Преодоление устойчивости злокачественных клеток к ингибиторам киназ семейства Src с помощью ингибитора киназ PIM тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Михеева Алеся Михайловна

• Михеева Алеся Михайловна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Михеева Алеся Михайловна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура и регулирование тирозинкиназ семейства Src

1.1.1. Структура Src киназ

1.1.2. Регулирование Src киназ

1.2. Сигнальные пути, в которых участвуют SFK

1.2.1. Путь JAK/STAT3

1.2.2. Путь Src-FAK/паксиллин

1.2.3. Путь Src-Ras-Raf-MAPK-ERK2

1.2.4. PI3K-AKT-mTOR

1.3. Канцерогенез при участии Src киназ

1.3.1. Вклад Src в клеточные функции

1.3.1.1. Роль Src в адгезии и подвижности

1.3.1.2. Src в инвазии, пролиферации и выживании

1.3.1.3. Src в регуляции ангиогенеза

1.3.1.4. Src в устойчивости к ингибиторам

1.3.2.1. Роль Src при колоректальном раке

1.3.2.2. Роль Src при раке молочной железы

1.3.2.3. Роль Src при раке легких

1.3.2.4. Роль Src при раке поджелудочной железы

1.3.2.5. Роль Src при плоскоклеточном раке головы и шеи

1.3.2.6. Роль Src в гематологических злокачественных новообразованиях

1.4. Ингибиторы Src киназ

1.4.1. Доклинические ингибиторы Src киназ

1.4.2. Клинические ингибиторы Src

1.4.2.1. Ингибитор Src бозутиниб ^Ы-606)

1.4.2.2. Ингибитор Src дазатиниб

1.4.2.3. Ингибитор Src cаракатиниб (AZD0530)

1.4.2.4. Ингибитор Src бафетиниб (NS-187, INNO-406)

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Клеточные линии, используемые в исследовании и их культивирование

2.2. Обработка 2D-культур препаратами и расчет для них AUC и IC50

2.3. Обработка препаратами сфероидов

2.4. Окрашивание клеток красителями на морфологию клеток

2.5. Окрашивание клеток красителями на гибель клеток

2.6. Сегментация клеточных структур

2.7. ПЦР в реальном времени

2.8. Получение клеточных осадков

2.9. Измерение фосфорилированных киназ семейства Src в клетках с помощью набора MILLIPLEX MAP

2.10. Вестерн-блот анализ

2.11. Иммуноцитохимия с помощью конфокальной микроскопии

2.12. Оценка подвижности клеток под действием бозутиниба

2.13. Анализ базы данных с результатами скрининга препаратов

2.14. Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Подсчет количества клеточных ядер с помощью флуоресцентного микроскопа является наиболее точным методом оценки выживаемости клеток

3.1.1. Сравнение результатов, полученных разными методами

3.1.2. Результаты, полученные методом количественной оценки ядер с помощью флуоресцентного микроскопа, не зависят от изменения митохондриальной активности, вызванной препаратами

3.1.3. Визуализация H2B-mRuby позволяет отслеживать различную динамику гибели клеток

3.2. Корреляция между восприимчивостью клеток к действию ингибиторов Src и экспрессией киназ семейства Src

3.3. Активность киназ Src, Yes и Lyn определяет чувствительность клеток к ингибиторам киназ семейства Src

3.4. Невосприимчивость клеток к бозутинибу не связана с активностью EGFR

3.5. Транскриптомный анализ клеток под действием бозутиниба

3.6. Влияние бозутиниба на морфологию клеток и клеточную гибель

3.7. Бозутиниб способствует образованию клеточных групп и снижает подвижность клеток

3.8. Бозутиниб способствует накоплению стресс-фибрилл в клетках

3.9. Ингибиторы PIM, mTOR и FAK усиливают эффект бозутиниба

3.10. Возникновение синергичного эффекта обусловлено препятствием комбинаций препаратов образования клеточных агрегатов

3.11. Синергический эффект от комбинации бозутиниба с PIM447 наблюдается на 3D-моделях клеток

3.12. Комбинированная терапия бозутиниба с PIM447 приводит к изменению локализации Р-катенина в клетках от области межклеточных контактов к центру

3.13. Эффективность действия комбинации бозутиниба с PIM447 зависит от подавления MYC

3.14. Активация пути ERK 1/2 способствует выживаемости клеток, но действие комбинации бозутиниба с PIM447 препятствует этому процессу

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

7-AAD - 7-аминоактиномицин 5-FU - 5-фторурацил ALL - острый лимфобластный лейкоз AML - острый миелоидный лейкоз

AUC - area under the curve - площадь под кривой зависимости выживаемости клеток и концентрации ингибиторов

BLK - B-лимфоидная тирозинкиназа

c- SRC - белок SRC в здоровых клетках

CHK - CSK-гомологичная киназа

CSF-1 - рецептор колониестимулирующего фактора

c-KIT - рецептор фактора роста стволовых клеток

CML - хронический миелоидный лейкоз

p130Cas - Crk-ассоциированный субстрат

CRC - колоректальный рак

CSK - концевая SRC киназа

CTRP - Cancer Therapeutic Response Portal

GAPs - белки-активаторы ГТФазной активности

DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол

DMEM - модифицированная Дульбекко среда Игла

DMSO - диметилсульфоксид

dNTP - дезоксиаденозинтрифосфат

dTMP - дезокситимидинмонофосфат

EGFR - рецептор эпидермального фактора роста

EMT - эпителиально-мезенхимальный переход

PIM - протоонкоген серин/треонин-протеинкиназа

FAK - киназа фокальной адгезии

FGFR - рецептор фактора роста фиброластов

FGR - вирус саркомы кошек

FLT3 - FMS-подобная тирозинкиназа

FLT3-ITD - FMS-подобная тирозинкиназа 3 с мутацией внутренней тандемной дупликации

FRK (RAK) - Fyn-родственная киназа

FYN - протоонкоген тирозинкиназа FYN

GAPDH - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

HCK - гематопоэтическая клеточная киназа

HER2 - рецептор эпидермального фактора роста человека

IC50 - концентрация полумаксимального ингибирования

IL-8 - интерлейкин

JAK2 - янус-киназа

LCK - лимфоцит-специфическая киназ

LYN - тирозин-протеинкиназа LYN

MAPK - митогенактивируемая протеинкиназа

MET - рецептор фактора роста гепатоцитов

MYC - протоонкоген MYC, фактор транскрипции bHLH

NucView Caspase3 488 (NucView) - краситель каспаз 3/7

PBS - натрий-фосфатный буфер

PDAC - аденокарцинома протоков поджелудочной железы

PCR - полимеразная цепнаяреакция

PDGFRb - рецептор тромбоцитарного фактора роста

PI3K - фосфоинозитид-3-киназа

PPII-линкер - линкерный домен SRC

PR - рецептор прогестерона

PTEN - гомолог фосфатазы и тензина

PALs - pathway activation levels - активность сигнальных путей

Pyk2 - богатая пролином тирозинкиназа 2 Crk-ассоциированный субстрат (p130Cas)

RPMI - среда для культур клеток и тканей

RSV - вирус саркомы Рауса

SEM - стандартная ошибка среднего

SD - стандартное отклонение

SFK - семейство SRC киназ

SH1 -домен гомологии SRC

SH2 - домен гомологии SRC

SH3 - домен гомологии SRC

SH4 - домен гомологии SRC

SRM - SRC-родственная киназа, лишенная C-концевого регуляторного тирозина и сайта N-концевого миристоилирования

STAT - сигнальный белок и активатор транскрипции

v- SRC - белок SRC в раковых клетках

TBST - Трис-буферный солевой раствор с Твином 20, включающий Трис-HCl, NaCl, Tween-20

TMRE - этиловый эфир тетраметилродамина

TubDR - краситель тубулина темно-красного

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

YES 1 - протоонкоген тирозинкиназа Yes

YRK - Yes-родственная киназа

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплементарная ДНК

НМРЛ - немелкоклеточный рак легких

нРТК - нерецепторные тирозинкиназы

РМЖ - рак молочной железы

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТК - рецепторные тирозинкиназы

ПРГШ - плоскоклеточный рака головы и шеи

ПФА - перфторалкоксиалкан

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ХТТ - метод оценки жизнеспособности клеток, который основан на добавлении к клеткам 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2Н-тетразолий-5-карбоксанилида

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

В настоящее время онкологические заболевания являются одной из ведущих причин смертности во всем мире. Кроме того, по последним данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), с каждым годом диагностируется все больше случаев рака. Методы лечения, основанные на применении классических химиотерапевтических препаратов, которые воздействуют на быстро делящиеся клетки, не всегда являются эффективными. Поэтому, в задачи современной медицины и науки, входит разработка новых методов лечения. Одним из таких методов является таргетная терапия, которая подразумевает воздействие таргетных препаратов на молекулярные мишени, ответственные за развитие опухоли, и поэтому оказывает более выраженный терапевтический эффект. Применение первого таргетного препарата, одобренного для лечения онкологии, мультикиназного ингибитора - иматиниба, произвело революцию в лечении хронических миелоидных лейкозов. С тех пор для лечения различных онкологических заболеваний было одобрено более сотни таргетных препаратов. Тем не менее, только для трети пациентов со злокачественными опухолями, существуют эффективные схемы лечения такими препаратами. Связано это с несколькими факторами: отсутствие известных мишеней для терапии, быстрое развитие резистентности, или отсутствие молекулярных маркеров, по которым можно спрогнозировать эффективность применения препарата. Разработка новых ингибиторов является сложным, длительным и дорогостоящим процессом, сопряженным с различными рисками, например, возможной токсичностью препарата для пациентов. Поэтому крайне актуальным направлением является перепрофилирование тех ингибиторов, которые уже используются для терапии определенных типов опухолей, и имеют перспективу для лечения более широкого набора злокачественных заболеваний.

Первыми открытыми и описанными протоонкогенами являются гены киназ семейства Src, белковые продукты которых играют ключевую роль в активации процессов выживания и деления клеток, а также в развитии раковых опухолей и образовании метастазов [1-3]. Кроме того, в ходе многочисленных исследований, было показано, что активность киназ этого семейства в злокачественных клетках солидных опухолей повышена по сравнению со здоровыми тканями [4-5]. Перспективу их ингибирования демонстрируют многочисленные исследования, которые показывают, что подавление Src-киназ препаратами приводит к блокировке клеточной пролиферации, снижению миграции, уменьшению риска метастазирования и индукции апоптоза [6-9].

Для лечения хронического миелоидного лейкоза (ХМЛ) применяется препарат бозутиниб, который ингибирует химерный белок BCR-Abl [10]. Хромосомная транслокация, которая приводит к образованию этого белка, встречается только в клетках ХМЛ и изредка в лимфоцитарных лейкозах, что существенно ограничивает применимость ингибиторов BCR-Abl. Белок АЬ1 входит в одно из девяти семейств тирозинкиназ, однако все киназы семейств имеют высокую степень гомологии между собой. Поэтому ингибиторы тирозинкиназ часто воздействуют на различные тирозинкиназы, схожие по структуре. В частности, некоторые ингибиторы BCR-Abl также являются ингибиторами тирозинкиназ семейства Src, которые гиперактивированы во многих солидных опухолях. Поэтому применение ингибитора тирозинкиназ бозутиниба может представлять интерес для терапии солидных опухолей с повышенной активностью Src киназ [8,11-14].

Существуют и другие эффективные ингибиторы Src, которые тоже применяются или разрабатываются как ингибиторы BCR-Abl, например дазатиниб, саракатиниб, бафетиниб, нинтеданиб, понатиниб. Однако, в клинических испытаниях бозутиниб и другие ингибиторы Src показали ограниченную эффективность их применения в качестве основного лекарственного средства [13,15]. Согласно данным скрининга противоопухолевых препаратов на клеточных линиях различной природы, взятых из базы данных DepMap, часть клеточных линий солидных опухолей обладает чувствительностью к бозутинибу, сопоставимой с клетками ХМЛ (Рисунок 1). В 10% самых чувствительных клеточных линий входят клетки лейкозов, рака головы и шеи, лимфомы, миеломы, рака мочевого пузыря, рака пищевода, колоректального рака, рака яичников, рака желудка и рака легких.

17

sa

Ч15

X

s

H

m"12.5 О 1С

к

§10

и p

<

10% наиболее чувствительных линий

* ЛЧ О ^ ^

У

Рисунок 1. Боксплот чувствительности клеточных линий различных типов рака к бозутинибу. Каждая точка обозначает AUC отдельной клеточной линии. AUC - показатель выживаемости клеточных линий, который равен площади под кривой зависимости выживаемости клеток и концентрации ингибитора. Среди всех приведенных клеточных линий красным цветом обозначены 10% линий наиболее чувствительных к действию бозутиниба. В эти 10% входят клеточные линии лейкозов, рака головы и шеи, лимфомы, миеломы, рака мочевого пузыря, рака пищевода, колоректального рака, рака яичников, рака желудка и рака легких.

Это указывает на необходимость поиска молекулярных маркеров, обуславливающих эту чувствительность, и на возможность повышения эффективности действия бозутиниба в отношении клеток солидных опухолей за счет комбинированной терапии. Изучение особенностей действия ингибиторов Src киназ, а особенно бозутиниба, поможет понять причины нечувствительности к ним клеточных линий, и найти способы преодоления их резистентности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Преодоление устойчивости злокачественных клеток к ингибиторам киназ семейства Src с помощью ингибитора киназ PIM»

Цель работы

Целью данной работы является выявление механизмов преодоления устойчивости злокачественных клеток различной природы к ингибиторам киназ семейства Src с помощью ингибитора киназ семейства PIM.

Задачи работы

1. Выявить наиболее оптимальный метод для оценки выживаемости клеток под действием препаратов.

2. Изучить взаимосвязь между экспрессией или активностью киназ семейства Src и чувствительностью клеточных линий к ингибиторам Src киназ.

3. Провести анализ изменения транскриптома клеток под действием бозутиниба.

4. Сравнить изменения морфологии и гибели клеток в результате действия ингибиторов Src с изменениями, вызванными препаратами, воздействующими на другие молекулярные мишени.

5. Подобрать наиболее эффективные комбинации препаратов с ингибиторами Src.

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

В ходе работы было проведено первое систематическое сравнение точности и чувствительности различных методов измерения антипролиферативного действия противоопухолевых соединений. Впервые проведено комплексное сравнение характера действия различных ингибиторов киназ семейства Src на фосфорилирование основных белков семейства Src. Впервые сопоставлены результаты изменений транскриптома клеток аденокарциномы легких и их морфологии под воздействием бозутиниба, а также проведено сравнение характера действия бозутиниба с 52 другими таргетными ингибиторами. Описаны ранее не исследованные механизмы индукции резистентности клеток к бозутинибу за счет формирования межклеточных контактов. Впервые количественно описана динамика изменения морфологии, подвижности клеток и коллективного поведения клеток под действием ингибиторов Src. Показана новая функция киназ PIM в поддержании выживания клеток при активации межклеточных контактов, и участие PIM в локализации Р-катенина. Впервые показана эффективность совместного использования ингибиторов киназ Src и PIM для стандартных клеточных культур и моделей сфероидов.

Теоретическая значимость работы заключается в установлении уникальных особенностей действия ингибиторов Src на морфологию и подвижность клеток по сравнению с другими типами противоопухолевых препаратов. Такие данные указывают на особую роль Src киназ в регуляции клеточной подвижности и показывают существенные различия в роли киназ семейства Src и киназы фокальной адгезии (FAK) в контроле движения злокачественных клеток. Описан новый механизм индукции резистентности клеток к противоопухолевым препаратам, а также показана ключевая роль киназ PIM и транскрипционного фактора MYC в этом процессе. Практическая значимость работы заключается в обнаружении комбинации

противоопухолевых препаратов, которая может существенно увеличить эффективность применения ингибиторов Src для лечения аденокарциномы легких.

Апробация работы

Результаты научной работы были получены современными методами молекулярной биологии, такими как РНК-секвенирование, многопараметрическая микроскопия, конфокальная микроскопия, мультиплексный анализ фосфорилирования киназ, использование репортерных клеточных линий. В работе использована обширная коллекция клеточных линий, результаты сопоставлены с опубликованными исследованиями, а ключевые результаты работы подтверждены на нескольких клеточных моделях, что гарантирует высокую воспроизводимость результатов. По результатам диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных изданиях (Web of Science/Scopus). Результаты диссертации представлены на 7 научных конференциях: XI Международной конференции молодых ученых в рамках Площадки открытых коммуникаций OpenBio-2024 (2024 год, Наукоград Кольцово), XIX Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (2024 год, Санкт-Петербург), XXVII Пущинской школе-конференции молодых ученых с международным участием «Биология -наука XXI века» (2024 год, Пущино), VII Всероссийской конференции по молекулярной онкологии (2022 год, Москва), XXXIII Зимней Международной молодежной научной школе (2021, Москва), VI Всероссийской конференции по молекулярной онкологии (2021 год, Москва), 63-ей Всероссийской научной конференции МФТИ (2020, Долгопрудный).

Апробация работы была проведена на заседании межлабораторного коллоквиума Лаборатории клеточных основ развития злокачественных заболеваний и Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений "16" сентября 2025 г.

Степень разработанности темы исследования

На сегодняшний день подробно изучены строение киназ семейства Src, процессы активации/деактивации, участие киназ в различных сигнальных путях, их экспрессия в различных типах тканей злокачественной и незлокачественной природы, их участие в регуляции различных функций клеток. Однако, в силу большого числа киназ в семействе и различия их активности в зависимости от типа рака, остается мало изученным вклад конкретных Src киназ в прогрессию злокачественных заболеваний различной природы.

Методология и методы исследования

В работе использовались современные методы молекулярной и клеточной биологии: количественный ПЦР анализ, оценка выживаемости клеток с использованием счетной камеры Нойбауера, резазурина и флуоресцентного микроскопа, вестерн-блоттинг, иммуноцитохимия с

помощью конфокальной микроскопии, съемка пролиферации клеток в динамике, проведение мультиплексного анализа фосфорилирования Src киназ.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработан новый метод визуализации ядер с помощью флуоресцентного микроскопа. Данный метод превосходит другие подходы в том, что он позволяет наиболее точно и быстро оценивать выживаемость клеток, при этом полученные им результаты не зависят от механизма действия препарата.

2. Высокий уровень фосфорилирования киназ Src и Yes указывает на чувствительность клеток к действию бозутиниба и саракатиниба. В тоже время умеренный уровень фосфорилирования Src и Yes и высокий Lyn указывает на чувствительность клеток к бафетинибу.

3. Общей особенностью, характерной для всех Src киназ, является ингибирование подвижности клеток и инициация образования клеточных групп под действием препаратов.

4. Бозутиниб за счет снижения подвижности и последующего деления клеток способствует образованию плотных клеточных групп. Снижение подвижности сопровождается накоплением стресс-фибрилл.

5. Клетки, образуя межклеточные контакты, становятся менее восприимчивыми к действию бозутиниба.

6. Комбинация бозутиниба с PIM447 оказывает на злокачественные клетки солидных опухолей различного типа синергический эффект за счет того, что препятствует образованию межклеточных контактов, о чем свидетельствует снижение количества клеточных групп и числа клеток в группах.

7. Изменение локализации ß-катенина от области межклеточных контактов в центральную часть клетки под действием комбинации бозутиниба с PIM 447 может объяснять снижение межклеточных взаимодействий.

8. Снижение уровня экспрессии генаMYC и количества его белка является ключевым механизмом действия комбинации PIM447 и бозутиниба.

9. Комбинация бозутиниба с PIM447 препятствует повышению выживаемости клеток в результате действия ростовых факторов HGF и EGF.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Литературный обзор состоит из четырех ключевых разделов. В первом разделе подробно рассматриваются структура киназ семейства Src и механизмы их регуляции. Второй раздел посвящен основным сигнальным путям, в которых участвуют Src киназы. Третий раздел описывает роль Src киназ в канцерогенезе, а также их влияние на различные клеточные функции и прогрессию опухолей различной природы. В четвертом и пятом разделе описано действие известных ингибиторов Src в контексте доклинических и клинических испытаний.

1.1. Структура и регулирование тирозинкиназ семейства Src

Семейство Src киназ (SFK) относится к группе нерецепторных тирозинкиназ (нРТК), которые осуществляют внутриклеточную сигнализацию. Все нерецепторные тирозинкиназы подразделяют на 9 семейств: Abl, FES/FER , Syk/Zap70, JAK, TEC, FAK, Ack, Src, Csk. Данная подглава посвящена разбору структуры и процессов активации/деактивации киназ семейства Src.

1.1.1. Структура Src киназ

Семейство Src киназ представляет собой группу нерецепторных тирозинкиназ массой 60 кДа, играющих ключевую роль в передаче сигнала и регуляции множества биологических процессов, включая деление, пролиферацию, выживание, апоптоз и подвижность клеток [16]. В процессе передачи сигнала Src вступают во взаимодействие с эндосомами, перинуклеарными мембранами, секреторными пузырьками и цитоплазматической поверхностью мембраны, что позволяет им принимать сигналы от различных факторов роста, интегринов и G-белковых рецепторов [2,17-18].

Семейство состоит из 11 структурно и функционально схожих белков Src, Fyn, Lyn, Yes, Blk, Frk, Fgr, Lck, Hck, Brk, и Srm, гены которых экспрессируются во всех клетках млекопитающих [9,19-23] (Таблица 1).

Таблица 1. Характеристика генов киназ семейства SRC. В таблице указаны типы тканей, в которых наблюдается экспрессия киназ данного семейства, и локус хромосомы, в котором локализован ген.

Ген Экспрессия в здоровых тканях Экспрессия в опухолях Локус хромосомы

SRC Повсеместно Повсеместно 20q11

FYN 6q21

YES 18q2

LYN Миелоидные клетки Лимфома, рак простаты, рак поджелудочной железы 8q13

BLK Миелоидные клетки Лимфома, рак молочной железы, рак почек и легких 8p22

FGR Кроветворные клетки, легкие Лейкоз, карцинома молочной железы, аденокарцинома прямой кишки 1p36

HCK Миелоидные клетки Лимфома, лейкемия 20q11

LCK Кроветворные клетки Лимфома, рак мочевого пузыря, плоскоклеточная карцинома головы и шеи, меланома кожи 1p35

FRK Мочевой пузырь, мозг, молочная железа, толстый кишечник, лимфоидные клетки. печень, почки Рак поджелудочной железы, рак печени, рак молочной железы, рак почек, рак прямой кишки 6q21

BRK Толстый кишечник, тонкий кишечник, предстательная железа, нейрональные и эпителиальные клетки Нейрональные клетки, гемопоэтические клетки, рак мочевого пузыря, рак почек, рак поджелудочной железы 1p36

SRM Кератиноциты Рак желудка, рак печени, рак легких, рак яичников, рак почек 20q13.3

Киназы в свою очередь классифицируют на 3 группы в зависимости от тканей организма, в которых их гены экспрессируются [24-27]. Члены 1 группы, а именно Src, Fyn и Yes, экспрессируются одинаково во всех типах клеток. Экспрессия Blk, Fgr, Hck, Lck и Lyn встречается в основном в клетках кроветворной системы. А белки 3 группы характеризуются экспрессией в конкретных типах клеток. Например, протеинкиназа Srm наблюдается в кератиноцитах, киназа Frk в клетках мочевого пузыря, мозга, молочных желез, толстого кишечника и лимфоидных клетках, а Brk в нейрональных и эпителиальных клетках, а также в моноцитах/макрофагах [27-30]. Все члены этого семейства имеют единую структуру из пяти функциональных гомологичных доменов: Src-гомологичного домена 4 (SH4), уникального домена (UD), Src-гомологичного домена 3 (SH3), Src-гомологичного домена 2 (SH2), и киназного домена (SH1) (Рисунок 2 А) [22,31]. SH4 и уникальный домены входят в область N-концевого 14-углеродного миристоилированного мотива и обладают низкой свободной энергией Гиббса, что способствует их взаимодействию с другими белками и осуществляет транспорт киназы, определяет ее локализацию в цитоплазматическом пространстве и прикрепление к мембране за счет процессов миристоилирования и пальмитоилирования [18,22,32-37]. N-миристоилирование белка является ко- и посттрансляционной модификацией, в процессе которой происходит удаление и перенос миристиновой кислоты с мембраны ферментом миристоил-КоА на остаток глицерина на N-конце киназы [38]. Взаимодействие с мембраной имеет большое значение при активации киназ с фосфатазами в липидном бислое.

Киназы семейства Src различаются между собой уникальным доменом (UD), который осуществляет регуляторную функцию киназы, участвует в автофосфорилировании белка за счет наличия сайтов фосфорилирования треонина, серина, и ее специфических взаимодействий с мембраной и белками-субстратами, а именно с кислыми липидами и фосфоинозитидами в

результате фосфорилирования аминокислотных остатков в уникальном домене [39,40]. Фосфорилирование остатка ТЫ"-37 активирует Src, нарушая взаимодействие между доменом SH2 и регуляторным Туг530 [41]. Фосфорилирование остатков Ser43 и Ser51 деактивирует Src, а Ser75 влияет на рост клеток, реорганизацию цитоскелета и опосредует убиквитинирование и деградацию киназы [42-44]. Связывание с кислыми липидами запускает процесс отдаления киназы от мембраны, а нарушение связывания уникального домена с липидами регулируется кальцием-кальмодулином [45-46]. Кроме того, уникальный домен взаимодействует с фосфоинозитидами, такими, как Р13К, и соответственно опосредуют важные клеточные функции, такие, как рост клеток, их миграцию, метастазирование и др [47]. Помимо этого, предполагается, что уникальный домен считывает сигналы из окружающей среды и регулирует активность и специфичность киназы в зависимости от них [48].

Следом за уникальным доменом расположены SH3, SH2 и SH1-домены и С-хвост, которые являются ключевыми регуляторными элементами активности киназы (Рисунок 2 А, Б) [49]. Домен SH3 состоит примерно из 60 аминокислотных остатков и имеет форму Р-листа, состоящего из пяти антипараллельных цепей и двух петель [50]. Эти петли расположены с двух сторон от поверхности, состоящей из ароматических и гидрофобных остатков, что в совокупности образует сайт связывания с областью богатой пролином, расположенной между SH2 и SH1 доменами или лигандом [51]. Важно отметить, что наблюдаются явления взаимодействия SH3 доменов киназ семейства Src с последовательностями без пролина [52]. Последовательность, богатая пролином, при связывании с SH3 доменом закручиваются в спираль и служит для дополнительной стабилизации закрытой конформации киназы [53]. Домен SH3 содержит три петли, которые в совокупности образуют липид-связывающую область [54]. Однако, было показано, что киназы с мутациями в SH3 домене не приводят к нарушению взаимодействия с другими белками, и, следовательно, этот домен не является важным звеном при переходе киназы в неактивное состояние [55]. С другой стороны, экспериментально было показано, что домен SH3 с^гс необходим для митогенеза, индуцированного EGF и PDGF [56].

Рисунок 2. Структура и конформация Src киназ. (А) Доменная структура киназ семейства Src представлена четырьмя основными доменами: уникальным регионом (светло-зеленый + голубой), который варьируется среди членов семейства, а также доменами SH3 (серый), SH2 (темно-синий) и киназным (лососевый). Киназы Src имеют миристоилированный конец и С-концевой участок. Петля активации киназного домена представлена киназным доменом (оранжевый цвет) и С-хвостом и содержит ключевые участки фосфорилирования: активирующий (1уг 416) и аутоингибирующий (1уг 530). SH2-линкер богатый пролином находится между SH2 и SH1 доменами и связывается с доменом SH3 при переходе киназы в закрытое состояние. Карман для АТФ (черный цвет) связывается с молекулой АТФ при активации киназы. (Б) Киназа семейства Src в закрытой и открытой конформациях, которые определяют активность киназы [68].

Следующий Sffi-домен состоит примерно из 100 аминокислотных остатков, которые формируют а-спирали и ß-лист. Эти элементы вторичной структуры и соединяющие их петли формируют два кармана. Один из карманов отвечает за координацию фосфотирозина, в то время как другой расположен на противоположной стороне листа и обычно связывает один или несколько гидрофобных остатков с C-концевым участком фосфотирозина [57]. Карман распознающий фосфотирозин содержит остаток цистеина, который и играет ключевую роль в создании электростатических взаимодействий с фосфорилированным тирозином [57-60]. Второй карман представлен последовательностью, которая характеризуется молекулярным разнообразием между членами семейства Src [61]. С помощью этого кармана белок связывается с такими белками, как PI3K, Grb2, JAK, SHP1/2, Cbl и NCK [59-61,65-66]. Кроме того, остатки глутаминовой кислоты также способствуют образованию полярных и электростатических взаимодействий между белками.

Киназный домен SH1 состоит из двух долей: N-концевой (маленькой) и С-концевой (большой). N-концевая доля состоит из пяти ß-нитей и а-спирали (С-спирали). С-концевая доля преимущественно имеет спиралевидную структуру и содержит важный участок, называемый активационной петлей, в котором происходит активация фосфорилирования тирозина. N-концевая доля и щель, образовавшаяся между двумя долями, служат для связывания киназы с белками для их дальнейшего фосфорилирования.

1.1.2. Регулирование Src киназ

Фосфорилирование остатка тирозина Tyr419 в активационной петле переводит петлю и Src киназу в активное состояние. В сумме киназы семейства Src имеют два тирозиновых остатка, при этом второй Tyr530 находится на С-конце. Фосфорилирование одного из этих остатков вызывает конформационные изменения киназы и ее переход в активное или неактивное состояние (Рисунок 3).

Фосфорилирование Tyr530 специфической киназой Csk создает сайт внутримолекулярного связывания С-конца с Sffi-доменом. Домены SH3 и SH2 упаковываются напротив киназного домена и вступают с ними во взаимодействие, что приводит к блокировке активационной петли. При этом активационная петля принимает форму а-спирали, что препятствует связыванию с ней пептидных субстратов, а Tyr416 находится в щели между долями киназы, где он недоступен для фосфорилирования. В этот момент Sffi-домен взаимодействует с богатым пролином сегментом (PPP), расположенным между SH2- и SHl-доменами, что в результате приводит к переходу киназы в закрытое автофосфорилированное состояние и ингибированию ее активности [69]. Кроме того, было показано, что в закрытой конформации S^-домен взаимодействует с киназным доменом, в

результате чего активность Src снижается, и она фиксируется на мембране [70]. В таком состоянии киназа находится до тех пор, пока не получит активирующий сигнал. В закрытой конформации киназа становится доступной для связывания с другими белками [71]. Полипролиновый линкер, связанный с SH3-доменом, опосредует это взаимодействие [72].

Киназа может взаимодействовать с субстратом либо с помощью только SH2-домена, как в случае с PDGFR, так и с помощью обоих доменов SH3 и SH2, как в случае FAK, которая характеризуется наличием близко расположенных мотивов пролина и фосфотирозина, которые и вступают во взаимодействие с SH3 и SH2-доменами [73-74]. Киназы могут взаимодействовать с лигандами для поддержания автоингибированной конформации по Туг530, что имеет важное значение для контроля активации Src-киназ.

Активация Src киназ может происходить в случае взаимодействия их SH3 и SH2 доменов с конкретными лигандами [75]. Эти лиганды должны обладать высокой аффинностью для того, чтобы энергии связывания было достаточно для разрыва внутримолекулярных взаимодействий внутри киназы и осуществления ее конформационных изменений. Открытую конформацию киназа снова принимает в результате действия факторов роста и интегринов, которые путем активации фосфатаз или инактивации Csk, дефосфорилируют Туг530, что способствует деспирализации активационной петли с Туг416 в составе SH1-домена, удалению остатка фосфорной кислоты с С-конца и переноса его на Туг416. Это приводит к полной активации Src киназы и высвобождению участков связывания SH3- и SH2-доменов для дальнейшей передачи сигнала в клетке. В открытой конформации Src киназы осуществляют активацию или инактивацию целевого белка посредством фосфорилирования по остаткам тирозина [31]. Есть случаи, когда Src-киназы принимают активную конформацию путем смещения их SH3-домена, в то время как SH2-домен остается связанным с С-концевым хвостом [76].

Большую часть времени Src-киназы находятся в состоянии покоя и переходят в активное состояние по причине взаимодействия с другими молекулами в составе клеточной мембраны и адапторными белками [77]. За этим может следовать изменение положения доменов SH2 и SH3, электростатическая перестройка солевого мостика, дефосфорилирование Туг530 и фосфорилирование Туг416, который осуществляет фосфорилирование остатков тирозина других белков с помощью двух ионов магния Mg (2+) [22,69].

Активация Src в раковых клетках может происходить и с помощью различных внутриклеточных модуляторов, которыми могут являться рецепторы, факторы транскрипции, различные протеинтирозинфосфатазы и другие молекулы. В противоположность им в клетке синтезируются опухолевые супрессоры такие, как С-концевая Src-киназа (Csk), протеиновая тирозинфосфатаза (PTPR), miRNAs, CSK-гомологичная киназа (ЗДк) и другие.

Tyr419

тщшшчх

mmimi. $

Закрытая конформация (неактивная)

SH1

сОоН

шшшш

Знз

с°он

Активная открытая конформация (Туг419 фосфорилирован, TyrS30 дефосфорилирвап)

V-Src

(участок Туг530 утрачен)

Рисунок 3. Схема перехода киназы из закрытой конформащт в открытую и наоборот на примере c-Src и v-Src. Киназы прикреплены к клеточной мембране. У автоингибированной форме домен Src-киназы SH2 связывается с фосфорилированным С-концевым хвостом, тогда как домен SH3 взаимодействует с линкерным сегментом между SH2 и киназным доменом, образуя полипролиновую спираль. В случае v-Src у киназы отсутствует Туг 530, что не позволяет киназе перейти в неактивное состояние [67]. RSV - вирус саркомы Рауса (v-Src). Р -остаток фосфорной кислоты.

С-концевая Src-киназа (Csk) локализуется возле мембраны и путем фосфорилирования Туг530 на С-конце подавляет активность Src. Помимо Src Csk ингибирует киназы Lyn и Fyn [78]. Однако в раковых клетках наблюдается сниженная активность Csk, и она локализуется преимущественно в цитоплазме [79].

Csk-концевая Src-киназа (Chk) тоже ингибирует активность SFK, а именно Lck, Fyn, Src и Lyn путем фосфорилирования Tyr530. Отличительной чертой Chk является ее способность связываться с некоторыми активированными рецепторными тирозинкиназами, такими как ErbB-2 (HER2) или TrkA, и ингибировать активацию Src после стимуляции этих рецепторов. Также важно отметить, что Chk экспрессируется в клетках мозга и кроветворных клетках в отличие от Csk, которая экспрессируется повсеместно.

1.2. Сигнальные пути, в которых участвуют SFK

В рамках передачи сигнала Src киназа взаимодействует с несколькими белками, включая рецепторные тирозинкиназы: рецептором колониестимулирующего фактора 1 (CSF-1), рецептором тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), рецептором фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), рецептором эпидермального фактора роста человека (HER-2 и HER-3) и т.д. [80]. Нерецепторные белки, с которыми взаимодействует Src, представлены сигнальными преобразователями и активаторами транскрипции (STAT), гетеротримерными G-белками, митоген-активируемой протеинкиназой, внеклеточной сигнально-регулируемой киназой-2 (ERK2), циклинами D и E и FAK [81]. В этой подглаве идет описание сигнальных путей, в которых активно принимают участие киназы семейства Src в процессе передаче сигнала.

1.2.1. Путь JAK/STAT3

Путь JAK/STAT3 относится к ключевым сигнальным путям в клетке, так как он регулирует процессы иммунного ответа, деление и гибель клеток, и участвует в опухолеобразовании. Принимая молекулярный сигнал, поступающий извне, клетка запускает JAK/STAT3 каскад, который передает сигнал в ядро клетки и запускает транскрипцию генов, необходимых для этих процессов (Рисунок 4). Внеклеточный сигнал может быть представлен различными цитокинами, факторами роста и гормонами, которые вступают во взаимодействие с рецепторами на поверхности клеток. В результате этого рецепторы изменяют свою конформацию и контактируют с JAK, который фосфорилирует рецепторы. В этом состоянии рецепторы становятся доступными для взаимодействия с белком STAT, который фосфорилируется и, при помощи специальных белков, транспортируется в ядро клетки (Рисунок 4) [82-84]. Однако фосфорилирование STAT может происходить с помощью Src без участия JAK, что способствует развитию опухолей [84,85]. В случае рака пищевода, легких, головы и шеи EGFR-опосредованная активация STAT3, путем его фосфорилирования Src, и последующая передача сигнала провоцируют возникновение метастазов [86]. Также в этом каскаде может принимать участие член семейства киназ фокальной адгезии (FAK) Pyk2, который совместно с Src активирует STAT3, что приводит к усилению пролиферации клеток [87].

Рисунок 4. Схема процесса передачи сигнала посредством JAK/STAT3 пути. На мембране расположены цитокиновые рецепторы (зеленый цвет), которые связываются с цитокинами (красный цвет), поступающими снаружи клетки. После связывания рецептора с фосфатом, киназы JAK фосфорилируют рецептор. Затем белки STAT связываются с фосфатами, после чего фосфорилируются JAK с образованием димера. Димер проникает в ядро, связывается с ДНК и вызывает транскрипцию целевых генов.

1.2.2. Путь Src-FAK/пакеиллин

Путь Src-FAK/паксиллин регулирует подвижность, миграцию и адгезию клеток. Клеточная адгезия - это процесс взаимодействия между собой специфических мембранных гликопротеинов, которые способствуют не только прикреплению клетки к внеклеточному матриксу, но и объединению клеток в функциональные ткани и органы, и передаче клеткам информации о состоянии внешней среды [88]. Адгезивные клеточные контакты передают информацию в клетку посредством рецепторов, которые взаимодействуют с комплексом белков в цитоплазме [89]. В случае межклеточных контактов рецепторы в основном представлены кадгеринами, а с внеклеточным матриксом - интегринами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Михеева Алеся Михайловна, 2025 год

/ / / /

Дазатиниб

41 ф

М01Т-4 А V г /

А549 А V 7 /

ЬМ-18 А А / / / /

БК-ОУ-З А Г г у / /

ЗН-ЭУбУ А / г / / А уА /

НСТ-116 А в■ / / / / /

Бафстиниб

МОЬТ-4 ЭН-ЭУбУ НСТ-116 1_М-18 А54Э У БК-ОУ-З

15 о

и

и о

25 II 0 &

А А V 'V у /

А А V

А / Л Л

/ / /

А А / /

Рисунок 12. Анализ изменения активности киназ семейства Src под действием препаратов. А) Диаграммы активности киназ семейства Src в зависимости от восприимчивости клеточных линий к действию препарата. Каждая линия обозначена разным цветом. Показатель активности киназы в линии, чувствительной к ингибитору, располагается в красном блоке, а в нечувствительной линии - в сером. Б) Схема изменения активности киназ семейства Src в ответ на действие препарата. Клеточные линии расположены на основе значений AUC к препарату. Ячейки разделены на секции: правая - активность киназы в

контроле, левая - активность киназы под действием ингибитора. Активность киназ нормирована на активность GAPDH в тех же пробах. *-p-value < 0.05, **- p-value < 0.01, ***-p-value < 0.001 по критерию ^Стьюдента.

3.4. Невосприимчивость клеток к бозутинибу не связана с активностью EGFR

Существует множество литературных данных, подтверждающих важную роль EGFR в процессе выживания злокачественных клеток [268]. Для того, чтобы ответить на вопрос лежит ли в основе невосприимчивости клеточных линий к действию бозутиниба передача сигнала через EGFR, мы провели оценку изменения активности ERK на модифицированных клетках И1299 И2Б ERK-KTR в зависимости от добавления 2,5 мкМ бозутиниба и 100 нг/мл ростового фактора EGF (Рисунок 13 А). Выбор линии был основан на средней чувствительности к бозутинибу относительно других линий. В результате добавление ростовых факторов привело к незначительному увеличению активности ERK в клетках, однако действие бозутиниба никак не влияло на нее. Затем мы провели качественную оценку изменения активности белка рБгс в зависимости от добавления бозутиниба и ростового фактора EGF. Для этого к клеткам линии аденокарциномы легких Н1299, обработанным 2,5 мкМ бозутиниба, добавляли 100 нг/мл ростового фактора EGF и затем проводили анализ количества белка рБгс методом Вестерн-блот (Рисунок 13 Б). В результате EGF способствовал увеличению количества рБгс в 1,5 раза в клетках, необработанных бозутинибом, а бозутиниб полностью подавлял рБгс, и добавление ростовых факторов не влияло на эффективность бозутиниба. Исходя из этого можно сделать вывод, что EGF не влияет на действие бозутиниба через рБгс. Кроме того в ходе анализа влияния действия бозутиниба и ростового фактора EGF на кривую роста линии Н1299 в течение 144 часов мы наблюдали увеличение пролиферации линии, что говорит о том, что бозутиниб не блокирует сигнальный путь, опосредованный EGFR (Рисунок 13 В). И из этого следует, что невосприимчивость клеток к бозутинибу не связана с EGFR.

Рисунок 13. Активация EGFR не влияет на устойчивость клеток к бозутинибу. А) Изменение активности ERK V2 в линии Н1299 в зависимости от действия бозутиниба и ростовых факторов EGF относительно контроля. Серым цветом обозначено распределение активности ERK в контрольных клетках. зеленым - в клетках, обработанных ростовыми факторами EGF. Б) Изменение относительного количества белка pSrc в клетках H1299, обработанных бозутинибом, после добавления ростовых факторов EGF. Количество белка нормировано на количество fi-актина. В) График выживаемости клеток H1299 в условиях добавления ростовых факторов EGF и бозутиниба по сравнению с контрольными под действием бозутиниба. Черным цветом окрашена кривая роста контрольных клеток. зеленым - клеток, обработанных ростовыми факторами EGF.

3.5. Транскриптомный анализ клеток под действием бозутиниба

Для того, чтобы выявить, на мишени в каких сигнальных путях воздействует бозутиниб, мы провели транскриптомный анализ клеток, обработанных бозутнибом. Для данного эксперимента мы отобрали две клеточные линии: линия аденокарциномы легких H1299 и нейробластома SH-SY5Y по принципу их средней чувствительности к бозутинибу в сравнении с другими клеточными линиями в коллекции лаборатории. Клетки в течение 24 часов инкубировали с 2,5 мкМ бозутиниба. После чего коллегами из ЦКП "Геном" ИМБ РАН было проведено РНК-секвенирование, а коллегами из группы под руководством Антона Александровича Буздина с помощью OncoboxPD был выполнен расчёт сигнальных каскадов.

По итогу анализа для каждой клеточной линии были указаны гены, экспрессия которых изменяется под действием бозутиниба. Степень изменения экспрессии генов оценивали с помощью силы активации сигнальных путей, которая представляет собой сумму изменений экспрессии всех членов сигнального пути, выраженную в PALs (Pathway activation levels).

Показатель активности сигнального каскада рассчитывается как совокупность изменения экспрессии генов, с учетом их роли в активации или деактивации пути. Для анализа путей, члены которого в наибольшей степени изменились под действием бозутиниба, отобрали те пути, величина PAL которых составляет больше 10 или меньше -10 единиц. Значения PAL этих путей графически представлены в виде тепловой карты (Рисунок 14). Из нее видно, что паттерны PAL между линиями различается. У линии аденокарциномы легких бозутиниб вызывает повышение экспрессии членов путей, регулирующих апоптоз и клеточную гибель, адгезию и подвижность, стресс и передачу сигнала при участии NF-kp. У линии нейробластомы наоборот усиливается активность путей, регулирующих клеточный цикл, и путей при участии ростовых факторов.

Рисунок 14. Тепловая карта изменений экспрессии членов сигнальных путей относительно экспрессий всех сигнальных путей, участвующих в анализе для линий Н1299 и SH-SY5Y. Анализ произведен с помощью OncoboxPD.

На основе изменившейся активности путей под действием бозутиниба с помощью анализа Connectivity Map (CMAP) мы составили список классов препаратов, которые характеризуются действием на различные молекулярные мишени, но при этом вызывают

изменения экспрессии в тех же сигнальных путях, что и бозутиниб (Рисунок 15). На рисунке 15 каждому из препаратов соответствует показатель сходства с бозутинибом, выраженный от -1 до 1, а цветом обозначается величина р^а1ие. В результате наибольшим сходством с бозутинибом обладает препарат саракатиниб.

Saracatinib (ABL1 and SRC inh.) Tozasertib (Aurora A inh.) U-0126 (MEK1/2 inh.) Cediranib (VEGFR inh.) Lapatinib (EGFR inh.) Midostaurin (panRTK inh.) PRT-062070 (JAK2 inh.) PKCbeta inhibitor Tubulin inhibitor Digoxin (Na,K-ATPase inh.) Mocetinostat (HDAC inh.) ABT-737 (BCL-2 inh.)

OE-EGFR shPLK2 shBECNI OE-BRAF nilotinib (BCR-ABL1 inh.)

PI3K inhibitor Cell cycle checkpoints NF-kB activation SHC related events RAF MAPK cascade mTOR inhibitor Integrin alphallb beta3 signaling Topoisomerase inhibitor SRCRPTP pathway

o

o

o o

o o-o-o-o-

-o -o -o

-o -o

-o

Ю

-o

-1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 raw es

Рисунок 15. Препараты, которые на основе изменения экспрессии членов сигнальных путей, имеют прямую или обратную корреляцию с бозутинибом. raw cs - первичная оценка сходства. Ингибиторы с положительным raw cs вызывают изменения в клетках, схожие с теми, что вызывает бозутиниб. Ингибиторы с отрицательным raw cs приводят к противоположным изменениям. Чем краснее цвет круга, тем выше статистическая значимость оценки сходства препарата с бозутинибом.

3.6. Влияние бозутиниба на морфологию клеток и клеточную гибель

Одним из подходов к изучению механизмов действия бозутиниба является анализ изменения морфологии клеток в результате его действия и сопоставления полученных результатов с результатами изменения морфологии клеток под действием других препаратов. На основе ранее составленного списка препаратов, полученного в результате обработки данных транскриптома с помощью CMAP и OncoboxPD, а также на основе анализа молекулярных мишеней бозутиниба из литературы, мы составили список из 54 препаратов, характеризующихся различным механизмом действия, для дальнейшей оценки их влияния на морфологию и гибель клеток. Для этого клетки линии H1299 обработали отобранными

препаратами в концентрациях, близких к тем, которые блокируют пролиферацию клеток, и затем через 72 часа окрасили их флуоресцентными красителями для визуализации ключевых клеточных структур, таких как митохондрий (TMRE), лизосом (LysoGreen), тубулина (Tubuln Tracker Deep Red), а также для интенсивности окрашивания каспазы-3/7 (NucView), ионов железа (HMRho-Nox) и мертвых клеток (7-AAD) для оценки процесса гибели клеток (Рисунок 16 А, Б). С помощью флуоресцентной микроскопии мы получили изображения окрашенных клеток, и в результате их последующей обработки в программах CellPose и CellProfiller провели оценку изменений окрашивания клеток, возникших под действием препаратов. Помимо контроля окрашивания, в ходе анализа мы также учитывали изменения размера, формы и структуры клеток под действием препаратов. В результате этого анализа мы показали, что по сравнению с контрольными клетками в клетках, обработанных бозутинибом статистически значимо изменение таких явлений, как форма клеток, интенсивность окраски лизосом и железа, процента межклеточных взаимодействий, гранулярность клеток, и текстура лизосом и ядер (Рисунок 16 В). В итоге, мы сравнили изменения в клетках в результате действия бозутиниба по сравнению с изменениями, которые возникали под действием всех других протестированных препаратов, и проранжировали эти изменения в зависимости от их сходства или различия между препаратами (Рисунок 16 Г). В результате этого сравнения мы увидели, что под действием бозутиниба в клетках наблюдалось увеличение процента межклеточных взаимодействий и количества клеточных соседей, гранулярности клеток, увеличение интенсивности окрашивания и контраста текстуры ядер, увеличение интенсивности окраски лизосом, и снижение окрашивания тубулина, сокращение расстояния до ближайшей соседней клетки, площади, периметра и радиуса ядер, и интенсивности окрашивания каспаз и мертвых клеток (Рисунок 16 Г).

Клетки 111299

Ингибиторы

Флуорсс иен тн ыс красители

Вшуалшацни клеток с шшюшыи флуоресцентной микроскопии

'S /

DMSO Бозутиннб

Г % I *

у 9 4J «ь* %

tt-

V 1

30 min

В

П <I t v I и Ii nil vs DMSO

Ё.2 ■у

g

К 1

й!

Е —

■э-

-3-

Js

CjMlHI ЛП»1Са№Г —• :*

® о

о , а п-

t я

О [ KcnupjCTTfKT'p'puiuipHwhit 5-02

О) -\-

а ;

О Яо #о:

CD О Q)

-0.5 0.0 0.5 1.0

Отклонение

Сегментация Сегментации ядер клеток

Се II Profiler

Проаент межклеточных взаимодействий Гранулярность клеток Количество соседних клеток Контраст текстуры Hoechst 3 02 Средняя UHiomHBiiucib Hocchsl Контраст текстуры Hoeclisl 3-00 Средняя иигененкноггь .ihjocom Средняя интенсивность тубулиеа Расстояние до й.шжшмгп н клетки ШоШЯДЬ Äji'P Периметр ядер Средним нигснсивнопь каспаз Средняя интенсивность 7-AAD Максимальный радиус ядер

Тип объекта # Мертвые клетки О Форма клеток ® Железо (Fell) О Hoechst О Люосомы ® Митохондрии О Форма ядра О Гуоулпи

Дифференциальные сравнении

Рисунок 16. Анализ изменения морфологии клеток Н1299 под действием препаратов. А) Схема окрашивания клеток красителями морфологии клеток и красителями на гибель, съемки и обработки данных. Б) Клеточные структуры контрольных клеток и клеток, обработанных бозутинибом, окрашенные специализированными красителями. В) График оценки значимости изменения показателей клеток под действием бозутиниба по сравнению с изменениями в контрольных клетках. Г) График, демонстрирующий отрицательные или положительные изменения показателей клеток под действием бозутиниба по сравнению со всеми остальными ингибиторами. 7-АА1) - 7-аминоактиномицин I) краситель клеток на стадиях некроза или апоптоза.

Результаты оценки всех анализируемых показателей представлены на тепловой карте (Рисунок 17). Она иллюстрирует восприимчивость клеточной линии к препарату в зависимости от совокупности признаков клеток под действием препаратов, а именно изменения процента мертвых клеток, клеток в стадии апоптоза, ферроптоза, аутофагии, увеличения количества митохондрий в клетках, изменения площади, занимаемой клеткой и ядром. Помимо всего прочего в процессе объединения признаков в один кластер учитывалось изменение интенсивности окрашивания клеточных структур, формы и текстуры клеток.

В результате паттерн изменений, вызванных действием бозутиниба, наиболее схож с признаками, возникшими от действия саракатиниба и кабозантиниба. Другой ингибитор Src дазатиниб по своему действию сильно отличается от бозутиниба, и имеет наибольшее сходство с дактолисибом, акситинибом, винкристином, панобиностатом, венетоклаксом, дефактинибом и другими, которые являются ингибиторами PI3K, mTOR, VEGFR, PDGFR, KIT, HDAC, BCL2, FAK и т.д.

~ Defactii

-t Di9toxiS!

I— ПУ.<

Alisertib Axitinib Vincristine BI-2536 Fluorouracil Honokiol Panobinostat PD-0166285 Nocodazol ©Dasatinib Dactolisib Venetociax Defaclinib ienin .SL3 DMSO Barasertib Tozasertib Quizartinib Midostaurin Etoposide Hydroxyurea Cispfatin TAE-226 Palbociclib SCH-772984 PD-0325901 Selumentinib Bortezomib Rapamycin Entinostat Alpelisib Nutlin-3a Wortmannin

iabozanlinib Saracatinib ©Bosutinib Staurosporine Baricitinib Regorafenib Ruxolitinib AZD-7762 Gefitinib Adavosertib Digoxin Lonafarnib Paciitaxel Lovastatin R406 Topotecan Thymidine Nigerian

Pexiaartinib_

EverolimusQ

Объект

■ 7-AAD Каспаза Клетки/тубулин Щ Железо

Лизосомы U Митохондрии Ядро/Хроматин

Измерение

■ Интенсивность

Форма □ Текстура

1 F.

1 Л

■ т *

Li <'•■ п 1 ®

Показатель log2 FC

о

Я I

-2 -3

Рисунок 17. Тепловая карта значений относительной интенсивности флуоресценции клеточных органелл, окрашенных с помощью красителей в линии H1299 Все показатели клеток нормированы на контроль (DMSO). 7-AAD - 7-аминоактиномицин D краситель клеток на стадиях некроза или апоптоза. Z-оценка - показатель распределения относительно контроля. FC (fold change) - логарифм отношения количества клеток под воздействием к контролю.

3.7. Бозутиниб способствует образованию клеточных групп и снижает подвижность

клеток

В процессе изучения изменения клеточных показателей под действием бозутиниба мы показали, что бозутиниб приводит к увеличению количества соседних клеток и соответственно увеличения процента межклеточных взаимодействий. Для подтверждения этого путем флуоресцентной микроскопии мы получили изображения клеток под действием бозутиниба, и

обработали с помощью платформ CellProfiller и Cellpose для выявления количества межклеточных взаимодействий. В результате анализа мы показали, что бозутиниб уже через 24 часа после его добавления приводит к образованию плотных клеточных агрегатов, и со временем количество клеток в группах растет (Рисунок 18 А). На полученных изображениях клетки с большим количеством клеточных соседей обозначены наиболее интенсивным цветом.

В результате сопоставления результатов действия бозутиниба с другими 57 препаратами с различным механизмом действия, мы выявили, что образование клеточных агрегатов является общей чертой всех ингибиторов Src киназ, таких как саракатиниб и дазатиниб, а также ингибитор нинтеданиб, у которого тоже одной из мишеней является Src (Рисунок 18 А, Б).

Для того, чтобы понять природу образования таких групп клеток, мы следили за процессом агрегации клеток с помощью покадровой съемки клеток линии Н1299 ERK H2B mRuby под действием бозутиниба в концентрации 2,5 мкМ с помощью автоматизированного флуоресцентного микроскопа. Съемку проводили на протяжении 48 часов в трех спектральных диапазонах флуоресценции: в проходящем свете, зеленом и красном каналах. И в результате съемки было показано, что бозутиниб снижает клеточную подвижность. Процесс снижения клеточной подвижности отражен на Рисунке 18 В, на котором показано изменение длины пройденного пути и изменения расстояния от начального положения контрольных клеток и обработанных бозутинибом, выраженное в пикселях, относительно их начального положения. В процессе наблюдения за клетками мы отметили, что те клетки, которые вступили во взаимодействие друг с другом, сумели закрепиться на поверхности, становились неподвижными и начинали делиться, что приводило к образованию отдельных клеточных групп. В отличии от них одинокие клетки оставались подвижными, однако в сроком времени погибали. Это было подтверждено методом окрашивания клеток красителями на жизнеспособность через 24 часа после обработки их бозутинибом - клетки в составе группы оставались живыми и не были подвержены апоптозу (Рисунок 18 Г). При этом единичные клетки были окрашены красителем 7-AAD или NucView, что свидетельствует об их гибели. На основе подсчета процента мертвых клеток под действием различных концентраций бозутиниба мы показали взаимосвязь между гибелью клеток и процентом межклеточных взаимодействий - при наличии у клетки трех и более соседей она становится устойчивой к токсическому действию препарата (Рисунок 18 Д).

DMSO

Бозутиниб

iSaracatinib

Саракатиииб

Кол-во

клеточных

соседей

24 h

72 h

144fr

I Bosutinib]

]Nintedanïb|

Молекулярная мишень:

О JAK2 О MEK/ERK О другие © PI3k7mTOR

О РТК2

О рецепторные кшхазы Щ SRC

О SYK

25 50 75 100

Относительная плотность клеток

В Н1299 Н2В mRuby

Расстояние нроиленное

клеткой

1000

500

0 10 20 30 40 50 Часы

д

■À ю

х 5 3

Изменение клеткой положении

75

— Бозутиниб DMSO

0 10 20 30 40 50 Часы

Концентрации Бозутиниба мкМ

а

2.5

<=1 >=3

Количесгво соседних клеток

Hoechst,. •I

о о

Caspase 3/7

7-ААО

®

о

®

Совмещение ® ©

Ф в 1 в 0 %

в

■ — одинокие клетки мертвые клетки — клетки в группах

Рисунок 18. Изучение процесса образования клеточных групп и их роли в процессе невосприимчивости клеток. А) Процесс формирования групп клеток Н1299 под действием бозутиниба и саракатиниба, и образование групп под действием бозутиниба с течением времени. Чем больше у клеток межклеточных взаимодействий, тем более интенсивной окраской обозначены клетки. Б) Корреляция между процентом взаимодействующих клеток H1299 и плотностью клеток в группах. В) Графики средней величины пройденного клеткой

линии H1299 H2B mRuby пути и изменения расстояния относительно начального положения клетки под действием бозутиниба и DMSO на протяжении 48 часов. Единицами измерения пути выступают пиксели. Пунктирной линией обозначен средний диаметр клетки. Г) Изображения клеток окрашенных красителями Hoechst 33342, 7-AAD и NucView для выявления мертвых клеток и клеток в стадии апоптоза. Белым цветом обозначены одинокие клетки, зеленым клетки в группах, и красным мертвые клетки. Д) Диаграммы влияния числа клеточных соседей на гибель клеток под действием различных концентраций бозутиниба. *- p-value < 0.05 по критерию t-Стьюдента.

3.8. Бозутиниб способствует накоплению стресс-фибрилл в клетках

На основе предположения, что явление снижения подвижности клеток вызвано формированием актиновых нитей стресс-фибрилл, которые осуществляют сжатие клетки и удержание ее в неподвижном состоянии или наоборот регулируют подвижность клетки, мы предположили, что снижение подвижности клеток под действием бозутиниба может быть напрямую связано с его влиянием на их активность. Для оценки влияния бозутиниба на актиновые волокна мы, с помощью конфокальной микроскопии провели съемку зафиксированных клеток, которые были подвержены обработке бозутинибом на протяжении 6, 24 и 72 часов и затем окрашены красителями на F-актин (Рисунок 19). В результате съемки мы показали, что под действием бозутиниба в клетках накапливаются стресс-волокна. Это явление указывает на то, что действие бозутиниба влияет на процесс клеточной адгезии и подвижности клеток, стабилизируя точки фокальной адгезии.

6 h 24 h 72 h

Рисунок 19. Процесс формирования стресс-фибрилл в клетках Н1299 через 6, 24 и 72 часа после добавления бозутиниба. Ядра, окрашенные Hoechst 33342, обозначены синим цветом, а F-актиновые нити зеленым.

3.9. Ингибиторы PIM, mTOR и FAK усиливают эффект бозутиниба

Как было показано ранее, бозутиниб приводит к снижению подвижности клеток, которые в результате деления образуют плотные группы и становятся менее восприимчивыми к действию бозутиниба. И чем больше соседей у клетки, тем более она устойчива. Исходя из этого можно предположить, что препараты, препятствующие образованию клеточных групп, в комбинации с бозутинибом могут приводить к повышению его эффективности.

На основе транскриптомного анализа и составленного списка препаратов, которые обладают схожим или обратным от бозутиниба действием, мы подобрали 24 ингибитора для изучения их действия в комбинации с бозутинибом (Рисунок 14, 15). Концентрация бозутиниба в условиях его комбинации с другими ингибиторами составляла 2,5 мкМ, так как она приводит к 20-35% гибели клеток. Концентрацию подобранных для комбинационной терапии ингибиторов выбирали таким образом, чтобы процент мертвых клеток под действием конкретного ингибитора составлял около 10-20% по сравнению с необработанными клетками.

Затем на линиях H1299 и SH-SY5Y методом анализа жизнеспособности клеток с использованием резазурина провели оценку действия подобранных ингибиторов в комбинации с бозутинибом в концентрациях 0,5, 1 и 2, 5 мкМ (Рисунок 20 А). Для этого мы высчитывали разницу между процентом мертвых клеток, возникших под действием бозутиниба относительно контроля, и процентом мертвых клеток, возникших под действием комбинации бозутиниба с другим препаратом. Если разница между этими величинами составляла более 10%, то мы считали такую комбинацию эффективной. Среди всех препаратов мы наблюдали синергетический эффект у комбинаций бозутиниба с дигоксином, панобиностатом, сунитинибом, винкристином, дефактинибом, гефитинибом, стауроспорином, NVP-TAE 226, SCH772984, рапамицином, PIM447, венетоклаксом, BAY 11-7082, митрамицином и TP-3654. Однако, для получения более точной характеристики эффекта от их совместного действия, выраженной в проценте выживших клеток, на линии Н1299 H2B-mRuby мы дополнительно оценивали жизнеспособность клеток под действием наиболее эффективных комбинаций препаратов в динамике методом визуализации ядер и последующего анализа изображений с помощью программы CellProfiller через 24, 72 и 144 часа после обработки клеток. Для оценки жизнеспособности мы сравнивали количество живых клеток на каждой временной точке с количествов клеток в контроле в начале эксперимента, принимая это количество за 100%. В результате анализа ингибиторы PIM447, рапамицин и NVP-TAE 226 продемонстрировали наибольший синергетический эффект совместно с бозутинибом по сравнению с другими препаратами (Рисунок 20 Б). При этом с течением времени бозутиниб практически полностью замедлял пролиферацию клеток - количество клеток, обработанных 2,5 мкМ бозутиниба, по сравнению с контрольными клетками меньше более чем в 3 раза. Ингибиторы PIM447, рапамицин и NVP-TAE 226 в качестве монотерапии практически не влияли на скорость пролиферации клеток, однако в комбинации с бозутинибом они повышали его эффективность более чем в два раза.

Рисунок 20. Поиск препаратов, которые в комбинации с бозутинибом, усиливают его эффект. А) Процент изменения жизнеспособности клеток в результате действия комбинаций бозутиниба с препаратами для линий H1299 и SH-SY5Y. Б) Динамика гибели клеток H1299 H2B mRuby под действием комбинаций бозутиниба с PIM447, рапамицином и TAE-226 на протяжении 144 часов.

Важно отметить, что другие ингибиторы, действие которых тоже направлено на подавление PIM, mTOR и FAK, такие как TP-3654, дефактиниб и дактолисиб, не обладали таким же эффектом от их совместного действия с бозутинибом, как PIM447, рапамицин и NVP-TAE 226.

Известно, что ингибитор PIM447 подавляет киназы PIM-1, PIM-2 и PIM-3, которые принимают участие в сигнальном пути JAK/STAT3 и регулируют процессы пролиферации, апоптоза и миграции клеток. Синергичный эффект от совместного действия PIM447 с босутинибом может возникать благодаря подавлению бозутинибом активности киназы Src, которая фосфорилирует Stat3 в опухолевых клетках и передает нисходящие сигналы к PIM. А ингибирование PIM ингибитором PIM447 в свою очередь останавливает активацию Stat3 через PIMпосредством интерлейкинов [269].

Рапамицин является ингибитором mTOR, находящегося в белковом комплексе mTORC1. Нарушение работы этого комплекса приводит к сбоям в процессах аутофагии, транскрипции, трансляции, роста и выживания клеток. В сигнальном каскаде PI3K-AKT-mTOR активацию PI3K может осуществлять Src киназа, блокируя активацию нижестоящих молекулярных мишеней, в том числе mTOR. Возможно, двойная блокировка активации mTOR через подавление его напрямую и через Src киназы приводит к усилению эффекта от бозутиниба с помощью рапамицина.

Наиболее сильный эффект наблюдался от комбинации бозутиниба с NVP-TAE 226. Препарат NVP-TAE 226 описанный как ингибитор FAK, Pyk2 и IGF-1R. Известно, что он связывается с доменом перечисленных белков, препятствуя их взаимодействию с молекулами АТФ. Действие NVP-TAE 226 на клетки приводит к остановке клеточного цикла, индукции апоптоза, дефосфорилированию AKT и ингибированию инвазии. Особенность этих молекул заключается в их участии не только в сигнальном пути Src-FAK/паксиллин, но и JAK/STAT3 и PI3K-AKT-mTOR. Ингибирование параллельно Src и члена комплекса фокальной адгезии Pyk2 с помощью бозутиниба и NVP-TAE 226, приводит к замедлению пролиферации клеток [87]. Кроме того, ингибирование FAK препятствует его взаимодействию с Src и PI3k, что нарушает активацию сигнальных путей МАРК, ERK, AKT/mTOR/p70S6K, и Gsk3 и Rho [96].

3.10. Возникновение синергичного эффекта обусловлено препятствием комбинаций препаратов образования клеточных агрегатов

На основе того, что образование клеточных групп вызывает устойчивость клеток к бозутинибу, а лечение клеток комбинацией препаратов приводит к преодолению этой устойчивости, мы предположили, что эффективные комбинации бозутиниба с другими препаратами влияют на межклеточные контакты и за счет этого препятствуют образованию клеточных групп и развитию устойчивости.

Для того, чтобы подтвердить это предположение мы провели сравнительный анализ выживаемости клеток линии Н1299 под действием бозутиниба и комбинациями бозутиниба с PIM447, рапамицином и NVP-TAE 226. В результате анализа с помощью программ CellProfiller и Cellpose мы показали, что по сравнению с клетками под действием бозутиниба комбинации препаратов действительно приводят к снижению и процента клеточных групп относительно общего количества клеток в эксперименте и количества клеток в группе (Рисунок 21). Наиболее сильный эффект на группы клеток оказала комбинация бозутиниба с NVP-TAE 226.

15

со о a

a> H о

л §

Ü

s f о

H

a> g

о CQ H О О) F S П

й

ю

о

40

Xx

О

Q-

S-30

BQ В

О

H «

§ о

cq H

0

4> ET S

1

20

10

* *

■i * ? •

•• У •

• т

cv'

Рисунок 21. Влияние комбинаций препаратов на процент клеточных групп относительно всех клеток в анализируемой пробе и на количество клеток в группе на линии клеток Н1299. *-p-value < 0.05, **-p-value < 0.01 по критерию t-Стьюдента.

3.11. Синергический эффект от комбинации бозутиниба с PIM447 наблюдается на

3Б-моделях клеток

В связи с тем, что образование межклеточных контактов способствует возникновению устойчивости клеток к действию бозутиниба, нам необходимо было проверить эффективность отобранных комбинаций в условиях плотных межклеточных контактов, а именно на SD-моделях клеток. В качестве 3D- моделей выступали сфероиды. Они представляют собой сферу из клеток, образовавшуюся путем диффузии в круглодонном планшете. Преимущество сфероида перед 2D-культурой заключается в образовании высокого процента плотных межклеточных контактов, таким образом создавая для клеток условия, наиболее приближенные к условиям в многоклеточном организме. Это позволяет дать более точную характеристику действия препаратов на раковые клетки.

Действительно, анализ действия препаратов показал, что клетки линии H1299 в условиях плотных межклеточных контактов в сфероиде становятся менее восприимчивыми к действию ингибиторов и требуют повышения их концентраций (Рисунок 22 А, Б). Кроме того эффект от комбинаций препаратов на сфероидах отличался от эффекта на 2D-культуре (Рисунок 22 Б).

Среди трех комбинаций комбинация бозутиниба с PIM447 была наиболее эффективна на клеточных линиях H1299 и SH-SY5Y.

Ill 299 SII-SY5Y

s s

Я 10

ce

а

н X

V

я

О 20 Ьй

» t

DMSO

PIM-447 15 мкМ

Рапамицин 10 нМ

NVP-TAE 226 0.1 мкМ

Н1299

Hoechst 0 мкМ

PI -

\ } w

10 мкМ

SII-SY5Y

0 мкМ

Бо$утиниб

10 мкМ

Рисунок 22. Анализ действия комбинаций препаратов на сфероидах H1299 и SH-SY5Y. А) Сфероиды Н1299 и SH-SY5Y под действием различных концентраций бозутиниба (0, 2,5, 10 и 20 мкМ). Голубой цвет обозначает клетки, окрашенные красителем Hoechst 33342. Малиновым цветом обозначены мертвые клетки, окрашенные с помощью пропидия йодида (PI). Б) Сфероиды линий H1299 и SH-SY5Y под действием комбинаций препаратов.

Для того, чтобы проверить универсальность действия комбинации бозутиниба с PIM447, мы провели оценку их совместного действия на сфероидах четырех клеточных линий рака различной природы, а именно рака кожи, яичников, колоректального рака и глиобластомы (Рисунок 23). В результате комбинация бозутиниба с PIM447 привела к гибели сфероидов трех клеточных линий из шести (Рисунок 23 А, Б). А у четырех линий из шести наблюдалось уменьшение размера сфероида (Рисунок 23 Б). При этом среди линий, у которых размер сфероида не изменился относительно контроля, у линии А431 было отмечено изменение интенсивности окрашивания PI, что говорит о гибели клеток под действием комбинации препаратов (Рисунок 23 Б). Совокупность полученных наблюдений говорит о независимости синергического эффекта бозутиниба с PIM447 от природы раковых клеток и доказывает эффективность данной комбинации даже в условиях высокого процента межклеточных контактов.

А431 SK-OV-3 H1299 HT29 SH-SY5Y LN-18

О C\ П

kj л j

Бозутиниб 10 мкМ

PIM-447 15 мкМ

Комбинации

Hoechst PI

О П

О

500 мкм 500 um

>5 S X

5

а

U

| SH-SY5Y ] Условия:

U |М31~1 •dmso

Г ° , О Бозутиниб

| SH-SY5Y | OPIM-447

(Н1299I #комбинации

[SK-OV-30

|НТ-29|

• ш

_Q I LN-181

| НТ-29|

-2-10 1 Изменение размера сфероида, log2

Рисунок 23. Оценка действия комбинации бозутиниба с PIM447 на сфероиды. А) Анализ действия ингибиторов бозутиниба и PIM447 и их комбинации на сфероидах шести клеточных линий различных типов рака. Б) График изменения уровня интенсивности PI и размера сфероидов различных клеточных линий под действием бозутиниба, PIM447 и их комбинации относительно контрольных сфероидов.

С целью изучения процессов гибели клеток под действием комбинации было произведено окрашивание клеточных сфероидов линии Ш299, обработанных на протяжении 72 часов бозутинибом, PIM447 и их комбинацией, красителями каспаз и мертвых клеток. В результате окрашивания было показано, что бозутиниб приводит к активации каспазы-3 и -7 и соответственно запуску апоптоза, а PIM447 в клетках запускает процесс некроза, о чем говорит окрашивание мертвых клеток красителем 7-AAD (Рисунок 24 А, Б). Совместное действие ингибиторов позволяет одновременно наблюдать клетки как в состоянии апоптоза так и некроза. При этом интенсивность окрашивания клеток в стадии апоптоза в результате действия бозутиниба и его комбинации с PIM447 равна между собой (Рисунок 24 Б). А интенсивность окрашивания клеток в состоянии некроза при совместном действии ингибиторов превышает интенсивность некрозных клеток под действием бозутиниба и PIM447 более чем в два раза, что объясняет их синергический эффект (Рисунок 24 Б).

А

Б

' -1 О 1 2 3 4 Средний уровень интенсивности каспаз 3/7, log2

ODO СОЭ О

О

О

Условия: • DM SO

О Бозутиниб О PIM-447 О Комбинация

Рисунок 24. Комбинация бозутиниба с PIM 447 вызывает в клетках некроз. А) Оценка стадии гибели клеток линии H1299 под действием препаратов с помощью красителей каспаз 3/7 и мертвых клеток (7-AAD). Зеленым цветом обозначены клетки в стадии апоптоза, розовым - в стадии некроза. Голубым цветом обозначены клеточные ядра, окрашенные красителем Hoechst 33342. Б) Анализ изменения интенсивности окрашивания клеток в сфероидах линии H1299 красителем каспаз 3/7 и красителем клеток в стадии некроза 7-AAD. 7-AAD - краситель мертвых клеток.

Известно, что в клетке существуют механизмы, регулирующие процесс запрограммированной гибели клеток. Например, митохондриальные белки семейства BCL2 отвечают за подавление апоптоза и способствуют выживанию клеток. В связи с тем, что в сфероидах наблюдается значительная активация каспаз 3/7, мы предположили, что киназы семейства Src задействованы в подавлении активности белков BCL2. Для выявления взаимосвязи между запуском апоптоза и изменением активности киназ семейства Src (pSFK) в условиях действия ингибиторов, методом иммуноблоттинга на линиях H1299 и SK-OV-3 мы провели оценку изменения количества белка pSFK и митохондриальных белков BCL2 и BCL-XL относительно контроля и нормированных на ß-актин (Рисунок 25). В результате мы показали, что бозутиниб приводит к подавлению фосфорилирования белков семейства Src в 10 раз по сравнению с контролем в обеих клеточных линиях. PIM447 же наоборот вызывает в клетках увеличение количества фосфорилированных форм Src киназ в 3 раза относительно контрольных клеток линии H1299. Однако в клетках SK-OV-3 отмечается снижение количества pSFK относительно контроля, но при этом оно все равно в 8 раз превышает количество этого же белка в клетках, обработанных бозутинибом. В клетках обеих клеточных линий в условиях действия комбинации препаратов мы наблюдали снижение относительного количества pSFK в два и

более раза относительно контрольных клеток. Это говорит о том, что Р1М447 не ингибирует pSFK, а в линии Н1299 наоборот инициирует ее активацию.

При этом бозутиниб, Р1М447 и их комбинация снижали относительное количество белков ВСЬ2 и ВСЬ-ХЬ. Это явление соотносится с процессом гибели клеток в сфероидах под действием этих препаратов. Однако, между изменениями относительного количества белков семейств ВСЬ2 и pSFK отсутствует прямая взаимосвязь. Возможно, гибель клеток под действием комбинации препаратов вызвана нарушением процесса гликолиза.

Рисунок 25. Качественная оценка белков в клетках линий Н1299 и SK-OV-3, обработанных бозутинибом, Р1М447 и их комбинацией, методом Вестерн-блот с использованием антител против pSrc, В^2 и BCL-XL. Количество анализируемых белков нормировано на количество в-актина.

3.12. Комбинированная терапия бозутиниба с PIM447 приводит к изменению локализации р-катенина в клетках от области межклеточных контактов к центру

В связи с тем, что комбинация бозутиниба с Р1М447 препятствует образованию групп клеток, и это может лежать в основе ее эффективности на сфероидах, с помощью конфокальной микроскопии мы провели качественную оценку белков, участвующих в адгезии клеток (Рисунок 26). В качестве таких белков мы выбрали F-актин, паксиллин и в-катенин, которые принимают непосредственное участие в клеточном движении.

В результате мы показали, что интенсивность окрашивания F-актина, паксиллина и в-катенина усиливается под действием бозутиниба и комбинации препаратов, и понижается или

остается неизменной под действием Р1М447 (Рисунок 26). F-актиновые нити независимо от действия препаратов локализуются на периферии клеток в местах межклеточных взаимодействий, а паксиллин равномерно распределяется по цитоплазме (Рисунок 26). Напротив Р-катенин в случае действия бозутиниба или Р1М447 локализуется преимущественно на периферии клетки. Однако в условиях действия комбинации бозутиниба с Р1М447 его локализация смещается от периферии к центру (Рисунок 26).

DMSO Бозутиниб PIM-447 Комбинация

Рисунок 26. Анализ локализации белков F-актина, ß-катенина и паксиллина на линии H1299 методом конфокальной микроскопии. Синим цветом окрашены ядра красителем Hoechst 33342.

Это явление подтверждается распределением интенсивности ß-катенина в цитоплазме клеток, сделанным на основе анализа цвета пикселей изображений (Рисунок 27 А, Б). В результате анализа мы показали, что в контрольных клетках ß-катенин равномерно распределен

в клетке (Рисунок 27 Б). Действие Р1М447 и бозутиниба по отдельности приводит к изменению его локализации от центра к области межклеточных контактов (Рисунок 27 Б). А в случае их действия в комбинации распределение Р-катенина в клетке становится равномерным подобно его распределению в контрольных клетках (Рисунок 27 Б).

Такое распределение напрямую влияет на количество клеток в группе и их выживаемость (Рисунок 27 В, Г). Мы проанализировали связь между распределением Р-катенина и количеством соседних клеток и показали, что в клетках, обработанных бозутинибом или комбинацией бозутиниба с Р1М447, и взаимодействующих с тремя и более клетками, наблюдается смещение локализации Р-катенина от области межклеточных контактов к центру (Рисунок 27 В). В одиночных же клетках по прежнему распределение Р-катенина наблюдается на периферии. В этом случае процент одиночных мертвых клеток под действием комбинации препаратов гораздо выше, чем клеток в составе группы (Рисунок 27 Г). Однако даже при этом, процент мертвых клеток, взаимодействующих с тремя и более клетками, и обработанных комбинацией препаратов, значительно выше, чем в клетках под действием бозутиниба и Р1М447 по отдельности.

Исходя их этого можно сделать вывод, что совместное действие бозутиниба с Р1М447 препятствует локализации Р-катенина, в зоне межклеточных контактов, что приводит к нарушению взаимодействия между клетками и снижению их выживаемости.

Рисунок 27. Оценка локализации в-катенина в зависимости от действия ингибиторов и количества соседних клеток. А) Интенсивность окрашивания в-катенина в зависимости от его локализации в клетках линии Н1299 в результате действия препаратов. Чем темнее цвет, тем выше интенсивность окрашивания в-катенина. Б) Распределение интенсивности в-катенина в клетках в зависимости от локализации. В) Анализ изменения локализации в-катенина в клетке в результате действия препаратов в зависимости от количества соседей у клетки. Г) Диаграммы изменения процента мертвых клеток, обработанных препаратами, в зависимости от количества соседних клеток. *-р^аЫе < 0.05, **- р-уа1ие < 0.01 по критерию ^Стьюдента.

3.13. Эффективность действия комбинации бозутиниба с PIM447 зависит от

подавления MYC

Помимо влияния бозутиниба и PIM447 на изменение локализации Р-катенина в области межклеточных взаимодействий, еще одной их общей особенностью является факт подавления c-MYC. pSrc препятствует синтезу белка MYC за счет снижения его экспрессии, а PIM447 за счет снижения его стабильности. Помимо того, что MYC относится к протоонкогенам и выступает в качестве фактора транскрипции, и способствует выживаемости клеток, известно, что с-MYC взаимодействует с Р-катенином в рамках сигнального пути WNT. Во многих типах опухолей наблюдается гиперэкспрессия гена MYC, в том числе в тех клеточных линиях, которые характеризуются высокой экспрессией киназ SFK и PIM1/2/3. На основе этого, можно предположить, что эффективность комбинации бозутиниба с PIM447 может быть связана с подавлением MYC.

На основе предположения, мы провели анализ изменения экспрессии гена MYC в клетках под действием препаратов. В результате ПЦР было показано, что в клетках линии Н1299 снижается экспрессия гена MYC под действием бозутиниба и комбинации бозутиниба с PIM447 (Рисунок 28 А). Однако PIM447 не влиял на уровень экспрессии.

Для того, чтобы изучить, как влияет с-MYC на выживаемость клеток, с помощью лентивирусной трансдукции мы создали клеточную линию Н1299 с гиперэкспрессией MYC (Рисунок 28 Б). В качестве контрольной линии создали линию Н1299 с такой же лентивирусной вставкой, но в которой отсутствует ген MYC. По итогу ПЦР было показано, что экспрессия MYC в полученных клеточных линиях с гиперэкспрессией MYC значительно превосходит экспрессию гена в клетках с лентивирусной конструкцией без MYC, и подавление экспрессии в обеих клеточных линиях происходит пропорционально (Рисунок 28 В). Это означает, что даже в случае гиперэкспрессии MYC бозутиниб и его комбинация с PIM447 давит его экспрессию. На пролиферацию клеток MYC тоже почти не оказывает влияние, и под действием препаратов гибель клеток происходит пропорционально в обеих клеточных линиях за исключением случая действия комбинации препаратов (Рисунок 28 Г). Клеточная линия Н1299 с гиперэкспрессией MYC значительно более устойчива к действию комбинации. Возможно это связано с тем, что комбинация препаратов подавляет экспрессию только нативного гена, а вирусный ген при этом продолжает экспрессироваться. В результате наличие белка c-MYC способствует выживаемости клеток. Это говорит о том, что эффективность комбинации бозутиниба с PIM 447 напрямую зависит от подавления с-MYC.

В результате анализа изменения активности белков c-MYC и pSFK под действием бозутиниба, PIM447 и их комбинации, наблюдается подавление бозутинибом и его комбинацией

белков c-MYC и pSFK (Рисунок 28 Д). Однако PIM447 приводит к подавлению PIM, но при этом в 3 раза увеличивается активность pSFK. Возможно, pSrc компенсирует подавление PIM, увеличивая экспрессию MYC, поэтому под действием препарата PIM447 не видно изменение экспрессии MYC. А в случае ингибирования бозутинибом pSrc подавляется одновременно с экспрессией MYC. Поэтому синергичный эффект комбинации бозутиниба с PIM447 объясняется подавлением с-MYC на уровне и белка и на уровне гена (Рисунок 28 Е).

Рисунок 28. Эффективность действия комбинации бозутиниба с PIM447 зависит от подавления MYC. А) Диаграммы изменения экспрессии гена MYC под действием бозутиниба, PIM447 и их комбинации, полученные с помощью ПЦР в реальном времени. Контрольные клетки

обработаны DMSO. Б) Схема лентивирусных векторов, которые использовались для получения клеточных линий с гиперэкспрессией MYC. В) Диаграммы изменения экспрессии гена MYC в клеточной линии с гиперэкспрессией MYC и линии с лентивирусной вставкой, обработанные бозутинибом, PIM447 и их комбинацией, полученные путем ПЦР в реальном времени. Контрольные клетки обработаны DMSO. Г) Диаграммы изменения количества клеток с лентивирусной вставкой без MYC и с гиперэкспрессией MYC в лунке, обработанных бозутинибом, PIM447 и их комбинацией. Контрольные клетки обработаны DMSO. Количества клеток были получены методом прямого подсчета с помощью съемки на флуоресцентном микроскопе клеток, окрашенных красителем Hoechst 33342, и последующей обработкой изображений в программном обеспечении CellProfiller. *-p-value < 0.05, **- p-value < 0.01, ***-p-value < 0.001 по критерию t-Стьюдента. Д) Качественная оценка белков в клетках линий H1299, H1299ig2++, H1299ig2++MYC обработанных бозутинибом, PIM447 и их комбинацией, методом Вестерн-блот с использованием антител против pSFK и c-MYC. Количество анализируемых белков нормировано на количество ß-актина. Е) Схема действия комбинации препаратов на MYC. Линия с блоком на конце обозначает подавление активности киназы. Стрелка обозначает активацию транскрипции или поддержание стабильности белка. Красный крест обозначает остановку передачи сигнала в связи с блокировкой киназы ингибитором. Пунктирная стрелка обозначает синтез белка как продукт данного гена.

3.14. Активация пути ERK 1/2 способствует выживаемости клеток, но действие комбинации бозутиниба с PIM447 препятствует этому процессу

Для поиска сигнального пути, который затрагивается комбинацией бозутиниба с PIM447, что влечет за собой снижение выживаемости клеток, мы рассмотрели вероятность участия MET и EGFR в этом процессе. Известно, что рецепторы MET и EGFR, которые активируется через фактор роста гепатоцитов (HGF) и эпидермальный фактор роста (EGF) соответственно, участвуют в формировании резистентности клеток к противораковой терапии, в том числе к ингибиторам Src киназ [270]. Кроме того, анализ транскриптома показал, что бозутиниб затрагивает пути, в которых принимают участие данные ростовые факторы.

В результате на линии H1299 мы продемонстрировали, что добавление 100 нг/мл ростовых факторов HGF и EGF повышает выживаемость клеток, обработанных бозутинибом (Рисунок 29 А). А в случае клеток, обработанных комбинацией бозутиниба с PIM447, наблюдается явление преодоления устойчивости. Особенно эффект снижения выживаемости клеток под действием комбинации препаратов сильно заметен на клетках, обработанных ростовыми факторами EGF.

И на основе этого важно было проверить блокируется при действии комбинации препаратов сигнальный путь ЕЯЮ/2. Для этого клетки Н1299 ЕКК-КТЯ обрабатывали босутинибом и комбинацией препаратов в течение 72 часов, а затем поместили клетки в бессывороточную среду для дальнейшей оценки активности ЕЯК1/2 (Рисунок 29 Б). В результате было показано, что под действием бозутиниба активность ЕЯК1/2 относительно контрольных клеток падает, однако со временем начинает расти. Особенно рост ее активности наблюдался в клетках, которые взаимодействовали с тремя соседними клетками и более. При этом в случае действия комбинации бозутиниба с Р1М447 наблюдалось снижение активности ЕЯК1/2, которое сохранялось ниже контрольных клеток на протяжении всего времени как в одиночных клетках, так и в клетках в составе группы. Это говорит о том, что Р1М447 в сочетании с бозутинибом воздействует на сигнальный путь ЕЯК1/2, ответственный за возникновение лекарственной устойчивости к бозутинибу. Это позиционирует данные ингибиторы как перспективную комбинацию для лечения злокачественных опухолей.

Рисунок 29. Оценка активности ERK1/2 под действием препаратов и ростовых факторов. А) Графики динамики пролиферации клеток под действием препаратов и ростовых факторов EGF и HGF на протяжении 144 часов. Б) Графики изменения активности ERK1/2 в клетках Н1299 ERK-KTR под действием бозутиниба и комбинации бозутиниба с Р1М447 на протяжении 72 часов. В анализе учитывалось изменение активности ERK1/2 в одиночных клетках и клетках в составе группы. Пунктирная линия обозначает относительный уровень активности ERK1/2 в контрольных клетках.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В рамках работы был проведён комплексный анализ действия ингибиторов киназ Src, и, в частности бозутиниба, который включал анализ изменений транскриптома, количественный анализ изменения морфологии клеток, измерения уровня фосфорилирования ключевых мишеней бозутиниба, а также детальное изучение механизмов адаптации клеток. В результате данного исследования был описан новый механизм, при котором сильное ингибирование подвижности клеток приводит к образованию клеточных групп и формированию межклеточных контактов, что в свою очередь существенно снижает чувствительность злокачественных клеток к ингибитору Src бозутинибу. Также показано, что хотя бозутиниб имеет более 40 описанных белков-мишеней, его воздействие на клетки солидных опухолей характеризуется именно воздействием на киназы семейства Src. Это подтверждается особенностью воздействия на морфологию клеток и их подвижность, которые уникальные именно для ингибиторов Src и отличают их от ингибиторов других киназ. Кроме того, это также подтверждается взаимосвязью между высоким уровнем фосфорилирования киназ семейства Src и чувствительностью к ингибиторам для клеток различной природы.

Роль киназ Src в миграции и подвижности клеток хорошо описана во многих исследованиях. Src участвует в регуляции фокальной адгезии, а ингибиторы Src не только ингибируют фосфорилирование белка, но и повышают стабильность комплексов Src с белками фокальной адгезии, предотвращая их диссоциацию, которая необходима для движения клетки. Хотя существует множество киназ, включая киназы фокальной адгезии FAK и рецепторные тирозинкиназы, которые способствуют миграции и инвазии злокачественных клеток клеток, наши результаты показывают, что ингибиторы Src оказывают уникальное воздействие на подвижность клеток по сравнению с другими ингибиторами киназ. Известно, что избыточная экспрессия Src приводит к нарушению межклеточных контактов, и восстановление межклеточного взаимодействия и ингибирование способности к миграции с помощью бозутиниба обычно рассматривается как благоприятное событие, которое возвращает опухоли в более доброкачественное состояние. Однако полученные результаты указывают, что именно эти события могут сделать злокачественные клетки невосприимчивыми к ингибированию Src и снизить эффективность бозутиниба. Морфологические изменения, вызванные ингибиторами Src, были описаны ранее, но ранее не была описана связь между ними и развитием резистентности к бозутинибу. Прижизненная съемка клеток под действием бозутиниба показала, что снижение подвижности клеток при наличии контактов с соседними клетками поддерживает выживание и пролиферацию клеток, что затем приводит к образованию плотных

клеточных групп. Окрашивание клеток флуоресцентными индикаторами гибели клеток показало, что клетки с значительным количеством межклеточных контактов не подвержены гибели даже в условиях повышения концентрации бозутиниба, в отличие от клеток с низким количеством соседних клеток. Это указывает на то, что межклеточные контакты препятствуют восприимчивости клеток к препарату.

Интересно, что ингибитор киназ PIM PIM447 продемонстрировал наибольшую синергию с бозутинибом в стандартной культуре клеток и на моделях сфероидов. Мы показали, что ингибирование PIM влияет на несколько ключевых аспектов адаптации клеток к бозутинибу: оно нарушает транслокацию Р-катенина, предотвращает реактивацию киназ ERK1/2 и способствует гибели клеток. В клетках аденокарциномы легкого PIM447 также вызывает значительное усиление фосфорилирования Src, что может способствовать поддержанию транскрипции MYC и, таким образом, компенсировать ингибирование PIM, но при этом делает клетки более восприимчивыми к ингибированию Src. Другая возможная синергия между ингибированием PIM и Src связана со способностью PIM1 стимулировать образование липидных капель, что позволяет раковым клеткам адаптироваться к глюкозному голоданию. Src контролирует активность ключевых белков гликолиза и поддерживает стабильность липидных капель. Таким образом, вызванное бозутинибом глюкозное голодание может быть компенсировано поддержанием липидных капель PIM-1. Выявленный синергизм между ингибитором mTOR рапамицином и бозутинибом, а также подавление MYC с помощью комбинации PIM477 и бозутиниба дополнительно подтверждают возможное участие метаболизма глюкозы, поскольку MYC и mTOR являются основными регуляторами гликолиза. В других работах было показано, что ингибиторы PIM и Src одинаково эффективны для преодоления резистентности к ингибированию MET, что подчеркивает их участие в комплементарных сигнальных путях.

Полученные в работе результаты позволили объяснить причины возникновения устойчивости клеточных линий к действию ингибиторов Src бозутинибу, саракатинибу и бафетинибу, и найти способ преодоления резистентности с помощью комбинации бозутиниба с PIM447. Ингибирование PIM является многообещающим подходом к преодолению механизмов клеточной адаптации, который показал эффективность в отношении различных типов злокачественных клеток. Комбинация ингибиторов Src и PIM может быть особенно эффективна для пациентов с опухолями, зависимыми от экспрессии MYC, или опухолями с усиленной передачей сигналов MET или EGFR.

ВЫВОДЫ

1. Был разработан метод для оценки выживаемости клеток с помощью автоматизированного флуоресцентного микроскопа. Измерение выживаемости данным методом минимизирует влияние изменений размеров клеток и активности митохондрий под действием противоопухолевых препаратов на точность измерений и позволяет проводить широкомасштабные прижизненные измерения, в том числе для исследования динамики пролиферации клеток.

2. Повышенный уровень фосфорилирования киназ Src и Yes может указывать на чувствительность клеток к действию бозутиниба и саракатиниба. Повышенный уровень фосфорилирования Lyn указывает на чувствительность к бафетинибу.

3. Бозутиниб приводит к изменению активности сигнальных путей, ответственных за передачу сигнала от рецепторов ростовых факторов, миграцию клеток и реакцию клеток на стресс. На основе изменения активности сигнальных путей под действием бозутиниба удалось подобрать ингибиторы, проявляющие синергию совместно с бозутинибом: ингибитор mTOR рапамицин, ингибитор киназы фокальной адгезии NVP-TAE 226, и ингибитор киназ PIM PIM447.

4. Образования групп клеток с усиленными межклеточными контактами вследствие сниженной подвижности клеток под действием ингибиторов Src приводит к развитию резистентности клеток к этим ингибиторам.

5. Комбинация бозутиниба с PIM447 проявляет синергический эффект за счет препятствования локализации ß-катенина в области межклеточных контактов, снижения экспрессии MYC и блокирования реактивации ERK1/2.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Liu S.T. и др. Src as the link between inflammation and cancer // Front. Physiol. 2014. Т. 4.

2. Pelaz S.G., Tabernero A. Src: coordinating metabolism in cancer // Oncogene. 2022. Т. 41, № 45. С.4917-4928.

3. Chen J. и др. Focal adhesion kinase/Src family kinase axis-mediated tyrosine phosphorylation of metabolic enzymes facilitates tumor metastasis // Signal Transduct. Target. Ther. 2025. Т. 10, № 1. С. 280.

4. Marcinkowska E., Gocek E. Tyrosine Kinase Signaling Pathways in Normal and Cancer Cells // Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors / под ред. Focosi D. Cham: Springer International Publishing, 2016. С. 1-25.

5. Wheeler D.L., Iida M., Dunn E.F. The role of Src in solid tumors // The Oncologist. 2009. Т. 14, № 7. С. 667-678.

6. Kumar A., Jaggi A.S., Singh N. Pharmacology of Src family kinases and therapeutic implications of their modulators // Fundam. Clin. Pharmacol. 2015. Т. 29, № 2. С. 115-130.

7. Angelucci A. Targeting Tyrosine Kinases in Cancer: Lessons for an Effective Targeted Therapy in the Clinic // Cancers. 2019. Т. 11, № 4. С. 490.

8. Egeland E.V. и др. The SRC-family serves as a therapeutic target in triple negative breast cancer with acquired resistance to chemotherapy // Br. J. Cancer. 2024. Т. 131, № 10. С. 1656-1667.

9. Martellucci S. и др. Src Family Kinases as Therapeutic Targets in Advanced Solid Tumors: What We Have Learned So Far // Cancers. 2020. Т. 12, № 6. С. 1448.

10. Golas J.M. и др. SKI-606, a 4-anilino-3-quinolinecarbonitrile dual inhibitor of Src and Abl kinases, is a potent antiproliferative agent against chronic myelogenous leukemia cells in culture and causes regression of K562 xenografts in nude mice // Cancer Res. 2003. Т. 63, № 2. С. 375-381.

11. Song L. и др. Dasatinib (BMS-354825) Selectively Induces Apoptosis in Lung Cancer Cells Dependent on Epidermal Growth Factor Receptor Signaling for Survival // Cancer Res. 2006. Т. 66, №

11. С. 5542-5548.

12. Johnson F.M. и др. Dasatinib (BMS-354825) Tyrosine Kinase Inhibitor Suppresses Invasion and Induces Cell Cycle Arrest and Apoptosis of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma and Non-Small Cell Lung Cancer Cells // Clin. Cancer Res. 2005. Т. 11, № 19. С. 6924-6932.

13. Bieerkehazhi S. u gp. Novel Src/Abl tyrosine kinase inhibitor bosutinib suppresses neuroblastoma growth via inhibiting Src/Abl signaling // Oncotarget. 2017. T. 8, № 1. C. 1469-1480.

14. Messersmith W.A. u gp. Bosutinib (SKI-606), a dual Src/Abl tyrosine kinase inhibitor: Preliminary results from a phase 1 study in patients with advanced malignant solid tumors // J. Clin. Oncol. 2007. T. 25, № 18_suppl. C. 3552-3552.

15. Vultur A. u gp. SKI-606 (bosutinib), a novel Src kinase inhibitor, suppresses migration and invasion of human breast cancer cells // Mol. Cancer Ther. 2008. T. 7, № 5. C. 1185-1194.

16. Parsons S.J., Parsons J.T. Src family kinases, key regulators of signal transduction // Oncogene. 2004. T. 23, № 48. C. 7906-7909.

17. Hikita T. u gp. Src in endosomal membranes promotes exosome secretion and tumor progression // Sci. Rep. 2019. T. 9, № 1. C. 3265.

18. Kasahara K. u gp. Rapid trafficking of c-Src, a non-palmitoylated Src-family kinase, between the plasma membrane and late endosomes/lysosomes // Exp. Cell Res. 2007. T. 313, № 12. C. 2651-2666.

19. Raji L., Tetteh A., Amin A.R.M.R. Role of c-Src in Carcinogenesis and Drug Resistance // Cancers. 2023. T. 16, № 1. C. 32.

20. Bagnato G. u gp. Nuclear Functions of the Tyrosine Kinase Src // Int. J. Mol. Sci. 2020. T. 21, № 8. C. 2675.

21. Pelaz S.G., Tabernero A. Src: coordinating metabolism in cancer // Oncogene. 2022. T. 41, № 45. C.4917-4928.

22. Roskoski R. Src protein-tyrosine kinase structure, mechanism, and small molecule inhibitors // Pharmacol. Res. 2015. T. 94. C. 9-25.

23. Roskoski R. Src protein-tyrosine kinase structure, mechanism, and small molecule inhibitors // Pharmacol. Res. 2015. T. 94. C. 9-25.

24. Roskoski R. Src protein-tyrosine kinase structure and regulation // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. T. 324, № 4. C. 1155-1164.

25. Thomas S.M., Brugge J.S. CELLULAR FUNCTIONS REGULATED BY SRC FAMILY KINASES // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1997. T. 13, № 1. C. 513-609.

26. Sen B., Johnson F.M. Regulation of Src Family Kinases in Human Cancers // J. Signal Transduct. 2011. T. 2011. C. 1-14.

27. Bagnato G. u gp. Nuclear Functions of the Tyrosine Kinase Src // Int. J. Mol. Sci. 2020. T. 21, № 8. C. 2675.

28. Marhäll A., Kazi J.U., Rönnstrand L. The Src family kinase LCK cooperates with oncogenic FLT3/ITD in cellular transformation // Sci. Rep. 2017. T. 7, № 1. C. 13734.

29. Chong Y.-P. u gp. Endogenous and synthetic inhibitors of the Src-family protein tyrosine kinases // Biochim. Biophys. Acta BBA - Proteins Proteomics. 2005. T. 1754, № 1-2. C. 210-220.

30. Martins-Green M. u gp. Tissue specific expression of Yrk kinase: implications for differentiation and inflammation // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2000. T. 32, № 3. C. 351-364.

31. Boggon T.J., Eck M.J. Structure and regulation of Src family kinases // Oncogene. 2004. T. 23, № 48. C. 7918-7927.

32. Kato G. Regulatory Roles of the N-Terminal Intrinsically Disordered Region of Modular Src // Int. J. Mol. Sci. 2022. T. 23, № 4. C. 2241.

33. Amata I., Maffei M., Pons M. Phosphorylation of unique domains of Src family kinases // Front. Genet. 2014. T. 5.

34. Summy J.M. u gp. The SH3 and SH2 domains are capable of directing speci^city in protein interactions between the non-receptor tyrosine kinases cSrc and cYes.

35. Honda T. u gp. Protective role for lipid modifications of Src-family kinases against chromosome missegregation // Sci. Rep. 2016. T. 6, № 1. C. 38751.

36. Kamps M.P., Buss J.E., Sefton B.M. Rous sarcoma virus transforming protein lacking myristic acid phosphorylates known polypeptide substrates without inducing transformation // Cell. 1986. T. 45, № 1. C. 105-112.

37. Bagrodia S., Taylor S.J., Shalloway D. Myristylation Is Required for Tyr-527 Dephosphorylation and Activation of pp60 c- src in Mitosis // Mol. Cell. Biol. 1993. T. 13, № 3. C. 1464-1470.

38. Udenwobele D.I. u gp. Myristoylation: An Important Protein Modification in the Immune Response // Front. Immunol. 2017. T. 8. C. 751.

39. Thomas S.M., Brugge J.S. CELLULAR FUNCTIONS REGULATED BY SRC FAMILY KINASES // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 1997. T. 13, № 1. C. 513-609.

40. Kato G. Regulatory Roles of the N-Terminal Intrinsically Disordered Region of Modular Src // Int. J. Mol. Sci. 2022. T. 23, № 4. C. 2241.

41. Shenoy S. u gp. Role of p34cdc2-mediated phosphorylations in two-step activation of pp60c-src during mitosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. T. 89, № 15. C. 7237-7241.

42. Kim J.-G. u gp. RhoA GTPase phosphorylated at tyrosine 42 by src kinase binds to P-catenin and contributes transcriptional regulation of vimentin upon Wnt3A // Redox Biol. 2021. T. 40. C. 101842.

43. Kato G., Maeda S. High-level expression of human c-Src can cause a spherical morphology without loss of anchorage-dependent growth of NIH 3T3 cells // FEBS Lett. 1997. T. 411, № 2-3. C. 317-321.

44. Pan Q. u gp. Cdk5 targets active Src for ubiquitin-dependent degradation by phosphorylating Src(S75) // Cell. Mol. Life Sci. 2011. T. 68, № 20. C. 3425-3436.

45. Pérez Y. u gp. Lipid binding by the Unique and SH3 domains of c-Src suggests a new regulatory mechanism // Sci. Rep. 2013. T. 3, № 1. C. 1295.

46. Pérez Y. u gp. Lipid binding by the Unique and SH3 domains of c-Src suggests a new regulatory mechanism // Sci. Rep. 2013. T. 3, № 1. C. 1295.

47. Martelli A.M. u gp. Intranuclear 3'-phosphoinositide metabolism and Akt signaling: New mechanisms for tumorigenesis and protection against apoptosis? // Cell. Signal. 2006. T. 18, № 8. C. 1101-1107.

48. Mezquita B., Reyes-Farias M., Pons M. Targeting the Src N-terminal regulatory element in cancer // Oncotarget. 2023. T. 14, № 1. C. 503-513.

49. Williams J.C. u gp. The 2.35 á crystal structure of the inactivated form of chicken src: a dynamic molecule with multiple regulatory interactions // J. Mol. Biol. 1997. T. 274, № 5. C. 757-775.

50. Noble M.E. u gp. Crystal structure of the SH3 domain in human Fyn; comparison of the three-dimensional structures of SH3 domains in tyrosine kinases and spectrin. // EMBO J. 1993. T. 12, № 7. C. 2617-2624.

51. Kaneko T. The SH3 domain- a family of versatile peptide- and protein-recognition module // Front. Biosci. 2008. T. Volume, № 13. C. 4938.

52. Li S.S.-C. Specificity and versatility of SH3 and other proline-recognition domains: structural basis and implications for cellular signal transduction // Biochem. J. 2005. T. 390, № 3. C. 641-653.

53. Salinas-Garcia M.C., Plaza-Garrido M., Camara-Artigas A. The impact of oncogenic mutations of the viral Src kinase on the structure and stability of the SH3 domain // Acta Crystallogr. Sect. Struct. Biol. 2021. T. 77, № 6. C. 854-866.

54. Kapoor T.M., Andreotti A.H., Schreiber S.L. Exploring the Specificity Pockets of Two Homologous SH3 Domains Using Structure-Based, Split-Pool Synthesis and Affinity-Based Selection // J. Am. Chem. Soc. 1998. T. 120, № 1. C. 23-29.

55. Shvartsman D.E. u gp. Src kinase activity and SH2 domain regulate the dynamics of Src association with lipid and protein targets // J. Cell Biol. 2007. T. 178, № 4. C. 675-686.

56. Broome M.A., Hunter T. Requirement for c-Src Catalytic Activity and the SH3 Domain in Platelet-derived Growth Factor BB and Epidermal Growth Factor Mitogenic Signaling // J. Biol. Chem. 1996. T. 271, № 28. C. 16798-16806.

57. Waksman G. Binding of a high affinity phosphotyrosyl peptide to the Src SH2 domain: Crystal structures of the complexed and peptide-free forms // Cell. 1993. T. 72, № 5. C. 779-790.

58. Xu W., Harrison S.C., Eck M.J. Three-dimensional structure of the tyrosine kinase c-Src // Nature. 1997. T. 385, № 6617. C. 595-602.