3248-3253.

22. Moore, D.F., Curry, J.I. / Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis directly from sputum sediments by ligase chain reaction // J. Clin. Microbiol.-1998.-V. 36-P. 1028-1031.

23. Tortoli, E., Lavinia, F., Simonetti, M.T. / Early detection of Mycobacterium tuberculosis in BACTEC cultures by ligase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36 - P. 2791-2792.

24. Shetty, N., Shemko, M., Holton, J., Scott, G.M. / Is the detection of Mycobacterium tuberculosis DNA by ligase chain reaction worth the cost: experiences from an inner London teaching hospital // J. Clin. Pathol. 2000. V. 53 - P. 924-928.

25. Kissin, D.M., Holman, S., Minkoff, H.L., DeMeo, L., McCormack, W.M., DeHovitz, J.A. / Epidemiology and natural history of ligase chain reaction detected chlamydial and gonococcal infections // Sex. Transm. Infect. 2002. V. 78-P. 208-209.

26. Blocker, M.E., Krysiak, R.G., Behets, F., Cohen, M.S. Hobbs, M.M. / Quantification of Chlamydia trachomatis elementary bodies in urine by ligase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40 - P. 3631-3634.

27. Bachmann, L.H., Desmond, R.A., Stephens, J., Hughes, A., Hook, E.W. /

28. Duration of Persistence of Gonococcal DNA Detected by Ligase Chain

29. Reaction in Men and Women following Recommended Therapy for111

30. Uncomplicated Gonorrhea // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40 - P. 3596-3601.

31. Loeffelholz, M.J., Jirsa, S.J., Teske, R.K., Woods, J.N. / Effect of endocervical specimen adequacy on ligase chain reaction detection of Chlamydia trachomatis // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39 - P. 3838-3841.

32. Nikkari, S., Puolakkainen, M., Yli-Kerttula, U., Luukkainen, R., Lehtonen, O.-P., Toivanen, P. / Ligase chain reaction in detection of Chlamydia DNA in synovial fluid cells // Brit. J. Rheumat. 1997. V. 36 - P. 763-765.

33. Notomi, Т., Ikeda, Y., Okadome, A., Nagayama, A. / The inhibitory effect of phosphate on the ligase chain reaction used for detecting Chlamydia trachomatis // J. Clin. Pathol. 1998. V. 51 - P. 306-308.

34. Landegren, U. / Molecular mechanics of nucleic acid sequence amplification // Trends Genet. 1993. - V. 9. - P.199-204.

35. Kalin, I., Shephard, S., Candrian, U. / Evaluation of the ligase chain reaction (LCR) for the detection of point mutations // Mutat. Res. 1992. - V. 283. - P. 119-123.

36. Southern, E.M. // Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. - V. 98. - P.503-517.

37. Brand, L., Johnson, M.L. Fluorescence Spectroscopy (Methods in Enzymology, Volume 278) // Academic Press. 1997.

38. Lakowicz, J.R. / Principles of Fluorescence Spectroscopy, Second Edition // Plenum Publishing. -1999.

39. Sharma, A., Schulman, S.G. / Introduction to Fluorescence Spectroscopy // John Wiley and Sons. 1999.

40. Малеев, Г.В., Гинцбург, A.JI. / Методы флюоресцентной детекции и их применение в микробиологии // Мол. ген. микробиол. вирусол. 2004. -Т. З.-С. 30-40.

41. Millard, P.J., Roth, B.L., Kim, С.Н. / Fluorescence-Based Methods for Microbiol Characterization and Viability Assessment // Biotechnol. Intl. -1997.-V. l.-P. 291.

42. Lloyd, D., Hayes, A.J. / Vigour, Vitality and Viability of Microorganisms // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V. 133. - P. 1.

43. Burgess, S.M., Delannoy, M., Jensen, R.E. / MMM1 Encodes a Mitochondrial Outer Membrane Protein Essential for Establishing and Maintaining the Structure of Yeast Mitochondria // J. Cell. Biol. 1994. - V. 126. - P. 1375-1391.

44. Mazzoni, C., Zarov, P., Rambourg, A., Mann, C. / The SLT2 (MPK1) MAP Kinase Homolog is Involved in Polarized Cell Growth in Saccharomyces Cerevisiae // J. Cell. Biol. 1993.-V. 123.-P. 1821-1833.

45. Valdivieso, M.H., Mol, P.C., Shaw, J.A., Cabib, E., Duran, A. / CAL1, A Gene Required for Activity of Chitin Synthase 3 in Saccharomyces Cerevisiae // J. Cell. Biol.-1991.-V. 114.-P. 101-109.

46. Shaw, J.A., Mol, P.C., Bowers, В., Silverman, S.J., Valdivieso, M.H., Duran, A., Cabib, E. / The Function of Chitin Synthases 2 and 3 in the Saccharomyces Cerevisiae Cell Cycle // J. Cell. Biol. 1991. - V. 114. - P. 111-123.

47. Millard, P.J., Roth, B.L., Thi, H.P., Yue, S.T., Haugland, R.P. / Development of the FUN-1 Family of Fluorescent Probes for Vacuole Labeling and Viability Testing of Yeasts // Appl: Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. - P. 2897-2905.

48. Wenisch, C., Moore, C.B., Krause, R., Presterl, E., Pichna, P., Denning, D. W. / Antifungal Susceptibility Testing of Fluconazole by Flow Cytometry Correlates with Clinical Outcome // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 2458-2462.

49. Prudencio, C., Sansonetty, F., Corte-Real, M. / Flow Cytometric Assessment of

50. Cell Structural and Functional Changes Induced by Acetic Acid in the Yeasts113

51. Zygosaccharomyces Bailii and Saccharomyces Cerevisiae // Cytometry. 1998. -V. 31.-P. 307-313.

52. Deere, D., Shen, J., Vesey, G., Bell, P., Bissinger, P., Veal, D. / Flow Cytometry and Cell Sorting for Yeast Viability Assessment and Cell Selection//Yeast.- 1998.-V. 14.-P. 147-160.

53. Wenisch, C., Linnau, K.F., Parschalk, В., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. / Rapid Susceptibility Testing of Fungi by Flow Cytometry Using Vital Staining // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. - P. 5-10.

54. Kretschmar, M., Nichterlein, Т., Nebe, C.T., Hof, H., Burger, K.J. / Fungicidal Effect of Tyrothricin on Candida Albicans // Mycoses. 1996. - V. 39. - P. 45-50.

55. Comas, J., Vives-Rego, J. / Assessment of the Effects of Gramicidin, Formaldehyde, and Surfactants on Escherichia coli by Flow Cytometry Using Nucleic Acid and Membrane Potential Dyes // Cytometry. 1997. - V. 29. - P. 58-64.

56. Boulos, L., Prevost, M., Barbeau, В., Coallier, J., Desjardins, R. / Live/Dead BacLight: Application of a New Rapid Staining Method for Direct Enumeration of Viable and Total Bacteria in Drinking Water // J. Microbiol. Methods. -1999.-V. 37.-P. 77-86.

57. Taghi-Kilani, R., Gyurek, L.L., Millard, P.J., Finch, G.R., Belosevic, M. / Nucleic Acid Stains as Indicators of Giardia muris Viability Following Cyst Inactivation // Int. J. Parasitol. 1996. - V. 26. - P. 637-646.

58. Gyurek, L.L. / Cryptosporidium Parvum Viability Assessment Using Nucleic Acid Staining and Flow Cytometry // Proc. Water Qual. Technol. Conf. 1998. -P. 1277-1285.

59. Belosevic, M., Guy, R.A., Taghi-Kilani, R., Neumann, N.F., Gyurek, L.L., Liyanage, L.R., Millard, P J., Finch, G.R. / Nucleic Acid Stains as Indicators of Cryptosporidium Parvum Oocyst Viability // Int. J. Parasitol. 1997. - V. 27. -P. 787-798.

60. Virta, M., Lineri, S., Kankaanpaa, P., Karp, M., Peltonen, K., Nuutila, J., Lilius E.-M. / Determination of Complement-Mediated Killing of Bacteria by Viability Staining and Bioluminescence // Appl. Envir. Micr. 1998. - V. 64. -P. 515-519.

61. Korber, D.R., Choi, A., Wolfaardt, G.M., Ingham, S.C., Caldwell, D.E. / Substratum Topography Influences Susceptibility of Salmonella enteritidis Biofilms to Trisodium Phosphate / Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. -P. 3352-3358.

62. Mason, D.J., Shanmuganathan, S., Mortimer, F.C., Gant, V.A. / A Fluorescent Gram Stain for Flow Cytometry and Epifluorescence Microscopy // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 2681-2685.

63. Virta, M., Lineri, S., Kankaanpaa, P., Karp. M., Peltonen, K., Nuutila, J., Lilius, E.M. / Determination of Complement-Mediated Killing of Bacteria by Viability Staining and Bioluminescence // Appl. Environ. Microbiol. 1998. -V. 64.-P. 515-519.

64. Pettipher, G.L., Mansell, R., McKinnon, C.H., Cousins, C.M. / Rapid Membrane Filtration-Epifluorescent Microscopy Technique for Direct Enumeration of Bacteria in Raw Milk // Appl. Environ. Microbiol. 1980. - V. 39.-P. 423.

65. Ann, S.J., Costa, J., Emanuel, J.R. / PicoGreen Quantitation of DNA: Effective Evaluation of Samples Pre- or Post-PCR // Nucl. Acids Res. 1996. - V. 24. -P. 2623-2625.

66. Heid, C.A., Stevens, J., Livak, K.J., Williams, P.M. / Real Time Quantitative PCR // Genome Res. 1996. - V. 6. - P. 986-994.

67. Nasarabadi, S., Milanovich, F., Richards, J., Belgrader, P. / Simultaneous Detection of TaqMan Probes Containing Fam and Tamra Reporter Fluorophores // Biotechniques. 1999. - V. 27. - P. 1116-1118.

68. Lee, L.G., Livak, K.J., Mullah, В., Graham, R.J., Vinayak, R.S., Woudenberg, T.M. / Seven-color, Homogeneous Detection of Six PCR Products // Biotechniques. 1999. - V. 27. - P. 342-349.

69. Tapp, I., Malmberg, L., Rennel, E., Wik, M., Syvanen, A.C. / Homogeneous Scoring of Single-nucleotide Polymorphisms: Comparison of the 5'-nuclease TaqMan Assay and Molecular Beacon Probes // Biotechniques. 2000. - V. 28. -P. 732-738.

70. Monpoeho, S., Dehee, A., Mignotte, В., Schwartzbrod, L., Marechal, V., Nicolas, J. C., Billaudel, S., Ferre, V. / Quantification of Enterovirus RNA in Sludge Samples Using Single Tube Real-time RT-PCR // Biotechniques. -2000.-V. 29.-P. 88-93.

71. Zhao, Y., Yu, M., Miller, J.W., Chen, M., Bremer, E.G., Kabat, W., Yogev, R. / Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral DNA by Using TaqMan Technology // J. Clin. Microbiol. 2002. - V. 40. - P. 675-678.

72. Maudru, Т., Peden, K.W. / Adaptation of the Fluorogenic 5'-nuclease Chemistry to a PCR-based Reverse Transcriptase Assay // Biotechniques. -1998.-V. 25.-P. 972-975.

73. Piatek, A.S., Tyagi, S., Pol, A.C., Telenti, A., Miller, L.P., Kramer, F.R. / Molecular Beacon Sequence Analysis for Detecting Drug Resistance in Mycobacterium Tuberculosis // Nature Biotech. 1998. - V. 16. - P. 359-363.

74. Tyagi, S., Bratu, D.P., Kramer, F.R. / Multicolor Molecular Beacons for Allele Discrimination // Nature Biotech. 1998. - V. 16. - P. 49-53.

75. Helps, C., Reeves, N., Tasker, S., Harbour, D. / Use of Real-Time Quantitative PCR To Detect Chlamydophila felis Infection // J. Clin. Microbiol. 2001. - V. 39. - P. 2675-2676.

76. Park, S., Wong, M., Marras, S.A.E., Cross, E.W., Kiehn, Т.Е., Chaturvedi, V., Tyagi, S., Perlin, D.S. / Rapid Identification of Candida dubliniensis Using a Species-Specific Molecular Beacon // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. P. 2829-2836.

77. Lanciotti, R.S., Kerst, A.J. / Nucleic Acid Sequence-Based Amplification Assays for Rapid Detection of West Nile and St. Louis Encephalitis Viruses // J. Clin. Microbiol. -2001. -V. 39. P. 4506-4513.

78. Rhee, J.T., Piatek, A.S., Small, P.M., Harris, L.M., Chaparro, S.V., Kramer, F.R., Alland, D. / Molecular Epidemiologic Evaluation of Transmissibility and Virulence of Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1999. - V. 37. -P. 1764-1770.

79. El-Haji, H.H., Marras, S.A.E., Tyagi, S., Kramer, F.R., Alland, D. / Detection of Rifampin Resistance in Mycobacterium tuberculosis in a Single Tube with Molecular Beacons // J. Clin. Microbiol. 2001. -V. 39. - P. 4131-4137.

80. Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J., Brown, T. / Mode of Action and Application of Scorpion Primers to Mutation Detection // Nucleic Acids Res. 2000. - V. 28. - P. 3752-3761.

81. Nazarenko, I.A., Bhatnagar, S.K., Hohman, R.J. / A Closed Tube Format for Amplification and Detection of DNA Based on Energy Transfer // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 2516-2521.

82. Myakishev, M.V., Khripin, Y., Hu, S., Hamer, D.H. / High-Throughput SNP Genotyping by Allele-Specific PCR with Universal Energy-Transfer-Labeled

83. Primers//Genome Res.-2001.-V. 11.-P. 163-169.118

84. Nuovo, G.J., Hohman, R.J., Nardone, G.A., Nazarenko, I.A. / In Situ Amplification Using Universal Energy Transfer-labeled Primers // J. Histochem. Cytochem. 1999. - V. 47. - P. 273-280.

85. Rist, M.J., Marino, J.P. / Fluorescent Nucleotide Base Analogs as Probes of Nucleic Acid Structure, Dynamics and Interactions // Curr. Org. Chem. 2002. -V. 6.-P. 775-793.

86. Marras, S.A.E., Kramer, F.R., Tyagi, S. / Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30. - P. el22.

87. Masuko, M., Ohuchi, S., Sode, K., Ohtani, H., Shimadzu, A. / Fluorescence resonance energy transfer from pyrene to perylene labels for nucleic acid hybridization assays under homogeneous solution conditions // Nucleic Acids Res.-2000.-V. 28.-P. e34.

88. Lakowicz, J. R., Knutson, J. R. / Hindered depolarizing rotations of perylene in lipid bilayers. Detection by lifetime-resolved fluorescence anisotropy measurements // Biochemistry. 1980. - V. 19. - P. 905-911.

89. Lewis, F.D., Zhang, L., Zuo, X. / Orientation control of fluorescence resonance energy transfer using DNA as a helical scaffold // J. Am. Chem. Soc. -2005. -V. 127.-P. 10002-10003.

90. Wang, W., Li, L. S., Helms, G., Zhou, H.H., Li, A.D.Q. / To fold or to assemble?//J. Am. Chem. Soc.-2003.-V. 125.-P. 1120-1121.

91. Balakin, K.V. Conjugates of oligonucleotides with polyaromatic fluorophores as promising DNA probes / К. V. Balakin, V. A. Korshun, G.V. Maleev et al. II Biosens. Bioelectron. 1998. - V. 13. - P. 771-778.

92. Zheng, Y., Long, H., Schatz, G.C., Lewis, F. D. / Duplex and hairpin dimer structures for perylene diimide-oligonucleotide conjugates // Chem. Commun. -2005.-P. 4795-4797.

93. Aubert, Y., Asseline, U. / Synthesis and hybridization properties of oligonucleotide-perylene conjugates: Influence of the conjugation parameters on triplex and duplex stabilities // Org. Biomol. Chem. 2004. - V. 2. - P. 3496-3503.

94. Балакин, K.B. Новый реагент для мечения биомолекул — активированное производное пиренового бихромофора с эксимерной флуоресценцией / К.В. Балакин, В.А. Коршун, Г.В. Малеев и др. II Биоорган, химия. 1997. -Т. 23 (№1).-С. 33-41.

95. Balakin, K.V., Korshun, V.A., Esipov, D.S., Mikhalev, I.I., Berlin, Yu.A. / Perylene-Labeled Oligonucleotide as a Probe in Homogeneous Hybridization Assay // Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 1999. - V. 18. - P. 1279-1280.

96. Maleev, G.V., Balakin, K.V. / New double dye-labeled oligodeoxyribonucleotide probes and their application in detection of PCR products // Proc. Internat. Congress "Trends in nucleic acids chemistry",

97. Moscow, November 20-26, 2000. P. 54.120

98. Heid, C.A., Stevens, J., Livak, K.J., Williams, P.M. / Real time quantitative PCR // Genome Res. 1996. - V. 6. - P. 986-994.

99. Higuchi, R, Dollinger, G., Walsh, P.S., Griffith, R. / Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences // Biotechnology. -1992.-V.10.-P. 413-417.

100. Holland, P.M., Abramson, R.D., Watson, R, Gelfand, D.H. / Detection of specific polymerase chain reaction products by utilizing the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. -P. 7276-7280.

101. Kalin, I., Shephard, S., Candrian U. / Evaluation of the ligase chain reaction (LCR) for the detection of point mutations // Mutat. Res. 1992. - V. 283. - P. 119-123.

102. Landegren, U. / Molecular mechanics of nucleic acid sequence amplification // Trends Genet. 1993. - V. 9. - P. 199-204.

103. Mackay, I.M., Arden, K.E., Nitsche, A. / Real-time PCR in virology // Nucl. Acids Res. 2002. - V. 30. - P. 1292-1305.

104. Abravaya, K., Carrino, J.J., Muldoon, S. Lee, H.H. / Detection of point mutations with a modified ligase chain reaction (Gap-LCR) // Nucleic Acids Res. 1995. -V. 23. - P. 675-682.

105. Marshall, R.L., Laffler, T.G., Cerney, M.B., Sustachek, J.C., Kratochvil, J.D., Morgan, R.L. / Detection of HCV RNA by the asymmetric gap ligase chain reaction // PCR Methods Appl. 1994. - V. 4. - P. 80-84.

106. Wittwer, C.T., Ririe, K.M., Andrew, R.V., David, D.A., Gundry, R.A., Balis, U.J. / The LightCycler™: A microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control // Biotechniques. 1997. - V. 22. - P. 176-181.

107. Cardullo, R.A, Agrawal, S., Flores, C., Zamecnik, P.C., Wolf, D.E. / Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 8790-8794.

108. Barringer, K.J., Orgel, L., Wahl, G., Gingeras, T.R. / Blunt-end and single-strand ligations by Escherichia coli ligase: influence on an in vitro amplification scheme // Gene. 1990. - V. 89. - P. 117-122.

109. Wu, D.Y., Wallace, R.B. / The ligation amplification reaction (LAR)-amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation // Genomics. 1989. - V. 4. - P. 560-569.

110. Wu, D.Y., Wallace, R.B. / Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNA ligase // Gene. 1989. - V. 76. - P. 245-254.

111. Nilsson, M., Barbany, G., Antson, D.O., Gertow, K., Landegren, U. / Enhanced detection and distinction of RNA by enzymatic probe ligation // Nat. Biotechnol. 2000. - V. 18. - P. 791-793.

112. Малеев, Г.В. ПЦР, ЛЦР и ГЦР цепные реакции нуклеиновых кислот в режиме реального времени / А.В. Чемерис, Ю.М. Никоноров, Г.В. Малеев и др. II Вестник биотехн. физ.-хим. биол. 2005. - Т. 1, №2. - С. 5-14.