Разработка ПЦР тест-системы для идентификации энтерогеморрагических E.COLI и дифференциации E.COLI О157:H7 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат биологических наук Брюсова, Мария Борисовна

• Брюсова, Мария Борисовна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Брюсова, Мария Борисовна

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка ПЦР тест-системы для идентификации энтерогеморрагических E.COLI и дифференциации E.COLI О157:H7»

Цель и задачи исследования.7

Научная новизна.7

Практическая значимость работы.8

Апробация работы.8

Объем и структура диссертации.9

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.10

1. Характеристика возбудителя.10

1.1. Систематика и классификация.10

1.2. Морфологические, культуральные и ферментативные свойства эшерихий.12

1.3. Антигенные свойства эшерихий.13

2. факторы патогенностиэнтерогеморрагических эшерихий и их роль' в" w»<c патогенезе.14

2.1. Колонизация кишечника ЭГКП.15

2.2. шигаподобные вероцитотоксины.<&16

2.2.1. Номенклатура шигатоксинов.!.1 б

2.2.2. Биологические свойства шигатоксинов.19

2.2.3. Строение шигатоксинов и их патогенетическое действие.20

3. Эпидемиология и эпизоотология возбудителя.21„

4. Экология энтерогеморрагических эшерихий.К:.*.27"

5. Методы выделения и идентификации энтерогеморрагических эшерихий.29

6. Принцип полимеразной цепной реакции.34

7. Заключение.39

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.41

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.41

1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе.41

2. Культивирование бактерий и определение концентрации.42

3. Клинический материал и его подготовка.43

4. Методика выделения геномной ДНК из исследуемого материала методом протеиназной обработки и осаждения этанолом с предварительной фенольной экстракцией.44

5. Методика выделения геномной ДНК из исследуемого материала методом аффинной сорбции Д НК на силикагеле.44

6. Методика проведения реакции амплификации.46

6.1 Состав реакционной смеси, условия амплификации.46

6.2 «Горячий старт».47

7. Методика проведения электрофореза в агарозном геле.47

8. Клонирование фрагментов ПЦР в фаг XgtIO.48

8.1 Очистка фрагментов ПЦР.48

8.2 Рестрикция фрагмента ПЦР.48

8.3 Гель-электрофорез, элюция фрагмента из геля.49

8.4 Реакция легирования.49

8.5 Упаковка фаговых частиц.49

8.6 Приготовление клеток Е. сои.50

8.7 Высев упакованных частиц фага.50

8.8 Отбор клонов и элюция фаговых частиц.50

8.9 Наращиваниерекомбпнантных фаговых частиц.50

9. Секвенирование.51

9.1 Подготовка матрицы ДНК- очистка продуктов ПЦР-.51

9.2 Измерение концентрации ДНК на флюориметре.52

9.3 Секвенирующаяамплификация.53

9.4 Очистка отневстроившихсяддНТФ.55

9.5 Детекция продуктов секвенпрования.55

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.57

1. Выбор олигонуклеотидных праймеров и изучение их специфичности.57

2. Подбор условий ПЦР.59

2.1. Выбор оптимальной концентрации ионов Mg2+.59

2.2. Оптимизация температуры отжига праймеров.60

2.3. Подбор концентрации праймеров.*.61

2.4. Применение «горячего старта».64

3. Подбор методов выделения (очистки) ДНК.65

4. Внутренний контрольный образец (ВКО).66

5. Отрицательные и положительные контрольные образцы.66

6. Состав разработанной тест-системы.67

7. Определение аналитической специфичности и чувствительности тест-системы .69

8. Исследование фекалий от животных с помощью тест-системы «КОЛИ-ДИФ» . 72

9. Комиссионные испытания ПЦР-тест-системы «КОЛИ-ДИФ».73

10. Изучение активности и стабильности ПЦР-тест-системы в зависимости от срока хранения.75

11. Использование тест-системы «КОЛИ-ДИФ» для государственного контроля пищевой продукции и кормов.75

ОБСУЖДЕНИЕ.!.77

ВЫВОДЫ.:.83

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.84

ЛИТЕРАТУРА.85

ПРИЛОЖЕНИЯ.104

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Taq Thermits aquaticus

АЕ Attaching and effacing (прикрепление и стирание) вко Внутренний контрольный образец гк Геморрагический колит

ГУС Гемолитический уремический синдром

ДГ Диареегенные кишечные палочки

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота крс Крупный рогатый скот м Моль/л

Мк/мл Микробных клеток/мл мМ Милимоль/л мрс Мелкий рогатый скот

МЭБ Международное эпизоотическое бюро

ОКО Отрицательный контрольный образец п.н. Пар нулеотидов

ДНТФ Дезоксинуклеотидтрифосфаты

ПДРФ Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов пко Положительный контрольный образец пмоль Пикомоль

ПЦР Полимеразная цепная реакция

ТБЕ-буфер Трис-борат-ЭДТА буфер

ТЕ-буфер Трис-ЭДТА буфер

Трис-НС1 Трис-(оксиметил)-аминометан гидрохлорид

УПКП Уропатогенные кишечные палочки

ЭАКП Энтероагрегативные кишечные палочки

ЭГКП (ЭГЭК) Энтерогеморрагические кишечные палочки энтерогеморрагические эшерихии коли)

ЭДТА Этилендиамин-тетрацетат натрия

ЭИКП Энтероинвазивные кишечные палочки

ЭПКГ1 Энтеропатогенные кишечные палочки эткп Энтеротоксигенные кишечные палочки

ЭФ Электрофорез

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Впервые энтерогеморрагические кишечные палочки (ЭГКП) идентифицированы в 1982 г., когда штаммы Е. coli ранее неизвестного серотипа 0157:Н7, оказались причиной двух крупных вспышек гемморагического колита у детей в США (89, 97, 98, 118, 123).

Основным резервуаром энтерогеморрагических эшерихий (ЭГЭК) является крупный и мелкий рогатый скот (76, 81, 105, 128). Однако такие домашние животные, как свиньи, лошади, олени, птицы, собаки и кошки так же могут быть носителями ЭГКП (51, 108, 129). Выделяя бактерии с фекалиями во внешнюю среду, животные служат основным источником контаминации различных объектов ЭГКП. При проведениии мониторинга ЭГКП среди сельскохозяйственных животных в Европе, обнаружено, что в Германии около 20,8% животных и 2,6% исследованных проб мяса крупного рогатого скота (крс) были заражены Е. coli 0157:Н7. При исследовании образцов мяса в Финляндии, данный показатель составил 1,4%, а в Бельгии -1,26% (89). При проведении мониторинга1 ЭГКП серовара 0157:Н7 в хозяйствах Рязанской, Воронежской, Тульской и Орловской областей обнаружено, что носительство среди крс составляет 2,6%, среди свиней 0,9% и птиц - 0,8% (29, 30).

Вспышки инфекции у человека возникают при употреблении пищевых продуктов животного происхождения, контаминированных эшерихиями в процессе убоя, переработки, упаковки, хранения и приготовления пищи, а также фруктов и овощей, обсеменение которых происходит в результате контакта с фекалиями домашних и диких животных на какой-либо стадии их выращивания или обработки. По данным Центра Всемирной Организации Здравоохранения Животных (МЭБ), каждый год на территории США в среднем регистрируется до 72 000 случаев заболеваний людей, вызванных ЭГКП, из них около 60 летальных. В Великобритании в период 1995-2000 гг. зарегистрировано 18 вспышек геморрагического колита (ГК) у людей, заболеваемость за это время возросла с 6 до 411 случаев на 100 тыс. населения, а число смертельных исходов составило 2,5% (112, 129).

Наиболее распространенным и значимым для здравоохранения серологическим вариантом ЭГКП является серовар 0157:Н7, тем не менее, при спорадических случаях и эпизоотиях часто выявляются и другие серогруппы эшерихий: 026, 091, 0103, 0104, Olll, 0113, 0117, 0118, 0121, 0128, 0145 (50, 97, 101, 105, 128), идентификация которых имеет немаловажное значение.

Сложность определения энтерогеморрагических эшерихий обусловлена тем, что среди множества непатогенных близкородственных представителей необходимо выявлять единичные серогруппы, которые приобретают измененные свойства в результате генетических мутаций, и не имеют фенотипических свойств, прочно коррелирующих с патогенностью (23, 89, 100,131,156). f

Разработка новых высокочувствительных и специфичных экспресс методов для идентификации энтер о геморрагических Е. coli является актуальной задачей. В последние годы широкое распространение во многих странах получил метод выявления факторов патогенности ЭГКП с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Большинство молекулярно-генетических методик, разработанных для идентификации ЭГКП, направлены на прямое выявление генов, кодирующих веротоксины (61, 74, 92, 103, 130, 154, 157). Метод ПЦР отличается высокой чувствительностью, специфичностью и универсальностью и позволяет выявлять ЭГКП не только в биологическом материале, но и в объектах внешней среды.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлась разработка тест-системы для идентификации энтерогеморрагических Е. coli и дифференциации Е. coli 0157:Н7 методом ПЦР.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать олигонуклеотидные праймеры для идентификации энтерогеморрагических Е. coli и дифференциации серологического варианта 0157:Н7, разработать оптимальные параметры ПЦР и оценить эффективность различных способов выделения ДНК из патологического материала;

2. Провести оценку аналитических и диагностических характеристик разработанной тест-системы;

3. Сравнить чувствительность и специфичность разработанной тест-системы с традиционным методом;

4. Провести комиссионные испытания ПЦР-тест-системы для идентификации E.coli 0157:Н7 и дифференциации веротоксинов энтерогеморрагических E.coli методом ПЦР.

Научная новизна

Впервые сконструированы оригинальные праймеры для амплификации ДНК энтерогеморрагических Е. coli и дифференциации E.coli 0157:Н7 в формате электрофоретической детекции.

Разработан положительный контрольный образец (ПКО) ДНК VT1, VT2, Н7, являющийся генно-инженерной конструкцией, несущей вставки Л фрагментов генов stxl, stx2 и fliCm Е. coli 0157:Н7. ПКО позволяет контролировать работу амплификационной смеси и является маркером длины ПЦР-продуктов.

Впервые в России разработана ПЦР тест-система для идентификации Е. coli 0157-.Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli, обладающая

100% специфичностью с пределом аналитической чувствительности 100 мк/мл.

Практическая значимость работы

Впервые в России разработана и внедрена в ветеринарную практику тест-система «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli методом ПЦР. Использование метода ПЦР в диагностических лабораториях позволит в течение одного рабочего дня проводить анализ биологического материала, продукции животного происхождения, объектов внешней среды на наличие ЭГКП, а также дифференцировать серологический вариант 0157:Н7, тогда как идентификация ЭГКП бактериологическим методом занимает от 6 до 7 суток и требует применения дополнительного исследования для определения веротоксинов.

С 2006 года на базе ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора аттестовано производство и налажен серийный выпуск тест-системы «КОЛИ-ДИФ» (Аттестат № 1167 от 01.02.06). Рекламаций на тест-систему в течение трех лет не поступало.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях Ученого совета ФГУ «ВГНКИ» (2004-2007 гг.), а также на научных и практических конференциях:

- Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов», посвященной 75-летию ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2006 г.);

- 6-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2007» (Москва, 2007 г.);

- Научно-проблемных методических комиссиях ФГУ «ВГНКИ»

2004-2007 гг.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 104 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 2003»), и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов исследований, выводы, практические предложения. Диссертация иллюстрирована 11 рисунками и 12 таблицами. Приложение к диссертации содержит разработанную нормативную документацию, подтверждающую результаты исследований, их научно-практическую ценность. Список литературы включает 162 источника, в том числе 127 иностранных.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Брюсова, Мария Борисовна

выводы

1. На основании компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей генов кодирующих шигаподобные токсины энтерогеморрагических E.coli (stxl и stx2) сконструированы оригинальные праймеры и оптимизированы параметры ПЦР для идентификации энтерогеморрагических Е. coli.

2. Разработан способ дифференциации Е. coli серологического варианта 0157:Н7 и положительный контрольный образец ДНК VT1, VT2, Н7, являющийся индикатором работы амплификационной смеси и ^ маркером длины ПЦР-продуктов.

3. При сравнении аналитических характеристик разработанной тест-системы с микробиологическим методом, установлено, что тест-система «КОЛИ-ДИФ» обладает 100% специфичностью и имеет предел аналитической чувствительности 10 мк/мл.

4. Тест-система «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli методом ПЦР позволяет в течение 4 часов выявлять ЭГКП и дифференцировать серовар 0157:Н7.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются следующие нормативные документы, разработанные в ходе выполнения научных исследований по теме диссертации:

1. Инструкция по применению тест-системы «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli методом ПЦР (РУ № Р077-1-4.6-1332, утв. Россельхознадзором 29.12.2006);

2. Технические условия на тест-систему «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli методом ПЦР (ТУ № 9388-15400494189-06, согл. Россельхознадзором 29.12.2006);

3. Регистрационное удостоверение на тест-ситсему «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli методом ПЦР (№ ПВР-1-4.6/01807 от 29.12.06);

4. Сертификат соответствия требованиям нормативных документов тест-системы «КОЛИ-ДИФ» для идентификации Е. coli 0157:Н7 и дифференциации энтерогеморрагических Е. coli методом ПЦР (№ РОСС 1Ш.ФВ01. В16591).

7. Заключение

В последние годы все большее внимание уделяется случаям пищевых инфекций среди людей, вызываемых ЭГКП, в частности Е. coli серологичекого варианта 0157:Н7. Основным резервуаром ЭГКП является крупный и мелкий рогатый скот, другие домашние животные также могут быть носителями данного патогена. Инфекция возникает при потреблении пищевых продуктов, полученных от больных животных, а также от вторично контаминированной продукции животного и растительного происхождения. Создание тест-систем для скрининга контаминированных энтерогеморрагическими эшерихиями продуктов питания, объектов окружающей среды и выявление животных - бактерионосителей, является актуальным. Анализ литературных данных о применении метода ПЦР для выявления ЭГКП в клинических образцах, продуктах питания и окружающей среде показывает, что данный метод обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционным бактериологическим и серологическим методами, так как сочетает в себе быстроту и простоту исполнения, а также потенциально высокую специфичность и чувствительность при выявлении патогенных микроорганизмов.

Тест-система на основе метода ПЦР должна обладать высокоэффективным методом выделения ДНК, системой амплификации обеспечивающей с максимальной чувствительностью, с последующей детекцией ПЦР-продукта, и набором контрольных образцов, позволяющим осуществлять контроль качества проведения каждого теста. Вышеперечисленные соображения послужили основой проведения собственных исследований.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе

Для оценки аналитической чувствительности и специфичности разработанной тест-системы использовали штаммы из коллекции ФГУ «ВГНКИ», любезно предоставленные лабораторией качества и стандартизации лекарственных средств против бактерийных болезней животных, - 40 штаммов Е. coli, из них 12 серологического варианта 0157:Н7 и 0157:ЕГ (табл. 4), а так же культуры других патогенных энтеробактерий: Salmonella enteritidis, Enterobacter faecalis, Streptococcus faecalis, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Morganella morganii, Yersinya enterocolitica, Campylobacter jejuni subsp. jejuni.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Брюсова, Мария Борисовна, 2009 год

1. Бакулина Н. А., Краев Э. Л. Микробиология. М.: Медицина, 1980. -с.68-106

2. Голубева И. В., Улиско И. Н. Классификационное положение E.coli В кн.: Научные достижения в изучении коли-инфекции. Под редак. И.В. Голубевой. М.: ВНИИМИ, 1973. - С. 3-15.

3. ГОСТ 29184-91 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae».

4. ГОСТ 30726-2001 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli.»

5. Гусев М. В., Минеева Л. А. Микробиология. //М.1977.

6. Емельяненко П. А., Дунаев Г. В., Кудлай Д. Г. и др. Ветеринарная микробиология. // "Колос" 1982.

7. Золотухин С. Н. // Малоизученные энтеробактерии и их роль в патологии животных. -Ульяновск, 2004.

8. Ю.Зоценко JI.В. Распространение шиготоксинпродуцирующих эшерихий среди крс и свиней, а также изучение их биологических свойств. // Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. вет. наук. Киев, 2003 - 20 с.

9. П.Калинина Г.П. Санитарная микробиология. М.: Медицина, 1969. 450 с.

10. Коротяев А.И., Бабичев С.А. // Медицинская миробиология, иммунология и вирусология: Учебник для мед. вузов. СПб.: СпецЛит, 2002.-591 с.

11. Красильников А.П., Романовская Т.Р. Микробиологический словарь-справочник. 2-е изд., доп. и перераб. //Мн.: "Асар", 1999.

12. Куликовский А.В. Эмерджментные пищевые зоонозы. М.: Крафт +, 2004.-174с.

13. Куликовский А.В. Эмерджментные пищевые зоонозы. Тезисы докладов Четвертой международной научно-технической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельско-хозяйственной прдукции». М.:2002. -С.12-13.

14. Макарова М.А.// Биологические свойства Escherichia coli серологических групп Ol, 0144 И 0157, регистрируемых как возбудители острых кишечных инфекций. // Автореф. дисс. на соиск. уч. степ, канд.меднаук. Санкт-Петербург - 2007. - 20 с.

15. Малов В.А., Пак С.Г.// Эпидемиология и инфекционные болезни. // 1996; 2: 50-53.

16. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: пер. с англ. / Под ред. С.Херрингтона, Дж. Макги. -М.: Мир, 1999. 558 с.

17. МУК 4.2.992-00 Методы выявления и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки Е. coli 0157:Н7.

18. МУК 13-7-2/2117 по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных.

19. Мюнх Д. Микробиология продуктов животного происхождения. М.: Агропромиздат, 1985. 590 с.

20. Нестерова И.С.; Коптев В.Ю.; Шкиль Н.А. // Распространение Esherichia coli 0157:Н7 среди мелких домашних животных. // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные 2005 - N 3 - С. 33-34.

21. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж. Хоулта. М.: Мир, 1997. -Т. 1.- С. 180-196.

22. Рапопорт С.М. Медицинская микробиология. М.: Медицина, 1976.-230с

23. Ратинер Ю.А., Бондаренко В.М., Sitonen А. Энтерогеморрагические кишечные палочки и вызываемые ими заболевания // Журн. Микробиол, эпидемиол. и иммунологии, 1998. №5. - С. 87-96.

24. Сидоров М.А., Корнелаева Р.П. Микробиология мяса и мясопродуктов. М.: «Колос», 1996. 256 с.

25. Степаншин Ю.Г.; Светоч Э.А.; Ерусланов Б.В.; Баннов В.А.; Борзенков В.Н. Возбудитель геморрагического колита Escherichia coli 0157: Н7 в России: мониторинг, экспресс-диагностика / Ульян, гос. с.-х. акад. -Ульяновск, 2006. С. 142-145.

26. Степаншин Ю.Г.; Светоч Э.А.; Ерусланов Б.В.; Баннов В.А.; Борзенков В.Н.; Каврук Л. С. Бактерионосительство энтерогеморрагических эшерихий серовара 0157:Н7 у животных. // Ветеринария, 2005; N 7. С. 17-22.

27. Херрингтон С. и Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. //М. "Мир" 1999.

28. Шуляк Б. Ф. // Руководство по бактериальным инфекциям собак. Том 2. Грамотрицательные бактерии. — Москва, 2003. — 608 с.

29. Зб.Энтеробактерии. Под ред. Покровского В.И. Руководство. М.: Медицина, 1985.-320 с.

30. A1-Ajmi D., Padmanabha J., Denman S.E., Gilbert R.A., A1 Jassim R.A.M., McSweeney C.S. Evaluation of a PCR detection method for Escherichia coli 0157:H7/H- bovine faecal samples. // Letters in Applied Microbiology -2006-V.42-P. 386-391.

31. Aleksic S., Karch H., Bockemuhl J. A biotyping scheme for Shiga-like (Vero) toxin-producing Escherichia coli 0157 and a list of serological cross-reactions between 0157 and other gram-negative bacteria. // Zbl. Bakt. — 1992-V.276-P. 221-230.

32. Altschul S.F., Boguski M.S., Gish W., Wootton J.C. Issues in searching molecular sequence databases. //Nature Genet. 1994. - V. 6. — P. 119-129.

33. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool. // J. Mol. Biol. 1990. - V. 215. - P. 403-410.

34. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman DJ. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 33893402.

35. Appleman S., Ascher D., Park C. Clinical Spectrum of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli (STEC) in Adults and Children. // Clin Pediatr (Phila) 2008 V. 22.

36. Barak J.D., Sananikone K., Delwiche M.J. Comparison of primers for the detection of pathogenic Escherichia coli using real-time PCR // Letters in Applied Microbiology 2005 - V. 41 - P. 112-118 .

37. Bastin D. A., Reeves P. R. Sequence and analysis of the О antigen gene (rfb) cluster of Escherichia coli Olll.// Gene 1995 - V. 164 - P. 17-23.

38. Benson D.A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D.J., Ostell J., Wheeler D.L. GenBank: update. // Nucleic Acids Res. 2004. - V. 32(Database issue). - P. D23-D26.

39. Beutin L., Aleksic S., Geier D., Zimmermann S. Virulence factors and phenotypical traits of verotoxigenic strains of E. coli isolated from human patients in Germany. Med. Microbiol. Immunol. 1994 -V. 183 - P. 13-21.

40. Bettelheim K.A., Evangelidis H., Pearce J.L., Sowers E., Strockbine N.A. Isolation of a Citrobacter freundii strain which carries the Escherichia coli 0157 antigen. // Journal of clinical Microbiology 1993 - V. 31 - P. 760761.

41. Bettelheim K.A. Serotypes of VTEC: The VTEC Table. 2003. http://www.microbionet.com.au/vtectable.htm.

42. Beutin L., Geier D., Zimmermann S., Karch H. Virulence markers of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli strains originating from healthy domestic animals of different species. // J. Clin. Microbiol. — 1995 V. 33 -P. 631-635.

43. Boerlin P., McEwen S.A., Boerlin-Petzold F., Wilson J.B.,Johnson R.P.,Gyles C.L. Association between virulence factors of Shiga toxin-producing E. coli and disease in humans. // Journal of clinical microbiology -1999-V. 37-P. 497-503.

44. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Jansen C.L., Wertheim-van Dillen P.M.E., Van Der Noordaa J. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids. // Journal of Clinical Microbiology. 1990. - V. 28(3). - P. 495-503.

45. Borczyk A.A., Lior H., Ciebin B. False positive identifications of Escherichia coli 0157 in foods. // Int. J. Food. Microbiol. 1987 - V.4 - P.347. 349.

46. Brownie J., Shawcross S., Theaker J., Whitcombe D., Ferrie R., Newton C., Little C. The elimination of primer dimer-accumulation in PCR. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 3235-3241.

47. Buchanan R.L., Edelson S.G., Snipes K. Boyd G. Inactivation of Escherichia coli 0157:H7 in apple juice by irradiation. // Appl Environ Microbiol 1998 -V. 64-P. 4533^4535.

48. Caprioli A., Morabito S., Brugere H., Oswald E. Enterohaemorrhagic Escherichia coli: emerging issues on virulence and modes of transmission. // Vet. Res. 2005 - V. 36 - P. 289-311.i

49. Centers for Disease Control. 1993. Update. Multistate outbreak of Escherichia coli 0157:H7 infections from hamburgers western United States - 1992-1993. // Morbid. Mortal. Weekly Rep. V. 42 - P. 258-263.

50. Chart H., Okubadejo O.A., Rowe B. The serological relationship between Escherichia coli 0157 and Yersinia enterocolitica 09 using sera from patients with brucellosis. //Epidemiol. Infect. 1992 - V.108 -P. 77- 85.

51. Chapman P.A., Siddons C.A., Cerdan Malo A.T. et al. A one year old study of E. coli 0157:H7 in raw beef and lamb products. // Epid. And Infect. -2000-V. 124-P. 207-213.

52. Chen H., Zhu G. Computer program for calculating the melting temptrature of degenerate oligonucleotides used in PCR or hybridization. // Biotechniques.- 1997.-.V. 22(6).-P. 1158-1160.

53. Chenna R., Sugavwara H, Koike Т., Lopez R., Gibson T.J., Tompson J.D., Multople sequence alignment with the Clustal series of programs. // Nucleic Acids Res. 2003 - V. 31 - P. 3497-3500.

54. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extractoin. // Anal. Biochem. -1987.-V. 162.-P. 156-159.

55. Coyne V.E., James M.D., Reid S.J., Rybicki E.P. (ed.). Molecular Biology Techniques Manual. Departament of Molecular and Cell Biology, University of Cape Town. - 2001.

56. Dang C., Jayasena S.D. Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. // J.Mol.Biol. -1996. V. 264(2). - P. 268-278.

57. DAquila R.T., Bechtel L.J., Videler J.A., Eron J.J., Gorczyca P, Kaplan J.C. Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating. //Nucleic Acids Res. 1991.-V. 11;19(13). -P. 3749.

58. Deng M.Y., Fratamico P.M. A multiplex PCR for rapid identification of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli 0157:H7 isolated from foods. // J. Food. Prot. 1996 -V. 59 - P. 570-576.

59. Dielfenbach C.W., Lowe T.M.F., Dveksler G.S. General concepts for PCR primer desin. // PCR Methods Appl. 1993. - V. 3. - P. S30-S37.

60. Dodd С. C., Sanderson M. W., Sargeant J. M., Nagaraja T. G.,Oberst R. D., Smith R. A., Griffin D. D. Prevalence of Escherichia coli 0157 in Cattle Feeds in Midwestern Feedlots.// The Veterinary Journal 2007.

61. Dytoc M.T., Ismaili A., Philpott D.J., Soni R., Brunton J.L., Sherman P.M. Distinct binding properties of eaeA-negative verocytotoxin-producing E. coli of serotype 0113:H21. // Infect. Immun. 1994 - V. 62 - P. 3494-3505.

62. Erlich H.A. (ed.) PCR technology. Stockton Press, New York. - 1989 - P. 254.

63. Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky J.J. Recent advances in the polymerase chain reaction.//Science. 1991.-V. 252(5013).-P. 1643-1651.

64. Fegan N., Vanderlinde P., Higgs G., Desmarchelier P. The prevalence and concentration of E. coli 0157 in faeces of cattle from different production systems at slaughter. // J. Appl. Microbiol. 2004 - V. 97 - P. 362-370.

65. Fortin N.Y., Mulchandani A. Chen W. Use of real-time polymerase chain reaction and molecular beacons for the detection of Escherichia coli 0157:H7. // Anal Biochem 2001 - V. 289 - P. 281-288.

66. Friedrich A.W., Bielaszewska M., Zhang W.L., Pulz M. Kuczius Т., Ammon A., Karch H. E. coli harboring Shiga toxin 2 gene variants: Frequency and association with clinical symptoms. // J. Infect. Dis. 2002 - V. 185 - P. 7484.

67. Gannon V. P. J., Teerling C., Masri S. A., Gyles C. L. Molecular cloning and nucleotide sequence of another variant of the Escherichia coli Shiga-like toxin II family. // J. Gen. Microbiol. 1990 - V. 136 - P. 1125-1135.

68. Gelfand D.H., White TJ. Thermostable DNA polymeases. In: PCR protocols (ed. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J J., White T.J.) New York: Academic Press. - 1990. - P. 129-141.

69. Gorelenkov V., Antipov A., Leinine S., Daraselia N., Yuryev A. Set of novel tools for PCR primer design. // Biotechniques. 2001. - V. 31(6). - P. 13261330.

70. Gunzer F., Bohm H., Russmann H., Bitzan M., Aleksic S., Karch H. Molecular detection of sorbitol-fermenting Escherichia coli 0157 in patients with hemolytic-uremic syndrome. // J. Clin. Microbiol. 1992 - V.30 - P. 1807- 1810.

71. Gyles C. L. Shiga toxin-producing Escherichia coli: An overview. I I J. Anim. Sci. 2007 - V. 85(E. Suppl.) - P. E45-E62.

72. Hara-Kudo Y., Konuma H., Iwaki M., Kasuga F., Sugita-Konishi Y., Ito Y., Kumagai S. Potential hazard of radish sprouts as a vehicle of Escherichia coli 0157:H7. // J. Food Prot. 1997 - V. 60 - P. 1125-1127.

73. Harrington C. S., Thomson-Carter F. M., Carter P. E. Evidence for recombination in the flagellin locus of Campylobacter jejuni: implications for the flagellin gene typing scheme. // J. Clin. Microbiol. 1997 - V.35 - P. 2386-2392.

74. Henegariu О., Neerema N.A., Dlouhy S.R., Vance G.H., Vogt P.H. Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. // Biotechniques. 1997.-V. 23.-P. 504-511.

75. Johnson R.P., Clarke R.S., Wilson J.B., Read S.D. et al. Growing concerns and recent outbreaks involving non-0157:H7 serotypes of verocytotoxigenic E. coli. II J. food Protect. 1996 - V. 59 - P. 1112-1122.

76. Kainz P., Schmiedlechner A., Strack H.B. Specifity-enhanced hot-start PCR: addition of double-strand DNA fragments adapted to the annealing temperature. // Biotechniques. 2000. - V. 28(2). - P. 278-282.

77. Karch H., Bielaszewska M. Sorbitol-Fermenting Shiga Toxin-Producing Escherichia coli 0157:H2 Strains: Epidemiology, Phenotypic and Molecular

78. Characteristics, and Microbiological Diagnosis. // Journal of Clinical Microbiology 2003 - V. 41, No. 6 - P. 2669-2671.

79. Karmali M. A. Infection by verotoxin-producing Escherichia coli. II Clin. Microbiol. Rev. 1989 - V.2-P. 15-38.

80. Karpman D., Connell H., Svensson M., Scheutz F., Aim P., Svanborg C. The role of lipopolysaccharide and Shiga-like toxin in a mouse model of Escherichia coli 0157:H7 infection. // J. Infect. Dis. 1997 - V. 175 - P. 611-620.

81. Lee J.H., Hur J., Stein B.D. Occurrence and characteristics of enterohemorrhagic Escherichia coli 026 and Olll in calves associated with diarrhea. // Applied and Environmental Microbiology 2000 - V. 66, No. 6 -P. 2513-2519.

82. Lior H., С. L. Gyles Classification of Escherichia coli. Escherichia coli in domestic animals and humans. CAB International, Wallingford, United Kingdom - 1994-P. 31-72.

83. McPherson M.J., Haines B.D., Taylor G.R. (ed.) PCR 2. A Practical Approach. Oxford University Press. - 1995.

84. Miyazaki S., Sugawara H., Gojobori Т., Tateno Y. DNA Data Bank of Japan (DDBJ) for genome scale research in life science. // Nucleic Acids Res.-2003.-V. 31.-P. 13-16.

85. Mobassaleh M., Koul O., Mishra K., McCluer R. H., Keusch. G. T. Developmentally regulated Gb3 galactosyltransferase and alpha-galactosidase determine Shiga toxin receptors in intestine. // Am. J. Physiol. 1994 - V. 267 - P. 618-624.

86. Monteiro L., Bonnemaison D., Vekris A., Petry K.G., Bonnet J., Vidal R., Cabrita J., Megraud F. Complex polysaccharides as PCR inhibitors in feces: Helicobacter pylori model. I I J. Clin. Microbiol. 1997 - V. 35 - P. 995998.

87. Moon H. W., Booher S. L., Cornick N. A., Hoffman L. J. Prevalence of Virulence Factors Among Escherichia coli. II Journal of clinical microbiology 1998 - V. 36, No. 4 - P. 878-882.

88. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. // Methods Enzymology (ed. R. Wu). -1987. V. 155. - P. 335-50. Academic Press, London.

89. Nataro J. P., Kaper J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. II Clinical microbiology reviews 1998 - V. 11, No. 1 - P. 142-201.

90. Nielsen E. M., Tegtmeier C., Andersen M. T. et al. Influence of age, sex and herd characteristics on the occurrence of Verocytotoxin-producing E. coli 0157 in Danish dairy farms. // Vet. Microbiology 2002 - V. 88 - P. 245-257.

91. Nielsen E. M., Scheutz F., Torpdahl M. Continuous surveillance of Shiga toxin-producing Escherichia coli infections by pulsed-field gel electrophoresis shows that most infections are sporadic. // Foodborne Pathog. Dis. 2006 - V. 3 - P. 81-88.

92. O'Brien A.D., Lively T.A., Chen M.E., Rothman S.W., Formal S.B. Escherichia coli 0157:H7 strains associated with haemorrhagic colitis in the United States produce a Shigella dysenteriae 1 (SHIGA) like cytotoxin. // Lancet- 1983 V. 1-P. 702.

93. O'Brien A.D., Holmes R.K. Shiga and Shiga-like toxins. // Microbiology Reviews 1987 - V. 51 - P. 206-220.

94. Ohnishi M., Kurokawa K., Hayashi T. Diversification of Escherichia coli genomes: are bacteriophages the major contributors? // Trends in Microbiology.- 2001 V.9 No.10 -P.481-485.

95. Orrego C. Organizing a laboratory for PCR work. In: PCR Protocols: a guide to methods and applications. Academic Press. 1990.

96. Paton A. W., Paton J. C. Pathogenesis and Diagnosis of Shiga Toxin-Producing Escherichia coli Infections. // Clinical microbiology reviews -1998 V.l 1, No. 3 - P. 450-479.

97. Pearson W. R. Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA // Methods in Enzymology. 1990. - V. 183. - P. 63-98.

98. Pearson W. R., Lipman D. J. Improved Tools for Biological Sequence Comparison. // Proc Natl Acad Sci USA.- 1988. V. 85. - P. 2444- 2448.

99. Pearson W.R. Flexible sequence similarity searching with the FASTA3 program package. // Methods Mol Biol. 2000. - V. 132. - P. 185-219.

100. Perelle S., Fach P., Dilasser F., Grout J. A PCR test for detecting Escherichia coli 0157:H7 based on the identification of the small inserted locus (SILO 157). // J. Appl. Microbiol. 2002 - V. 93 - P. 250- 260.

101. Pie'Rard D., Muyldermans G., Moriau L., Stevens D., Lauwers S. Identification of New Verocytotoxin Type 2 Variant B-Subunit Genes in Human and Animal Escherichia coli Isolates. // Journal of Clinical Microbiology- 1998-V. 11, No. 11 P. 3317-3322.

102. Ratiner Y. A., Salmenlinna S., Eklund M., Keskima M., Siitonen A. Serology and Genetics of the Flagellar Antigen of Escherichia coli 0157:H7a,7c. // Journal of clinical microbiology. 2003 - V. 41, No. 3 - P. 1033-1040.

103. Ray P. E., Liu X. H. Pathogenesis of Shiga toxin-induced hemolytic uremic syndrome. // Pediatr. Nephrol. 2001 - V.16 - P. 823-839.

104. Read S. et al. Prevalence of verocytotoxigenic E. coli in ground beef, pork and chicken in Southwestern Ontario. // Epidem. And Infect. 1990 - V. 105 -P. 11-20.

105. Reid S.D., Selander R.K., Whittam T.S. Sequence diversity of flagellin (fliC) alleles in pathogenic E. coli. Journal of bacteriology. - 1999 - V. 181 (1)-P. 153-160.

106. Rybicki E. PCR Primer Design and Reaction optimisation. In: Molecular Biology Techniques Manual, (ed. Coyne V.E., James M.D., Reid S.J.,

107. Rybicki E.P.) Departament of Molecular and Cell Biology, University of Cape Town. - 2001.

108. Rychlik W., Spencer W.J., Rlioads R.E. Optimization fo the annealing temperature for DNA ampification in vitro. // Nucleic Acids Research. -1990.-V. 18 (21).-P. 6409-6412.

109. Schoenhals G., Whitfield C. Comparative analysis of flagellin sequences from Escherichia coli strains possessing serologically distinct flagellar filaments with a shared complex surface pattern. // J. Bacteriol. 1993 - V. 175-P. 5395-5402.

110. Selander R. K., Caugant D. A., Whittam T. S. Genetic structure and variation in natural populations of Escherichia coli — 1987 P. 1625—1648.

111. Shaikh N., Tarr P. I. Escherichia coli 0157:H7 Shiga Toxin-Encoding Bacteriophages: Integrations, Excisions, Truncations, and Evolutionary Implications. // Journal of Bacteriology 2003 - V. 185, No. 12 - P. 35963605

112. Sharma V.K. Detection and quantitation of enterohemorrhagic Escherichia coli 0157, Ol 11, and 026 in beef and bovine feces by real-time polymerase chain reaction. // J. Food Prot. 2002 - V.65 - P. 1371- 1380.

113. Shaw S. Identification of E. coli 0157:H7 and verotoxin-producing of E. coli 0157:NM by the WARNEXTM REAL-TIME PCR system. // MFLP. -2006-V. 12.

114. Shimada Т., Kosako Y., Isshiki Y., Hisatsune K. Enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 possesses somatic (O) antigen identical with that of Salmonella 030. //Curr. Microbiol. 1992 - V.25 - P. 215-217.

115. Son W.G., Graham Т. A., Gannon V. P. J. Immunological Characterization of Escherichia coli 0157:H7 Intimin yl. // Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 2002 - V. 9, No. 1 - P. 46-53.

116. Strockbine N.A., Marques L.R., Holmes R.K., O'Brien A.D., Characterization of monoclonal antibodies against Shigalike toxin from Escherichia coli. // Infect. Immun. 1985 - V. 50 - P. 695- 700.

117. Thompson J.S., Hodge D.S., Borczyk A.A. Rapid biochemical test to identify verocytotoxin-positive strains of Escherichia coli serotype 0157. // Journal of clinical Microbiology 1990 -V. 28. - P. 2165-2168.

118. Toma C., Lu Y., Higa N., Nakasone N., Chinen I., Baschkier A., Rivas M., Iwanaga M. Multiplex PCR Assay for Identification of Human Diarrheagenic Escherichia coli. II Applied and Environmental Microbiology 2003 - V. 69, No. 9 - P. 5243-5247.

119. Torres A.G., Kaper J.B. Multiple elements controlling adherence of enterohemorragic E. coli 0157:H7 to HeLa cells. // Infect. Immun. — 2003 -V. 71 P. 4985-4995.

120. Vernozy-Rozand C. Detection of E. coli 0157:H7 and other verocytotoxin-producing E. coli in food. // J. Appl. Microbiol. 1997 — V. 82 -P. 537-356

121. Wang L., Rothemund D., Curd H., Reeves P. R. Sequence Diversity of the Escherichia coli H7 fliC Genes: Implication for a DNA-Based Typing Scheme for E. coli 0157:H7. // Journal of clinical microbiology 2000 - V. 38, No. 5-P. 1786-1790.

122. Waters J. et al. Infection caused by E. coli 0157:H7 in Alberta, Canada and in Scotland. // Clinical Infect. Dis. 1994 - V. 19 - P. 834-843.

123. Welinger-Olsson С., Kaijser В. Enterohaemorragic E. coli (EHEC). // Scand. J. Infect. Dis. 2005 - V.37 - P. 405-416.

124. Wick L. M., Qi W., Lacher D. W., Whittam T. S. Evolution of Genomic Content in the Stepwise Emergence of Escherichia coli 0157:H7. // Journal of Bacteriology 1999 - V. 181, No. 1 - P. 153-160.

125. Zhang J., Madden T.L. Power BLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation. // Genome Res. 1997. - V. 7. - P. 649-656.