Нейротропная активность аналога С-концевого фрагмента аргинин-вазопрессина-Ac-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH2 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Пономарева, Наталья Сергеевна

• Пономарева, Наталья Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пономарева, Наталья Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Аргинин-вазопрессин: структура, локализация в мозге, особенности метаболизма.

2. Влияние АВП на вегетативные функции.

3. Влияние АВП на поведение животных.

4. Особенности интраназального введения веществ.

5. Поведенческие эффекты фрагментов АВП.

6. Рецепторы к АВП.

7. Модулирующее влияние АВП на нейромедиаторные системы.

8. Возможные механизмы влияния АВП, его фрагментов и аналогов на обучение.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования.

1. Регистрация двигательной активности и ориентировочно-исследовательского поведения животных.

1.1.Актометр "Opto-Varimex".

1.2.Тест "открытое поле".

1.3.Тест "норковая камера".

2. Определение болевой чувствительности животных.

2.1.Тест "отдергивания хвоста".

3. Исследование различных видов обучения животных

3.1.Выработка условной пищедобывательной реакции на место.

- :>

3.2. Выработка условного рефлекса активного избегания болевого раздражителя.

4. Исследование некоторых параметров физиологического состояния организма.

4.1. Тест "вертикальная сетка".

4.2. Измерение уровня пищевой мотивации.

4.3. Определение частоты сердечных сокращений.

5. Статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Влияние Ас-Б-МРКХЗ на различные формы обучения при разных сроках введения.

1.1. Влияние Ас-О-МРЯО на выработку условной реакции активного избегания.

1.2. Влияние Ас-Э-МР]Ш на обучение животных в Т-образном лабиринте с пищевым подкреплением.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Нейротропная активность аналога С-концевого фрагмента аргинин-вазопрессина-Ac-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH2»

В настоящее время регуляторные пептиды являются одним из наиболее интенсивно изучаемых классов биологически активных веществ. Интерес к эндогенным пептидным регуляторам вызван тем, что представители этой группы прямо или опосредовано воздействуют на все физиологические процессы, а любое нарушение в деятельности пептидной регуляторной системы может привести к развитию целого ряда патологических реакций организма. С другой стороны, постоянно ведутся исследования, направленные на создание новых лекарственных средств на основе эндогенных пептидных регуляторов, причем спектр их клинического применения может быть достаточно широк. Как примеры, можно привести анальгетическое и противоязвенное средство - даларгин, аналог дерморфина, и стимулятор деятельности ЦНС - семакс, аналог АКТГ(4-10).

Одним из классов регуляторных пептидов, привлекающих большой интерес исследователей, является семейство нейрогормонов задней доли гипофиза и их фрагментов, лишенных гормональной активности. Достаточно давно показано, что фрагменты вазопрессина способны стимулировать консолидацию энграммы, улучшать сохранение и воспроизведение выработанных навыков у животных и человека {De Wied, 1964). Вазопрессин и его фрагменты использовались также для лечения пациентов, мнестические функции которых нарушены в результате черепно-мозговых травм, а также пациентов с болезнью Альцгеймера на ранней стадии и синдромом Корсакова {Hijman, 1992; Zager, Black, 1985). Однако создание эффективных лекарственных препаратов пептидной природы затруднено тем, что эти вещества отличаются низкой биологической доступностью, быстро разрушаясь протеолитическими ферментами и плохо проходя через гематоэнцефалический барьер. Для многих пептидов показано, что при периферическом введении в мозг поступает не более 0.01% вещества (Mens et al, 1983; Mezey et al, 1978). Этим объясняется необходимость использования нестандартных способов введения пептидов в организм. Одним из наиболее удачных способов следует признать интраназальный, т.е. введение пептидов через нос. При этом способе введения многие регуляторные пептиды и их аналоги оказывают выраженное действие на функции мозга, сопоставимое с введением этого пептида непосредственно в мозговые желудочки (Gomita et al, 1985; Born et al, 1998). Однако к настоящему времени не существует теории, позволяющей априорно предсказать степень эффективности того или иного пептида при интраназальном введении.

Известно, что аргинин-вазопрессин (АВП) распадается в организме на несколько линейных фрагментов, включающих в себя с 4-го по 9-ый аминокислотные остатки {De Wied, 1983). Эти метаболиты обладают нейротропной активностью, которая не уступает, а зачастую и превосходит активность целой молекулы АВП в отношении стимуляции поведения, улучшения обучения и памяти {Burbach, Kovacs, 1983; Chao Lin, 1990). По данным, полученным ранее в нашей лаборатории, наибольшим нейротропным эффектом обладает фрагмент АВП(6-9) - Cys6-Pro7-Arg8-Gly9-NH2. В ходе предварительных исследований было показано, что удаление Gly9 в последовательности АВП(6-9) приводит к потере физиологической активности, замена Arg8 на Leu8 приводит к появлению у пептида противоположных по сравнению с прототипом эффектов, удаление Cys6-Pro7 или замена Pro7 на другой аминокислотный остаток также приводит к исчезновению физиологических эффектов. Следовательно, для сохранения у аналога поведенческой активности

6 7 8 9 необходима следующая основная структура: Z-Pro-Arg-Gly-NH2 (где Z -аминокислотный остаток). Таким образом, для получения нового аналога, обладающего выраженными ноотропными эффектами при интраназальном введении в малых дозах, было целесообразно синтезировать пептид с заменой Cys6 на другую аминокислоту, способствующую повышению устойчивости к действию пептидаз.

На основании конформационного анализа, проведенного доктором биологических наук профессором В.П.Голубовичем, было высказано предположение о том, что замена Cys6 на D-Met приведет к увеличению энзиматической стабильности нового пептида, что может заметно повысить его биодоступность и, следовательно, нейротропную активность. Для проверки этого предположения был

6 7 8 9 синтезирован аналог АВП(6-9) тетрапептид Ac-D-Met -Pro -Arg -Gly -NH2 (Ac-D-MPRG).

Целью представленной работы явилось исследование физиологических эффектов Ac-D-MPRG при интраназальном введении, определение зависимости этих эффектов от дозы и времени введения, а также изучение возможных механизмов действия этого аналога.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В настоящее время осуществляется широкое исследование функции нейропептидов как эндогенных регуляторов, выполняющих, в частности, координирующую роль во взаимодействии ЦНС и периферических систем. С середины 60-х годов стало известно, что некоторые гормоны, кроме специфической гормональной активности, обладают способностью модифицировать процессы обучения и памяти. Одним из пептидов, оказывающих выраженное влияние на процессы обучения и памяти, является гормон нейрогипофиза - вазопрессин.

Лргинин-вазопрессин: структура, локализаг1ия в мозге, особенности метаболизма.

Нейрогипофизарные гормоны по особенностям структуры и выраженности биологических эффектов можно разделить на две группы: группу вазопрессина с преобладанием антидиуретического и вазопрессорного эффектов и группу окситоцина, для которого характерны эффекты на молочные железы и семявыносящие протоки, а также стимуляция сокращений гладкой мускулатуры матки. Выраженность тех или других свойств определяется, прежде всего тем, какие аминокислоты занимают 3-е и 8-е положения в молекуле гормона (рис. 1).

В группу вазопрессина входят аргинин-вазопрессин (АВП), лизин-вазопрессин (ЛВП) (антидиуретические гормоны) и вазотоцин, характеризующиеся наличием в 8-м положении аргинина или лизина. Имея в 3-м положении фенилаланин, антидиуретические гормоны обладают антидиуретическими и вазоактивными свойствами. Вазотоцин, имеющий, подобно окситоциновым соединениям, изолейцин в 3-м положении, сочетает функциональные свойства вазопрессинов и гормонов окситоцинового ряда. Вазотоцин присущ представителям всех классов позвоночных, кроме млекопитающих. Вазопрессины синтезируются только у млекопитающих, причем у большинства - аргинин-8-вазопрессин (АВП), лишь у нежвачных парнокопытных - лизнн-8-вазопрессин (Розен, 1994).

В группу окситоциновых нанопептидов входят окситоцин, мезотоцин, изотоцин, глумитоцин, валитоцин и аспаротоцин. В отличие от гормонов ряда

Вазопрессиновый ряд

Окситоциновый ряд

Туг

Туг

Су 5

-Агд° -в1у (11Н2) в1пч

Бег, Аэй'

Ьуз)

Аэп

Аэп3

СуэТРго -Ьеи • - Э1у -СОЫН2

Не, Уа1)

Вазопрессин

Окситоцин

Туг

Туг

РЬе в1п

Сув

Не

Су в 6-Рго7 - Аг д8 - в1у9 <ЫН2) б1п' (Ьуз)

Сув

Суз6-Рго7 -Ьеи8-е1у9-С01Ш2

Аэп

Ту.

Не'

Суз1 в1п4

Сузб-Рго7-Агд8-в1у9 (ОТ2)

Абп'

Рис. 1. Первичная структура нейрогипофизарных гормонов вазопрессинового и окситоцинового ряда {Розен, 1994). вазопрессина пептиды окситоцинового ряда содержат в 8-м положении боковой цепи остаток лейцина, изо лейцина, глутамина или валина, в 3-м - изо лейцина, а в 4-м -глутамина, серина или аспарагина. Окситощш, имеющий в 3-м положении Не, а в 8-м - Leu, синтезируется только у млекопитающих и является стимулятором сокращений гладкой мускулатуры матки во время родов, сокращения семявыносящих протоков и яйцеводов, отделения молока грудными железами.

Первоначально считалось, что вазопрессин и окситоцин являются гормонами-регуляторами только вегетативных функций. Позднее выяснилось, что нейрогипофизарные гормоны, в том числе и вазопрессин, обладают также и центральной активностью, не связанной с регуляцией висцеральных функций (De Wied and Gispen, 1977), По-видимому, с этим связано существование двух внутримозговых систем синтеза вазопрессина (De Vries and Buijs, 1983). Первая система синтеза нейрогипофизарных гормонов локализована в крупноклеточных ядрах гипоталамуса. Вазопрессин образуется в паравентрикулярном (PVN), супраоптическом (SON) и супрахиазматическом (SCN) ядрах, окситоцин - в PVN и SON (Hawthorn et al, 1980; Rhodes et al, 1981). Вероятно, гипоталамическая система связана с реализацией вегетативной активности гормонов. Отсюда вазопрессин- и окситоцинсодержащие волокна направляются:

- основная часть волокон: в заднюю долю гипофиза, где пептид секретируется в кровь и реализует свои функции, взаимодействуя с периферическими органами-мишенями. Секреция происходит посредством экзоцитоза и регулируется внутриклеточным Са2+;

- меньшая часть волокон направляется в продолговатый и спинной мозг, где оканчиваясь на нейронах ядер одиночного тракта, ядер тройничного нерва, желатинозной субстанции, п. ambiguus, дорзальных моторных ядрах блуждающего нерва, участвуют в центральной регуляции висцеральных функций (Hawthorn et al, 1985; Sawchenko and Swanson, 1982; Morris et al, 1980). При этом в проекциях в задние отделы мозга преобладают окситоцинергические волокна.

Вторая система синтеза вазопрессина (экстрагипоталамическая) локализована в ядрах основания концевой пластинки. Отсюда вазопрессинергические волокна идут в составе диагонального пучка Брока в латеральные ядра уздечки, область голубого пятна, ядра миндалевидного комплекса, зубчатую извилину, вентральную область гиппокампа, каудальную область передней комиссуры, перегородку, перивентрикулярное серое вещество {Baskin et al, 1983; Biegon et al, 1984; Buijs, 1978; Caffe and van Leewven, 1983; Van Leewven and Wolters, 1983; Tiberiis et al, 1983). Экстрагипоталамическая система синтеза вазопрессина участвует в регуляции функций гипоталамической системы, оказывая влияние на активность нейронов паравентрикулярного и супраоптического ядер, посылая волокна в срединное возвышение и ядра продолговатого и спинного мозга {Garrís, 1979; Sawchenko, Swanson, 1983). В ядрах основания концевой пластинки обнаружен и окситоцин, что может свидетельствовать о существовании второй системы синтеза и для этого гормона.

Таким образом, можно предположить, что системы синтеза вазопрессина функционально разнородны:

• гипоталамическая система сопряжена с реализацией вегетативных эффектов гормона

• экстрагипоталамическая - с реализацией его эффектов на центральную нервную систему, выражающееся во влиянии вазопрессина на поведенческую активность.

Приведенные данные получены на мозге животных. В мозге человека гормоны задней доли гипофиза распределены несколько иначе. Вазопрессин- и окситоцинсодержащих волокон гораздо меньше в перегородке, миндалине и гигаюкампе и значительно больше в области голубого пятна {Fliers et al, 1986). У человека лимбические структуры в меньшей степени иннервированы вазопрессинергическими окончаниями, чем у низших млекопитающих, что сказывается на выраженности и специфичности функций гормона у приматов.

Как и большинство нейропептидов вазопрессин образуется в результате ограниченного ("прицельного") протеолиза крупного пептида-предшественника. Предшественником вазопрессина является пептид длиной 160-170 аминокислотных остатков, содержащий кроме вазопрессина еще и специфический для вазопрессина белок - нейрофизин II (НФ). Биосинтез предшественника АВП происходит в нейросекреторных гранулах крупноклеточных нейронов, а образование из него более коротких пептидов происходит в процессе аксонального транспорта {Zimmerman, 1977; Robinson, 1987; Ban and Yoshida, 1993).

Пептиды (вазопрессин и нейрофизин) секретируются из нервных окончаний при помощи механизмов, подобных тем, которые описаны для медиаторов непептидной природы. Нейрофизины представляют собой гетерогенную группу низкомолекулярных кислых белков. Пептидная цепь нейрофизина состоит из 91-95 а. о. Интересно, что 85-90% аминокислотных остатков в составе этих пептидов идентичны у человека и исследованных животных. В плазме крови нейрофизины находятся в прочном комплексе с окситоцином или вазопрессином. Связь нейрофизинов с этими гормонами нековалентная. Основная их функция - транспорт и защита от разрушения вазопрессина и окситоцина.

Скорость синтеза вазопрессина в тканях гипоталамуса составляет, по некоторым данным, 1.2-1.9 пмоль в час. В среднем концентрация вазопрессина в плазме крови составляет несколько пгр/мл - по одним данным 1пг/мл {Robinson et al, 1989), по другим - 1.7пг/мл {Dogterom et al, 1978). Вазопрессин циркулирует в крови около 20 минут, затем захватывается тканями и разрушается {Ang et al, 1982; Janaky etal, 1982).

Содержание АВП в спинномозговой жидкости в норме составляет 0.5-2.0 пг/мл {Sorensen, 1986). Время полужизни вазопрессина в цереброспинальной жидкости, по данным исследователей, составляет 26 минут {Mens et al, 1983), что сопоставимо со временем полужизни в крови.

Измерения количества АВП в тканях мозга разными исследователями дают вариабельные значения. Разброс данных может быть связан с различными факторами - возрастом и полом животных, линией крыс, методикой экстракции и т.д. В среднем в миндалине, гиппокампе, переднелимбическом мозге и гипофизе содержание АВП колеблется от 2 до 20 пг/мг белка {Hashimoto et all, 1985). По другим сведениям, содержание АВП в дорзальном гиппокампе в среднем составляет 30.3 пг/мг связанного белка, а в вентральном - 81.4 пг/мг белка, при этом в коре головного мозга вазопрессин обнаружен не был {Tiberiis, 1983).

Инактивация вазопрессина может происходить при помощи N6-ацетилирования (этот процесс, возможно, протекает в мозге). Liu et al полагают, что ацетилирование является механизмом, посредством которого регулируется биологическая активность гормонов нейрогипофиза - вазопрессина и окситоцина

Liu et al, 1989). Обычно ацетилированные пептиды полностью лишаются присущей им периферической и центральной активности (Kovacs et al, 1989).

Другим путем метаболизма вазопрессина является расщепление его на фрагменты. Было показано наличие в норме дез-01у-КН2-[А^8]-вазопрессина (ДгАВП) как эндогенного метаболита АВП в плазме крови крысы (Laczi et al, 1991). Время полужизни ДгАВП в крови зависит от способа введения и при внутривенном введении составляет от 8 до 16 минут (Ang et al, 1982; Verhoef et al, 1986). При подкожном введении время полужизни значительно увеличивается и, по разным исследованиям, составляет от 4 до 6.5 часов (Verhoef et al, 1986; Van Bree, 1989).

Было выдвинуто предположение, что молекула вазопрессина распадается на кольцевую структуру (прессинамид) и С-концевую часть (De Wied, 1976). Позднее выяснилось, что в организме под действием пептидаз гормоны нейрогипофиза распадаются не на прессинамид и С-концевую цепочку, а на несколько линейных фрагментов, включающих с 4-го по 9-ый аминокислотные остатки: [pGlu4, Cyt6]ABn(4-9), [pGlu4, Cyt6]ABn(4-8), [Cyt6]ABn(5-9) и [Cyt6]ABn(5-8) (De Wied, 1983; Burbach, 1983, Lin et al, 1990). Было показано in vivo, что превращения вазопрессина в гиппокампе происходят менее чем за 1 минуту. При этом в мозге обнаруживаются С-концевые фрагменты, которые не обладают гормональной активностью, свойственной их предшественнику - вазопрессину (Stark et al, 1989).

Как и другие белково-пептидные гормоны, вазопрессин быстро накапливается в печени и в почках. Его интенсивная деградация и инактивация происходит под действием специфических пептидаз в печени, в почках и в крови (Janaky et al, 1982, Розен, 1994). Метаболиты вазопрессина выводятся преимущественно в форме свободных аминокислот, их солей и небольших пептидов в основном через почки.

Существует четко выраженная циркадная ритмика секреции вазопрессина, прослеженная у человека и млекопитающих с дневным и ночным образом жизни. Она показала, что состоянию бодрствования, особенно у дневных животных, соответствуют два пика содержания вазопрессина в плазме крови. У человека они наблюдаются с 8 до 10 часов утра и с 16 до 18-20, а также незначительный подъем наблюдается за час до сна (22-23 час.). Во время сна увеличения содержания вазопрессина приходятся на стадию быстрого сна, когда "висцеральная буря" приводит к появлению десинхронизации в ЭЭГ коры больших полушарий и, опосредованно через ретикулярную формацию среднего мозга и активацию ядер глазодвигательного комплекса, - к движениям глаз.

Возникает вопрос, как синтетический вазопрессин при периферических способах введения, таких как, подкожный, внутримышечных, внутрибрюшинный, внутривенный и интраназальный, может оказывать эффекты на центральную нервную систему?

Существует несколько возможностей реализации центральных эффектов при периферическом введении пептидных регуляторов (Tinklenberg and Thornton, 1983; Марьянович и Поляков, 1991):

1) ГЭБ может быть проницаем для этих соединений (основным механизмом проникновения нейропецтидов в мозг является трансмембранная диффузия, скорость которой определяется главным образом жирорастворимостью нейропептидов);

2) могут существовать молекулы-переносчики гормонов через ГЭБ;

3) гормоны могут попадать в мозг, минуя ГЭБ (через портальную гипоталамо-гипофизарную систему, через циркумвентрикулярные органы, через слизистую оболочку носа, с помощью ретроградного транспорта по аксонам нейронов);

4) пептиды могут изменять проницаемость ГЭБ для каких-либо других веществ, то есть действие их может быть опосредованным;

5) через ГЭБ могут проходить более мелкие фрагменты пептидов.

В настоящее время имеются данные, что нейрогипофизарные гормоны проникают через ГЭБ в достаточных количествах для оказания эффектов на ЦНС {Mens et al, 1983). При периферическом введении АВП через некоторое время обнаруживается в ЦНС. Так АВП, введенный подкожно, обнаруживается в ЦНС в количестве 0.002% уже через 10 минут {Mens et al, 1983). Через некоторое время вазопрессин обнаруживается в основном в аденогипофизе и малом желудочке. Показано, что существует цереброваскулярная проницаемость для циркулирующего АВП, связанная с присутствием на луминарной стороне ГЭБ системы переносчиков вазопрессина. Механизм поглощения АВП не имеет сродства к фрагментам пептида и к крупным аминокислотам и требует взаимодействия с интактной молекулой вазопрессина (Zlokovic et al, 1990). То, что фрагменты вазопрессина обладают поведенческой активностью не только при внутримозговом, но и при периферическом введении, позволяет предположить, что они проникают в мозг другим путем. Возможно, при периферическом введении фрагменты АВП попадают в мозг или через слизистую оболочку носа (при интраназальном введении) или с помощью ретроградного транспорта по аксонам нейронов (при внутривенном или подкожном введении).

Влияние АВП на вегетативные функции

Специфика распределения и секреции вазопрессина в ЦНС обеспечивает ему возможность как периферической, так и центральной регуляции вегетативных функций.

Основное действие вазопрессина, иначе называемого антидиуретическим гормоном, - реабсорбция воды в дистальных отделах почечного нефрона {Розен, 1994). Кроме того, к функциям вазопрессина относятся регуляция осмотического давления крови; воздействие на мышечные волокна кровеносных сосудов; воздействие на деятельность сердца; реабсорбция воды в слизистой кишечника и слюнных желез; регуляция температуры тела.

Прессорное действие вазопрессина может быть реализовано тремя способами {Sawyer, 1984). Во-первых, непосредственным взаимодействием АВП с периферическими рецепторами сосудов. Во-вторых, опосредованно, через регуляцию водного баланса. В-третьих, гормон может воздействовать на центры сердечнососудистого рефлекса, находящиеся в продолговатом мозге.

Системное введение вазопрессина вызывает дозозависимое повышение давления в периферических сосудах, обусловленное прямым прессорным эффектом гормона, и, по-видимому, как компенсаторную реакцию рефлекторного происхождения, снижение частоты сердечных сокращений {Титов и др., 1982; Тomita et al, 1985; Simpson et al, 1986). Однако, вазопрессин может вызывать прессорный эффект и при внутримозговом введении, что свидетельствует о его участии в центральной регуляции функций сердечно-сосудистой системы {Реттинг и др., 1983;

Pittman et al, 1982). Так, показано, что гормон усиливает сердечно-сосудистый компонент ориентировочно-исследовательской реакции, продлевая феномен брадикардии, возникающей при внезапном изменении окружающей обстановки (Hagan and Bohus, 1984). Кроме того, активирующее воздействие вазопрессина на барорецепторные рефлексы проявляется ярче на фоне значительных изменений температуры среды (Simpson et al, 1986). Все это говорит в пользу участия пептида в регуляции сердечно-сосудистого компонента комплекса физиологических реакций, связанных с адаптацией к изменяющимся условиям.

Известно, что вазопрессин может влиять на пролиферацию и дифференцировку клеток в аденогипофизе, и, кроме того, увеличивает образование щелевых контактов между тропоцитами (Чернышева, 1995).

Имеются сведения, что вазопрессин участвует в регуляции температурного гомеостаза. При введении в преоптическую область АВП вызывает снижение температуры тела у интактных животных и на фоне лихорадки (Kovacs and De Wied, 1983; Zeisberger, 1985).

Влияние АВП на поведение животных

Первые работы, выявившие влияние гормонов нейрогипофиза на поведение, появились в 60-х годах. В дальнейшем изучение эффектов вазопрессина велось в нескольких направлениях: введение синтетического вазопрессина как нормальным животным, так и на фоне нарушений, вызванных введением фармакологических агентов; введение антисыворотки к вазопрессину; демонстрация выброса вазопрессина при определенном поведении; эффекты вазопрессина при неонатальном введении, и т.д.

Было показано, что удаление гипофиза у нормальных животных приводит к нарушению процесса формирования навыка, в данном случае - выработки рефлекса активного избегания (De Wied, 1964). Введение экстракта задней доли гипофиза препятствовало угашению условной реакции активного избегания (УРАИ). Действующим началом экстракта оказался вазопрессин.

Позже, было показано, что вазопрессин при внутрибрюшинном введении в дозах 1-5 мкг/кг замедляет угасание выработанной условной реакции в тестах активного и пассивного избегания у крыс (De Wied et al, 1974).

АВП в малых дозах (до 5 мкг/кг при системном введении и до 10 нг/кг при внутримозговом), инъецируемый после сеанса обучения, приводит к облегчению выработки УРАИ {De Wied and Gispen, 1977). Введение вазопрессина не позже, чем через 6 часов после обучения или не ранее, чем за час до начала тестирования облегчает выработку и другой условной реакции - пассивного избегания (УРПИ) {Bohus et al, 1978; Gabor et al, 1979; Izquierdo andDias, 1985).

При введении перед началом сеанса воспроизведения, АВП замедляет угашение УРАИ {De Wied, 1969; De Wied and Gispen, 1977). При этом было показано, что эффекты АВП при внутримозговом введении в дозах 0.01, 0.1, 1 и 100 нг/крысу в случае замедления угасания УРПИ и сохранения УРАИ развиваются дозозависимо. {De Wied, 1969; Kovacs, De Wied, 1983).

При изучении влияния синтетического гормона на процессы обучения интактных животных выяснилось, что как периферическое, так и внутримозговое введение АВП оказывает более эффективное влияние при выработке реакций с отрицательным подкреплением (De Wied, 1976; Bohus et al, 1978). При выработке условных реакций, главным образом с отрицательным подкреплением, вазопрессин оказывает влияние и на долговременную память. По мнению De Wied эффективность воздействия пептида на долговременную память зависит от интервала между сеансом обучения или воспроизведения и введением пептида (De Wied et al, 1993).

При изучении влияния вазопрессина, вводимого в различные области мозга в дозах 0.05-10 нг/животное, на процессы обучения и памяти, было показано, что инъекция вазопрессина в заднеталамическую область, включая парафасцикулярное ядро (Van Wimersma Greidanus et al, 1973; Van Wimersma Greidanus et al, 1975), или в гиппокампальные структуры (Stark et al, 1978) приводило к лучшему сохранению УРАИ. Кроме того, микроинъекция вазопрессина в зубчатую извилину, дорзальные ядра прозрачной перегородки или ядра шва улучшало выработку УРПИ при введении пептида сразу после обучения (Kovacs et al, 1979а). У крыс с амнезией, вызванной введением пентилентетразола, введение вазопрессина в различные отделы лимбической системы также приводило к улучшению выработки УРПИ (Bohus et al, 1982).

Нидерландскими учеными было показано, что эндогенный вазопрессин в дорзальных ядрах шва и дорзальном гиппокампе принимает участие в процессах консолидации полученной информации. Дальнейшая локализация микроинъекций вазопрессина показала, что наиболее чувствительная структура для вазопрессина -вентральный гиппокамп (Kovacs, De Wied, 1994).

При обучении в пространственном лабиринте Морриса было показано, что эндогенный вазопрессин, действующий через центральные VI-рецепторы, не является необходимым для выработки рефлекса в пространственном "водном лабиринте Морриса". Влияние эндогенного вазопрессина исключали введением специфического антагониста Vl-рецепторы - d(CH2)5Tyr(Me)AVP. При этом животные этой группы не отличались по параметрам обучения от контрольных. Однако введение экзогенного АВП методом микродиализа в кору приводило к нарушению пространственного обучения, то есть экзогенный АВП оказывает влияние на выработку рефлекса в "водном лабиринте Морриса" (Engelmann et al, 1992).

Данные по влиянию вазопрессина на обучение с положительным подкреплением противоречивы. Имеются сведения о положительном влиянии вазопрессина на сохранение и воспроизведение условных реакций с пищевым, питьевым и половым подкреплением (Alescio et al, 1985), что может свидетельствовать о действии гормона на процессы обучения и памяти вне зависимости от эмоционального фона, на котором это действие реализуется, хотя механизмы этого влияния до сих пор остаются неизвестными. Так, было показано, что вазопрессин, введенный подкожно в дозах 1 или 5 мкг/кг, приводит к улучшению обучения с пищевым подкреплением в восьмилучевом лабиринте (Packard and Ettenberg, 1985). Стоит отметить, однако, что влияние АВП на обучение с положительным подкреплением является спорным. Имеются сведения, что подкожное введение АВП в дозах 0.5 и 1 мкг/крысу нарушает выработку рефлекса с пищевым подкреплением (Andrews et al, 1983). Кроме того, внутрибрюшинное введение родственного АВП пептида - лизилвазопрессина в дозах 0.15, 0.3 и 0.6 мкг/кг стимулируют угашение условного рефлекса с пищевым подкреплением. При этом пептид не влиял на пищевую мотивацию. (.Ibragimov et al, 1988). В связи с этим было выдвинуто предположение, об избирательном влиянии вазопрессина и его аналогов на обучение с положительным подкреплением в зависимости от определенных условий окружающей обстановки (Газанов и др., 1986, Ibragimov et al, 1988).

Вазопрессин оказывает стимулирующее влияние не только на обучение интактных животных. Вазопрессин и родственные нейропептиды предотвращают или прекращают ретроградную амнезию у грызунов {Bohus et al, 1982; Rigter et al, 1974). Введение пептида приводит к нормализации процессов обучения, нарушенных каким-либо сильным амнезирующим агентом, например, электрошоком, блокатором белкового синтеза пуромицином, введением насыщенных растворов KCl или глутамата Na {Bohus et al, 1982; Flexner et al, 1977; Gibbs et al, 1986; Pfeifer, Bookin 1978; Walter et al, 1975).

Одним из методов исследования роли вазопрессина в процессах обучения является изучение особенностей выработки условных реакций у животных, тем или иным способом лишенных эндогенного гормона. Удобной моделью для изучения поведенческих реакций в такой ситуации служат крысы линии Браттлборо, у которых в результате мутации гена DI (Brattlboro diabetes insipidus) не синтезируется вазопрессин. Спонтанное поведение и уровень мотивации у таких животных, по мнению ряда исследователей {Bohus et al, 1975; Brito, 1985) практически не отличаются от нормы. В то же время, у мутантных крыс наблюдается угнетение выработки и ускорение угашения оборонительных реакций, которые устранялись введением экзогенного вазопрессина, его аналогов и фрагментов, не влияющих на эндокринную систему {De Wied and Gispen, 1977; Bohus et al, 1975).

Однако способность к обучению у крыс линии Браттлборо в значительной степени зависит от их возраста {Van Haaren et al 1985) и, следовательно, не может служить стабильным показателем. Поэтому более адекватным способом изучения поведения крыс, лишенных эндогенного вазопрессина, представляется введение антисыворотки к данному гормону нормальным животным. Внутримозговая инъекция антисыворотки приводит как к ускорению угашения УРАИ {Bohus, Urban 1978), так и к нарушению выработки оборонительных реакций {Kovacs et al, 1980; Kovacs and De Wied, 1994). Внутривенное введение антисыворотки оказало влияние на выработку и угашение эффекта только в больших дозах, приводящих к исчезновению вазопрессина в мозге.

Существуют сведения о влиянии пептида на спонтанное поведение животных. Вазопрессин регулирует такие генерализованные стереотипии, как локомоции, стойки, реакцию "сгибания-скусывания-чесания" задней конечности у крыс {Чернышева, 1995). Внутрибрюшинное и подкожное введение вазопрессина в дозе 510 мкг/кг вызывает подавление двигательной активности животных {Титов и др., 1982; Шаиакина и др, 1987 ; Meisenberg, 1982; Skopkova et al, 1987). Изменение двигательной активности в данном случае, по-видимому, является следствием вегетативного действия гормона, так как ее зависимость от дозы и временные характеристики коррелируют с развитием брадикардии, возникающей в ответ на периферический вазоконстрикторный эффект вазопрессина. Сходные изменения возникают и при одноразовом внутримозговом введении 20 нг АВП. При этом наблюдается угнетение исследовательской активности и увеличение полной неподвижности животных {Millan et al, 1984). Анализ описанных эффектов АВП и ряда его аналогов и антагонистов американскими учеными показал, что они не связаны с его действием на процессы обучения и памяти {Meisenberg and Simmons, 1982). В большинстве исследований было показано активирующее влияние АВП при различных способах введения (1мкг/кг подкожно, 1мкг/крысу при внутримозговом) на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность {Tendis et al, 1987; Gaffori and de Wied, 1985; Winnicka and Wisniewski, 1999). Внутримозговые инъекции и выброс эндогенного (при стрессе) вазопрессина запускают локомоторные реакции преимущественно активного избегания {Чернышева, 1995).

Социальное узнавание животных, принадлежащих к одному и тому же виду, облегчается при воздействии вазопрессина и родственных пептидов {Dantzer and Bluthe, 1992; Topic, Vetulani et al, 1991). Однако, социальное узнавание, которое улучшается у обоих полов животных после введения вазопрессина, нарушается под действием антагониста вазопрессина с!РТуг(Ме)АВП (30 мкг/кг, п.к.), причем только у самцов.

В отношении влияния АВП на груминг существуют разноречивые сведения. По мнению De Wied и сотрудников подкожное введение АВП в дозе 1 мкг/крысу приводит к уменьшению груминга в тесте "открытое поле" {Gqffbri and de Wied,

1985), однако по некоторым данным введение АВП в той же дозе при таком же способе введения не влияет на уровень груминга вообще (Tendis et al, 1987). Нейропептидный контроль реакций груминга, относящихся по механизму генеза к стволовым или генерализованным стереотипиям, довольно сложен. Внутримозговое или интраназальное введение нонапептидов нейрогипофиза вызывает груминги морды и/или тела, а локальное введение в преоптическое медиальное ядро гипоталамуса приводит к грумингу гениталий (Чернышева, 1995). Ряд авторов подтверждает данные о том, что внутримозговое введение вазопрессина (Змкг/крысу), также как и окситоцина, приводит к повышению груминга в новой обстановке. Это влияние опосредованно через VI-рецепторы, так как предварительное введение селективного антагониста к VI-рецепторам устраняет эффекты вазопрессина на груминг. Введение селективного антагониста к V2-рецепторам не влияло на эффекты вазопрессина в отношении груминга. Однако введение вазопрессина в этой дозе при данном способе введения параллельно приводит к гипотермии (Drago et al, 1997).

В основном все сведения о повышении груминга после введения вазопрессина получены в тестах на социальное поведение животных (Wang et al, 1994; Bamshad et al, 1997). Однако следует учитывать, что в этом случае природа груминга отличается от груминга, возникающего у одиночных животных, помещенных в незнакомую обстановку.

В настоящее время АВП и его аналог ДГАВП (АВП 1-8) широко используются в клинической практике. Наиболее распространенными дозами при интраназальном введении аргинин-вазопрессина и аналога его фрагмента АВП(1-8) - ДДАВП (1-дезамино-8-Б-Аг§-вазопрессина) являются от 10 мкг/кг до 40 мкг/кг (Naumann et al, 1991; Perras et al, 1997). Исследования влияния вазопрессина и родственных пептидов на людях показали положительный эффект на обучение, память, внимание и концентрацию (De Wied, 1997). Так, у пожилых людей с нарушением сна интраназальное введение вазопрессина в дозе 20 мкг/кг приводит к нормализации этой функции (Perras et al, 1999). При повышенной физической нагрузке АВП улучшает работоспособность людей (Бахарев и др., 1983). Введение АВП в дозе 30 мкг оказывает положительное действие на мнестические способности человека в процессе адаптации (Бахарев и др., 1981). Интраназальное введение АВП в дозе 15 мкг вызывает значительное улучшение кратковременной памяти у людей (Медведев и др., 1981). Показано улучшение состояния пациентов с посттравматической амнезией после введения вазопрессина (Hijmcin et al, 1992). Кроме того имеются сведения, что ДДАВП (1 -дезамино-8-0-Аг£-вазопрессин) оказывает стимулирующее действие на скорость решения задачи, связанной с запоминанием и опознанием конкретного предмета из ряда ранее предъявленных предметов, что, по мнению авторов, свидетельствует в пользу участия гормона в регуляции не только процессов запоминания, но и процессов внимания (Beckwith et al, 1983).

На основании многочисленных литературных данных можно заключить, что аргинин-вазопрессин, помимо антидиуретической и вазопрессорной активности, обладает нейротропной активностью, оказывает влияние на поведение животных, в том числе на обучение и память. Для вазопрессина существуют все критерии вещества, оказывающего влияние на когнитивные процессы:

- дозо- и временно-зависимые эффекты на обучение;

- присутствие этого пептида в различных областях мозга и увеличение его концентрации при различных типах поведенческой активности;

- большая эффективность после внутричерепного введения;

- нарушения процессов обучения и памяти после иммунонейтрализации самого вазопрессина, блокады гена или рецепторов вазопрессина.

Нейротропные эффекты АВП не зависят от его гормонального действия, а являются результатом прямого влияния на центральную нервную систему (De Wied andGispen, 1977; De Wied, 1997).

Особенности интраназалъного введения веществ.

В современных клинических и лабораторных исследованиях основными способами введения веществ являются подкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный и внутривенный. Перечисленные способы имеют ряд недостатков. Во-первых, попадая в периферическую систему кровообращения, вводимым веществам необходимо пройти гемато-энцефалический барьер, что приводит к снижению их концентрации и расщеплению пептид азами. Во-вторых, время жизни пептидных соединений относительно невелико, поэтому эффективность этих веществ зависит от скорости попадания их в ЦНС.

Внутрижелудочковый способ введения, обеспечивающий попадание вещества непосредственно в мозг, связан с операционным вмешательством, которое, в свою очередь, осложняет интерпретацию результатов и затрудняет перспективы их клинического использования.

В отличие от этого способа, интраназальное введение препаратов, получившее широкое распространение, имеет ряд преимуществ (Gomita et al, 1985, Su et al, 1985, Naumann et al, 1991). Во-первых, вводимые интраназально, пептидные соединения легко диффундируют через слизистую оболочку полости носа, попадая в общий кровоток (Su et al, 1985). Во-вторых, кровеносные сосуды носовой полости и области турецкого седла сообщаются. При этом контакт сосудов с мозгом осуществляется, в основном в области срединного возвышения, где, по некоторым предположениям (Deyo et al, 1986), находятся специфические клетки, способные захватывать вазопрессин. В результате, гормон быстро попадает в мозг, минуя гемато-энцефалический барьер.

В настоящее время интраназальное введение АВП и его аналога ДГАВП (АВП 1-8) используется в клинической практике.

Поведенческие эффекты фрагментов АВП

Нейротропное действие фрагментов АВП и их аналогов в настоящее время не вызывает сомнений. Эти эффекты были продемонстрированы в различных поведенческих тестах и на животных различных видов.

Предполагалось, что кольцевая структура АВП (прессинамид) важна для процессов консолидации, а С-концевая часть более важна для восстановления памяти при нарушениях (амнезии) (De Wied, 1976; Van Ree et al, 1978). В дальнейшем было показано, что вазопрессин распадается на несколько линейных фрагментов, включающих с 4 по 9 аминокислоты (De Wied, 1983; Burbach, 1983). Изучение зависимости эффектов вазопрессина от его структуры показало, что наличие С-концевого глицинамида способствует воспроизведению выработанных навыков, тогда как его отсутствие приводит к усилению влияния вазопрессина и его фрагментов на процессы консолидации (De Wied et al, 1987).

Главным пептидом, образующимся при протеолизе аргинин-вазопрессина в синаптических мембранах мозга крыс и оказывающим стабильный эффект на поведение, является гексапептид pGlu-Asn-Cys(Cys)-Pro-Arg-Gly-NH2 - АВП(4-9). При внутримозговом введении этот фрагмент вазопрессина и его аналог дезглицинамид-АВП(4-9) - АВП(4-8) облегчали консолидацию при обучении животных в тесте УРПИ (Burbach et al, 1983). Фрагменты, включающие с 4-го по 9-й аминокислотные остатки, не обладали периферической активностью, свойственной гормону-предшественнику, однако при любом способе введения оказывали эффекты на обучение (De Wied et al, 1987). Они оказывали более селективное воздействие на поведение, при этом во много раз меньших дозах, чем целый гормон (Burbach et al, 1983).

Исследования влияния различных фрагментов АВП на выработку навыков показали, что введение фрагментов, включающих с 4-го по 9-й аминокислотные остатки, сразу после сеанса обучения в тесте УРАИ вызывало улучшение сохранения выработанного навыка. Наиболее эффективным в этом тесте оказалось введение фрагмента АВЩ4-8) (De Wied et al, 1987).

При исследовании влияния АВП(4-9) на процессы памяти в радиальном лабиринте с пищевым подкреплением было показано, что введение пептида как до, так и после сеанса обучения приводило к улучшению воспроизведения выработанного навыка. Кроме того была выявлена зависимость между улучшением обучения, наблюдающемся при введении АВП(4-9) после сеанса обучения, и степенью обучаемости крыс. Введение пептида не оказывало влияние на выработку навыка у хорошо обучаемых животных, однако влияние на воспроизведение навыка сохранялось. Эти результаты показывают, что различные ответы животных на введение пептида могут быть объяснены изначально разной физиологической способностью животных к обучению. Таким образом, автор поддерживает теорию влияния вазопрессина на процессы памяти, но обращает внимание, что экзогенное введение родственных вазопрессину пептидов может улучшать память только в определенных подгруппах животных и при соблюдении определенных условий проведения эксперимента (Strupp, 1989)

По данным американских ученых, подкожное введение АВП(4-9) за 30 минут до обучения в 8-лучевом лабиринте приводило к ускорению обучения. Введение этого пептида приводило также к улучшению не только кратковременной, но и долговременной памяти (Dietrich and Allen, 1997а).

Японские ученые Fujiwara и др. обнаружили, что АВП(4-9) и АВП(5-8) более чем в 1000 раз активнее нормализуют поведение, чем АВП, при нарушении пространственного распознавания, вызываемого скополамином (De Wied, 1997; Fujiwara et al, 1997). Эти результаты согласуются с данным, полученными в другой лаборатории, так Burbach и др. показали это на примере выработке УРПИ (Burbach et al, 1983).

Было обнаружено, что вентральный гиппокамп более чувствителен к АВП(4-9). Введение АВП(4-9) приводило к увеличению выброса ацетилхолина в гиппокампе на фоне действия скополамина. Ретроградную амнезию, вызываемую введением пентилентетразола, в наибольшей мере ослабляли фрагменты АВП(4-9) и АВП(5-9) (De Wied et al, 1987).

Инъекция другого фрагмента АВП - дезглшданамида-(А^8)-вазопрессина (ДгАВП—АВП(1-8)) - приводила к улучшению не только обучения в тесте норковой камеры, но и приводило к улучшению кратковременной, долговременной памяти и пространственной памяти (Vawter and Van Ree, 1995). Эффекты ДгАВП на все типы памяти находились в прямой зависимости от дозы введенного пептида. В дальнейшем эти же ученые показали, что к улучшению долговременной и кратковременной памяти при обучении в тесте норковой камеры приводит также введение АВП(4-8). Было сделано предположение, что влияние ДгАВП на поведение включает в себя эффекты, оказываемые фрагментом АВП(4-8) (Vawter et al, 1997). Кроме того, введение ДгАВП также приводит к облегчению выработки условного рефлекса с пищевым подкреплением (Ibragimov et al, 1988).

Liu et al показали, что введение в течение первых 14 дней АВП(4-8) и аналога АВП(1-8) - 1 -дезамино-8-D-Arg-вазопрессина (ДДАВП) в отличие от D-Arg-ABn(4-8) значительно облегчало выработку и сохранение рефлекса выбора отсека лабиринта по освещенности (Liu et al, 1990).

Введение АВП(5-8) влияет на процессы консолидации (De Wied et al, 1987). В дальнейшем было показано, что инъекция фрагмента АВП(5-8) в малых дозах приводила к облегчению выработки УРПИ. При введении сразу после обучения действие этого пептида оказывалось более эффективным, чем действие целой молекулы вазопрессина (Kovacs and De Wied, 1994).,

Некоторый ингибирующий эффект ацетилированного вазопрессина был показан при исследовании влияния АВП(5-8) на выработку УРПИ.

De Wied и другие авторы показали, что АВП(5-9), введенный перед повторным тестированием, оказывает влияние на процессы воспроизведения, т.к. приводит к облегчению воспроизведения УРПИ {De Wied et al, 1987).

Китайские ученые исследовали влияние АВП и его аналога ДДАВП (1-дезамино-8-0-А^-вазопрессина) на развитие становления и развития способности к обучению. Для этого пептиды вводили в течение первых 14 дней жизни крысят. Спустя 1 или 3 месяца после введения препаратов проводили выработку условных реакций избегания. Было показано, что у крыс, которым вводили пептиды, наблюдается значительное улучшение обучения и сохранение выработанных навыков в тестах выработки условных реакций избегания. Это дало основание предположить, что АВП и ДДАВП влияют на развитие способности к обучению, а также на процессы, связанные с хранением и воспроизведением информации {Chen et al, 1988).

Исследования влияния фрагментов АВП на поведение животных показали, что при замедлении угашения УРАИ С-концевой трипептид - Pro-Arg-Gly был эффективнее АВП {Walter et al, 1978). Следовательно наименьшим фрагментом АВП оказывающим влияние на поведение и обучение животных является, по-видимому, АВП(7-9).

Введение аналога фрагмента АВП [d(CH2)l(5),Tyr(Me)2]AVP облегчало процессы воспроизведения реакции пассивного избегания у животных {Саг et al, 1995). Этот же аналог, применяемый после амнезии, вызванной гипоксией и электрошоком, способствовал восстановлению выработки УРПИ у исследуемых животных {Саг et al, 1995).

Другой аналог аргинин-вазопрессина [d(CH2)l(5),Tyr(Me)2,delta3Pro7] АВП, оказывая такое же влияние на воспроизведение УРПИ, не влиял на выработку УРАИ, однако нормализовал нарушение обучения, вызванное введением алкоголя {Саг et al, 1993).

При подкожном введении катионизированного аналога фрагмента АВЩАВП4-9) - К-АВЩ4-9) за 1.5 часа до повторного тестирования при выработке УРПИ был выявлен улучшающий эффект пептида на процессы формирования навыка (ТапаЬе е1 а1, 1997).

Было показано, что рС1и-А8п-8ег-Рго-А^-С1у-1ЧН2 (N01900) активный аналог фрагмента АВП оказался более стабильным, чем АВП(4-9) и обладал в 5 раз большим временем полужизни, чем природный фрагмент АВЩ4-9). Внутрижелудочковое введение бета-амилоидного белка (1-40) приводит к нарушению процессов обучения и памяти, связанных с нарушением функционирования ДА-ергической и холинергической систем. На этом фоне введение N01900 нормализует процессы обучения и памяти. Кроме того, инъекция этого пептида увеличивает холинацетилтрансферазную активность во фронтальной коре крыс, которым вводили бета-амилоидный белок (1-40). Все это позволяет предположить, что КС-1900 может быть использован при лечении больных с синдромом Альцгеймера (Тапака е1 а1, 1998).

Другими авторами (Нггай е1 а1) показано, что введение другого пептида, подобного АВП(5-8) - р01и-Азп-8ег-Рго-Аг§-ЫН2 (N0 302), где остаток Суэ заменен Бег, приводит к 5-тикратному увеличению активности в улучшении состояния после амнезии у крыс, вызываемой введением циклогексамида, по сравнению с АВП(5-8). Кроме того, этот пептид (N0 302) оказался более стабилен к разрушению пептидазами (Ое Шгес1, 1997, Fujiwara et а1, 1997).

Зоосоциальное узнавание животных, принадлежащих к одному и тому же виду, облегчается при воздействии фрагментов вазопрессина. При второй посадке социальные контакты крыс уменьшаются. Это уменьшение контактов принято считать критерием обучения. Контакты возобновляются через 1 час и более после 1-й посадки. Было показано, что введение ДгАВП и АУР(4-8) увеличивало время зоосоциалъного узнавания до 2 часов, что объясняется влиянием этих пептидов на процессы восприятия объекта и выработки навыка (Роргс, Шокеппк е/ а1, 1991; БекщисЫ е/ а1, 1991).

Ученые из Нидерландов выявили зависимость влияния на социальное узнавание от структуры родственных вазопрессину пептидов. Было показано, что инъекция АВП(1-8), АВП(1-7) и АВП(1-6) сразу после первого предъявления другой особи приводило к облегчению социального узнавания спустя 24 часа. Таким образом, было сделано предположение, что способность выработки долговременного облегчения социального узнавания присуща АВП-родственным пептидам, имеющим в своей структуре кольцо H-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 (Popik and Van Ree, 1992). Однако наличие кольца не является обязательным условием, так как, например AVP-(4-8), не имеющий кольца в своей структуре, также оказывает влияние на облегчение социального узнавания.

Таким образом, нейротропные эффекты фрагментов АВП и их аналогов в настоящее время не вызывают сомнений. Эти эффекты были продемонстрированы в различных поведенческих тестах и на животных различных видов.

Рецепторы к АВП

Поведенческие эффекты АВП и его фрагментов, включающие в себя влияние на процессы обучения и запоминания, не вызывают сомнений, однако физиологический механизм этого явления не совсем ясен.

В периферических тканях рецепторы, чувствительные к гормону, изучены достаточно хорошо. Рецепторы типа Via, опосредующие вазоконстрикторное действие гормона, локализованы в клетках гладкой мускулатуры кровеносных сосудов, рецепторы Vlb (3-клеток поджелудочной железы опосредуют инсулинотропный эффект вазопрессина, рецепторы V2, опосредующие антидиуретический эффект вазопрессина, находятся в почечных канальцах. Все рецепторы (VI и V2 для вазопрессина и рецепторы для окситоцина) были клонированы и показали высокую степень схожести. По строению они принадлежат к суперсемейству G-белок содержащих рецепторов с 7 трансмембранными доменами (Birnbaumer et al, 1992; Kimura et al, 1992; Lolait et al, 1995; Morel et al, 1992). VI и V2-peHeirropbi отличаются друг от друга по степени сродства к лиганду и механизмами активации внутриклеточных процессов.

Ранее считалось, что за связывание молекулы с циторецепторами соответствующих органов-мишеней ответственна кольцевая часть молекулы гормона и, прежде всего аминокислота, находящаяся в 3-м положении. По-видимому, за принципиалъную возможность гормон-рецепторного взаимодействия ответственна структура всей 1-6-петли, а силу данного взаимодействия с тем или иным типом рецепторов и специфику эффекта определяют остатки в 3-м положении петли. Роль актона, по существующим представлениям, выполняют боковая цепь и остаток тирозина во 2-м положении (Розен, 1994). Однако сейчас имеются сведения, что АВЩ4-9), не имеющий в своей структуре кольца и аминокислоты в 3 положении, активирует Vla-рецепторы (Gouzenes et al, 1999).

Вазопрессин относится к нейропептидам, которые способны в зависимости от типа рецепторов изменять содержание как циклических нуклеотидов, так и продуктов гидролиза фосфоинозитидов. Активация Vl-рецепторов сопровождается индукцией диацилглицерола и инозитидфосфатов (Shewey and Dors а, 1988). Механизм активации Vl-рецепторов вазопрессина сходен с таковым для а-адренорецепторов и Н1-гистаминовых рецепторов (Напке and Janssnes, 1983) и связан с накоплением свободных ионов Са2т в цитозоле (Michel! et al, 1979; Mclnture and Pollock, 1982; Berthon et al, 1985; Hess et al, 1991; Lolait et al, 1995). Именно этим объясняется стимуляция под влиянием вазопрессина секреции норадреналина, тиролиберина, соматолиберина и гонадотропинов, кортикотропина и кортиколиберина.

Через этот же Са2 -зависимый механизм опосредуется воздействие гормона на сокращение гладких мьшщ стенок сосудов, выраженное в виде локальной вазоконстрикции при активации VI. Однако в стволе мозга, в сосудодвигательном центре, те же рецепторы опосредуют генерализованные эффекты вазопрессина на системное артериальное давление. В этих структурах пептид выделяется из гипоталамических терминалей синаптически как медиатор. В гепатоцитах печени действие вазопрессина, сопряженное с активацией Gi-белков, приводит к усилению глюконеогенеза и гликолиза. В почечных гломерулах Via сопряжен с GPLA2-белками, что, через синтез PgE2 из арахидоновой кислоты, приводит к вазодилатации афферентных артериол и увеличению объемного кровотока в гломерулах, способствуя процессу фильтрации плазмы (Чернышева, 1995).

В результате активации У2-рецепторов стимулируется активность внутриклеточной цАМФ (Michell et al, 1979; Block et al, 1981; Philips et al, 1990). Через V2-рецепторы, локализованные в почечных гломерулах, и ОРЬА2-белки, однонаправленный эффект гормона через Via и V2 суммируется. Но в дистальных почечных канальцах и собирательных протоках, где в клетках эпителия выявлены V2, сопряженные с Gs-белками, воздействие вазопрессина сводится, в основном, к антидиурезу. Эффект основан на экспрессии гена белка водных пор (Water pores, WP), - СН1р28. Этот белок образует гомотетрамер водного канала плазмалеммы, через который вазопрессин-зависимо транспортируется до 90% воды, поступающей в клетку. Проницаемость водной поры зависит от фосфорилирования ее белка СаСаМ-зависимой киназой, стимуляция которой происходит при активации Gq-белка, сопряженного с V2-рецептором. Реабсорбция воды сопряжена и с усилением анти-Na+-уреза под влиянием вазопрессина.

Аналогичный тип V2-рецепторов обнаружен и в ЦНС - на уровне сосудистых сплетений желудочков мозга (в циркумвентрикулярных органах). Здесь вазопрессин, регулируя водную проницаемость, контролирует объем спинномозговой жидкости, чем определяет величину внутричерепного давления. Показано, что в нервной ткани вазопрессин увеличивает связывание воды с протеогликанами во внеклеточном матриксе нейронов и глии. Насыщенность нейропиля водой, таким образом, в значительной мере вазопрессин-зависима. Кроме того, через \'2-рецепторы гормон (как и через Via) активирует ОРЬАг-белки с последующим синтезом PgE2, вызывающим вазодилатацию сосудов (Чернышова, 1995).

Рецепторы Vlb (иногда называемые V3) Р-клеток поджелудочной железы опосредуют инсулинотропный эффект вазопрессина, связанный с активацией Gq-белков и последующими Са-зависимыми - деполяризацией мембраны и экзоцитозом инсулина. Этому способствует и ингибирование вазопрессином гиперполяризующих АТФ-чувствительньк К+-каналов. В зонах миогенных водителей ритма сердца и бифуркаций артерий Vlb сопряжены с быстрыми потенциал-чувствительными К+-иоиными каналами, участвующими в генерации миоцитами спонтанных потенциалов действия. Выделенный в аденогипофизе рецептор вазопрессина на основании специфики его аффинности к агонистам и антагонистам отнесен к Vlb.

Рецепторы окситоцина, а также вазопрессина:Via и Vlb обнаружены во многих областях мозга, однако наиболее они представлены в гиппокампе (Lolait et al, 1995). Кроме того, существуют доказательства присутствия в мозге V2-peuerixopoB (Hirasawa et al, 1994).

Чувствительность рецепторов к вазопрессину очень велика. Так, для нейрона моллюска пороговые концентрации составляют для вазопрессина 10~16 г/мл. Различие порогов и сродство окситоцина к V2 и Vlb приводят к опосредованию через эти типы рецепторов действия гормона при его высоких концентрациях, что объясняет частичное перекрытие эффектов нонапептидов в этих условиях (Чернышева, 1995).

Было установлено, что если для вазопрессина основные места связывания в мозге располагались в вентральной части гиппокампа, центральных ядрах миндалины, ядрах солитарного тракта и обонятельных ядрах, то для фрагментов АВП основные места связывания находились в эпифизе, ядрах солитарного тракта, области аркуатных ядер, и концевой пластинки (De Kloet; Voorhuis et al, 1985; De Kloet, Rotteveel et al, 1985). Кроме того, введение в наномолярных концентрациях фрагментов АВП(4-8) и АВП(4-9) вызывало увеличение концентрации внутриклеточного Са2+ в нейронах и астроцитах области концевой пластинки мозга (.Jurzaketal, 1995).

По последним данным АВП(4-9) активирует Vla-рецепторы, находящиеся в супраоптических нейронах в мозге крысы. Французскими учеными было показано дозозависимое возрастание концентрации внутриклеточного Са2+ в нейронах супраоптического ядра под влиянием АВП(4-9). Этот эффект блокировался введением специфического антагониста Yla-рецепторов SR 49059 (Gouzenes et al, 1999).

Модулирующее влияние АВП на нейромедиаторные системы

В настоящее время собраны обширные сведения по вопросу о влиянии АВП и его фрагментов на различные нейромедиаторные системы мозга. Существуют доказательства влияния вазопрессина на норадренергическую, дофаминергическую и серотонинергическую системы (Kovacs and De Wied, 1994).

Значительное число работ посвящено изучению взаимоотношений вазопрессина и катехоламинов в регуляции поведения. Так, было показано, что в эффектах вазопрессина на обучение и память, выражающихся в облегчении воспроизведения в тесте условной реакции пассивного избегания, принимают участие проекции дофаминергических волокон в ядрах латеральной перегородки, но не в центральной миндалине (Winnicka, 1996; Winnicka et al, 1998). Имеются сведения, что эффекты вазопрессина на социальное узнавание опосредуется в частности через норадренергические волокна обонятельных луковиц (Dluzen et al, 1998). Обнаружено, что инъекция АВП в структуры, иннервируемые норадреналинсодержащими волокнами, облегчает выработку условной реакции пассивного избегания (Kovacs, Bohus et al, 1980). Кроме того, норадренергические волокна, имеющие проекции в красном ядре концевой пластинки, принимают участие в облегчении под действием вазопрессина выработки условной реакции с отрицательным подкреплением (Опака and Yagi, 1998). Предполагается, что в процессах влияния вазопрессина на консолидацию задействованы норадренергические проекции голубого пятна на конечный мозг (Van Wimmersma Greidanus et al, 1983; De Wied, 1997). Есть данные, свидетельствующие о том, что свои эффекты на консолидацию вазопрессин может осуществлять посредством связывания с норадренергическими и дофаминергическими нейронами латеральной перегородки. При этом вазопрессин связывается с VI рецепторами, расположенными на катехоламинергических нейрорнах, находящихся в латеральной перегородке, вызывая выброс норадреналина и дофамина (Ishizawa et al, 1990). Кроме того, по мнению ряда исследователей (Gabor et al, 1979; Kovacs et al, 1980; Winnicka and Wisniewski, 1999), различного рода нарушения функции катехоламинергической системы влекут за собой исчезновение положительного влияния вазопрессина на обучение. Однако нельзя не отметить наличия работ, подтверждающих независимость центральных эффектов вазопрессина от функции системы катехоламинов. Имеются данные о сохранении улучшающего действия ДДАВП на выработку УРПИ, осуществляемую на фоне дисфункции катехоламинергической системы (Hamburger-Bar et al, 1985). В связи с этим можно говорить о взаимовлиянии вазопрессинергической и катехоламинергической систем в регуляции различных функций (Metzger et al, 1994). В пользу этого свидетельствуют и данные биохимических исследований. С одной стороны, известно, что вазопрессин участвует в регуляции метаболизма дофамина и норадреналина в различных отделах мозга (Dunn et al, 1982; Hanley et al, 1984). Однако, при этом сведения о направленности его эффектов разноречивы. Наряду со сведениями об увеличении уровня норадреналина и дофамина под действием вазопрессина, существуют данные о снижении содержания катехоламинов и ускорении оборота дофамина при введении гормона (Van Heuven-Nolsen et al, 1985; Tanaka et al, 1977).

По-видимому, разногласия по поводу эффектов вазопрессина могут, по крайней мере, частично, объясняться использованием различных способов введения гормона, в зависимости от чего вовлекаются либо периферические, либо центральные механизмы; кроме того, существенную роль играет выбор структур мозга, в которые вводят пептид, и где регистрируют содержание медиаторов. Тем не менее, можно с уверенностью утверждать, что вазопрессин, так или иначе, участвует в регуляции функции этой медиаторной системы.

Привлекает внимание исследователей и вопрос о взаимоотношениях вазопрессина с серотонинергической системой. На основании данных, показавших угнетение положительного эффекта аналогов АВП на выработку условной реакции пассивного избегания в условиях повышенного содержания серотонина, Кругликов и соавт. (Кругликов и др., 1985) делают вывод о необходимости оптимального функционального состояния серотонинергической системы для проявления эффекта пептида.

Существует также гипотеза о вторичной, опосредованной норадреналином, роли серотонинергической системы в реализации центрального действия вазопрессина. Эта гипотеза основана на многочисленных данных (Gabor et al, 1979; Joels, Urban, 1985; Kovacs et al, 1980; Wolkowitz et al, 1985) о норадренергической регуляции функции ядер шва - основного источника серотонина в мозге. Так, с одной стороны, инъекция АВП в ядра шва облегчала выработку УРПИ, с другой -разрушение этой структуры или блокада рецепторов серотонина не препятствовали проявлению эффекта вазопрессина, в то время как нарушение норадренергической регуляции функции ядер шва полностью блокировало его (Gabor et al, 1979; Kovacs et al, 1980). По-видимому, и разноречивость данных о влиянии серотонина на секрецию вазопрессина можно объяснить именно отсутствием непосредственного взаимодействия вазопрессин- и серотониергической систем. Например, существуют сведения, что при инкубации культуры клеток нейрогипофиза с серотонином изменений в выбросе АВП не наблюдается (Hisada et al, 1977). Кроме того, введение ДГАВП не влияло на содержание серотонина (Кругликов и др., 1991). Однако усиление передачи в серотонииергических синапсах приводит к увеличению уровня вазопрессина в плазме (Iovino et al, 1985).

С другой стороны, существуют многочисленные сведения об облегчающем влиянии дофамина и норадреналина на секрецию обоих гормонов задней доли гипофиза (Hisada et al, 1977; Day et al, 1984; Brooks et al, 1986; Moos et al, 1982; Ochiai et al, 1990; Shioda et al, 1992; Knigge et al, 1999). Известно, что при стрессе, в том числе осмотическом, секрецию вазопрессина активирует норадреналин (как гормон и медиатор). С дугой стороны введение вазопрессина ведет к накоплению норадреналина в гипоталамусе, таламусе и продолговатом мозге вследствие пресинаптического торможения медиации норадреналина. Таким образом, между вазопрессином и норадреналином существует положительная обратная связь (Чернышева, 1996). Иммуноцитохимические и функциональные исследования свидетельствуют в пользу тесного взаимодействия нейрогипофизарных гормонов и катехоламинергической системы в регуляции вегетативных и поведенческих реакций. Это необходимо иметь в виду, так как катехоламины участвуют в регуляции неспецифических механизмов памяти, реакции активации, оценки значимости стимула и силы подкрепления (Wolfowitz et al, 1985).

В последнее время большое внимание уделяется вопросам взаимодействия вазопрессина с другими медиаторными системами. Появились данные о том, что ацетилхолин, усиливая секрецию вазопрессина, участвует таким образом в регуляции водно-солевого баланса (Iovino et al, 1985; Gregg, 1985). Имеются сведения, что вазопрессин является модулятором центральной холинергической системы, принимающей активное участие в процессах, связанных с процессами воспроизведения (Faiman et al, 1992).

В регуляции секреции и выброса вазопрессина основную роль играет уровень осмоляльности плазмы (осмотическая регуляция) и уровень кровяного давления или общего объема крови в организме (неосмотическая регуляция) (Ban, Yoshida, 1993; Mann et all, 1999). Некоторые нейромедиаторы, гормоны и другие химические агенты оказывают модулирующее влияние на выброс АВП. Например, у крыс, которым вводили диоксикортикостерон-ацетат, наблюдалось увеличение количества АВП в паравентрикулярном ядре (Saravia, 1999). Такие пептиды, как соматостатин, тиролиберин, кортиколиберин, ß-эндорфин, ангиотензин II, нейротензин, холецистокшшн, вещество Р и ВИП при введении извне также вызывают выброс вазопрессина в мозге (Ашмарин, Каразеева, 1996). Тот же эффект достигается при введении L-аргинина (Cao and Shen, 1998). Однако в работах американских ученых показано, что центральный N0 подавляет выброс вазопрессина из крупноклеточных структур (Liu el al, 1998, Kadekaro et al, 1998). Имеются сведения, что ГАМК вызывает выброс АВП, действуя через ГАМК-рецепторы типа A (Isobe, Nishino Н, 1997).

Такие пептиды как энкефалин и натрийуретический гормон подавляют выброс вазопрессина (Ашмарин, Каразеева, 1996).

В свою очередь, сам вазопрессин обладает свойствами либеринов и статинов. АВП подавляет выброс тиролиберина и пролактина и активирует выброс таких пептидов как: АКТГ, (3-эндорфин, соматотропин и тиреотропин (Аишарин, Каразеева, 1996).

В гонадах и надпочечниках вазопрессин ингибирует секрецию андрогенов. При этом кортиколиберин, оказывающий схожее с нонапептидами воздействие на многие процессы организма, синтезируется вместе с ними в одних нейросекреторных центрах и клетках гипоталамуса и может выделяться в одних везикулах с окситоцином или вазопрессином.

В вазопрессинергических клетках гипоталамуса синтезируется кортиколиберин. Кроме того, там синтезируются такие нейропептиды как галанин, динорфин, лей-энкефалин, тиролиберин и холецистокшшн. При разных функциональных состояниях соотношение синтезируемых в одной нейросекреторной клетке гормонов меняется. В значительной мере это связано со степенью синергичности их воздействий на метаболизм с эффектами нонапептидов. Так, в гепатоцитах гликогенолиз и глюконеогенез усиливают вазопрессин, окситоцин и холесцистокинин. В нейронах и тимоцитах вазопрессин усиливает трансмембранный транспорт глюкозы (Чернышева, 1996).

Что касается действия фрагментов АВП, то имеются данные о том, что АВП(4-9) стимулирует выброс ацетилхолина в гиппокампе у свободно движущихся крыс (Maegawa et al, 1982) и повышает выброс ацетилхолина, действуя на VI-рецепторы (Wan et al, 1992).

Аналог AVP(4-9) No302 (синтетический гексапептид), имеющий более продолжительный период полужизни, при внутримозговом введении в меньших дозах, чем AVP(4-9), компенсировал нарушения памяти животных, вызванные введением скополамина. Этот пептид, по-видимому, может быть с успехом применен при лечении холинергической дисфункции (например, болезнь Альцгеймера) (Fujiwara, 1997).

Возможные механизмы влияния АВП, его фрагментов и аналогов на обучение.

Результаты исследований влияния АВП на поведение животных подтвердили модулирующую роль этого гормона и родственных нейропептидов на консолидацию и процессы воспроизведения полученной информации. Место действия этих пептидов - лимбическая система (миндалина, гиппокамп, перегородка и некоторые части таламуса). Наиболее чувствительной областью при влиянии вазопрессина на выработку условной реакции пассивного избегания оказался вентральный гиппокамп (Kovacs et al, 1986). При введении вазопрессина внутрь гиппокампа его влияние оказалось более чем в 100000 раз активнее, чем при периферическом введении. Показано, что эта область гиппокампа принимает вазопрессинергические пути (Buijs et al, 1983) и содержит предполагаемые рецепторы для вазопрессина и окситоцина (Barberis, 1983; Biegon et al, 1984; Elands et al, 1992).

По мнению М.П. Чернышовой, влияние вазопрессина на механизмы памяти значительно превышает воздействия других гормонов на уровне нейрона и организма в целом. Последнее, по-видимому, можно объяснить с точки зрения гипотез о механизмах фиксации и извлечения энграмм памяти. Известно, что в таковых участвуют белки, возможности конформации которых позволяют фиксировать до

28 л

10 бит информации, и вода, изменения структуры молекулы которой позволяют фиксировать 1019 бит. Деполяризация мембраны, вызванная действием вазопрессина, влияет на проницаемость воды, на конформацию белков плазмалеммы и внеклеточного матрикса, а также на структуру воды, связанной с ними и протеогликанами. По-видимому, именно это суммарное воздействие обусловливает столь значимое влияние гормона на механизмы памяти (Чернышева, 1995).

Воздействие нейрогипофизарных гормонов на выработку УРПИ может быть заблокировано введением специфических антагонистов VI-рецепторов, V2-рецепторов и рецепторов окситоцина. Так как аффинность вазопрессиновых антагонистов для мест нахождения окситоциновых рецепторов довольно высока, то постулировано, что эффект и вазопрессина и окситоцина опосредуется через окситоциновые рецепторы в вентральном гипоталамусе. Вазопрессин может действовать через этот неселективный рецептор как агонист, а окситоцин как "обратный" агонист {De Wied et al, 1991).

Имеются сведения, что действие вазопрессина на память может быть объяснено возбуждением нейронов гиппокампа и перегородки. В некоторых нейронах в области латеральной перегородки высвобождение вазопрессина вызывает одиночную активность, видимо играя роль нейромедиатора {Joels and Urban, 1984). У большинства нейронов этой области вазопрессин вызывает высвобождение глютамата, выполняя функцию модулятора проводящих путей лимбического среднего мозга.

Рассечение глутаматергических связей между височной и энторинальной областями коры мозга приводило к ослаблению эффектов вазопрессина на выработку пассивного избегания. Из этого было сделано предположение, что влияние вазопрессина на выработку УРПИ опосредуется через височно-энторинальные связи {Winnieка and Wisniewski, 1999).

Под действием вазопрессина при обучении в таких областях мозга как: зубчатое ядро, гиппокампальная область САЗ и латеральная область перегородки, возрастает экспрессия Fos и Fos-подобных белков. Это свидетельствует о том, что влияние АВП на процессы консолидации включает в себя активацию этих областей мозга {РаЪап et al, 1999).

Интересен момент включения вазопрессина в процессы долговременной потенциации {Van den Hoof et al, 1989). Chen et al {Chen et al, 1993) показали, что наномолярная концентрация вазопрессина вызывает продолжительное увеличение амплитуды и временного хода вызванных постсинаптических потенциалов (ВПСП) в зубчатом ядре, в присутствии Са2+, причем процесс продолжается и после удаления вазопрессина из перфузата. Этот эффект был назван долговременной потенциацией вазопрессина и блокировался специфическими антагонистами VI-рецепторов.

Особого внимания заслуживают данные о фосфорилировании мембранного белка (В-50) после воздействия вазопрессина. Фосфорилирование В-50 коррелирует с процессами запоминания. Минимальные эффективные концентрации вазопрессина

9 8 составляют 10" - 10" М, т.е. сопоставимы с существующими и возникающими in vivo. Большие концентрации - 10"3-10"4М вызывают обратный эффект. Вазопрессин оказался также активатором (посредством индукции фосфорилирования) метилтрансферазы фосфолипидов, превращающей фосфатидилэтаноламин в фосфатидилхолин. Эти данные представляют большой интерес в связи с вероятной ролью фосфоинозитидов в активации клеток-мишеней при связывании нейромедиаторов и гормонов с мембранными рецепторами. Трифосфоинозитид обладает высокой степенью сродства к Ca и рассматривается как возможный регулятор концентрации Ca в пресинаптических окончаниях (Ашмарин, Каразеева, 1996).

Эффект фрагментов вазопрессина АВЩ4-9) и АВЩ5-8) на выработку условной реакции пассивного избегания блокируется всеми 3-мя антагонистами вазопрессиновых и окситоциновых рецепторов, которые также блокируют и эффекты вазопрессина на УРПИ. При этом антагонисты окситоцина проявляют более высокую способность к блокаде этих эффектов. Однако эти фрагменты не показали аффинность к местам нахождения рецепторов вазопрессина и окситоцина в мозге (De Kloet; Voorhuis et al, 1985).

Было показано, что повреждения в гиппокампе, связанные с NMDA-рецепторами, блокируют эффекты АВЩ4-9) в радиальном лабиринте (Dietrich and Allen, 19976). Это дало возможность предположить, что эффекты АВП на память опосредуются через гиппокамп, однако не ограничиваются только этим путем (Dietrich and Allen, 19976).

Японские ученые синтезировали новый аналог АВП(4-9) катионизированный АВП(4-9) (К-АВП(4-9)). Через 1.5 часа после подкожного j 25 введения при использовании радиометки J было показано присутствие К-АВЩ4-9) в головном мозге, мозжечке и спинном мозге. Кроме того, в гомогенате головного мозга крысы К-АВП(4-9) был превращен в АВП(4-9). Недавно было показано, что К-АВП(4-9) проходит через гематоэнцефалический барьер и в головном мозге

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на половозрелых самцах нелинейных белых крыс массой 180-230 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария, все эксперименты проводили с 10 до 17 часов. Всего в работе использовано 2518 крыс.

В экспериментах применяли следующие препараты: тетрапептид Ac-D-MPRG (N-Ac-D-Met-Pro-Arg-Gly-NH2), синтезированный в Институте Биоорганической химии АН Беларуси (Минск). пептид семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), синтезированный в лаборатории регуляторных пептидов Института молекулярной генетики РАН.

С целью изменения функционального состояния системы биогенных аминов мозга применяли следующие фармакологические агенты: галоперидол (з-д Гедеон Рихтер, Будапешт, Венгрия) и аминазин отечественного производства.

С целью изменения функционального состояния центральной холинергической системы применяли блокатор центральных М-холино-рецепторов - бипериден ("Акинетон", фирма Кноль, Германия)

Все пептиды вводили интраназально, в водном растворе из расчета 0.1 мл/кг веса животного. Аминазин и галоперидол вводили внутрибрюшинно в водном растворе из расчета 1 мл/кг. Бипериден вводили подкожно в водном растворе из расчета 1 мл/кг. Контрольным животным вводили эквивалентные объемы дистиллированной воды.

Первым вопросом, возникающим при сравнении нового аналога с его прототипом, является вопрос, о том, в каких дозах новый аналог может оказывать эффект. Наиболее распространенные дозы при интраназальном введении аргинин-вазолрессина и его аналога фрагмента АВП(1-8) - ДДАВП являются от 10 мкг/кг до 40 мкг/кг (Naumann et al, 1991; Perras et al, 1997). Известно, что фрагменты АВЩ4-9), АВЩ4-8), АВП(5-9) и их аналоги при других способах введения эффективно влияют на процессы обучения и памяти в значительно меньших дозах - от 0.1 мкг/кг до 5 -41 мкг/кг (Lin et al, 1990; Vawter et al, 1997). Мы выбрали интраназальное введение и диапазон доз от 0.001 мкг/кг до 10 мкг/кг. Наименьшая из использованных нами доз была меньше, чем используемые дозы фрагментов АВП, применяемые подавляющим большинством авторов, так как ожидалось, что пептид должен отличаться высокой устойчивостью к действию пептидаз, и следовательно высокий биологической эффективностью.

Дозы и сроки введения препаратов:

Ac-D-MPRG в дозах 0.001; 0.01; 0.1; 1 и 10 мкг/кг за 5, 30 минут и 1 час до начала опыта, а также сразу после окончания сеанса обучения; семакс - 50 мкг/кг за 30 минут до начала экспериментов; аминазин - 2.5 мг/кг за 15 минут до начала экспериментов; галоперидол - 0.1 мг/кг за 20 минут до начала экспериментов; бипериден - 1 мг/кг за 15 минут до начала экспериментов.

В опытах по исследованию совместного действия Ac-D-MPRG и других фармакологически активных препаратов использовали 4 группы животных:

1) контроль (2 инъекции воды);

2) препарат (инъекция препарата и инъекция воды);

3) Ac-D-MPRG (инъекция воды и инъекция пептида);

4) сочетанное введение (инъекция препарата и инъекция пептида).

-421. Регистрация двигательной активности и ориентировочно-исследовательского поведения животных

1.1. Актометр "Opto-Varimex"

Прибор "Opto-Varimex" (фирма "Columbus Instrum", США) позволяет раздельно регистрировать горизонтальную и вертикальную компоненты двигательной активности при помощи встроенных фотодатчиков. Размер камеры составляет 40x40x25 см. Регистрацию осуществляли в тишине и темноте в течение 30 минут. Оценку двигательной активности производили в условных единицах приборов. Динамику двигательной активности оценивали суммарно по 5 минут, точки кривой соответствуют регистрации: 5-10, 11-15, 16-20, 21-25 и 26-30 минутам регистрации.

1.2. Тест "открытое поле"

Открытое поле (Hall, 1936; Титов и др., 1980) представляет собой арену диаметром 80 см с деревянным полом, расчерченным восемью диаметрами и двумя концентрическими окружностями, находящимися на равном расстоянии друг от друга. Арена окружена стенкой высотой 40 см. Над ареной на высоте 80 см помещена электрическая лампа мощностью 200 Вт, бытовой электрический звонок и красная лампа мощностью 15 Вт.

При тестировании животное помещали в центр арены и в течение 2-х минут визуально оценивали следующие показатели: горизонтальную двигательную активность (пробег) - количество пройденных секторов, вертикальную двигательную активность (стойки) - число подъемов на задние лапы, количество отходов от стенки арены - число пересечений внешней концентрической окружности, количество выходов в центр арены - число пересечений внутренней окружности, груминг - число касаний морды лапами.

Исследования проводились в двух модификациях: "бесстрессориой" - на фоне белого шума и при свете красной лампы, "стрессогенной" - при включенных мощной лампе и звонке

1.3. Тест "норковая камера"

Норковая камера (Makanjuola et all, 1977.) представляет собой ящик из органического стекла, 40x40x30 см с семнадцатью круглыми отверстиями в полу (норками), диаметр каждого отверстия составляет 3 см. Пол камеры расчерчен на 9 квадратов. При тестировании животное помещали в правый верхний угол камеры и в течение 3-х минут визуально регистрировали следующие показатели: горизонтальную двигательную активность (пробег) - число пройденных квадратов, вертикальную двигательную активность (стойки) - число подъемов на задние лапы, груминг - число касаний морды лапами; число обследованных норок. Все показатели оценивали суммарно за 3 минуты.

Опыты проводились при свете красной лампы на фоне белого шума.

2. Определение болевой чувствительности животных

2.1. Тест "отдергивания хвоста"

В работе использован стандартный "tail flick"-test (метод отдергивания хвоста), реализуемый с помощью анальгезиметра Analgesia test, Tail-flick, Type 812 фирмы "Hugo Sachs Elektronik" (Germany). В ходе тестирования животное удерживается рукой внутри экспериментальной установки. При этом на его хвост воздействует сфокусированный пучок световых лучей, оказывающий болевое воздействие. Регистрируется время отдергивания хвоста до, и после введения препарата. Всего делали 3 измерения исходной и 9 измерений болевой чувствительности после введения препаратов с интервалами в 5 минут. Для дальнейших вычислений использовали значение исходной болевой чувствительности, усредненное за 3 измерения, и значения приобретенной болевой чувствительности отдельно по каждому измерению.

3. Исследование различных видов обучения животных

3.1. Выработка условной пищедобывательной реакции на место

Выработку условной пшцедобывательной реакции на место производили в стандартном Т-образном лабиринте (размер рукавов - 30x10 см, стартовой камеры -20x10 см). В первый день эксперимента животных помещали на 1 час в лабиринт с пищевым подкреплением в виде хлеба, разделенного на мелкие кусочки, общей массой 50 грамм с целью адаптации и угашения ориентировочно-исследовательской реакции. Затем крыс не кормили в течение суток. В последующие 4 дня каждое животное помещали в лабиринт по 5 раз подряд ежедневно, причем длительность каждой посадки не превышала 3-х минут. Инъекции препаратов производили ежедневно. В качестве пищевого подкрепления использовали хлеб, который помещали в один из рукавов лабиринта. В опытах визуально регистрировали следующие показатели: латентный период (ЛП) - время от момента посадки до выхода из стартовой камеры, время реакции - время, понадобившееся животному для достижения требуемого отсека лабиринта и взятия пищи, число выполненных реакций (ВР) - число случаев, когда животное заходит в подкрепляемый отсек и съедает пищу, число ошибок - число заходов в неподкрепляемый отсек.

В дни опыта животных кормили один раз в день непосредственно после эксперимента.

3.2. Выработка условного рефлекса активного избегания болевого раздражителя

Условный рефлекс активного избегания болевого раздражителя (УРАИ) вырабатывали в камере размером 30x22x35 см, с угловой полкой на высоте 18 см и решетчатым полом, на который подавали электрический ток со стимулятора ЭСЛ-1. Условным раздражителем служил звук звонка продолжительностью 3 с, безусловным подкреплением - удар током (напряжение подбирали индивидуально для каждого животного в диапазоне 50-90 В по голосовой реакции). Условной реакцией считали прыжок на полку. При тестировании животное помещали в камеру и адаптировали к условиям эксперимента в течение 25 с, после чего следовало первое предъявление условного сигнала. Интервал между условным сигналом и безусловным подкреплением составлял 2 с. Если избавление не наступало в течение 30 с, то напряжение отключали. Длина временных интервалов между сочетаниями условного раздражителя и безусловного подкрепления колебалась случайным образом в пределах от 15 до 30 с.

В работе использовали четырех- и двухдневную схемы выработки УРАИ. В первом случае каждое животное получало по 10 сочетаний условного и безусловного раздражителей в течение 4 дней обучения. Инъекции препаратов проводили ежедневно. Во втором случае крысы получали по 15 сочетаний в течение 2-х дней. Препараты вводили только перед первым сеансом обучения. Через неделю после последнего сеанса обучения животных тестировали для проверки сохранения выработанного навыка.

В опыте фиксировали: количество выполненных реакций (КВР) - число прыжков на полку в ответ на условный сигнал; количество коротколатентных избавлений (КЛИ) - число прыжков на полку через 1-2 с после включения тока; число межсигнальных реакций (МСР) - число прыжков на полку в период между предъявлениями безусловного и условного раздражителей).

4. Исследование некоторых параметров физиологического состояния организма

4.1. Тест "вертикальная сетка"

Экспериментальная установка для оценки статической физической выносливости крыс представляет собой проволочную сетку с ячейками 1.5x1.5 мм, площадью 30x60 см. Сверху и с боков сетка ограничена деревянными стенками. Установку располагали на краю стола. При тестировании животное помещали на сетку и регистрировали время, прошедшее с момента посадки на сетку до момента падения с нее.

4.2. Измерение уровня пищевой мотивации

Для определения уровня пищевой мотивации животных предварительно подвергали пищевой депривации в течение суток. Затем каждое животное помещали в отдельную клетку и измеряли количество сухой пищи (в граммах), съеденной за 10 минут.

4.3. Определение частоты сердечных сокращений

Для регистрации электрокардиограммы (ЭКГ) под кожу животным вводили два проволочных электрода. Операцию проводили под легким эфирным наркозом за 3 суток до основного эксперимента. Электроды из мягкой стальной проволоки диаметром 1 мм размещали: один на брюшной стороне на уровне верхних грудных позвонков ближе к передней левой конечности, другой - на уровне верхних поясничных позвонков ближе к правой нижней конечности. Электроды пропускали под кожей животного на участке около 5 мм, их концы загибали на наружной поверхности кожи. При регистрации ЭКГ животное находилось в свободном состоянии в экранированной камере размером 15x25x30 см. За сутки до основного эксперимента животных помещали в камеру на 30 мин с целью адаптации к условиям эксперимента. Адаптация проводилась в тишине и при свете красной лампы. -47В день эксперимента крысу помещали в камеру и проводили регистрацию ЭКГ. Биопотенциалы усиливали с помощью предусилителя фирмы "Nihon Kohden" (Япония) и усилителя "Nokia" (Финляндия), после чего сигнал попадал на аналогово-цифровой преобразователь компьютера. Запись ЭКГ начиналась через 5 минут после помещения крысы в камеру; условия регистрации были аналогичны условиям адаптации. Фоновые значения ЭКГ снимали трижды (в течение 1 минуты) с интервалами в 15 минут, после чего животным вводили препараты (в контрольной группе воду) и проводили запись ЭКГ через 15, 30, 45 и 60 минут после инъекции. Результаты обрабатывали с помощью пакета специализированных программ CONAN. Оценивали длительность R-R интервалов, а также вариабельность этого параметра. Результаты по отдельным экспериментальным группам обрабатывали с помощью пакета статистических программ Statgraf. Отличия между группами оценивали с помощью парного критерия Стьюдента и непараметрического критерия Манна-Уитни.

5. Статистическая обработка данных

При обработке результатов использовали стандартные методы статистического анализа. Вычисляли средние, ошибки средних, дисперсии и стандартные квадратичные отклонения. При сравнении характеристик массивов применяли как параметрические (Стьюдента), так и непараметрические (Вилкоксона-Манна-Уитни, Фишера) критерии. Использовали также параметрический и непараметрический методы корреляционного анализа. Названные операции и оценку форм распределения массивов осуществляли на IBM РС/АТ-386 с помощью пакета статистических и графических программ STATGRAF (версия 2.1), кросстабуляционный анализ осуществляли с помощью пакета программ STADIA (версия 5.0/6.94г.). Запись и обработку ЭКГ осуществляли с помощью программно-регистрационного комплекса CONAN.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение диссертации по теме «Физиология», Пономарева, Наталья Сергеевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании полученных нами результатов можно заключить, что оригинальный аналог АВП(6-9) тетрапептид Ac-D-MPRG обладает выраженным нейротропным действием. Интраназальное введение этого пептида во всех исследованных дозах (от 0.001 мкг/кг до 10 мкг/кг) приводит к значительному ускорению выработки и улучшению сохранения условных рефлексов у белых крыс. Следовательно, пептид Ac-D-MPRG является агонистом АВП и его фрагментов в отношении действия на процессы обучения. При этом следует подчеркнуть, что наименьшая из эффективных доз (0.001 мкг/кг) была в 1000 раз меньше, чем дозы АВП, используемые при интраназальном способе введения большинством исследователей. Таким образом, проведенные нами исследования подтвердили теоретическое предположение о том, что замена N-концевого остатка цистеина на D-метионин приведет к увеличению нейротропной активности аналога АВП(6-9).

Ноотропные эффекты Ac-D-MPRG имеют дозозависимый характер. Наиболее эффективными оказались средние дозы пептида: 0.01 и 0.1 мкг/кг, с уменьшением или увеличением дозы стимулирующий эффект пептида на процессы формирования условнорефлекторного навьпса снижался. Кривая зависимости доза-эффект по суммарному количеству выполненных реакций за 4 дня обучения имеет колоколообразный вид, что характерно для многих регуляторных пептидов (.Ашмарин, 1986; Diamant, 1993; Janak, 1994).

Исследования влияния Ac-D-MPRG на обучение животных в тестах с различным знаком подкрепляющего раздражителя показало, что ноотропные эффекты пептида наблюдаются как при обучении с отрицательным (выработка условной реакции активного избегания), так и с положительным подкреплением (выработка пищедобывательного рефлекса). Однако эффекты Ac-D-MPRG при обучении с положительным подкреплением были менее выражены. Полученные нами результаты хорошо согласуются с литературными данными о том, что действие АВП, его фрагментов и аналогов, проявляется в большей степени при обучении животных с отрицательным подкреплением (Paban, 1997; Титов, 1987; Liu, 1990).

Исследования зависимости нейротропного действия Ac-D-MPRG от времени введения показало, что инъекция пептида как до (за 5, 30 и 60 минут), так и после сеанса обучения приводит к ускорению выработки условных рефлексов. Положительные ноотропные эффекты, полученные при введении пептида сразу после сеанса обучения, позволяют сделать предположение о влиянии Ac-D-MPRG на консолидацию памятного следа, т.к. влияние пептида при таких сроках введения на процессы внимания и восприятие экспериментальной обстановки исключаются. Однако, при введении препарата до сеанса обучения, то есть, когда Ac-D-MPRG действует и в момент восприятия обстановки, и во время консолидации памятного следа, воздействие его на выработку УРАИ выражено сильнее (положительный эффект на обучение оказывает пептид даже в дозе 0.001 мкг/кг), чем в случае введения пептида после сеанса обучения. Анализ полученных результатов позволяет высказать предположение о том, что Ac-D-MPRG оказывает влияние не только на процессы консолидации, но и на процессы восприятия и анализа окружающей обстановки. Для проверки этого предположения было проведено подробное исследование влияния пептида на ориентировочно-исследовательское поведение животных и их реакцию на стрессогенные факторы.

Данные, полученные при исследовании ОИР, свидетельствуют о том, что пептид при введении в использованном диапазоне доз усиливает ориентировочно-исследовательское поведение, что особенно ярко выражено при введении пептида за 5 минут до тестирования. При введении пептида за 30 минут и за 1 час до тестирования влияние Ac-D-MPRG на двигательную активность выражено слабее.

Уменьшение груминга под действием Ac-D-MPRG наблюдалось как в тесте "норковая камера", так и в тесте "открытое поле". Груминг обычно рассматривается как замещающая реакция, отражающая высокий уровень эмоциональной напряженности крыс (Delius, 1967). Эмоциональная напряженность возникает как следствие одновременной активации противоположных мотиваций (Мак-Фарленд, 1988). В данных тестах она, очевидно, отражает равновесие между исследовательской и пассивно-оборонительной мотивациями (Мак-Фарленд, 1988; Буреш и др., 1991). Снижение уровня груминга под действием Ac-D-MPRG может свидетельствовать о смещении этого равновесия либо в сторону усиления ОИР, либо в сторону снижения пассивно-оборонительной мотивации. Первое предположение кажется нам более вероятным, поскольку в тех же тестах под влиянием Ac-D-MPRG возрастает количество стоек и, частично, обследованных норок, что является отражением возрастающей исследовательской активности.

Влияние Ac-D-MPRG на поведение животных в условиях стрессогенного воздействия зависило от исходного состояния животных. Если у контрольных крыс под воздействием стрессогенных факторов преобладала реакция избегания (увеличение двигательной активности), то действие пептида выражалось в снижении уровня эмоциональной реактивности животных. На это указывает снижение длины пробега и уровня груминга у животных под действием Ac-D-MPRG. Механизмы воздействия исследованного пептида Ac-D-MPRG не могут принципиально отличаться от механизма эффектов АВП и его фрагментов. Полученные нами результаты согласуются со сведениями (Williams, 1983) о том, что в стрессорной модификации "открытого поля" у крыс линии Long-Evans двигательная активность снижалась значительно быстрее, чем у крыс линии Браттлборо. Иными словами, в случае отсутствия эндогенного вазопрессина моторный ответ на предъявление стрессирующего раздражителя угасает медленнее, чем в норме.

Если же у контрольных животных в ответ на стрессогенное воздействие наблюдалась реакция затаивания и двигательная активность снижалась, то на этом фоне Ac-D-MPRG влияния на двигательную активность не оказывал. Стоит отметить, что уровень груминга у животных всех опытных групп в этом случае оставался таким же, как в бесстрессорной модификации, достоверно от нее не отличаясь. Кроме того, отмечалось достоверное повышение вертикальной двигательной активности. Это позволяет сделать предположение о том, что пептид, возможно, оказывает антистрессорное действие и на этом фоне улучшается восприятие окружающей обстановки.

Таким образом, полученные нами результаты (при применении прибора "Опто-Варимекс" и в тестах "норковая камера" и "открытое поле") позволяют предположить, что пептид вызывает повышение ориентировочно-исследовательской реакции животных, что сопровождается снижением эмоциональной напряженности животных в бесстрессорных условиях и в присутствии стрессогенных факторов.

Так как основные эффекты пептида на обучение были выявлены в те же сроки, что и эффекты пептида на ОИР в стрессогенных условиях, то мы можем предположить, что некоторое усиление ОИР облегчало восприятие экспериментальной обстановки, и таким образом способствовало обучению. Снижение эмоциональной напряженности животных под действием Ac-D-MPRG, показанное в стрессогенной модификации теста "открытое поле", также может лежать в основе ускорения обучения, особенно в тестах с отрицательным подкреплением. Однако мы не можем связывать положительные эффекты пептида на обучение только с его воздействием на ОИР, тем более, что стимуляция выработки УРАИ под действием пептида наблюдалась и в том случае, когда пептид вводили сразу после сеанса обучения. Следовательно, можно предположить, что Ac-D-MPRG оказывает влияние как на процессы восприятия и анализа окружающей обстановки, так и на процессы консолидации памятного следа.

Анализ влияния Ac-D-MPRG на различные физиологические показатели, такие как уровень пищевой мотивации, болевой чувствительности, физической выносливости и частота сердечных сокращений, показал, что ни один из перечисленных показателей под действием пептида в исследованных дозах не изменялся. Это является еще одним свидетельством высокой избирательности действия пептида на процессы связанные с мнестическими функциями ЦНС.

Известно, что АКТГ и его фрагменты также являются стимуляторами обучения и памяти, хотя механизм из воздействия на мнестические процессы отличается от таковых для АВП и его фрагментов. Предполагается, что АКТГ и его фрагменты влияют на восприятие и оценку окружающей обстановки в целом (Kovacs G.L. and De Wied D., 1994; Wied D., 1997). АВП и его фрагменты и аналоги в отличие от АКТГ улучшают процессы консолидации памятного следа, а также стимулируют ориентировочно-исследовательское поведение ' при некотором снижении эмоционального реагирования (Wied D., 1997; Усенко, 1987). Рассматривая гормоны переднего и заднего гипофиза как компоненты системы сопряженной регуляции комплекса процессов обучения, мы предположили, что сочетанное введение Ac-D-MPRG, являющегося аналогом фрагмента АВП, и семакса, являющегося аналогом фрагмента АКТГ, приведет к некоторому ускорению обучения и улучшению сохранения выработанного навыка. По нашим данным оба пептида: и Ac-D-MPRG и семакс по-отдельности, действуют однонаправленно в сторону ускорения процессов обучения и улучшения сохранения выработанного навыка в тесте УРАИ.

Сочетанное введение пептидов стимулировало процессы обучение в большей степени, чем раздельное введение пептидов - по КВР животные этой опытной группы достоверно отличались от животных, с раздельным введением пептидов. Кроме того, сочетанное введение пептидов способствовало лучшему сохранению выработанного навыка по сравнению с контролем.

При выработке условного пищедобывательного навыка в Т-образном лабиринте введение семакса, в отличие от Ac-D-MPRG, вызывало ускорение обучения животных. Сочетанное введение пептидов ускоряло процесс обучения, а также способствовало лучшему сохранению выработанного навыка по сравнению с контролем. Исходя из вышесказанного, можно предположить, что при выработке пищедобывательного навыка в Т-образном лабиринте в случае сочетанного введения пептидов преобладает стимулирующий эффект семакса.

Таким образом, сочетанное введение пептидов приводило к ускорению обучения и лучшему сохранению выработанного навыка. Относительно небольшое взаимное усиление эффектов Ac-D-MPRG и семакса вполне естественно, так как каждый из ноотропных агентов сам по себе достаточно эффективен. Значительно увеличить это воздействие невозможно, поскольку животные обучаются практически на оптимуме своих физиологических возможностей. Можно полагать, что при дефиците обучения, вызванного травмами или фармакологическими нарушениями, комбинация двух пептидов класса АКТГ и АВП может оказаться очень перспективной для клинического применения. Однако детальная разработка механизмов их сочетанного воздействия на мнестические процессы не входила в задачу нашего диссертационного исследования, поскольку мы хотели лишь показать принципиальную возможность совместного влияния пептидов различных классов.

Анализ эффектов пептида Ac-D-MPRG на фоне действия фармакологических препаратов, нарушающих функционирование системы биогенных аминов мозга и холинергической системы, позволил сделать предварительные предположения о возможных механизмах действия этого пептида. Для нарушения функционирования системы биогенных аминов мы использовали нейролептики аминазин и галоперидол. Ac-D-MPRG не влиял на угнетение двигательной и ориентировочно-исследовательской активности животных, являющееся одним из проявлений успокающего действия галоперидола и аминазина. Однако дисфункция

- 178 катехоламинергической системы, вызываемая введением нейролептиков, не препятствовала проявлению стимулирующего действия пептида на выработку условной реакции активного избегания. Таким образом, пептид, не препятствуя реализации терапевтических эффектов использованных фармакологических препаратов, способен устранять их нежелательное побочное действие, выражающееся в угнетении процессов обучения.

Введение пептида на фоне блокады центральных М-холинорецепторов бипериденом не компенсировало нарушения двигательной активности и обучения животных, вызванных введением фармагента. Это дает возможность предположить, что влияние Ac-D-MPRG на ЦНС каким-то образом опосредуется через центральные М-холинорецепторы. Однако для того чтобы делать более конкретные выводы о механизмах влияния Ac-D-MPRG на мнестические процессы, необходимы дополнительные исследования.

Обобщая полученные нами данные, можно заключить, что характер и направленность нейротропного действия пептида Ac-D-MPRG сходный с таковыми у пептидов семейства аргинил-вазопрессина. При этом исследованный тетрапептид значительно более эффективен в отношении обучения животных, чем целый гормон и его С-концевой фрагмент АВЩ6-9). Высокая активность Ac-D-MPRG при интраназальном способе введения позволяет рассматривать этот препарат как перспективный с точки зрения возможного клинического применения.