Тест-система для диагностики трихинеллеза свиней иммуноферментной реакцией с антигеном, очищенным моноклональными антителами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.19, кандидат биологических наук Козлова, Галина Александровна

• Козлова, Галина Александровна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Козлова, Галина Александровна

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Антигены в диагностике трихинеллеза

2.2. Методы иммунологической диагностики трихинеллеза

2.3. Внутрикожная аллергическая проба

2.4. Реакция кольцепреципитации

2.5. Реакции агглютинации

2.6. Реакция непрямой гемагглютинации

2.7. Реакция латекс-агглютинации

2.8. Реакция связывания комплемента

2.9. Реакции иммунофлуоресценции

2.10. Иммуноферментная реакция (ИФА)

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методы

3.1.1. Культивирование гибридом

3.1.2. Криоконсервирование клеток

3.1.3. Восстановление клеточной культуры после хранения в глубокозамороженном состоянии

3.1.4. Определение качества клеточных линий

3.1.5. Спектрофотометрическое определение концентрации белков

3.1.6. Приготовление антигенов из личинок трихинелл

3.1.6.1. Получение культуры личинок трихинелл

3.1.6.2. Приготовление цельного экстракта личинок трихинелл

3.1.6.3. Фракционирование экстракта личинок Т.spiralis

3.1.6.4. Очистка антигена с помощью моноклональных антител

3.1.7. Отработка технологических условий создания тест-системы

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.2.1. Влияние криоконсервирования на биологическую активность

клеточной культуры

3.2.2. Технологические параметры тест-системы

3.2.3. Изучение сравнительной диагностической эффективности антигенов в иммуноферментной реакции

3.2.4. Динамика иммунного ответа при экспериментальном заражении свиней личинками Т. spiralis

3.2.5. Динамика выделения антител при экспериментальном заражении свиней личинками T.pseudospiralis

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

8. ПРИЛОЖЕНИЯ

119

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Тест-система для диагностики трихинеллеза свиней иммуноферментной реакцией с антигеном, очищенным моноклональными антителами»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Широкое распространение ряда опасных гельминтозоонозов, таких как трихинеллез, эхинококкозы, цистицеркозы и др. свидетельствуют о недостаточно высоком уровне ветеринарно-санитарных мероприятий при этих заболеваниях и необходимости разработки и внедрения средств и методов борьбы, обеспечивающих их надежную профилактику и, соответственно, защиту населения в отношении этих инвазий.

Данная проблема становится особенно значимой в условиях современной реорганизации сельскохозяйственного производства, формирования животноводческих хозяйств различных форм собственности, с широким спектром технологии выращивания животных и слабой кормовой базой.

На этом фоне, особенно последние годы, четко просматривается тенденция в увеличении экстенсинвазированности сельскохозяйственных животных, в частности, свиней трихинеллезом, и соответственно уровень заражения этим гельминтозом населения.

Комплекс противотрихинеллезных мероприятий широко применявшихся в предыдущие годы, как правило, базировался на решении ветеринарных и медико-санитарных вопросов - трихинеллоскопическом контроле туш и мясопродуктов, дератизации, наведении санитарного порядка на территориях ферм и населенных пунктов, борьбе с бродячими животными.

Анализ современной эпизоотической и эпидемической ситуаций по трихинеллезу и перспектив развития агропромышленного комплекса в России свидетельствуют о необходимости коррекции системы мер борьбы с трихинеллезом и интеграции в нее новых приоритетных направлений.

В этом плане наиболее важное значение имеет внедрение современных иммунологических методов прижизненной диагностики с использованием высокочувствительных и высокоспецифичных антигенов.

В связи с этим Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации и Министерством здравоохранения РФ утвержден ряд важных нормативно-технических документов, указывающих на роль прижизненной диагностики трихинеллеза в системе мер борьбы с этой инвазией (Инструкция о мероприятиях по предупреждению и ликвидации заболеваний животных гельмин-тозами, Москва, 1999; Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации - Санитарные правила и нормы Сан ПиН 3.2 569-96; Методические указания по лабораторной диагностике трихинеллеза животных, 1998, N13-7-2 1428 и др.).

Таким образом включение в комплекс мер борьбы с трихинеллезом иммунологической диагностики позволяет оперативно решать вопросы массового сероэпизоотического обследования и выявления больных животных, определять в целом иммунологическую структуру в отношении трихинеллеза у животных на уровне фермы, или конкретной группы, уточнять результаты противотрихинеллезных мероприятий, а при снятии ограничений с неблагополучного по трихинеллезу хозяйства ведущее значение имеют результаты иммунологических обследований свиней.

Подчеркивая роль прижизненной диагностики в борьбе с трихинеллезом необходимо выделить значение таких критериев, как специфичность и чувствительность теста, технологичность постановки, уровень сложности оценки результатов, т.е. показателей, определяющих в целом диагностическую эффективность теста.

Анализ лабораторных и производственных испытаний некоторых иммунологических реакций, выполненных в нашей стране и за рубежом (Коновалова J1.M. с соавт., 1977; Полетаева О.Г. с соавт., 1986; Лейкина Е.С.,1980; Бессонов А.С.,1975; Takanashi Y. et al.,1990; Gamble

Н.Я.Д983,1984,1986; БеБропитег а1.Д970) свидетельствует о сложности иммунохимической структуры антигенов трихинелл и, определенных затруднениях в создании эффективных диагностических средств. Таким образом поиск перспективных методов очистки антигенов, их испытание и выявление наиболее специфических компонентов позволяют оптимизировать разработку эффективных тест-систем.

Цель и задачи исследования. Учитывая актуальность проблемы, цель работы заключалась в разработке тест-системы для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней на основе иммуноферментной реакции с использованием антигена, очищенного с помощью моноклональ-ных антител.

В соответствии с этим определены следующие задачи исследований:

1. Получить препаративные количества моноклональных антител для очистки трихинеллезного антигена.

2. Оптимизировать методику постановки и учета иммунофермент-

»-» I* II

ной реакции с моноклональным антигеном.

3. Провести сравнительные диагностические испытания опытного (очищенного моноклональными антителами) и коммерческого (фракционированного) антигенов в экспериментальных и производственных условиях.

4. Изучить в сравнительном аспекте динамику иммунного ответа при трихинеллезе, вызванном экспериментальным заражением свиней личинками Т.БркаНз и Т.рБеисЬзркаШ.

5. Освоить тест-систему для диагностики трихинеллеза свиней на основе ИФА с использованием антигена, очищенного с помощью моноклональных антител и разработать технологический регламент на его получение.

Научная новизна.

1. Испытана тест-система для прижизненной диагностики трихинеллеза с использованием антигена, очищенного с помощью мо-ноклональных антител, на сыворотках экспериментально и спонтанно зараженных животных.

2. Определена специфичность и чувствительность тест-системы в сравнении с коммерческим набором компонентов для иммуно-ферментной диагностики трихинеллеза свиней.

3. Изучена в сравнительном аспекте динамика иммунного ответа у животных зараженных Т. spiralis и T.pseudospiralis с использованием очищенного моноклональными антителами антигена.

4. Дана комплексная оценка тест-системы с "моноклональным" антигеном.

Практическая ценность работы.

На основании выполненных исследований отработаны технология получения "моноклонального" антигена и тест-система для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней.

Созданы необходимые условия для опытного производства наборов этого диагностикума и разработан технологический регламент на получение антигена, очищенного моноклональными антителами.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены:

1. На 7-й научной конференции по трихинеллезу человека и животных (1996 г.)

2. На 5-й Всероссийской научной конференции "Актуальные вопросы медицинской паразитологии" (1998 г.)

3. На Всероссийской научной конференции "Взаимоотношения паразита и хозяина" (1998 г.)

4. На заседаниях Ученого совета ВИГИС (1993 - 1999 гг.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ, в которых отражены основные направления и результаты исследований.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего: материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, список использованной литературы, содержащего 79 отечественных и 111 иностранных источников, приложения. Работа иллюстрирована 10 фотографиями, 9 рисунками и 3 таблицами.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Оценка диагностической эффективности тест-системы с антигеном, очищенным с помощью моноклональных антител.

2. Результаты сравнительных испытаний очищенного монокло-нальными антителами и фракционированного антигенов в иммунофер-ментной реакции на сыворотках экспериментально и спонтанно зараженных трихинеллами свиней.

3. Обоснование перспектив применения разработанной тест-системы для иммунологической диагностики трихинеллеза.

4. Особенности динамики иммунного ответа у свиней, зараженных T.spiralis и T.pseudospiralis.

Заключение диссертации по теме «Паразитология», Козлова, Галина Александровна

ВЫВОДЫ

1. На основе использования гибридомной технологии наработаны препаративные количества моноклональных антител, проведена очистка трихинеллезного антигена и дана его комплексная иммунодиагностическая оценка.

2. Длительность хранения культуральных сред с моноклональными антителами в режиме фрастирования при -20 С составляет не менее 4 лет, при сохранении специфичности в отношении трихинеллезного антигена.

3. В процессе отработки технологических параметров тест-системы определено, что сенсибилизирующая концентрация антигена составляет 10 мкг/мл, значение рН комплексирующего буфера - 9,6 и режим инкубирования - в течение 18 часов при +4 С или в течение 1 часа при +37° С. Установлено, что оптимальным скрининг титром является разведение 1:100.

4. При сравнительной оценке диагностической эффективности фракционированного - коммерческого и "моноклонального" антигенов установлена их равная чувствительность. Специфичность "моноклонального" антигена составила 97,27 %, коммерческого 90,9%.

5. Изучение динамики иммунного ответа с использованием тест-системы с "моноклональным" антигеном, при экспериментальном заражении свиней личинками Т^ркаИв, показали, что первые положительные ответы отмечали на 8-25 день, а максимальные титры (1:3200) на 40-75 день, а при использовании коммерческого антигена на 15-20-й и 60-85 день соответственно.

6. Динамика иммунного ответа у свиней, зараженных личинками ТрзеидовркаИв при применении тест-системы с испытуемым и контрольным антигенами характеризовалась появлением специфических антител на 25-38-й день и их максимальным уровнем на 85-100-й день после заражения.

7. Испытание тест-системы с "моноклональным" антигеном на сыворотках от свиней, экспериментально зараженных личинками Трзеиск^рнаНз свидетельствует о возможности ее использования и для диагностики трихинеллеза, вызываемого бескапсульным видом трихинелл.

8. Результаты комплексных испытаний тест-системы с "моноклональным" антигеном указывают на перспективность ее практического использования в системе ветеринарно-санитарных проти-вотрихинеллезных мероприятий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. По материалам выполненных исследований разработан и утвержден в 1998 г. Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации "Технологический регламент на способ получения диагностического антигена трихинелл с помощью моноклональных антител".

2. Материалы диссертационной работы включены в Федеральную научно-техническую программу приоритетных направлений развития науки в сфере агропромышленного комплекса на период до 2005 года Министерства науки России в разделе 6.1.3.1 "Средства и методы диагностического мониторинга и прогнозирования эпизоотической и эпидемической ситуации по гельминтозоонозам (трихинеллез, фасциолез, цистицеркоз и др.).

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выполнен комплекс биотехнологических, иммунологических и паразитологических исследований, позволивший получить высокоспецифичный и чувствительный антиген, очищенный с помощью монок-лональных антител и оптимизировать на его основе тест-систему для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней.

В процессе исследований детально отработан технологический цикл, связанный с получением препаративных количеств моноклональных антител, включающий культивирование гибридом, криоконсервирование клеток, их восстановление после хранения и оценку жизнеспособности. Нами установлено, что моноклональные антитела не теряют своей специфичности в отношении трихинеллезного антигена в течение 4 лет при температуре хранения -20° С, что на наш взгляд важно с производственной точки зрения.

Использование моноклональных антител для эффективной очистки трихинеллезного антигена позволило не только обозначить новый методический подход к созданию диагностически ценного препарата, но и в целом провести комплексную оценку тест-системы на его основе.

Одним из важных моментов работы было изучение динамики иммунного ответа при экспериментальном заражении свиней личинками трихинелл Т. spiralis и T.pseudospiralis, что имеет значение не только с точки зрения уточнения особенностей проявления специфической иммунной реакции у зараженных животных, но и определения диагностических возможностей тест-системы.

При исследовании сывороток крови от экспериментально зараженных различными видами трихинелл свиней в ИФА с "моноклональ-ным" и фракционированным - коммерческим антигенами, в целом получены аналогичные результаты. Однако, детально сопоставляя наиболее важные диагностические признаки антигенов, (начальные сроки выявления специфических антител, длительность периода максимальных титров и т.д.), предпочтение следует отдать "моноклональному" антигену.

Таким образом, применение очищенного и коммерческого антигенов позволило уточнить кинетику антителообразования в процессе трихинеллезной инвазии, вызванной Т^ркаШ и Т.рзеисЬзркаНз и подтвердить более высокую специфичность очищенного антигена.

Важным моментом, который обуславливается технологией получения антигена, является и возможность его стандартизации, чего зачастую не хватает аналогичным диагностическим препаратам.

Как известно, структура видоспецифических компонентов трихинелл имеет не только определенную антигенную общность, но и ряд иммунохимических различий, выражающихся в разной патогенности, особенностях клинического проявления заболевания /Н.И. Красовская, Е.С.Лейкина,1980; Н.Н.Озерецковская,1975; Н.Н.Озерецковская, Э.В.Переверзева, 1977/.

В связи с этим научно-практический интерес представляли исследования по изучению возможности применения тест-системы с

II И о моноклональным антигеном для диагностики трихинеллеза у свинеи, зараженных Т. рзеисЫркаНз.

Как следует из наших исследований, "моноклональный" антиген в равной степени успешно выявлял животных, зараженных обоими видами трихинелл.

Наиболее высокие титры (1:800; 1:1600) регистрировались к 85 дню (Т.рБеиск^рн-аНз) и к 85-100 дню (Т^ркаИв), т.е. в период, характеризующийся усилением иммунного ответа, вызываемого увеличением уровня личинок трихинелл и, соответственно, усилением активности В-системы лимфоцитов. В последующем интенсивность реакции снижалась.

Таким образом, полученные результаты позволили провести оценку очищенного антигена и разработать "Технологический регламент на способ получения диагностического антигена трихинелл с помощью моноклональных антител", что открывает возможности наработки ди-агностикума в производственных масштабах.

В результате проведенных нами исследований были определены диагностические возможности тест - системы с антигенами различной технологии получения, уточнены особенности иммунного ответа при трихинеллезе в целом и обоснованы перспективность применения тест-системы с "моноклональным" антигеном в целях эффективной борьбы с этой инвазией.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Козлова, Галина Александровна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бекиш О.Я-Л., Бурак И.И. Особенности патогенеза трихинеллеза в зависимости от интенсивности заражения// Паразитоценозы диких и домашних животных. Белоруссия. Минск.- 1984.- С. 56-58.

2. Бекиш О.Я-Л., Федосов В.М. Влияние ингибиторов биосинтеза простогландинов на формирование инвазионного процесса при трихинеллезе// Паразитоценозы диких и домашних животных. Белоруссия.- Минск.- 1987.- С. 30-33.

3. Белозеров С.Н. Эффективность реакции непрямой иммунофлуо-ресценции при экспериментальном трихинеллезе свиней.// Бюлл. ВИГИС.-М.- 1973.- 10.- С. 11-15.

4. Белозеров С.Н., Бессонов A.C. Применение реакции иммуно-флуоресценции для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней в производственных условиях.//Бюлл. ВИГИС.- 1974.- 12.-С. 175-179.

5. Белозеров С.Н. Прижизненная диагностика трихинеллеза свиней.// Ветеринария.- 1975.- 6.- С. 70-72.

6. Белозеров С.Н. Применение непрямой реакции иммунофлуоресценции (РИФ) для прижизненной диагностики трихинеллеза свиней. //Материалы докладов 2-й Всесоюзной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных.- Вильнюс.- 1976.- С. 175-176.

7. Белозеров С.Н., Гуданавичус Т.И. Реакция энзим-меченых антител для диагностики трихинеллеза.//Ветеринария.- 1982.- 11.- С. 41-44.

8. Белозеров С.Н., Рочкене A.A., Баеринене Д.В. Иммунологическая диагностика трихинеллеза людей реакцией напрямой имму-нофлуоресценции. Метод, рекомендации. Минздрав Лит. ССР.- Вильнюс.- 1983.- 3 с.

9. Белозеров С.Н., Подсебловский Т.С., Рочкене A.A. Сравнительная диагностическая эффективность реакции непрямой иммуноф-луоресценции и связывания комплемента на холоду в диагностике трихинеллеза людей.// Мед. паразитол. и паразитар. болезни.- 1985.- 2-С. 40-43.

10.Белозеров С.Н. Иммунологическая диагностика гельминтозоонозов.// Дис. докт. вет. наук.- М.- 1990.

И.Бережко В.К., Белозеров С.Н., Шеховцов Н.В., Написанова Л.А., Успенский A.B. Диагностическая эффективность иммуноферментной реакции при трихинеллезе свиней.// Материалы 5-й Всесоюзной конференции по проблемам трихинеллеза человека и животных. Новочеркасск, 1988.- М.- 1988.- С. 21-22.

12.Бережко В.К., Написанова Л.А., Успенский A.B., Шеховцов Н.В. Сравнительные испытания наборов на основе иммуноферментной реакции для прижизненной диагностики трихинеллеза.// Материалы докл. 7-й науч. конф. по трихинеллезу человека и животных.- М.-1996.- С. 7.

13.Березанцев Ю.А. Трихинеллез.- Медицина.- 1974.- 160 с. Березанцев Ю.А., Оксов И.В. Микрогемоциркулярные системы, формирующиеся в скелетных мышцах вокруг личинок трихинелл// Докл. АН СССР.-1986.-287.-5.-С. 1278-1280.

14.Бессонов A.C. Диагностика трихинеллеза методом непрямой агглютинации эритроцитов.// Материалы к науч. конф. ВОГ.- 1966.- 1.-С. 27-37.

15.Бессонов A.C. Изучение реакции латекс-агглютинации для диагностики трихинеллеза свиней.// В кн.: Вопросы очаговости болезни.-Алма-Ата.- 1966.- С. 23-25.

16.Бессонов A.C. Сравнительная диагностическая эффективность внутрикожной аллергической реакции, биопсии и трихинеллоскопии ножек диафрагмы при трихинеллезе свиней.// Тематический сборник работ по гельминтологии сельскохозяйственных животных.- М.- 1967.13,- С. 165-174.

17.Бессонов A.C. Комплексное применение иммунореакций для диагностики трихинеллеза свиней.// Ветеринария,- 1967.- 2.- С. 62-65.

18.Бессонов A.C. Пути совершенствования иммунологической диагностики трихинеллеза.//Проблемы паразитологии в Прибалтике. 1970.- 206-209.

19.Бессонов A.C. Эпизоотология (эпидемиология), диагностика и профилактика трихинеллеза (монографический анализ и собственные исследования). Дисс. ... докт. ветеринарных наук.- М.- 1970.- 1068 с.

20.Бессонов A.C. Диагностика трихинеллеза. Вильнюс.- Минтис.- 1975.381 с.

21.Бессонов A.C. Трихинеллез. Киев.- Урожай.- 1977.- 112 с.

22. Бессонов A.C., Успенский A.B., Шеховцов H.B. Аппараты для групповой экспертизы свинины на трихинеллез//Ветеринария.-1985.-10.- С.71-73.

23.Бессонов A.C. Ветеринарная гельминтология: проблемы девяностых // Вестник сельскохозяйственных наук.- 1988.- 8.- С.78-84.

24.Бессонов A.C. Эпизоотическая и эпидемическая ситуации по трихинеллезу в бывшем СССР // Ветеринария.- 1994.- 2.- С.34-36.

25.Бритов В.А. Возбудители трихинеллеза М.- 1982.- 271 с. Бритов В.А., Логачев Е.Д., Фигунов В.А. Трихинеллез человека и животных в свете последних достижений науки и практики // Гельминты и вызываемые ими заболевания.- Владивосток.- 1987.- С. 87-97.

26.Васерин Ю.А., Попов М.А., Нагорный С.А., Пиголкин А.У. К прижизненной диагностике трихинеллеза свиней.// Мат. докл. к 7 научной конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных.- Москва, 2-3 октября 1996 г.- М.-1996.- С. 19-22.

27.Гаркави Б.Л. Эпизоотология трихинеллеза в Краснодарском крае и характеристика очагов инвазии //Тр. Куб. СХИ.- 1987.- 262.- С. 16-19.

28.Дзиковский В.Н. Усовершенствование ветеринарно-санитарных мероприятий при трихинеллезе.//Бюлл. ВИГИС.- 1991.- 55.- С. 47

29.Дзиковский В.Н. Совершенствование мер борьбы с трихинеллезом в центральной части Подолья Украины. Дис. канд. вет. наук.- М.- 1992.-С. 152.

30.Дзиковский В.Н. Эпизоотическая и эпидемическая ситуация по трихинеллезу в Хмельницкой области.// Материалы 6-й научной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных. Киров, 1992.-М.- 1992.- С. 76-77.

31.Довгалев A.C. Автореферат дисс. доктора медицинских наук.- М.-1998.-С. 16-18.

32.Ермолин Г.А. Иммунохимическое изучение антигенной структуры декапсулированных личинок Trichinella spiralis. Дис.канд. биол. наук.-М.- 1968.- 202 с.

33.Ермолин Г.А. Антигены, экскретируемые личинками Trichinella spiralis в процессе их инкубирования в искусственных питательных средах.// Труды Всес. ин-та гельминтол.- 1971.-17.- С. 276-273.

34.Ермолин Г.А., Лысенко Ф.Я. Количественный ферментативный иммуноанализ. // Иммунологические методы исследования в клинике и эксперименте.- М.- 1978.- С. 36-52.

35.Ефремов Е.Е. Реакция на ензим белязаните антителя в сероди-агностиката на трихинеллозата. // Пета национальна конференция на младите специалиста отхес.- Варна.- 1977.- С.132-133.

36.Ефремов Е.Е. Биохимические и иммунохимические критерии в таксономии трихинелл и иммунологическая диагностика трихинеллеза. Дис. канд. биологических наук.- М.- 1982.- 217 с.

37.Ефремов Е.Е., Ермолин Г.А. Иммуноферментный метод обнаружения антител к антигенам декапсулированных личинок трихинелл. //В. кн.:

Морфофункциональные закономерности неспецифических защитных реакций организма.- М.- 1980.- С. 112-116.

38.Жданова О.Б. Иммунологическая диагностика трихинеллеза песцов. Дис. канд. вет. наук.- Киров.- 1997.- 154 с.

39.Железникова В.В. Определение видовой принадлежности трихинелл, циркулирующих на территории Хабаровского и Приамурского краев, и значение выявляемых видов в эпизоотологии трихинеллеза.// В кн.: Гельминтозы Дальнего Востока.- Хабаровск.- 1976.- 3.- С. 43-51.

40.Коновалова Л.М., Красовская H.H., Лейкина Е.С. Разработка реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с диагностикумами длительного хранения и оценка существующих методов диагностики трихинеллеза. // Материалы докладов ко П-ой Всесоюзной конференции по проблеме трихинеллеза человека и животных.- Вильнюс.- 1976.- С. 192-198.

41.Коновалова Л.М., Красовская H.H., Железникова В.В. Применение реакции непрямоц гемагглютинации для диагностики трихинеллеза человека. // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни.- 1977.- 3.-С. 337-345.

42.Костецкий А.Ф., Васерин Ю.И. Сравнительная характеристика чувствительности и специфичности РНГА с культуральным и коммерческим трихинеллезными антигенами.// Материалы 5-й Всесоюзной конференции по проблемам трихинеллеза человека и животных. Новочеркасск, 1988.- М.- 1988.- С. 90-91.

43.Костецкий А.Ф., Васерин Ю.И. Получение и характеристика экскреторно-секреторного антигена трихинелл.// Материалы докл. к 6

научной конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных. Киров, 12-14 мая, 1992г.- М.- 1992.- С. 93-95.

44.Красовская H.H., Лейкина Е.С. Сравнение двух видов трихинелл Т. spiralis и T.nativa по иммунологическим критериям.//Мед. паразитология и паразитарн. болезни.- 1980.- 2.- С. 70-73.

45.Курманова Л.В., Цветков B.C., Ефремов Е.Е. Поэтапная процедура постановки реакции энзим-меченых антител (РЭМА).// Иммунодиагностика тропических и паразитарных болезней.- М.- 1980.- С. 24-31.

46.Лейкина Е.С. Иммунитет при трихинеллезе.// В кн.: Трихинеллы и трихинеллез. Под ред. Боева С.Н. Алма-Ата.- 1978.-С. 134-146.

47.Лейкина Е.С. Применение иммунологических методов для изучения эпидемиологии и оценки эффективности мероприятий по борьбе с гельминтозами.// Мед. паразитология и паразит, болезни.- 1980.- 3.-С. 3-10.

48.Лукашенко Н.П. Прижизненная диагностика трихинеллеза свиней методами аллергической (внутрикожной) и серологических реакций. Дисс. канд. вет. наук.-М.- 1956.

49.Лысенко А.Я., Ермолин Г.А., Цветков B.C. Реакция энзим - меченых антител (РЭМА) в иммунодиагностике паразитарных болезней.// Мед. паразитол. и паразитар. болезни.- 1978.- 4.- С. 39-47.

50.Лысенко А.П., Ермолин Г.А. современные тенденции в иммунодиагностике заразных болезней.// Иммунодиагностика тропических и паразитарных болезней.- М,- 1980.- С. 3-13.

51.Лысенко А.П., Ермолин Г.А., Цветков B.C., Ефремов Е.Е., Эткин А.Ф., Курманова Л.В. Параметры конструирования диагностических тест-систем на основе реакции энзим-меченых антител. // Иммунодиагностика тропических и паразитарных болезней.- М.- 1980.- С. 36-44.

52.Моренец Т.М. Реакция непрямой иммунофлюоресценции при трихинеллезе человека. // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни.-1984.- 3.- С. 22-34.

53.Моренец Т.М. Клиника и лечение трихинеллеза при заражении в природном и смешанном синантрапиоприродном очагах. Автореферат дисс. канд. мед. наук.- М.- 1984.- 24 с.

54.Моренец Т.М., Шеховцов Н.В., Дмитриева Н.И., Мурашов Н.Е. Мебендазол в лечении трихинеллеза от "пассированных" природных штаммов трихинелл. // Материалы докл. к 3-ей Всесоюзн. конф. по проблеме трихинеллеза человека и животных.- Вильнюс.- 1981.-С. 196-201.

55.Написанова Л.А. ELISA и dot-ELISA в динамике экспериментального трихинеллеза свиней. //Материалы докл. к 7-й научной конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных. Москва, 2-3 октября 1996 г.- М.-1996.- С. 48-49.

56.0зерецковская H.H. Клинико-эпиемиологические особенности трихинеллеза из разных географических районов СССР. // Мед. паразитология и паразитарные болезни. 1968.-N4.- С.387.

57.0зерецковская H.H., Тумольская Н.И., Переверзева Э.В., Ермолин Г.А. Медицинское значение клинико-эпидемиологических и паразитологических особенностей трихинеллеза человека от синантропных и природных штаммов трихинелл.//Wiad. Parazytol.-1975.- 21.- 4-5.- Р.577-589.

58,Озерецковская H.H., Тумольская Н.И., Переверзева Э.В., Бронштейн A.M., Моренец Т.М., Бодылевский В.Н., Шихарева А.Ф., Имамкулиев К.Д., Коновалова JI.B. Тиабендазол, хлофазол и мендазол в лечении трихинеллеза от синантропных и природных штаммов трихинелл. // Материалы докл. 2-й Всесоюз. конф. по проблеме трихинеллеза человека и животных. Вильнюс.- 1976.- С. 198-203.

59.0зерецковская H.H. Патогенез, патоморфология и клиника трихинеллеза.// В кн.: Трихинеллы и трихинеллез. Под ред. Боева С.Н. Алма-Ата,- 1978.- С. 165-196.

бО.Озерецковская H.H., Переверзева Э.В. Биологические особенности штаммов трихинелл и их значение для эпидемиологии, клиники и лечения трихинеллеза.// В кн.: Природноочаговые антропозоонозы.-Омск.- 1976.- С.172-173.

61.0зерецковская H.H., Переверзева Э.В. Трихинеллез человека от природных штаммов трихинелл.//Тезисы докл. 16-го Всесоюз. съезда микробиологов и эпидемиологов.- М. 1977.- С. 274-276.

62.Пашук В.П. Экспериментальные данные к применению иммунологических реакций в диагностике трихинеллеза.// Здравоохранение Белоруссоо.- 1956.- 3.- С. 42-45.

63.Пашук В.П. Иммунодиагностика в вопросах изучения эпидемиологии и эпизоотологии трихинеллеза в БССР. //Тезисы докл. III съезда белорусских гигиенистов.-Минск.- 1957.- С. 175-177.

64.Пашук В.П. К иммунологической диагностике трихинеллеза. // Сборник научных трудов белорусского института эпидемиологии, микробиологии и гигиены,- 1957.- С. 349-354.

65.Полетаева О.Г., Красовская H.H. Оптимизация методов иммунологической диагностики трихинеллеза.// Материалы докл. к 4-ой конфер. по проблеме трихинеллеза человека и животных.- Ереван.-1985.- С. 145-146.

66.Полетаева О.Г., Красовская H.H., Глаголева В.А. Характеристика иммуноферментной тест-системы с антигенами трихинелл // Мед. паразитология и паразит, болезни.- 1986.- 3.- С. 51-56.

67.Понтюшенко Н.Т., Богомолова Е.Е. Повысить эффективность противотрихинеллезных мероприятий //Ветеринария.- 1994.-10.- С. 4-6.

68.Сакалаускайте Ю.А. Иммунный ответ хозяина на паразитирование трихинелл и его изменение под воздействием мебендазола. Сообщение 1. Развитие клеточных и гуморальных иммунных реакций у мышей, инвазированных Т. spiralis.// Мед. паразитология и паразитарн. болезни.- 1978.- 5.- С. 24-29.

69.Старкова Т.В., Полетаева О.Г. Оценка различных методов инструментального учета ИФА с антигеном трихинелл.//Материалы докл. к 7 научн. конф. по пробл. трихинеллеза человека и животных. -Москва, 2-3 октября, 1996 г.- М.- 1996.- С. 93-95.

70.Субботин Н.Ф. Эффективность иммунологических реакций в диагностике трихинеллеза.// Ветеринария.- 1968.- 2.- С. 66-68.

71.Успенский A.B. Изучение реакции латексагглютинации для прижизненной диагностики трихинеллеза животных.// Бюл. ВИГИС.-М.- 1971.-5.- С. 127-130.

72. Успенский A.B. Сравнительная диагностическая эффективность агглютинационных реакций при трихинеллезе. Дис. канд. вет. наук.-М.- 1972.

73.Успенский A.B. Диагностическая эффективность агглютинационных реакций при спонтанном трихинеллезе песцов.//Бюл. ВИГИС.- М.-1974.- 12.- С. 88-90.

74.Успенский A.B., Назарова Н.С., Нечиненный А.Д., Певнева В.Д. Реакция кольцепреципитации в капилляре (РКПК) для прижизненной диагностики трихинеллеза песцов.// Бюл. ВИГИС.- М.- 1975.- 16._ С. 80-81.

75.Шеховцов Н.В., Бережко В.К., Написанова JI.A. Сравнительная эффективность РНИФ и ИФР в диагностике трихинеллеза свиней.// Ветеринария.- 1989.- 12.- С. 39-41.

76.Шеховцов Н.В., Успкнский А.В., Белозеров С.Н. Сероэпизоотические исследования по трихинеллезу в производственных условиях.// Материалы докл. 6-й науч. конф. по проблеме трихинеллеза человека и животных. Киров.- М.- 1992.- С. 219-221.

77.Шимкунене Б.А. Применение реакций преципитации при диагностике трихинеллеза.// Acta parasitológica Lintunica.-1969.- 9.- Р.96-106.

78.Шимкунене Б.С. О роли серологических реакций при диагностике трихинеллеза человека.//Вопросы эпидемиологии и гигиены в Литовской ССР. Материалы республиканской конф. по кишечным инфекциям.-Вильнюс.- 1969.

79.Шимкунене Б.С. Сравнительная оценка серологических реакций в диагностике трихинеллеза. Дис. канд. мед. наук.- 1970.

80.Шимкунене Б.А. Применение серологических реакций в диагностике трихинеллеза человека. Проблемы паразитологии. // Труды 70ой науч. конф. паразитологов УССР.- Киев.- 1972.- 2.- С. 443-445.

81.Шимкунене Б.А. Сравнительная оценка разных серологических реакций при экспериментальном трихинеллезе. // Материалы докл. Всесоюзн. конф. по проблеме трихинеллеза человека и животных.-Вильнюс.- 1972.- С. 136-140.

82.Ambroise- Thomas Р., Bocchio J.J., Faure Н., Mme, Stinge J.-C. Trichinose humane decouverte fortmitement. Intered du diagnosis seroloque.// Bull. Soc. sci. vet. med. сотр.- Lion.- 1972.- 74.- 3.- P. 279-282.

83.Baldelli В., Frescura T., Gialetti L. L,immunofluorescenza nella diagnosi della trichinosi sperimentale e umana. // Atti Soc. Ital. Sci. Veterin.- 1969.22.- P. 739-745.

84.Bany J., Bankowski A., Kazmierczuk J. Protein composition of Trichinella spiralis and T.pseudospiralis investigated by electrophoresis on poliac-rylamide gel. /Дn: Abstracts of the papers submitted to the IV Inter, confer, on Trichinellosis.- 1976.- P. 9-10.

85.Baratawidjaja R.K., Hewson A., Labzoffsky N.A. Fluorescent antibody staining in the serodiagnosis of trichinosis.// Canad. J. Microbiol.- 1963.- 9.4.- P. 625-628.

86.Barciszewski M., Janecki J., Jezioranska J. Clinical and serological evaluation of trichinosis.// J. Hyg., Epidemiol., Microbiol, and Immunol.-1959.-33.- P. 317-328.

87.Barciszewski M., Janecki J., Jezioraska J. Клиническая и серологическая оценка трихинеллеза.// Журнал гигиены, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии.- Прага.- I960.- 4.- 1.- С. 15-25.

88.Batteli J., Juberti V., Martini M. Trichinellosiscontrol in Italy; consideration on samling in impoated horses and thir meat.//Eight Int. conf. on Trichinellosis.- 1993.- Italy.- P. 13.

89.Bouree P., Diallo D. Interet du test d,agglutination au latex dans la trichinose.//Bull. Soc. Fr. Parasitol.- 1988.- 6.- 1.- P. 73-76.

90.Brzosko W., Gancarz Z., Nowoslawski A. Immunofluorescence a w iag-nostyce serologiczney wiosnicy. //Med. doswiad. i micro - biol.- 1965.- 17.4.- P. 325-332.

91.Brzosko W.J., Gancarz Z. Immunoelectronoscopic studies on antibody binding to the cuticle of Trichinella spiralis larvae. //In: II International Conference on Trichinellosis, Wroclaw, June 26-29, 1969. Abstracts of Papers.-Wroclaw.-1969.- P. 39.

92.Candolfi E., Frashe P., Kien T. Detection par une methode immuno-enzymatique des anticops IgG, IgM, IgA et de l,antigene circulant dans la trichinose experimentale des rongeurs // Bul. de la Société Fransaise de Parasitologic.- 1986.- 4(2).- 217-220.

93.Capron A., Bout D., Dugimont J.C. Apport des metodes immunoenzi-mologiques utilizantt des antigenes purifies en diagnostic spesifique et automatise des infections parasitaries //Aun. soc. belgemeg. trop.- 1975.55.- 5.- P. 443-452.

94.Chan S.M., Ko R.S. Comparison between standart ELISA and dot-ELISA for serodiagnosis of human trichinosis // Transaction of Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene.- 1988.- 82(6).- C.892-894.

95.Chroust K., Dubansky V., Pikac A. Fluorescent - antibody studies of muscle larvae Trichinella spiralis (Owen, 1835). I. The direct fluorescent-antibody method. // Sbor. Vysoke skoly zemed. v. Brne.- 1966.-14.- 4.- P. 505-514.

96.Chroust K., Dubansky V. Fluorescent-antibody studies of muscle larvae Trichinella spiralis (Owen, 1835) the direct and indirect fluorescent-antibody method. //In: IX Zjazd Polskiego Towarzystwa Parazytologic-znego, Katowice, 18-21 maja 1967.-Katowice.- 1967.-P.78-79.

97.Chroust K., Dubansky V. //Acta veterin.- 1970.- 39.- 2.- P. 157-163.

98.Clinard E.H., Saunders H. Prospects for use of the ELA- test in control of Trichinellosis in swin.// VI intern. Conf. on Trichinellosis, Poznan, 1976.-P. 501-509.

99.Coons A.H., Kaplan M.H. Localization of antigen in tissue cells. ILImprovements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. //J. Expti. Med.-1950.- 91.- P. 1-13.

100. Daskalova M., Zheler Zh., Novoselska L. Assesment of the specificity and sensitivity of a new antigen used in trichinellosis diagnostics.// Sci. Works Higher Med. Inst. Pleven.- 1983.- 5.-1.- P. 10-13.

101. Despommier D.D., Kajima M., Wostmann B.S. Ferritin - conjugated antibody studies on the larvae of Trichinella spiralis.// J. Parasitol.- 1967.- 53.3.- P. 618-624.

102. Despommier D.D., Muller M. The stichosome of Trichinella spiralis. Its structure and function.//Second Inter. Congr. of Parasitol.-1970.- 2.- P. 11.

103. Despommier D.D., Campbell W.C., Blair L.S. The in vivo and in vitro analysis of immunity to Trichinella spiralis in vice and rats.// Parasitology.-1977.- 74.- P. 109-119.

104. Despommier D.D., Lacetti A. Trichinella spiralis: protein and antigen isolated from a large particle fraction derived from the muscle larvae.// Exp. Parasitol.-1981.- 51.- P. 279-295.

105. Despommier D.D., Lacetti A. Trichinella spiralis partial characterization of antigens isolated by immuno - affinity chromatography from a large par-tical fraction of the muscle larvae.// J. Parasitol.-1981.- 67.- P. 332-339.

106. Ducas R. L, immunite dans la trichinose. These. - Paris.-1921.

107. Dymowska Z., Zakrzewska A., Aleksandrowicz J. Effect of the methods of preparation on the diagnostic value of T. spiralis antigens.// Wiad. Para-zytol.- 1970.- 16.- 1.- P. 3.

108. Engelbrecht E., Kampelmacher E.H. Diagnosis of recent and long standing Trichinella spiralis infections by means of the immunofluorescence test. Summaries of Communications. //In: The National. Congress of Medical Microbiology, September 15 - 18, 1965.- Bucharest.-1965.- P. 186-187.

109. Gamble H.R., Anderson W.R., Graham C.E., Murrell K.D. Diagnosis of Swine Trichinosis by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Using an Excretory-Secretory Antigen.// Vet. Parasit.- 1983.- 13.- P. 349-361.

110. Gamble H.R., Graham C.E. Comparison of monoclonal antibodi-based competitiv and indirect enzime-linked immunosorbent assay for diagnosis of swine trichinosis.// Vet. Immunol. Immunopeth.- 1984.- 6.- P. 379-389.

111. Gamble H.R., Graham C. Monoclonol antibody-purified antigen for the immunodiagnosis of trichinosis.// Am. J. Vet. Res.-1984.- 45.-1.- P. 67-74.

112. Gamble H.R. Induction of immunity of Trichinella spiralis in mise using antigens derived from different life cycle stade. //J. Parasitol.- 1985.- 71.-P. 680-682.

113. Gamble H.R., Murrell K., Marti Ph. Inoculation of pigs against T. spiralis using larvae excretory-secretory antigens. //Amer. J. Vet. Res.- 1986.-47.-11.- P. 2396-2399.

114. Gamble H.R., Murrell K.D. Conservation of diagnostic antigen epitopes among biologically diverse isolates of T. spiralis.// J. of Parasit.- 1986.- 72.6.- P. 956-961.

115. Gamble H.R., Zarlenga D.S. Biotechnology in the development of vaccines for animal parasites.//1986.- 20.- P. 237-250.

116. Gamble H.R. Monoclonal antibody technology in the development of vaccine for liverstock parasites.// J. of Animal sciens.- 1987.- 64.- 1.-P. 328-337.

117. Gamble H.R., Murrell K.D. Swine trichinellosis: diagnosis and control.// Agri-Pract.- 1987.- 8 (1).- P. 12-15.

118. Gamble H.R., Rapic D., Marinculis A., Murrell K.D. Evalution of excretory-secretory antigens for the serodiagnosis of swine trichinellosis.// Veter. parasitol.- 1988.- 30.- P. 131-137.

119. Gancarz Z. Metody immunobiologiczne w diagnostyce wlosnicy u ludzi i zwierzat.// Med. dosw. Microbiol.- 1968.- 20.- 2.- P. 213-218.

120. Gortner L., Falkennhagen IL, Keller P. Fluoresczennz serologische Un-tersuhungen zum Nachweis von Trichinella spiralis.// Arch. exp. Veteri-narmed.- 1976.- 30.- 2.- P. 227-238.

121. Husmann K., Kauer E. Laboratory diagnosis of trichinosis. Results and experiences in the 1967 epidemic at Diez.// Off. Gesundhwesen.- 1970.32.- 9.- P. 482-488.

122. Jezioranska A., Kicinska H. Odczyny immunologiczne w przebiegu epi-demii wlosnicy w Rydgoszczy w r.// Wiadom. parazytol.- 1957.- 4.- 5-6.-P. 389-390.

123. Jezyna C., Tomaszko H., Zaborowska - Sulkowska A. Zachowanie sie odczynu wiazania dopelniacza, obczynu precypitacji pierecienniowej oraz odczynu mikroprecypitacji u 74 chrych z wlosnica. //Wiadom. parazytol.-1967.-13.- 2-3.- P. 237-241.

124. Jezyna C., Zaborowska - Sulkowska A., Tomaszko H. Dynamika obczynu wiazania dopelniacza w przebiegu wlosnicy u 128 chorych. //Wiadom. parazytol.- 1967.-13.- 1.- P. 81-86.

125. Isenstain R.S., Marks H.M., Webet D.W. Development of an enzyme ummunoassay for surveitllance of trichinellosis in swine //Trichinellosis: Proceedings.- 1985.- P. 240-245.

126. Kagan I.G. Kagan Trichinosis: areview of biologic, serologic and immunologic aspects.//J. Infect. Diseases.- 1960.- 107.- 1.- P. 65-93.

127. Kagan I.G. Advanse in the immunodiagnosis of parasitic infection.// Z. Parasitenk.- 1974.- 45.- 2.- P. 163-195.Kagan I.G. Serodiagnosis of trichinosis.// Immunol. Parasit. Infect.- 1976,- P. 143-151.

128. Kampelmacher E.H., Streefkerk E.W. Experiments a latexslide test for serodiagnosis of trichinosis. (Proliminary report). // Wiad. Parazytol.- 1965.11.- 4.- P. 317-326.

129. Kampelmacher E.H., Ruitenberg E.J.,Berkvens J. Onderzoekingen naar het voorkomen van Trichinella spiralis bij. de mens in Nederland.// Nederl. tiodschr. geneeskunde.- 1966.- 110.- P. 1927-1929.

130. Kampelmacher E.H., Streefkerk C.W. Experiments with a latex-slide test for the serodiagnosis of Trichinellosis. // Proceeding of the First International Congress of Parasitology (Roma, 21-26 September 1964).- Milano.-1966.- 2.- P. 694.

131. Karmannska K. Immunofluorescencja i jej zastosowanie w parazytologii, ze szezegolnum uwzglednieniem toksoplazmozy i wlosnicy. // Wiadom. parazytol.- 1965.- 11.- 5.- P.433-442.

132. Kassur B., Woloszczuk I. Use of serologic tests in the diagnosis of trichinellosis.// Wiad. Parazytol.-1970.- 16.- 1.- P. 38.

133. Kociecka W., Van Knapen F. Experimental Trichinella spiralis and T. pseudospiralis in monkeys.// Forth Inter. Congr. Parasitol.- Warsawa.-1978.- Short commun. Sec. C.T-CU. s.l.- 1978.- P. 147.

134. Kozar M., Kozar Z., Karmanska K. The comparative ovaluation of agglutination tests in the diagnosis of trichinellosis. //Wiad. Parazytol.- 1964.10.- 6.- P. 717-737.

135. Kozar Z. Investigations on Trichinellosis with Special Reference to Epidemiology and Epizootology, Immunodiagnosis, Host-Parasite Relationschips, Clinical and Therapeutic Aspects. Spec. ed. Wroclaw.- 1967.

136. Kozar Z., Kozar M. Dinamics and persistence of antibodies in trichinellosis.//Wiad. Parazytol.-1968.-14.- 2.- P. 171-185.

137. Kozar Z., Kozar M. Indirect fluorescent antibody test in diagnosis of trichinellosis.// Wiad. Parasitol.-1969.- P. 141-145.

138. Kozar Z., Kozar M. Inderect fluorescent antibody test in diagnosis of trichinellosis.// Wiad. Parasitol.-1970.-16.- 1.- P. 7-13.

139. Lupasco G., Hacig A., Solomon P. Etude sur la dynamique des anticorps dans la trichinellose experimentale par methode de 1,immunofluorescence.// Arch. roum. pathol. exp. et microbiol.- 1968.- 27.- 3.- P. 611-618.

140. Lupasco G., Solomon P., Tintareanu J. Studies on the persistence of immunologie response in persons from foci of trichinellosis.// Third. Intern. Conf. on Trichinellosis, November 2-4.-1972.- Miami Beach.- P. 88-89.

141. Matow K.P. О целесообразности исследования на трихинеллез пищевода вместо ножек диафрагмы свиных туш.// Ветеринария.- 1960.9.- С. 77-79.

142. Melcher L.R. an antigenic analysis of Trichinella spiralis.// J. Infect. Dis.- 1943.- 73.- 1.- P. 31-39.

143. Moore L.L.A. Studies in nise on the immunogenicity of cuticular antigens from larvae Trichinella spiralis.//J. Elisha Mitchell Scient. Sos.- 1965.81.- 2.- P.137-143.

144. Moore L.L.A. Studies on the acquired immunity of white mice to somatic and cuticular antigens of Trichinella spiralis.// Diss. Abstr.- 1966.26.- 7.- 4132 p.

145. Muraschi T.F., Bloomfield N., Newman R.B. Trichinosis, Slid Latex Test. "An Annual Report of the New York State Department of Health, Division of Laboratories and Research".- I960.- Albany, N.Y. State Department of Health.- P. 100. Murraschi T.F., Bloomfield N., Newman R.B. A slid latex-particle agglutization test for trichinosis.// Amer. J. Clin. Pathol.-1962.- 37.- 2.- P. 227-231.

146. Murreil K.D., Andersan M., Sehad Ph., Hanbury B.C., Kazacos V., Gamble H., Brown D. Field evaluation of the enzymelinked immunosorbent assay for swine trichinosis. Efficacy of the excretory-secretory antigen.// Amer. J. Vet. Res.- 1986.- 47.- 5.- P. 1046-1049.

147. Neumann G. Die Sérodiagnostic der Trichinellose.// Angew. Parasitologic.- 1965.- 5.-1.- P. 60-67.

148. Naumann G., Wildfuhr G. Die Bedeutung der Immunofluoreszenz fur die Serodiagnose von Infektions-krankheiten. //Munchener med. Wochennschr.-1965.-107.- 28.- P. 1384-1386.

149. Niu B.H., Pan G.W., He W., Pou L.Q. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in trichinellosis of pig.// Chinese J. of vet. science and technology.- 1985.- 2.- P. 3-7.

150. Novoselska I., Zhelco.I., Daskalova M. Studies on the sensitivity and specifity of a new antigen eluted from trichinella larvae.// 4-th Int. Symp. of the Helmintol. Just of the IAS, Kosice, 12-15, Oct. 1982. Abstract of Papers.- 1982.- P. 123.

151. Plonka W.S., Gancarz Z., Jedrzejewska B. Simple hemagglutination test in diagnosis of Trichinellosis in man. // Wiad. Parazytol.- 1974.- 20.- 1.-P. 89-93.

152. Rapic D. Immunoenzimaski test (ELISA) u diagnostici experimentale i prirodne trihinellose svinja.// Acta Parasitol. Yugosl.- 1980.- 11.- 1-2.-P. 49-57.

153. Rapic D., Dzakula N., Zukovic M. A study of crossreaction between trichinellosis and metastrongylosis in pigs by enzyme - linked immunosorbent assay (ELISA).// Vet. Arch.-1981.- 51.- P. 223-227.

154. Rapic D., Van Knapen F., Stoicevic D. Enzyme-linked immunosorbent asseay (ELISA) in detection of specific immunoglobulines in human trichinellosis.// Period biol.- 1986.- 88.- Suppl 1/A.- P. 417-418.

155. Roach T., Wakelin D., Else K., Dundy D. Antigenic cross - reactivity between the human Whipworm, Trichiris trichiura, aut the mouse trichuroids Trichuris muris and Trichinella spiralis. //Parasite Immunology.-1988.- 10.- P. 279-291.

156. Roth H. Employment of serological and skin tests at outbreaks of trichinosis in the Alingsas and Baras districts.// Acta med. scand.- 1946.-126.- 1.-P. 17-33.

157. Ruitenberg E.J., Kampelmacher E.H, Berkvens J. Die indirekte fluo-resziende Antikortechnik bei Serodiagnostik von mit Trichinen (Trichinella spiralis) infizierten Schweinen. // Fleischwirtschaft.- 1967.- 47.- 11.- P. 1220-1223.

158. Ruitenberg E.J., Kampelmacher E.H., Berkvens J. Indirect fluorescer-ende antilichaam-techniek voor de serodiagnostiek van trichinöse bio vark-ens.// Tijdschr. diergeneeskunde.- 1967.- 92.- 25.- P. 1769-1781.

159. Ruitenberg E.J., Kampelmacher E.H. Diagnostischhe Methoden zur Feststellung der Invasion mit Trichinella spiralis. // Fleischwirtschart.- 1970.-50.-1.- P. 42-44.

160. Ruitenberg E.J., Duyzings M., Kampelmacher E.H. Studies on the reliability of the fluorescent antibody techgue in the serodiagnosis of trichinosis.// Neth. I. Veter. Sei.- 1972.- 4.- 2.- P. 141-144.

161. Ruitenberg E.J., Van Knapen F. Enzymo-linked immunosorbent assay (ELISA) as a diagnostic metod for T.spiralis infections in pigs.// Vet. Para-sitol.- 1973.- 3(4).- P 317-326.

162. Ruitenberg E.J.,Steerenberg P.A., Brosi B.J.M., Buys J., Ljungstrom I., Engvall E. Application of ELISA for the serodiagnosis of T.spiralis infe c-tions in pigs under slaughterhouse conditions.// Proc. third Inter. Congr. of parasitol.- Munnchen.- 1974.- P. 1203-1204.

163. Ruitenberg E.J., Steerenberg P.A., Brosi B.J.M.,Buys J. Serodiagnosis of Trichinella spiralis infections in pigs by Enzyme-linked immunosorbent assay.// Bull. Wd. Heth. Org.- 1974.- 51.- 1.- P. 108-109.

164. Ruitenberg E.J., Steerennberg P.A., Brosi B.J.M., Buys J. Evalution of the reliability of immunoenzymatic techniques for the serodiagnosis in Trichinella spiralis infections.// Pro of the 1st Intor. symposium on immunoenzymatic techniques. Paris, 1975. - Amsterdam.- 1976.- P. 149166.

165. Ruitenberg E.J., Ljungstrom I., Steerenberg P.A., Buys J. Application of immunofluorescence and immunoensyme metods in the serodiagnosis of Trichinella spiralis infection. // Annals of the New York Academy of Sciences.- 1975.- 254.- P. 296-303.

166. Ruitenberg E.J., Steerenberg P.A., Brosi B.J.M., Buys J. ELISA as preventive and repressive control method for the detection of Trichinella spiralis infections in slaughter pigs. //Wiad. Parazytol.- 1975.- 21.- 4-5.- P. 747751.

167. Ruitenberg E.J., Steerenberg P.A., Brosi B.J.M., Buys J. Evalution of the reliability of immunoenzymatic technique for the serodiagnosis in Trichinella spiralis infections.// Inter. Symmposium on Immmunoenzymatic Techniques.-1975.- North Holland Publ. Company.- 2.- P. 149-166.

168. Ruitenberg E.J., Eteerenberg P.A., Brosi B.J.M., Buys J. Reliabilitty of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the serodiagnosis of T.spiralis infections in canventionally raised pigs.// Tijdschrijt Piergen-eeskunde.- 1976.- 101(2).- P. 57-70.

169. Ruitenberg E.J., Van Knapen F., Vermenler C.J. ELISA in Trichinella spiralis infection in pigs.// Proc. of the 4th Inter. Confer, on Trichinellosis. Poznan,1976.

170. Ruitenberg E.F., Van Knapen F. Enzyme-linked immunosorbent assay as a Diagnostic method for Trichinella spiralis infection in pigs.//Vet. parasi-tol.-1977.- 3.- 4.- PP. 317-326.

171. Ruitenberg E.J., Steerenberg P.A., Brosi B.J.M. Micro-sistem for the application of ELISA in the serodiagnosis of T. spiralis infection. // Medikon Nederland.-1978.- 3.- P. 30-31.

172. Ruitenberg E.J., Van Knapen F. Incidence and control of Trichinella spiralis throughout the world. //Food. Technol.- 1983.- 37.- 3.- P. 98-100.

173. Sadun E.H. Recent advances on the serological diagnosis of trichinello-sis.// Proc. of the 1th Inter. Confer, on Trichinellosis.- Warszawa.- 1962.- P. 266-274.

174. Sadun E.H. Seminar on immunityte parasitic helmintic infections.// Exp. Parasitol.- 1963.- 13.-1.- P. 72-82.

175. Seawright G.L., Zimmerman W.J., Isenstein R.A., Despommier D.D. Enzyme immunoassay for swine trichinellosis using antigens purified by immunoaffinity chromatography // Am. J. Trop. Med. Hyg.- 1983.- 32.-P. 1275-1284.

176. Shookhoff H., Brunnkrant W., Greenberg M. An outbreak of Trichinosis in New Jork city with special reference to the untradermal and precipitin tests. // Amer. J. Pub. Health.- 1946.- 36.- 12.- P. 1403-1411.

177. Simkuniene B.A., Biziulevicius S. Comperative evaluation of serological tests during experimental trichinellosis.//Wiad. parazytol.-1970.- 16.- 1.-P.36-37.

178. Smith H.J. Evalution of the ELISA for the serological diagnosis of trichinosis in Canadiann Swine.// Canadian J. of vet. Research.- 1987.-51(2).- P. 194-197.

179. Smith H.J., Snowdon K.E. Detection of T. spiralis nativa antibodies in parcine sera by ELISA using T.spiralis excretorysecretory antigen.// Canadian J. of vet. Research.-1987.- 51 (3).- P. 413-414.

180. Smith H.J., Snowdon K.E. Experimental trichinella infections in ponies.// Canadian J. of vet. Research.- 1987.- 51 (3).- P. 415-416.

181. Speiser F. Application of enzyme-linked immunosorbent Assay the sero-diagnosis of Filariasis and echinococcosis.//Tropenmed. and Parasitol.-1980.- 31.- 4.- P. 459-466.

182. Strobel H. Die Serodiagnostik der Trichinosis. //Munchener med. Wo-chennschr.-1911.- 58.-13.- P. 672-674.

183. Takahashi Y., Uno T., Mizuno N., Yamada S., Araki T. Ultrastructural localization of antigenic substances in Trichinella spiralis.// Parasit. Research.- 1989.- 75.- 4.- P. 316-324.

184. Takahashi Y., Uno T., Mizuno N., Suzuki H., Shimazu K., Araki T. Trichinella spiralis: the in situ localization of muscle larva antigens recognized by hymans.// Exp. Parasitol.- 1990.- 70.-1.- P. 107-110.

185. Taylor S.M., Kenni I., Mallon T. The micro - ELISA for antibodies to Trichinella spiralis: elemination of false positive reactions by antigen fractionation and technical impovement.// Zbl. Veterinarmed.- 1980.- 27.- 9.10.- P. 764-772.

186. Teuber J., Brehm H., Stumpt J. Zur diagnostik der Trichinellosen unter besonderer Berücksichtigung eines modifizierten immunofluoreszenztests.// Immun, und Intek.- 1979.- 7.- 6.- P. 213-221.

187. Van Knapenn F., Framstad , Ruitenberg E.J. Reliability of ELISA as control method for the detection of T.spiralis infection in naturnally infected slaughter pigs.//J. of parasit.-1976.- 62.- 2.- P. 332-333.

188. Van Knapen F., Franchimout J.H., Ruitenberg E.J. Comparision of the Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) with three oder methods for the detection of T.spiralis infection in pigs.// Vet. parasitol.- 1980.- 7(2).- P. 109-121.

189. Van Knapen F., Frachimout J.H., Ruitenberg E.J., Andre P., Baldelli B. Cojmparision of four methods for the early detection of T.spiralis infection in pigs.//Vet. parasitol.-1981.- 9.- P. 117-123.

190. Van Knapen F., Franchimont J.H., Ruitenberg E.J., Andre P., Baldelli B., Gibson T.E., Kohler G., Roneus O., Soule C., Strickland K.L., Tayor S.M., Thomsen D.U., Wolff F. Comparison of three methods for detection of prolonged txperimental trichinellosis in pigs // Ven. Parasitol.- 1984.16.- p. 167-171.

191. Van Knapen F., Franchimont J.H., Skovgaard N. Husbandry, parasitic and other diseases as factors in the reliability of the enzime-linked immuno-

sorbent assay (ELISA) for detection of trichinellosis in pigs // Vet. Parasi-tol.- 1984.- 16.- p. 17-22.

192. Voller A., Bidwell D.E/, Bartlett A. Enzyme-immunoassays in diagnostic medicine theory and practics // Bull.wid.Health.Org.-1976.-53.-p.55-65.

193. Wehesa P. A slide antigen in the indirect fluorescent antibody test for T.spiralis.// Immunol.-1971.- 21.- 5.- P. 805-808.

194. Who T.T. The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). // Bull. Wld. Hlth. Org.- 1976.- 54.- 2.- P. 129-139.

195. Wodehouse R.P. Antigenic analisis and standartization of Trichinella extract bi gel diffusion.// Ann. Allergy.- 1956.- 14.- P. 121-138.

196. Zapart W., Adinajto A., Gancarz Z. The evalution of fractionated antigens of T.spiralis in complement fixation and ring precipitation tests.// Acta parasitol. polon.-1969.-16.-1-19.- P. 9-19.

197. Zapart W., Slusarski W. Attempts to Employ Hom-made Latex particles in the serodiagnosis of trichinellosis in experimental animols.// Acta parasitol. polon.- 1972.- 10.- P. 29.

198. Zhang J.A., Fu C.L. Requirements of an ELISA for diagnosis of trichi-niasis in swine.// Chinese J. of Vet. Science and Technology.- 1986.- 10.- P. 7-15.

СОГЛАСОВАНО: Зам. директора ВИГИС рессор

А.М.Сазанов

1998 г.

УТВЕРЖДАЮ: Заместитель руководителя департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства юдовольствия жой Федерации

В.В. Селиверстов СОМН*.9 1998 г.

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ РЕГЛАМЕНТ

на способ получения диагностического антигена трихинелл с помощью моноклональных антител

Разработано:

Лаборатория биохимии и биотехнологии с.н.с., к.б.н. В.В.Клименко н.с. Г.А. Козлова

Способ получения диагностического антигена трихинелл с помощью моноклональных антител включает следующие этапы:

1. Получение и культивирование гибридом, продуцирующих моно-клональные антитела к антигену с молекулярной массой 55 кД.

2. Очистка моноклональных антител.

3. Синтез афинного сорбента (ковалентное связывание моноклональных антител с активированным гелем).

4. Аффинная хроматография антигенной смеси белкового экстракта личинок трихинелл на сорбенте, содержащем в качестве лиганда монокло-нальные антитела.

1. Получение и культивирование гибридом, продуцирующих моно-клональные антитела.

Для иммунизации использовали 12 недельных мышей линии BALB/c, массой не менее 18-20г, применяя метод внутрибрюшинного введения антигена в сочетании с введением в хвостовую вену (Cianfriglia М.,1983).

Схема иммунизации состояла из нескольких этапов: антиген в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) вводили внутрибрю-шинно (100 мкг белка в 0,5мл на каждую мышь). Через семь дней проводили повторную иммунизацию и через неделю в течение трех дней вводили 75 мкг антигена внутрибрюшинно и 25 мкг - в хвостовую вену. Слияние клеток выполняли через день после последней иммунизации по методу Келлера и Мильштейна (Kohler G., Milstein С., 1975) в модификации Девидсона (Davidson R.L., Gerald P.S.,1976).

После проверки титра антител в сыворотке крови у иммунизированных мышей извлекали селезенку, из которой путем гомогенизации и трехкратной отмывки средой ДМЕМ выделяли лимфоциты.

Миеломные клетки (линия PAI-X.63 Ag8.653 - клон Р301) поддерживали на ростовой среде ДМЕМ с 1-5 % телячьей сывороткой. Для гибридизации использовали клетки в логарифмической фазе роста. Клетки миеломы смешивали с лимфоцитами в соотношении 1:3 и осаждали центрифугированием. К осадку добавляли полиэтиленгликоль (ПЭГ-3350) и среду ДМЕМ, после осаждения ресуспендировали в среду RPMI с 20% сыворотки и добавками гипоксантина, аминоптерина и тимидина и рассевали в 96-ти луночные планшеты из расчета 2x106 клеток в лунку.

Скрининг антител проводили методом твердофазного иммунофер-ментного анализа в РАР-системе (пероксидаза-антипероксидаза) по методу Стернбергера (Sternberger L.A. et al.,1970) с некоторыми модификациями

(Фаерман А.И.Д987). Положительными считали гибридомы, уровень ответа которых в ИФА в 5 и более раз превышал отрицательный контроль.

Клонирование проводили методом лимитирующих разведений, рассе-вая гибридные клетки в 96-ти луночные планшеты с питающим слоем из спленоцитов из расчета 1-2 клетки в лунку. Культуральные среды от клонов тестировали методом ИФА в РАР-системе.

Препаративные количества моноклональных антител получали in vitro в пластиковых сосудах (в атмосфере 5% СО2, температуре 37°С, 70%-ной влажности) и последующего выделения культуральных супернатантов, а также in vivo из асцитной жидкости, продуцируемой мышами BALB/c, предварительно обработанными иммунодепрессантом (пристаном), после интраперитонеального введения гибридных клеток.

При хранении в качестве криопротектора использовали сыворотку крупного рогатого скота, содержащую 10% ДМСО.

2. Очистка моноклональных антител.

Культуральная среда - это сложная смесь, в которой удельное содержание моноклональных антител незначительно, а основную массу белка представляют компоненты питательной среды (главным образом, фетальная телячья сыворотка).

При синтезе аффинного сорбента (см. следующий этап) балластные белки культуральной среды и другие вещества, имеющие аминогруппы, будут конкурировать с моноклональными антителами за активные группы геля и, заблокировав их, снизят ёмкость полученного сорбента. Поэтому моно-клональные антитела, прежде чем их использовать в качестве лиганда, подвергали предварительной очистке двумя способами:

а) сочетанием солевого осаждения и ионообменной хроматографии в её стандартных и высоко эффективных вариантах;

б) аффинной хроматографией на антигенном сорбенте, лигандом в котором служит антигенный препарат трихинелл, ковалентно связанный с гелем..

Согласно способу "а" к культуральной среде, содержащей монокло-нальные антитела, добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием, промывали тем же раствором и растворяли в 50-кратно меньшем объёме буферного раствора с рН 7,5, чем объем исходной культуральной среды.

Полученный раствор после диализа и центрифугирования подвергали ионнообменной хроматографии на колонке с DEAE-сефарозой CL-6B или с её аналогами, применяемыми в стандартной хроматографии. Для элюции применяли экспериментально подобранный солевой градиент. Контроль иммунологической активности фракций проводили методом диффузионной

преципитации e использованием в качестве антигена экстракта личинок трихинелл или препарата, частично очищенного на сефадексе Г-200.

Активные фракции объединяли в пул и после диализа рехроматогра-фировали на колонке "Mono Q" в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии FPLC шведской фирмы Pharmacia - LKB.

Иммунологически активные фракции, представляющие собой очищенные моноклональные антитела, объединяли в пул, содержание балластных белков в котором было в 50 раз меньше, чем в исходной культуральной среде.

Для очистки моноклональных антител по способу "б" (методом аффинной хроматографии) готовили сорбент, лигандом в котором служил антигенный препарат, частично очищенный на сефадексе Г-200, содержащий множество белков, в том числе и антигенный компонент, комплементарный моноклональным антителам (антиген с молекулярной массой 55 кД). Очищенные по способу "б" моноклональные антитела отличались более высокой степенью очистки, чем по способу "а", но ввиду низкой ёмкости сорбента выходы антител были очень малыми. Низкая ёмкость сорбента была обусловлена недостаточной чистотой лиганда (антигенного препарата). Повторными опытами с новыми порциями культуральной среды можно было наработать достаточное количество моноклональных антител, но их объёмы были значительными, т.е. они были сильно разбавленными, что создавало трудности при их использовании в качестве лиганда при синтезе антительного сорбента. Концентрирование же сильно разбавленных образцов чревато потерей значительной части моноклональных антител в результате их необратимой сорбции на полупроницаемых мембранах.

3. Синтез аффинного сорбента.

Очищенные моноклональные антитела ковалентно связывали с нерастворимым матриксом - CNBr активированной сефарозой 4В шведской фирмы "Pharmacia".

Нужную навеску геля суспендировали в 0.001 Н НС1 в течение 15 минут. 1 г активированной сефарозы после набухания даёт 3,5 мл геля. Набухший гель промывали на фильтре 0,001 Н НС1 из расчета 200 мл/г.

Раствор очищенных моноклональных антител в ОД М бикарбонатном буфере (рН 8,3) с добавлением 0,5 М NaCl (нельзя использовать буферы, содержащие аминогруппы) смешивали с промытым активированным гелем примерно в равных объемах. Количество белка в препарате моноклональных антител должно составить 5-10 мг на 1 мл геля. Ковалентное связывание лиганда (моноклональных антител) с гелем при комнатной температуре заканчивается через 2 часа при постоянном перемешивании реакционной смеси посредством покачивания или осторожного встряхивания. Во избежание раз-

рушения гранул геля нельзя использовать магнитную мешалку. После присоединения лиганда проводят блокирование оставшихся активных групп геля добавлением этаноламина, глицина или Триса в течение 2-х часов. Удаление избытка блокирующего агента и адсорбированного (не связавшегося кова-лентно) белка проводят поочередным промыванием растворами 0,1 М ацетатного (рН 4,0) и 0,1 М бикарбонатного (рН 8,3) буферов с добавлением 0,5 М №С1. Проводили 3-4 таких цикла. Полученный продукт представляет собой гранулированный гель, в котором лиганд (моноклональные антитела) связан прочной ковалентной связью. Этот гель хранится при 8° С с добавлением бактериостатика и может быть использован для проведения аффинной хроматографии сложной белковой смеси, содержащей в своем составе антигенный компонент, комплементарный моноклональным антителам.

4. Аффинная хроматография антигенной смеси белкового экстракта личинок трихинелл на сорбенте, содержащем в качестве лиганда моноклональные антитела.

Гель-сорбент, лигандом в котором служат моноклональные антитела, упаковывают в хроматографическую колонку, которую подключают к хрома-тографической системе БРЬС шведской фирмы "Р11агтас1а"( или к любой другой системе). Промывают колонку поочередно кислым (рН 4,0) и щелочным (рН 7,5-8,0) буферами, содержащими 0,5 М №С1 (3-4 цикла). Затем в колонку вводят хроматографируемый образец (белковый экстракт личинок трихинелл), в котором присутствует, как показано электрофорезом и имму-ноблоттингом, не менее 2-х десятков антигенных компонентов. При этом антигенный компонент с молекулярной массой 55 кД вступает с лигандом в сорбирующую связь, образуя прочный иммунный комплекс. Несорбируемые компоненты экстракта при пропускании через колонку щелочного буфера вымываются. После их удаления (нулевые показания оптической плотности на детекторе) на колонку подают кислый буфер (0,1 М ацетатный / 0,5 М №С1) с рН 2,8. При этом иммунный комплекс распадается, происходит десорбция антигена с молекулярной массой 55 кД, и он выходит из колонки. Собранные на колекторе соответственно пику на хроматографическом графике фракции подщелачивают до рН 7-8 добавлением предварительно подобранного объема 1М ЫаОН. Каждую фракцию анализируют на наличие антигенной активности методом иммуннодиффузии или иммуноферментным методом. Активные фракции объединяют в пул, используемый в качестве антигена в тест-системе для иммуноферментной диагностики трихинеллеза.

При отсутствии хроматографического оборудования очистку антигена можно проводить не в колонке, а в объеме. Экстракт трихинелл смешивают с афинным сорбентом в какой-либо ёмкости. Отмывают несорбируемые компоненты экстракта на фильтре. К гелю с сорбировавшимся антигеном добав-

ляют минимальный объем кислого буфера. Спустя несколько минут после перемешивания суспензию выливают на фильтр, вытекшую при этом жидкость подщелачивают до рН 7-8 и используют как очищенный диагностический антиген.

С.н.с., к.б.н. Клименко В.В. и^с-Л-сСа^^

Н.с. Козлова Г.А.