Разработка иммуноферментного метода диагностики стрептококковой инфекции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат ветеринарных наук Ашурова, Зебуниссо Джамаловна

• Ашурова, Зебуниссо Джамаловна
• кандидат ветеринарных наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Ашурова, Зебуниссо Джамаловна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

1.1. Общая характеристика стрептококков

1.1.2. Этиологическая роль стрепто- 11 коккозов в патогенезе различных заболеваний

1.1.3.Антигенная структура стрепто- 14 кокков

1.1 ^.Классификация стрептококков

1.2.0сновные методы диагностики

1.2.1. Иммуноферментный анализ в 27 диагностике инфекционных заболеваний

1.2.2.Ферменты и субстраты, исполь- 33 зуемые в иммуноферментном анализе.

1.2.3. Применение иммунофермент-ного анализа для диагностики стрептококковых инфекций

2. Собственные исследования 39

2.1.Материалы и методы 39-47 2.1.1 .Материалы 39 2.1.2.Методы исследований

2.2. Статистические методы

3.Результаты исследований

3.1.Культивирование 8. ецш БиЬБр. гооер1(1е1Шсиз

3.2.Получение специфических антистрептококковых сывороток

3.2.1.Совершенствование метода получения стрептококковых антигенов для гипериммунизации.

3.2.2.Изыскание оптимальных вариантов схем для иммунизации

3.3.Результаты испытания антистрептококковых сывороток на активность и специфичность

3.4. Получение реагентов набора ИФА.

3.4.1. Получение иммунопероксидаз-ных конъюгатов и отработка постановки иммуноферментного анализа.

3.4.2. Выделение и сравнительный химический состав антигенных препаратов Б. eqш БиЬБр. 200ер1(1егтси8 полученных разными методами

3.4.3. Иммуноферментный анализ с антигенами, полученными различными методами.

3.4.4. Определение оптимальных условий проведения ИФА

3.4.5. Определение оптимального 80 разведения конъюгата

3.4.6. Подбор индикаторной смеси

3.5. Экспериментальные испытания твердофазного иммуноферментного анализа

4. Обсуждение результатов исследо- 91 ваний

ВЫВОДЫ

Практическое использование полу- 101 ченых научных результатов

Рекомендации по использованию по- Ю1 лученных научных результатов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка иммуноферментного метода диагностики стрептококковой инфекции»

Ветеринарная наука за последние годы достигла значительных успехов в диагностике, профилактике и лечении инфекционных болезней животных. С целью разработки более эффективных и адекватных методов диагностики, средств специфической профилактики болезней животных требуются новые методические подходы, основанные на современных достижениях биологической науки и научно-технического прогресса в целом.

В связи с этим одним из главных направлений ветеринарной диагностики является создание простых в использовании и надежных иммунохи-мических методов экспресс-диагностики инфекционных болезней животных. Этот подход важен, когда речь идет о диагностике таких бактериальных инфекций как стрептококкозы. Из-за особенностей идентификации стрептококков при бактериологическом анализе не всегда удается выявить их как этиологический агент.

Применение антибиотиков, а также появление атипичных, плохо дифференцируемых форм бактерий существенно снижают эффективность бактериологического исследования. Трудности бактериологического анализа стрептококковых инфекций также связаны с несовершенством питательных сред и дороговизной или отсутствием в практических лабораториях некоторых ингредиентов, необходимых для идентификации. Поэтому представляется перспективным использовать методы иммунохимической диагностики стрептококковой инфекции, направленные на выявление постинфекционных или поствакцинальных антител.

Стрептококкозы регистрируют в крупных и мелких животноводческих хозяйствах Дании, Германии, Франции, США, Англии, Словакии, России и ряда других стран (126; 152; 122, 156; 8, 19; 45). Значительное распространение и экономический ущерб от заболеваний, вызываемых стрептококками (слагаемый из гибели животных, затрат на диагностику, лечение,

• профилактику), актуализируют задачу создания современных методов лабораторной диагностики инфекции.

Широкое распространение кокков затрудняет диагностику только по результатам бактериологического исследования и нуждается в дополнительном подтверждении путем выявления реакции антителообразования у инфицированных животных. Этим требованиям отвечают методы, основанные на реакции взаимодействия антигена с антителом и получении иммунного комплекса, который можно выявить с помощью меченного ферментом реагента (62; 152; 16). Результат реакции оценивают по интенсивности окрашивания визуально или используют автоматизированные методы учета.

В ветеринарии иммуноферментный анализ используют для обнаружения возбудителей инфекционных болезней животных и птиц. Метод успешно применяется для выявления антител вирусу лейкоза крупного рогатого скота (84), к возбудителю бруцеллеза (46), для диагностики трихинеллеза, к

• возбудителю вируса болезни Ньюкасла, к возбудителю чумы свиней и др. (15).

При разработке препарата для диагностики стрептококковой инфекции необходимо определить, какие из бактериальных антигенов играют ведущую роль в ходе патологического процесса. В многочисленных исследованиях, посвященных этому вопросу ранее, было показано, что полисахариды клеточной стенки стрептококков играют основную роль в стимуляции иммунного ответа и создании иммунитета к стрептококку гомологичного серотипа (13,97,107,170,180).

Это послужило основанием для использования С-полисахарида в качестве специфического реагента (антигена) в иммуноферментном анализе. Ранее изученные биологические и серотипические свойства С-полисахарида (11; 19; 152; 102, 130; 13) позволили определить оптимальные условия ад

• сорбции его на твердом носителе (полистироловом планшете) и получить высокоактивные гипериммунные сыворотки к стрептококковым антигенам (45; 62; 11,18).

Классические иммунологические тесты, такие как РА, РДП, РП по выявлению специфических антител к стрептококкозам животных требуют титрования. При этом невысокая чувствительность и значительная доля субъективизма в учете этих реакций, связанного с тем, что, как правило, нелегко отличить слабую положительную реакцию от отрицательной с достаточной надежностью (52). Альтернативным является иммуноферментный анализ, позволяющий непосредственно регистрировать взаимодействие антигена с антителом, а не анализировать вторичные их проявления — агглютинацию, преципитацию или гемолиз.

Результативность метода иммуноферментного анализа зависит от активности, специфичности и стабильности всех компонентов реакции.

В связи с этим, целью настоящего исследования явилась разработка ИФА теста для диагностики стрептококковой инфекции.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Отработка режимов выделения и очистки антигена штамма 8. еяш БиЬБр. 200ер1с1еггисиз и изучение его биохимического состава.

2. Разработка схемы гипериммунизации и получение специфической сыворотки и иммуноглобулина к стрептококковым антигенам.

3. Отработка параметров коньюгирования иммуноглобулинов (гаммаглобулина) пероксидазой хрена и получение специфического конъю-гата.

4. Составление набора ИФА для выявления противострептококковых антител в биологических жидкостях, подбор оптимальных параметров постановки ИФА.

5. Экспериментальные испытания ИФА выявления антител к Б. equi БиЬэр. 2ооер1с1егтси8.

Научная новизна результатов исследования. Впервые для серологической диагностики инфекционных болезней животных, вызываемых Б^ш БиЬБр. 200ер1с1егтси8 разработана тест-система ИФА. Метод показал высокую чувствительность и специфичность и позволял выявлять поствакцинальные и постинфекцинные специфические антитела.

Разработаны биотехнологические параметры получения кроличьих гипериммунных референс-сывороток и иммуноглобулинов к растворимым антигенам 8. ецш БиЬБр. гооер1с1егшси5.

Изучены условия адсорбции антигенов стрептококка на полистироловых планшетах.

Практическая значимость результатов исследования. Разработана тест-система для диагностики стрептококкозов животных, вызываемых Б. ецш БиЬБр. 2ооер1с1етюи8, методом ИФА и нормативная документация на опытно-промышленное производство антигенного иммуноферментного стрептококкового диагностикума (СТО (Технические условия), инструкция по применению). Практическое применение антигенного иммуноферментного стрептококкового диагностикума позволит повысить диагностическую значимость лабораторных исследований, проводить серологический мониторинг и прогнозировать стрептококкозы у животных.

Материалы исследований включены в учебные программы кафедр иммунология и биотехнология ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И.Скрябина.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на научно-практической конференции (г. Душанбе, 2004г) и обсуждены на межкафедральном совещании сотрудников кафедр микробиологии, эпизоотологии, иммунологии, биотехнологии и научно-исследовательской лаборатории инфекционной патологии и биотехнологии.

По теме диссертации опубликовано 4 научных работ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследований по обоснованию и разработке ИФА теста для серологической диагностики стрептококковой инфекции, вызываемой Б.ецш БиЬзр. гооер1с1е1шси8.

2. Результаты экспериментальных испытаний разработанного ИФА теста для серологической диагностики и мониторинга стрептококковой инфекции у животных.

Структура и объем работы.

• Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 рисунками и 16 таблицами. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 184 источника, из которых 100 иностранных и приложение.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Ашурова, Зебуниссо Джамаловна

4. В Ы В О Д Ы

1. Разработаны и оптимизированы методы получения реагентов тест-системы ИФА для индикации антистрептококковых антител в периферической крови животных.

2. Разработанный конкурентный ИФА тест диагностики стрептококковой инфекции характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с РА и РДП.

3. Оптимизированная схема иммунизации кроликов-доноров и выделение гамма-глобулиновой фракции позволяет получить высокоактивные гипериммунные сыворотки к Б. equi БиЬБр. гооер1с1е1шси5 с титром антител 1:3200 и более.

4. При хранении конъюгатов в присутствии глицерина, х.ч. в соотношении 1:1 в течение 6 месяцев при температуре —20°С, активность их в ИФА не снижается.

5. Перйодатный метод можно рекомендовать для получения иммуно-ферментных конъюгатов, пригодных для выявления антител к стрептококкам.

6. Метод ультразвуковой дезинтеграции позволяет получить антигены с более высокой иммуногенной активностью в ИФА, чем метод замораживания-оттаивания.

7. Адсорбция стрептококкового антигена в 0,2 М Иа-карбонатного буфере, при рН 9,6, происходили более интенсивно, чем в буфере с низким значением рН.

8. Применение ортофенилендиамина в качестве субстратно-индикаторной смеси повышает чувствительность анализа и время постановки реакции в 1,5 раза.

9. Применение нативной сыворотки северных оленей в качестве "инертного" белка позволяет заблокировать остаточные свободные центры связывания на полистироловом носителе.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Конкурентный метод ELISA рекомендуется для серологической диагностики, эпизоотологического и иммунологического мониторинга стрептококковой инфекции.

2. Разработаны проект нормативной документации (СТО и инструкция) по применению набора компонентов для диагностики стрептококковых инфекций методом иммуноферментного анализа.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Метод твердофазного ИФА на основе конкурентного метода специфического антигена S. equi subsp. zooepidemicus рекомендуется для внедрения в диагностическую практику ветеринарных лабораторий в качестве серологического экспресс-метода диагностики стрептококковых инфекций животных вызываемых S. equi subsp. zooepidemicus и мониторинга иммунного фона.

2. Отработанные технологические параметры и режимы производства с использованием отечественного сырья и оборудования могут быть использованы для изучения антигенной структуры и приготовления тест-систем для ИФА других микроорганизмов.

3. Результаты исследований по разработке иммуноферментной тест-системы по выявлению стрептококковых инфекций рекомендуется использовать в учебном процессе по дисциплине «Иммунология» в высших учебных заведениях по специальностям 020208 - Биохимия и 310800 — Ветеринария.

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Ашурова, Зебуниссо Джамаловна, 2005 год

1. Беляков В.Д Стрептококковая инфекция. /Беляков В.Д., Ходырев А.П., Тотолян A.A.// JIМедицина.-1978.-293с

2. Березин И.В. Состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа./ Березин И.В. // Бюл. ВИЭВ.-1985, Вып.58.-С.З.

3. Блюменталь H.A. Реакция преципитации, как метод скорой диагностики холеры / Блюменталь H.A., Карпов Ш.К. // ЖМЭИ.-1936.-Т.ХУ1.-С.739.

4. Бородиюк H.A. Изучение полисахарида стрептококка группы А имму-нодифузионными методами / Бородиюк H.A., Галагьянц О.П., Рассохина // ЖМЭИ. 1978, - №4. - С.94-99.

5. Бородиюк H.A. Получение сывороток для определения стрептококка группы А при помощи реакции преципитации в геле /Бородиюк H.A., Галагьянц О.П., Рассохина И.И., Лямперт И.М. // ЖМЭИ.-1975а.-№8.-62с.

6. Бородиюк H.A. Иммунодифузионный метод определения антител к специфической антигенной детерминанте полисахарида стрептококка группы А в сыворотках человека/ Бородиюк H.A., Лямперт И.М. // Лабораторное дело.-1986.-№ 11.-692с.

7. Бочков И.А. Этиология стрептококков серогруппы В в родовспомогательных учреждениях / Бочков И.А., Шевчук М.С., Игонина Ю.А.,

8. Фикс Л.И. и др.// ЖМЭИ.-1985.-№3.-6с.

9. Буй Тхап Тху Биологические свойства и серотипизация стрептококков при смешанной респираторной инфекции телят откормочных хозяйств: Автореферат дисс. канд.вет.наук: 16.00.03/ Буй Тхап Тху;МГАВМиБ-М,1989.

10. Бухова В.П. Изучние локализации нетипоспецифических белковых антигенов у стрептококка группы А и их распространение среди стрептококков других групп/ Бухова В.П., Бородиюк H.A., Колесников В.Ю., Акимова В.В. //ЖМЭИ.-1979.-№1.-С.75-78.

11. Ю.Ванеева Л.И. Иммуноферментный метод, его настоящее и будущее: (обзор) /Ванеева Л.И., Цветкова Н.В.//- И ммунология,1980,№2,с.13-19.

12. Вашакидзе М.Р. Основные биологические свойства и серотипизация возбудителя стрептококкоза нутрий./ Вашакидзе М.Р.// МВА. Автореф. к.в.н. 1990.-С.16.

13. Введенская О.И. Антитела к различным антигенным компонентам гемолитического стрептококка в антистрептококковых сыворотках./ Введенская О.И. //Дисс. канд., М.,1957.

14. Волчек H.A. Изучение G-белка в клинических изолятах стрептококков группы С и G и его использование в биотехнологии: Автореферат дисс. канд. биол. наук/Волчек Н.А.,С.-Пб., 2000.-С.16.

15. Гаврилова К. М. Получение и свойства иммунопероксидазных комплектов./ Гаврилова К. М. и др.// Биохимия.-1979.-Вып.9.-т.44.-С.1614-1622.

16. Гусев A.A. Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом /под ред. Гусева A.A. и Панина А.Н.// Владимир, 1998.

17. Дзантиев Б.Б. Гетерогенные методы иммуноферментного анализа./ Дзантиев Б.Б. //Бюллетень ВИЭВ.- М.,1985. Вып.58.-С.10-22.

18. Дзантиев Б.Б. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа. /Дзантиев Б.Б., Егоров A.M. //Журнал всесоюзного химического общества. 1982. — т.2. - №4. - С.442-449.

19. Дзюбак А.П. Иммунофлуоресцентный метод выявления и дифференциации стрептококков групп А, В, С, Д и Е при маститах коров: Автореферат дисс. канд. вет. наук: 16.00.03/Дзюбак А.П.; МГАВМиБ М., 1971.-С.20.

20. Есепенок В.А. Стрептококкоз нутрий: Диагностика, меры борьбы и специфическая профилактика: Дисс.док. вет. наук: 16.00.03/ Есепенок В.А.; МГАВМиБ М.,1998.

21. Здродовский Н.Ф. Проблемы инфекции иммунитета и аллергии./ Здро-довский Н.Ф. //- М: Медицина, 1969.-343с.

22. Ибрагимов В.М. О получении агглютинирующих сывороток / Ибрагимов В.М. // Лабораторная практика.- 1937, №7. С. 15.

23. Иоффе В.И. Иммунология ревматизма. / Иоффе В.И.// Л.:Медицина,1962.-855с.

24. Иоффе В.И. Клиническая и эпидемиологическая иммунология./ Иоффе В.И. //- Л.: Медицина,1968.-376.

25. Кадымов P.A. Стрептококкоз кур/ Кадымов P.A., Дунямалиев Г.Э. // Ветеринария.-1986.-№9.-С.39-42.

26. Камышников B.C. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика./ Камышников B.C. // Т.2., Минск 2003.

27. Капитанаки М.В. Экспериментальное изучение химиопрофилактики и терапии стрептококка кур/ Капитанаки М.В. // Инфекц. Болезни с/х животных.-1961.Научные труды. Т .4.-С.339-344.

28. Капитанаки М.В. Изучение некоторых факторов токсического действия Streptococcus zooepidemicus выделенного от кур/ Капитанаки М.В.// Труды. Краснод. книжн. изд.-Т.З.-1965.-С.135-142.

29. Капитанаки M.B. Опыты по серологической дифференцировке культур возбудителя стрептококкоза кур/ Капитанаки М.В. // Труды. Краснод. книжн. изд.-Т.З.-1965.-С. 121-127.

30. Капитанаки М.В. Бактериологическая диагностика стрептококкоза кур /Капитанаки М.В., Федорченко Е.А.// Труды. Краснодар. НИВС и вет. лаб.-Т1.-1965.-С. 143-156.

31. Капитанаки М.В. Сравнительное изучение стрептококковых инфекций у кур/ Капитанаки М.В. // Ветеринария.-1966.-№8.-С.47.

32. Капитанаки М.В. Пути распространения стрептококкоза кур/ Капитанаки М.В., Перепечаев А.И. // Ветеринария.-1969.-№8.-41с.

33. Капитанаки М.В. Изучение патогенности различных гемолитических стрептококков для кур/ Капитанаки М.В. // Инфекц. болезни с/х животных.-1971.- Научные труды. Т .4.-С.334-33

34. Капитанаки М.В. Распространение и течение стрептококкоза птиц/ Капитанаки М.В. // Инфекц. болезни с/х животных.-1971.Научные труды. Т .4.-С.311-320.

35. Капусто М.Л. Типаж гемолитических стрептококков в связи с клинической и эпидемиологией скарлатины / Капусто М.Л. // ЖМЭИ.- 1937.-Т.18.-№1.-С.21-23.

36. Карташова В.М. Индикация S.agalactiae в молоке флуоресцентно-серологическим методом./ Карташова В.М., Кузьмин H.A.// Ветеринария, 1970, 11, 109-110.

37. Карташова В.М. Маститы коров. /Карташова В.М., Ивашура А.И.// -М.: Агропромиздат, 1988.-С. 96-100.

38. Козловский E.B. Иммунофлуоресцентный метод дифференциации стрептококков/ Козловский Е.В., Дзюбак А.П. // Ветеринария.-1972.-№2.-С.94-96.

39. Колакина М.Ф. Исследование условий конструирования набора для идентификации стрептококков группы А, В и С/ Калакина М.Ф. и др. // Актуальные вопросы производства медицинских иммунологических препаратов. Т омск, 1986.-221с.

40. Колесникова В.Ю. Перекрестные иммунологические реакции между полисахаридами стрептококков групп А и др./ Колесникова В.Ю., Бо-родиюк H.A., Лямперт И.М. // Бюлл. экспер. биол. и мед.-1979.-№5.-С.433-436.

41. Куриленко А.Н. Стрептококкоз// Лечение сельскохозяйственных животных при инфекционных болезнях./ Куриленко А.Н., Крупальник В.Л.// -М.: Агропромиздат, 1986.-С. 156-159.

42. Литвин В.П. Эпизоотический процесс и особенности его проявления в промышленных комплексах/ Литвин В.П.//Тез. докл. III Всесоюз. конф. по эпизоотологии Новосибирск,-1991.-С.34-36.

43. Лямперт Б.А., Получение нетипоспецифических белковых антигенов стрептококка группы В/ Лямперт Б.А., Барановская Н.Г., Бабаева Л.Р. // ЖМЭИ.-1988.-№2.-С. 10-13.

44. Лямперт И.М. Стрептококковые инфекции // Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней / Лямперт И.М.; под общ. ред. К.И. Матвеева. М.;Медицина.-1973-с.298-318.

45. Лямперт И.М. Содержание М -субстанции как одного из показателей вирулентности стрептококков группы А, выделенных при различных стрептококковых инфекциях/ Лямперт И.М., Введенская О.И. // ЖМЭИ.-1961 .-№8.-С.43-48.

46. Малик Е.В. Этиологическая структура стрептококкозов свиней./ Малик Е.В. // Автореферат канд. вет. наук. — М.,2000.

47. Маматова З.Б. Отработка оптимальных условий проведения иммуно-ферментного анализа для выявления бруцеллезных антител./ Маматова З.Б. //Бюлл. ВИЭВ. Вып.58. - М.1985. С.39-40.

48. Матвеев К.И. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней/ Матвеев К.И. и соавт. (ред.)// Медицина, М.,1973.

49. Методическое указание по лабораторной диагностике стрептококкоза животных // Ветеринария. 1987. №7. - С.73-74

50. Миланов М. стрептококкозы по кокошките/ Миланов М. // Вет. с бирка.-1972.-№69.-1 .-С. 18-21.

51. Москалик P.C. Стрептококки серологической группы С и вызываемые ими болезни./ Москалик P.C. // Кишенев: Штиница, 1974.-С.65.

52. Мытус И. Диагностика латентных инфекций вымени индикаторными растворами./ Мытус И., Оя М. //Сб. науч. труд, студентов / Эстонский с.-х. ин-т.-№69.-1 .-С. 18-21.

53. Нго Т.Т. Иммуноферментный анализ./ Нго Т.Т, Ленхофф Г.// М.: Мир,1988, С.26-31,172-190,195-209,212-221,370-374, 428.

54. Нестеров И.А. Инфекционный полиартрит ягнят/ Нестеров И.А. Поликарпов В.А // Ветеринария.-1971.-№9.-С.57-59.

55. Нестеров И.А. Групповая серологическая идентификация возбудителя стрептококкового полиартрита ягнят/ Нестеров И.А., Поликарпов В.А., Попов Р.Ф. //Сб. науч. работ/ Сев. Кавк. НИВИ.-1975/1976.-Вып. 17.-с.55-58.

56. Нестеров И.А. Стрептококковый полиартрит у ягнят/ Нестеров И.А. //Журнал Ветеринария.-1981 .-№6.-С.35-36.

57. Нестеров И.А. Стрептококковый полиартрит/ Нестеров И.А. //Журнал паразитология.-1981 .-№6.-С.40-41.

58. Нестеров И.А. Испытание активности гипериммунной сывортки против стрептококкового полиартрита у ягнят/ Нестеров И.А. // Бюл. ВИ-ЭВ.-1986.-Вып.62.-С.56.

59. Н. Крига Определитель Бактерий Берджи /под ред. Н. Крига, Дж. Хо-улта, П.Снита, Дж. Стейли и С.Уилльямса девятое изд. В 2-х том. Том 2. -М. Мир 1997., стр537-566.

60. Падегимас Т.И.: Изучение скрытых и клинических форм маститов стрепто-стафилакокковой этиологии у коров в условиях Литовской ССР./ Падегимас Т.И.//Авторев. диссерт., Тарту, 1968.

61. Панин А.Н. Стрептококкоз свиней/ Панин А.Н. // Ветеринария-1986. №5.-С.42.

62. Покровский В.И. Медицинская микробиология/ Покровский В.И., По-здеев O.K.// М.: ГЭОТАР Медицина, 1998г.

63. Пугачева Н.Л. Разработка новых методов иммуноферментного анализа для диагностики пневмококковых инфекций: Автореф. дисс. канд. биол. наук./ Н.Л. Пугачева НИИВиС М., 1997. -23 С.

64. Рапопорт Ж.Ж. Ревматизм у детей./ Рапопорт Ж.Ж., Смирнова A.M. //М.: Медицина, 1975.

65. Ридала Э.Х. Стрептококковый мастит коров/ Ридала Э.Х. // Ветеринария.-! 964.-№5.-С.82-84.

66. Рекомендации по индикации и идентификации стрептококков. — М.,1976.

67. Савельев Е.П. Методы выделения и изучения М-белка стрептококка группы А/ Савельев Е.П., Блиникова Е.И., Петров Г.И. // ЖМЭИ.-1982.-34.-С.8-14.

68. Савельев Е.П. Молекулярные аспекты строения клеточной стенки бактерий/ Савельев Е.П., Петров Г.И. // Успехи биологической химии.-1978.-. 18.-е. 106-129.

69. Свинцов П.М. Получение паратифозных преципитирующих сывороток и испытание их с преципитогенами из чистых бактериальных культур мяса и кала/ Свинцов П.М. //Авт. дисс. кан.вет.наук.-ВИЭВ.-1936.-С.16.

70. Седов В.И. Роль энтерококков в патологии человека/ Седов В.И. // Вопросы иммунологии и микробиологии стафилококковых и стрептококковых инфекций. Л.,1975.-С.68-72.

71. Семенова Е.П. Экстракция нетипоспецифических антигенов стрептококка гр. А тицианатом калия/ Семенова Е.П., Колесникова В.Г., Смирнова М.И//Бюл. эксп. биол. и мед. -1983. -№3.-С.51-53.

72. Симов И. Диплококкоза по телятата/ Симов И. // Вет.сбирка. -1976.-№4.-С.10-15.

73. Синай Г.Я Микробиологические методы исследования при инфекционных заболеваниях./ Синай Г.Я. и соавт. (ред.) // ГИМЛ Медгиз, М.,1949.1.l

74. Смирнов A.M. Стрептококковые инфекции/ Смирнов A.M., Годлевский А.Ф. //Микробиологические основы диагностики инфекционных заболеваний. JL: Медицина,1979.-c.89-l 10.

75. Смирнов В.В. Научные основы производства диагностических препаратов./ Смирнов В.В. и др. //- Киев: Наука думка, 1980.-С. 192.

76. Темпле Н.С. Борьба с инфекцинными маститами в штате Нью-Йорк/ Темпле Н.С. //Ветеринария.-1965.-№1.-С.104-105.

77. Третьякова И.В. Разработка технологии иммуноферментной тест-системы для выявления антител к аденовирусам к.р.с./ Третьякова И.В. // Дисс. к.б.н. М.2000.

78. Угаров H.H. Химическая модификация Е-групп остатков лизина в пе-роксидазе из хрена. Доступность этих групп различным модифицирующим агентам. / Угаров H.H., Рожкова Г.Д., Васильева Т.Е., Березин И.В. //Биохимия,1978,вып.5,т.43,с.793-797.

79. Фишети В.А. М-белки стрептококков/ Фишети В.А. //В мире науки. -М.: Мир.-1991-№8.-С.24-32.

80. Хоменко H.A. К изготовлению адсорбированных агглютинирующих сывороток / Хоменко H.A., Родионова Г.Л. // Вакцины и сыворотки.-1965.-Вып.5.-С.113-125.

81. Хоменко H.A. Селекция производственных штаммов Шигела Флекс-нер при изготовлении диагностических сывороток / Хоменко H.A., Киселева Б.С., Ольшевская Т.Р. // Вакцины и сыворотки.-1970.-Вып. 13.-С.122-129.

82. Хоронжак Р. Гнойничковые заболевания кожи./ Хоронжак Р., Расевич В., Слепек С. //- Варшава, 1970.

83. Цион Р.А. Значение эпизоотологической географии/ Цион Р.А. и др. // Научн. тр./ Всесоюзн. конф. по общей эпизоотологии.-1971.-Т.74 -С.66-79.

84. ШажковЖ.А. Получение специфических компонентов для иммуно-ферментного метода при ящуре./ ШажковЖ.А., Мищенко В.А., Шуть Н.Н. //Бюлл. ВИЭВ. Вып.58. - М.1985.- С.41-44.

85. Шишков П.В. Иммуноферментный метод определения антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота./ Шишков П.В., Бурба Л.Г., Иванова Л.А., Валихов А.Ф., Макарова Л.А.// Бюлл. ВИЭВ. Вып.58. -М.,1985.- С.23-26.

86. Anaoker S. Solide-phase enzyme immunoassay for serum ferritin/ Anaoker S., Garry P.J., Standefer J.C. //Clin.Chem., 1979,-V25,1426-1431.

87. Andersen J. Use of an ansyme-linked immunosorbent assay for the detection of IgG antibodies to rinderpost virus in epidemiological surweys./ Andersen J., Rowe J., Taylor W.// -Res. Vet.sci.,1983,34,77-79.

88. Ashbaugh C.D. Protein measurement with the Folin reagent/ Ashbaugh C.D. et al.//J. Clin Inv, 1998,-V.102,-N3,-p.550-560 .

89. Avrameas S. Enzyme immunoassays and related techniques: Development and limitations/Avrameas S. ^mmunochemistry, 1969.-V.6.-p.43-52.

90. Avrameas S. Immunoenzyme techniques: Enzymes as markers for the localization of antigens and antibodies./ Avrameas S. -Int. Review of cytology., 1970,-V.27.-p.345-385

91. Avrameas S. Peroxidase labeled antibody and Fab conjugates werh on hauced intracellular penetration/ Avrameas S., Terninok T. //Immunochemistry, 1971,-V.8, -p.l 175-1179.

92. Bert F. The antigenic complect of streptococcus /Bert F. et al. // J.Clin Micr, 1997,-V.35,-p.777-779.

93. Bessen D. Epitopes of Streptococcal M-proteins shared. / Bessen D. et al.// J Clin Micr, 1989,-V. 169,-p.269-283

94. Bocklisch H. Zur Streptokokken infektion des schweines/ Bocklisch H., Zeperauer V. // Monatahefte für veterinarmedisin.-1979.-H.22-s.841-846.

95. Canterero L. The adsorptive characteristics of protein for polisterine and their significance in solid phase immunoassays. / Canterero L., Butter J., Osborne J. //Anal. Biochem.-1980.-V.105.-p.375-382.

96. Christensson B. Diagnosing Staphiliciccus aureus endocarditis by detecting antibodies against S. aureus capsular polysaccharide tipes 5 and 8 / Chris-tensson B., Boutonnier A., Ryding Uu. et al.// J. Infect. Dis.-1991.-V.163-N3.-p.530-533.

97. Christie R.: A note on a lytic phenomenon shown by group B streptococci. / Christie R., Athins N.E., Munch-Petersen E// Austral.S.Exp.Med.Sci.1944,-V.22.-p.l97.

98. Clark M. ELISA. Techniques. / Clark M., Lister R. et al. // J. Meth. Enzy-mol. -Orlando.-1986.-V.l 18.-p.742-766.

99. Clerex C. Streptococcus zooepidememicus as the cause of septicemia in racing Greyhouds/ Clerex C. et al. //J Am anim Hosp Assoc, 1999,-V.35, N3,-p.220, 224-228.

100. Cunningham M.W. Types of haemolytic Streptococci in relation to scarlet fever / Cunningham M.W.//Clin Micr Rev,2000,V.13,-p.470-511

101. Engvall E. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Quantitalie assay for immunoglobulin G/ Engvall E., Perlmann P. //Immunochem.,1971 V.8,-p. 871-874.

102. Evans J.A. Studias on hemolytic streptococci. V. The charakteristics of human and animal strains of groupe A and C / EvansJ.A., Verder G.T. // J.Bact.-1938.-36.-p.l33.

103. Facklam R.R. Analysis of the optimal conditions for the adsorption of C-polysaccharide to plastic tor use in solid-phase ELISA/ Facklam R.R. //Inf Med, 1997,V.14, p.891-898.

104. Fischetti V.A. Gram-positive pathogens/ Fischetti V.A.// ASM Press, Washington, D.C.,2000, p.11-24.

105. Fishetti V.A. Streptococcal M protein size mutants occur at high frequency with in a single strain/ Fishetti V.A. //Clin Micr Rev, 1989,V.2, p.285-314.

106. Ford D.J. Characterization of glutaraldehyde coupled alkaline phos-phatasa-antibody and lactoperoxidase-antibody conjugates/ Ford D.J., Radin R., Pesce A.J. // Immunochemistry, 1978, N15, -p.237-243.

107. Garnett N.L. The cell surfase antigens of Streptococcus equi/ Garnett N.L. et al. //JAVMA, 1982,V. 181, N11, -p. 13 71 -13 74.

108. Gase K. The immunology of streptococcal infections./ Gase K.et al. //Eur J Bioch, 1996, V.239, -p.42-51.

109. Gillespie S.H. Detectuin of C- polysaccharide in serum of patiens with streptococcal bacteraemia/ Gillespie S.H., Smith M.D., Dickens A. et al. //J Clin Micr.-1995.-V48.-N9.-p.803-806.

110. Gillespie S.H. Diagnosis of Streptococcus pneumonia by quantitative en-zime-linked immunosorbent assay of C-polisaccharide antigen/ Gillespie S.H., Smith M.D., Dickens A. et al.// J Clin. Pathol.-1994.-V.47.-N8.-p.749-751.

111. Gillespie S.H., detections of streptococcus pneumoniae in sputum samples by PSR./ Gillespie S.H., Ullman C., Smith M.DM J Clin Micr.-1994.-V.32.-N5.-p.l308-1311.

112. Gracham R.C. The early stagen of adsorbtion of injected horseradian peroxidase in the proximal tubules of mouse kidnel: ultrastructural cytochemistry by a new technique./ Gracham R.C., Karnozsky M.J.// -J. Histo-chem. cytochem., 1966, N14, p.291-302.

113. Hogan J. Sensitivity And specifity of latexagglutination test used to identify streptococcus and stafilococcus aureus isolated from bulk tank milk./ Hogan J., Larry K., Todhunter D. // Am. J. vet. Res., 1984.,v.49.-№9.-p.87-90.

114. Horning M. Paper chromotography of pneumococcal cell-wall hy-drolisates containing glucosamine, galactosamine, muramic acid and peptides/ Horning M. // J.bacteriol., 1963,86,6,1345-1346.

115. Jalonen E. Measurement of antibody responses to pneumolisin-A promising method for the resumptive aetioligical diagnosis of pneumococcal pneumonia / Jalonen E., Paton J.C., Koskela M. et al. // J. Inf.1989.-V.19.-N2.-p.l27-134.

116. Jelenkova J.: Group B streptococci in the human population. / Jelenkova J. //Curr. Top. Microbiol.Immunol. N76, p. 127 (1977)

117. Jelenkova J.: Frequency of serotype in group B streptococcus isolates: New type candidate, p.50 in Holm, Christensen: Basic Concepts of Streptococci and Streptococcal Diseases. / Jelenkova J. // Reed Books (Chertsey) 1982.

118. Jensen N.E. Variation of type antigen of group B streptococci.III. Variation of the protein antigen Ibc. / Jensen N.E. // Acta Vet.Scand. 1980, V.21, p.354.

119. Kaijser B. // Scand. Infect. Dis.-1979.-V.3-Nl l-p.179-184.

120. Kalin M. The diagnosis of pneumococcal pneumonia by enzime-linked immunosorbent assay/ Kalin M., Kancleski K., Granstrom m. et dX.ll J Clin Micr.-1987.-V.25-N2.-p.226-229.

121. Köhler W. Die typisierung hamolisiereder Streptokokken der gruppe A IV. Das verkommen von R.-28 antigens bei Streptokokken gruppen B, C, G und sein wachweis mit fluoresee immarkiesten antikörpern/ Köhler W. Wagner M. //Z. Imm., forsch.-1962.

122. Kraus R.M. Simposium on relationship of structure of microorganisms to their immunological properties; antigenis and biochemical composition of haemolitic streptococcol cell walls/ Kraus R.M. // Bacteriological Reviews.• 1963.-V.27.-n.4-p.369-380.

123. Kraus R.M. The streptococcal cell relationship of structure function and pathogenesis/ Kraus R.M. // Streptococci and streptococcal desease.-London.-1972.-P.3-10.

124. Lammler C. Streptococcus group D/ Lammler C. et 2X.II J.Bact,1997, V.25, p.263-264.

125. Lamont M.W. Streptococcal meningitis in pigs: results a five-year suver/ Lamont M.W. etal//Vet. Recerd.-1980,107,20,467-469.

126. Lancefield R.C. The antigenic complex of Streptococcus haemolyticus/ Lancefield R.C. //J Exp Med,1928, V.47, p.9-10.

127. Lancefield RC.Current Kniowlege of type specific M antigents of group A streptococci/ Lancefield R.C. // J imm, 1962, V.89, p.307-313.

128. Lenthe-Eboa S. Comparison of immunological metods for diagnisis of pneumococcal pneumonia in biological fluids/ Lenthe-Eboa S., Brighouse G., Auckenthaler R. et al.//Eur. J. Clin. Microbiol.-1987.-V.6.-Nl.-p.28-34.

129. Li Z. Die typisierung der Streptokokken der grupper B/ Li Z. et al.// J.Bact,1999, V.181, p.6019-6027.

130. Little R.B. Bovine mastitis, A symposium Nnew-York and London./ Little R.B., Plastridge W.N.//-Ne Graw,1946.

131. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin reagent / Lowry O.H., RosenbroughtN.F., Farr A.L. //J. Chemistry.-195l.-V.l93.-p.265-275.

132. Mockett A.P.A. Comparative studies with an enzyme-linked immunosorbent assay / ELISA / for antibodies to avian infections bronchitis virus./ Mockett A.P.A., Barbyschire J.H.// Avian Patol.,1981. p. 1-10.

133. Moody M.D. Staining bacterial smears with fluorescent antibody.IV. Grouping streptococci with fluorescent antibody./ Moody M.D., Ellis E.C., Updyke E.l. // J.Bact., 1958, V.75, p.553-560.

134. Mousard A. Aspect de la pathologie pneumococcique on reanimation pediatrique/ Mousard A., Bompard Y. // Path. Biol.-1979.-V.27.-N9.-p.537-539.

135. Müller G. Der fluoreszenzserologische Nachweis von Streptokokken der Gruppe B/ str. agalactiae/1. Mitteeilung: Fluoreszenzserologische tichnik bei und Darstellbarkeit von B- Streptokokken. / Müller G. //Mh. Vet.2 Med. 1968, V.22, N2, p.64-69.

136. Musher D.M. Does naturally acquired IgG antibody to cell wall polysaccharide protect human subjects' aganst streptococcal infection? // Musher D.M., Watson D.A., Baughn R.E. et al.// J. Infect. Dis., 2000.-V.161.-N. 4.-p.736-740.

137. Nakane P.K. Peroxidase-labeled antibody a new method of conjugation, / Nakane P.K., Kawaoi A.//J.Histochem.cytochem.,1974, V.22, p. 1084-1091.

138. Navarre W.W. Streptococci and streptococcal disoases/ Navarre W.W. et al.///Micr Nol Biol Rev,1999, V.63, N1, p.174-229.

139. Niklasson P. Group streptococci meningitis in children and adults / Nik-lasson P. et al. // Scand. J. Infect. Dis. 1976.-v.8.-n.3. -P.823-828.1976.

140. Nohynek H. Bacterial antibody assays in the diagnosis of acute lower respiratory tract infection in children / Nohynek H., Eskola J., Kieemola M et al.// Pediatr. Infect. Dis.-1995.-V14.-N6.-p.478-484.

141. O'Beirne A.J., Heterogenecus Enzyme Immunoassay./ O'Beirne A.J., Gooper H.R.//-J.Histochem.cytochem, 1979, V.27, p. 1148-1162.

142. O'Sullivan H.J. (1979b) Comparison of two methods of preparing enzyme-antibody conjugates: Application of these conjugates for enzyme immunoassay / O'Sullivan HJ. et al // Anal. Biochem, V.100, -p. 100-108.

143. Olson P.S. The streptococcal in suis/ Olson P.S. //Vet Med Small anim Clin, 1975, V.70, N8, -p.933-934.

144. Oreskes I. The mechanism of particulate carrier reactions. I. Adsorption of human-globulin to polystyrene latex particles / Oreskes I., Singer J.M. // J. Immunol., 1961 V.86, p.338-344.

145. Plastridge W.N. Bovine mastitis A review/ Plastridge W.N. // J. Dairy Sci.-1958.-V.41 .-N9.-p. 1141-1181.

146. R.C. Wardlei A solid-phase enzyme linked immunosorbent assay for the detection of African swine fever virus antigen and antibody / R.C. Wardlei, Abu Elsein E.M.E., Crowther J.R. et al.// J. Hyg. Camb., 1979,-V.83,p.363-369.

147. Ramos-Vara J.A. Identificantion and significance of Str. group C/ Ramos-Vara J.A. et al.// J Vet Diagn Invest, 1994, V.6, N.3, P.371-375.

148. Rathnam P. A "Sandwich" solid-phase enzyme immunoassay for lutro-pin in urine / Rathnam P., Saxena B.B. //Clin. Chem., 1984 V.30, -p.665-671.

149. Riising H.T. Streptococcal infections in sucking pigs/ Riising H.T. et al. //Nord. Vet Med, 1976.-bd.28,-2.-p.65-87.

150. Rosocha J. Monoclonal antibodies against the common polysaccharide of streptococcus agalactiae./ Rosocha J, Mikula I.,Kollarova Z. and Holoda E. //Folia Micr,l996, V.41. N5, -p.436-440.

151. Rubenstein K.E. "Homoheneous" enzyme immunoassay, New Immunochemical, technique,/ Rubenstein K.E., Schneider R.S., Ullman E.F // Bio-chem. Biophys. Res. Commun., 1975. V.47. p.846-851.

152. Ruoff K. In: Manual of Clinical Microbiology, 7th ed. / Ruoff K. et al.// Murray P.R.ea.(eds). Amer Soc Micr, Washindton, 1999, p.283-295.

153. Sadatsune T. Identification of Streptococci in bacterial mixtures and clinical specimens/Sadatsune T. et al.// Arq Inst Biol (Sao Paulo), 1975,V.42, p.257-264.

154. Salasia S.I.O. Distribution of serotype, virulence markers and further characteristics of Streptococcus suis isolates from pigs./ Salasia S.I.O. and C.Lämmler// J.Vet.Med.b 42, p.78-83 (1995)

155. Schaffner A. Detection of capsular polysaccharide in serum for the diag-nisis of pneumococcal pneumonia: clinical and exerimental evalution/ Schaffner A., Michel-Harden C., Yeginsoy S., et al.// J. Infect. Dis.-1991.-V. 163 .-N5 .-p. 1094-1102.

156. Schuurs A. Enzyme — immunoassay./ Schuurs A., Van Weemen B. // Clin. Chem. Acta.- 1997.-v.8.-p.l-40.

157. Seelmann M. Biologic der Streptokokken /Seelmann M. //Care. Nürnberg, 1954.

158. Shermann H. Streptociccus n.sp /Shermann H, Wing B.O. //J.Dairy Sei., 1937, V.20,p.l65.

159. Standefer J.C. Enzyme immunoassay for gentamicin, / Standefer J.C., Saunders G.C.// Clin. Chem.,1978,V.24, p. 1903-1907

160. Standefer J.C. Enzyme immunoassay for human prolactin. / Standefer J.C., Saunders G.C.//Clin. Chem., 1978. V.29, P. 1240.

161. Stevenson R. Streptococcus zooepidemicus infection in sheep/ Stevenson R. // Caned. J. Comp Ved, 1974,V.38, N3, p.243-250.

162. Sundberg J.P. A cell surface antigens of streptococcus equi /Sundberg J.P. et al.// Vet Med Small Anim Clin,1981, V.76, N.6, P.839-842.

163. Timoney J.F. In: Pathogenesis of bacterial infections in animals./ Ti-money J.F., Gyles C.L.et al. (Eds.). // Iowa State Univ Press, 1993, P.3-20

164. Tissjen P. Practic and theory of enzyme immunoassay. / Tissjen P. // London, 1987. -V.15.-p.219-241

165. Torna B. Recherche des anticorps anti-virus de la maladie d'Auessky par la technique ELISA./ Torna B. // Ree. Med. Veter., 1979, V.155, N5, p.455-463.

166. Tomass A. Surface component of streptococcus pneumoniae /Tomass A. // Rev. Infect Dis.-1981V.2.-N2-p. 190-211.

167. Tomasz A., Jamieson J.D., Ottolenghi E. The fine structure of Diplococ-cus pneumoniae / Tomasz A., Jamieson J.D., Ottolenghi E. // J.Cell Biol. 1964, V.22, N.2, p.453-467.

168. Tsai P.J. Typing groupa hemolytic streptococci./Tsai P.J.et al. //Inf Imm,1999, V.67, P.4334-4339

169. Van Weemen B.K. Immunoassay using antigen enzyme conjugates, / Van Weemen B.K., Schuurs A.H.W.M. // FEBS Letters, 1971,15,232-236.

170. Vieira V.V. The charakteristics of human and animal strains of group G Nieira V.V. et al.// J Appl Bact,1994, V.77, N.4, P.408-411.

171. Voller A. Microplate anzyme immunoassays for the immunodiagnosis of virusinfections/ Voller A., Bidwell D., Bartlett A. //-In:-Am.Soc.Microbiol., 1976, p.5 06-512.

172. Voller A. Enzyme immunoassays with reference to ELISA techniques./ Voller A., Bidwell D., Bartlett A. //- J. of Clin. Pathol., 1978, V.31, N.6, p.507-520.

173. Voller A. The enzyme linked immunosorbent assay. / Voller A., Bidwell D., Bartlett A. //- In: A quide with abstracts of microplate application, London, 1979, V.l, p.128.

174. Voller A. The enzyme linked immunosorbent assay /ELISA/. / Voller A., Bidwell D. //- In: A review of recent developments with abstracts of microplate applications, London, 1980, V.2, p. 126.

175. Vort Roberts F. Quantitative differences among various proteins as bloking agents for ELISA microtites plates./ Vort Roberts F., Phillips J., DonaldL. // J. Immunol.Meth.- 1987.-V. 101., n.l, p.43-45.

176. Watanabe H., Molkensie J.S. The detection of influenza A viruses antigens in cultured cells by enzyme-linked immunosorbent assay./ Watanabe H., Molkensie J.S.//-Areh.Virol.,1981,V.67, N.l, p.31-43.

177. Whatmore A.M. A studi to determine the clinical and immunizing agente of streptococcus group G/ Whatmore A.M. et al. //J Clin Micr, 2001, V.39, N.ll, P.4169-4196.

178. Whitehead T.R. Grouping of hemolytic streptococci belonging to groups/Whitehead T.R. et al.//FEMS-Micr-Lett.,2000, V. 182, N.2, p.237-240

179. Yamamoto A. The structura and biochemical characteristics of streptococci bakteria/Yamamoto A. et al. //Br. J .Cancer, 1985, V.51, P.739-742.

180. Yolken R.H. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of human reoviruslike agent of infantile gastroenteritis / R.H.Yolken, H.W.Kim, T.Clem et al.-Lancet, 1971, V.8032, N2, -p.263-266.

181. Yolken R.H. Comparison of seven enzyme immunoassay systems for measurement of citomegalovirus. / Yolken R.H., Stopa P.J. // J.Clin.Microbiol. 1980, 11,6, p.546-551.

182. Bruskova M. Detection of serum antibodies to respiratory syncytial virus by ELISA./ Bruskova M., Svandova E., Syrucek L.// Acta Virol., 1981, V.25, N1, -p.41-47.1. УТВЕРЖДАЮ

183. Заместитель Руководителя Россельхознадзора Е.А. НЕПОКЛОНОВ2005г

184. Набор компонентов для диагностики стрептококковых инфекций методом иммуноферментногоанализа.

185. Гидроперит (перекись водорода) 1 таблетка 0,5г.

186. В состав набора также входит один 96-луночный полистироловый планшет для постановки реакции ИФА.

187. На флаконы с компонентами наклеивают этикетки с указанием: названия компонента, объема во флаконе, номера серии, номера контроля, даты изготовления (мес., год) и рабочего разведения препарата.

188. Этикитированные ампулы и флаконы укладывают в коробки по ГОСТ-12301.

189. В коробку вкладывают «Наставление по применению» препарата и ампульный нож.

190. Набор предназначен для выявления специфических антител в сыворотке крови при диагностике инфекционных заболеваний животных, вызываемых возбудителем стрептококкус зооэпидемикус методом иммуноферментного анализа, мониторинга иммунного фона.

191. Один комплект рассчитан на 45 определений исследуемых проб методом иммуноферментного « анализа, включая контроли.

192. Выявляет специфические антитела в сыворотке крови животных при инфекционных заболеваниях, вызываемых возбудителем стрептококкус зооэпидемикус и определение иммунного фона

193. I. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА

194. Препарат применяется для выявления специфических антител методом иммуноферментного анализа, который проводят в полимерных планшетах для иммунологических реакций однократного применения.8. Подготовка к анализу.

195. Приготовление сенсибилизирующего буферного раствора, рН 9,6.

196. Приготовление забуференного физиологического раствора с рН (7,2.7,4).

197. Для получения 100 см3 промывочного раствора к 99,9 см3 ЗФР добавляют 0,1 см3 твин-80. Хранить при 4° С не более двух недель.

198. Приготовление фосфатно-цитратного буфера (субстратная смесь), рН 4,9± 0,1.

199. Раствор останавливающий (20% раствор Н2504) готовят растворением 20 см3 концентрированной Н2504 (уд, вес) в 80 см3 бидистиллированной воды, раствор хранят при температуре 18-20°С до 30 дней.

200. Взятие крови и получение исследуемой сыворотки.

201. Подготовка компонентов набора для постановки реакции.

202. Препарат специфического стрептококкового антигена растворяют сенсибилизирующим буфером в объеме, который указан на этикетке ампулы (флакона) и доводят до рабочего разведения.

203. Исследуемые сыворотки разводят забуференным раствором 1:100, при титровании парных сывороток готовят разведения 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600.

204. Содержимое флакона с видоспецифическим конъюгатом разводят ЗФР в объеме, который указан на этикетке флакона (ампулы) и доводят до рабочего разведения.

205. Растворенные компоненты набора пригодны для работы в течение 2 нед. при температуре хранения 2-8°С. Препараты в рабочем разведении хранению не подлежат.1. Методика постановки ИФА

206. Во все лунки ряда планшета полимерного, исключая лунку 1А, используемую для вывода прибора на ноль, вносят по 0,1см3 антигена в рабочем разведении.

207. Планшет закрывают крышкой, инкубируют в течение 14 -16 ч при 37° С.

208. Панели с адсорбированным специфическим стрептококковым антигеном после промывки и подсушивания пригодны для постановки реакции ИФА в течение 3 мес. при условии хранения плотно закрытыми крышками при температуре 2-8°С.

209. Планшеты закрывают крышкой и инкубируют в течение часа при 37°С. Панели промывают, как указано в п. 11.2.

210. Внесение индикаторного раствора.

211. Во все лунки панели вносят по 0,1 см3 приготовленную субстратную смесь и выдерживают в течение 15-20 мин в темном месте при комнатной температуре.1. Учет результатов

212. Через 15-20 мин реакцию останавливают добавлением в лунки по 0,05 см3 серной кислоты.

213. Результаты реакции учитывают визуально или на спектрофотометре (при 492 нм) и оценивают по интенсивности окрашивания продуктов реакции по следующим схемам:

214. Визуальная оценка реакции:i i i i» бледно-желтое окрашивание;светло-желтое окрашивание (как в лунках В-1 и С-1); «++»- слабо-оранжевое окрашивание; «+» - оранжевое окрашивание (как в лунках G-1 и Н-1); «-» - интенсивно-оранжевое окрашивание.

215. Учет реакции на спектрофотометре:0,250 0,350 оп. ед. (++++) - положительная реакция 0,161 - 0,240 оп. ед. (+++) - положительная реакция 0,360 - 0,450 оп. ед. (++) - отрицательная реакция; 0,451 оп.ед и выше (+), (-) - отрицательная реакция;

216. Исследуемая сыворотка в разведении 1:200 считается положительной, если ее ОГЦи в 2 раза ниже ОП492 среднего значения нормальной (отрицательной) сыворотки в том же разведении, но при этом ОП492 не должна быть ниже 0,200 оп. ед.

217. Отрицательными сыворотками считаются те, ОП492 которых выше 0,360 оп. ед.

218. Диагностическим титром парной сыворотки считают то наивысшее разведение, при котором ее ОП492 в два раза и более раз превосходит ОП492 среднего значения нормальной (отрицательной) сыворотки в том же разведении.

219. За титр сыворотки принимаются ее последние разведения, при наличии в лунке продукта реакции с окраской слабо-желтого цвета с оценкой не ниже, чем на три креста или при оптической плотности продукта реакции >0,161.1. Интерпретация результатов

220. По результатам ИФА определяют напряженность иммунитета в группе привитых животных путем деления количества проб с титром 1:400 и выше к общему количеству исследованных сывороток и выражают в процентах.

221. Животных считают иммунными к стрептококкозу при напряженности иммунитета 80 и более процентов (т.е. если в 80 и более процентах проб сывороток крови титр антител достигает значения 1:400 и выше).

222. Утилизацию остатков испытуемых сывороток, полистироловые планшеты после учета результатов обеззараживают путем погружения в 3% раствор хлорамина на 5 часов или автоклавирования при 0,5 атм. в течение 30 минут.

223. Утилизацию остатков испытуемых сывороток, полистироловые планшеты после учета результатов обеззараживают путем погружения в 3% раствор хлорамина на 5 часов или автоклавирования при 0,5 атм. в течение 30 минут.1.. МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ

224. Запрещается пипетировать ртом, готовить все компоненты в резиновых перчатках.

225. В случае попадания компонентов набора на кожные покровы смыть водой и обработать дезинфицирующим раствором.

226. Проректор по НИР ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина1. А.А. Сидорчук

227. Зам. генерального директора ООО «Агровет»2005 г.1. СТАНДАРТ ОРГАНИЗАЦИИ

228. Набор компонентов для диагностики стрептококковых инфекций методом иммуноферментного анализа1. Технические условия

229. СТО 938830-027-46392258-051. Москва 2005