Эффективность препаратов, повышающих чувствительность тканей к инсулину, в профилактике и лечении экспериментального уратного нефролитиаза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.06, кандидат наук Перфильев, Вячеслав Юрьевич

• Перфильев, Вячеслав Юрьевич
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Перфильев, Вячеслав Юрьевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.............................................................4

Глава 1. УСЛОВИЯ РАЗВИТИЯ УРАТНОГО НЕФРОЛИТИАЗА И ПОДХОДЫ К ЕГО КОРРЕКЦИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)...........................11

1.1. Патофизиологические факторы, способствующие развитию уратного нефролитиаза.........................................................................................................11

1.2. Инсулинорезистентность как фактор развития уратного нефролитиаза. 14

1.3. Биохимические аспекты развития инсулинорезистентности....................16

1.4. Патофизиологическая роль инсулинорезистентности...............................20

1.5. Современные методы лечения уратного нефролитиаза.............................24

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ................................30

2.1. Экспериментальные животные.....................................................................30

2.2. Моделирование уратного нефролитиаза......................................................31

2.3. Лекарственные средства и обоснование их использования......................33

2.4. Методы биохимических исследований........................................................35

2.5. Гистологическое исследование.....................................................................46

2.6. Методы статистической обработки..............................................................47

Глава 3. МОДЕЛИРОВАНИЕ УРАТНОГО НЕФРОЛИТИАЗА У КРЫС......48

Глава 4. ВЛИЯНИЕ МЕТФОРМИНА НА ТЕЧЕНИЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО УРАТНОГО НЕФРОЛИТИАЗА У КРЫС........64

4.1. РЕЖИМ «ПРОФИЛАКТИКА».....................................................................64

4.2. РЕЖИМ «ЛЕЧЕНИЕ»....................................................................................72

Глава 5. ВЛИЯНИЕ ДАПАГЛИФЛОЗИНА НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО УРАТНОГО НЕФРОЛИТИАЗА У КРЫС........78

5.1. РЕЖИМ «ПРОФИЛАКТИКА».....................................................................78

5.2. РЕЖИМ «ЛЕЧЕНИЕ»....................................................................................86

Глава 6. ВЛИЯНИЕ ПИОГЛИТАЗОНА НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО УРАТНОГО НЕФРОЛИТИАЗА У КРЫС........92

6.1. РЕЖИМ «ПРОФИЛАКТИКА».....................................................................92

6.2. РЕЖИМ «ЛЕЧЕНИЕ»..................................................................................100

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................106

ВЫВОДЫ.............................................................................................................117

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................................................119

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................121

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эффективность препаратов, повышающих чувствительность тканей к инсулину, в профилактике и лечении экспериментального уратного нефролитиаза»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Уратный нефролитиаз - патологический процесс, возникающий вследствие нарушения пуринового обмена, приводящего к гиперурикемии и гиперурикозурии, и сопровождающийся отложением в почках кристаллов мочевой кислоты (МК). В последние десятилетия распространение уратного нефролитиаза в развитых странах значительно возросло. Частота возникновения мочекислых камней составляет в среднем 7-10% от общего количества конкрементов, образующихся в почках [12, 125, 158]. При этом в лечении таких больных зачастую приходится использовать хирургические методы либо ударно-волновую литотрипсию, что требует госпитализации и длительного периода реабилитации [7]. В то же время, химическая природа уратных конкрементов такова, что под воздействием определенных физико-химических факторов они могут полностью растворяться [76]. Фармакологическая модуляция таких факторов может способствовать эффективному и безопасному литолизу уратных камней, в связи с чем имеет высокую актуальность.

Сегодня не вызывает сомнений взаимосвязь уратного нефролитиаза с метаболическим синдромом (МС) [8, 42]. По статистике, частота развития уратного нефролитиаза у пациентов с МС достигает 21,9% против 4,1% без такового [94,250]. При этом известно, что наряду с изменениями в углеводном и липидном обменах, при МС отмечаются признаки нарушения метаболизма пуринов [110, 127, 200].

Изучение особенностей патогенеза МС позволили выявить чрезмерную ацидификацию мочи, обусловленную нарушением образования и почечного транспорта аммония [225, 230]. Результаты исследований показывают, что главную роль в повышении кислотности мочи играет снижение чувствительности почечных тканей к инсулину [251, 265]. Установлено, что инсулин, активируя собственные рецепторы в почечных канальцах, стимулирует активность

изоформы 3 №+/Н+ обменника, который обеспечивает перенос через мембрану КИ3 в просвет канальца [132].

При этом известно, что растворимость кристаллов МК напрямую зависит от рН среды, в которой они находятся. В крови, рН которой составляет 7,4, МК находится в растворимой форме. Уровень рН мочи может значительно изменяться. При значении рН 6,5 МК в моче, так же как и в крови, находится преимущественно в растворимой форме. Однако при снижении рН мочи до 5,5 МК становится в 20 раз менее растворимой, что даже в условиях нормальной экскреции МК значительно повышает вероятность ее кристаллизации и образования микролитов [76].

Таким образом, инсулин-зависимая ацидификация мочи при МС провоцирует формирование уратных камней. В то же время, существуют способы фармакологической модуляции чувствительности тканей к инсулину:

- повышение аффинности инсулиновых рецепторов к инсулину, изменения их конформации и стимуляции рецепторных и пострецепторных путей передачи сигнала [2, 34, 51];

- компенсаторное повышение восприимчивости инсулиновых рецепторов к инсулину на фоне снижения реабсорбции глюкозы в почках путем ингибирования натрий-глюкозного котранспортера 2 типа (SGLT-2) в эпителиоцитах канальцев [34, 61];

- повышение количества инсулиновых рецепторов на клеточной мембране путем активации ядерных рецепторов, активируемых пролифераторами пероксисом гамма (PPAR-y) [3, 11, 34].

Учитывая вышесказанное, мы предположили, что фармакологическая модуляция чувствительности тканей к инсулину при уратном нефролитиазе может способствовать ослаблению литогенных процессов.

Степень разработанности

В нескольких больших исследованиях, посвященных проблеме МС и уратного нефролитиаза, было установлено, что нефролитиаз значительно чаще выявляется у больных сахарным диабетом 2 типа (СД 2) в сравнении с

недиабетическими пациентами [246, 264]. В двух специально проведенных клинических обследованиях больных мочекаменной болезнью было показано, что среди пациентов с сопутствующим СД 2 уратные камни выявлялись у 33,9% и 35,7%, тогда как при его отсутствии эти цифры составляли 6,2% и 11,3% соответственно [119,259]. Кроме того, доказано, что повышенная резистентность к инсулину приводит к уменьшению секреции аммония, что ведет к снижению буферной емкости мочи и способствует ее ацидификации [129,169,184]. Однако исследования, посвященные применению препаратов, повышающих чувствительность тканей к инсулину, с целью коррекции уратного нефролитиаза, практически не проводились.

Цель исследования

Комплексная оценка эффективности ряда противодиабетических препаратов, повышающих чувствительность тканей к инсулину, в профилактике и лечении экспериментального уратного нефролитиаза.

Задачи исследования

1. Воспроизвести модель уратного нефролитиаза с учетом современных методических подходов и изучить возможную патогенетическую роль процессов свободно-радикального окисления в развитии экспериментального уратного нефролитиаза;

2. Изучить влияние метформина на концентрацию мочевой кислоты в крови и ее экскрецию с мочой, уровень рН мочи и активность в ней почечных ферментов, активность процессов свободнорадикального окисления, а также количество уратных микролитов в почках крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом.

3. Оценить влияние дапаглифлозина на концентрацию мочевой кислоты в крови и ее экскрецию с мочой, уровень рН мочи и активность в ней почечных ферментов, активность процессов свободнорадикального окисления, а также количество уратных микролитов в почках крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом.

4. Изучить влияние пиоглитазона на концентрацию мочевой кислоты в крови и ее экскрецию с мочой, уровень рН мочи и активность в ней почечных ферментов, активность процессов свободно-радикального окисления, а также количество уратных микролитов в почках крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом.

5. Сравнить эффективность профилактической и терапевтической модуляции чувствительности тканей к инсулину метформином, дапаглифлозином и пиоглитазоном при экспериментальном уратном нефролитиазе.

Научная новизна

Впервые продемонстрирована возможность эффективной коррекции уратного нефролитиаза путем фармакологической модуляции чувствительности тканей к инсулину.

Впервые установлено, что применение метформина, дапаглифлозина и пиоглитазона приводит к существенному ослаблению камнеобразования при экспериментальном уратном нефролитиазе.

Впервые установлено, что с целью коррекции уратного нефролитиаза в режиме профилактики наиболее эффективным является метформин, в режиме лечения - пиоглитазон. В обоих режимах введения максимальную эффективность среди изученных препаратов проявляет дапаглифлозин.

Впервые обнаружены ранее неизвестные особенности протекания уратного нефролитиаза в условиях повышения чувствительности тканей к инсулину.

Впервые определено новое показание к применению метформина, дапаглифлозина и пиоглитазона.

Теоретическая и практическая значимость работы

Получены данные прикладного характера о возможности эффективной коррекции уратного нефролитиаза при помощи фармакологической модуляции чувствительности тканей к инсулину.

Открыты новые фармакологические эффекты метформина, дапаглифлозина и пиоглитазона, которые в совокупности с их уже известными свойствами

позволяют рекомендовать назначение инсулин-модулирующей терапии при мочекаменной болезни, сочетающейся с метаболическим синдромом.

Результаты исследования расширяют и совершенствуют врачебный арсенал медикаментозного лечения мочекаменной болезни.

Методология и методы исследования

Согласно поставленным задачам были выбраны современные высокоинформативные методические подходы, имеющиеся в научно-исследовательских лабораториях ФГБОУ ВО АГМУ Минздрава России. В качестве объектов исследования использовались самцы крыс сток Вистар. Основные методы исследования: биохимические (определение МК и креатинина в суточной моче и плазме крови животных, определение в моче общего белка, активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ), N ацетил-Р^-глюкозаминидазы (НАГ), определение в крови и почечной ткани активности каталазы (КАТ), глутатионпероксидазы (ГПО), супероксиддисмутазы (СОД), концентрации восстановленного глутатиона (ВГ) и тиобарбитурат-реактивных продуктов (ТБРП), общей антиоксидантной активности (ОАА) и общей прооксидантной активности (ОПА)), морфологические (микроскопия срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, при четырехсоткратном увеличении) и морфометрические методы (подсчет количества уратных микролитов в просвете канальцев на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином при двухсоткратном увеличении).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Фармакологическая модуляция чувствительности тканей к инсулину путем длительного введения метформина, пиоглитазона и дапаглифлозина сопровождается существенным облегчением протекания экспериментального уратного нефролитиаза.

2. Применение пиоглитазона и метформина сопровождается тенденцией к ослаблению ацидификации мочи при сопутствующем уменьшении концентрации мочевой кислоты в крови и ее экскреции, ослаблении повреждающего фактора и оксидативного стресса в почках и снижении количества уратных микролитов.

3. Введение дапаглифлозина крысам с экспериментальным уратным нефролитиазом вызывает сдвиг рН мочи в кислую сторону, однако обусловливает снижение концентрации мочевой кислоты в плазме крови и ее экскреции с мочой, снижение активности процессов свободнорадикального окисления и количества уратных микролитов в почках.

4. Метформин оказывает наиболее благоприятное действие в условиях профилактики уратного нефролитиаза. Пиоглитазон проявляет максимальную активность в режиме лечения данной патологии. Дапаглифлозин превосходит описанные выше препараты по эффективности в отношении уратного нефролитиаза в обоих режимах применения лекарственных средств.

Степень достоверности и апробация результатов

Высокая степень достоверности полученных данных подтверждается достаточным объемом экспериментального материала, использованием современного оборудования и качественных реактивов, применением современных биохимических, морфологических и морфометрических методов и методологических подходов, соответствующих поставленным задачам. Выводы, сформулированные в диссертации, подтверждены лабораторными данными, анализом литературы, точностью статистической обработки полученных результатов.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях кафедры фармакологии Алтайского государственного медицинского университета (20142016), I Итоговой конференции Научного общества молодых ученых, инноваторов и студентов Алтайского государственного медицинского университета (Барнаул, 2016), ХУШ городской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь-Барнаулу» (Барнаул, 2016), Всероссийском молодежном форуме с международным участием «Неделя науки -2016» (Ставрополь, 2016), I Международной морфологической научно-практической конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Морфологические науки - фундаментальная основа практической медицины»,

посвященной памяти профессора М.Я. Субботина (Новосибирск, 2016), VII Международной научной конференции «Science4health 2016» (Москва, 2016).

Публикации

Результаты диссертации опубликованы в 9 научных работах, в том числе 6 -в изданиях из Перечня российских рецензируемых научных журналов, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертации на соискание ученой степени кандидата наук, утвержденного Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 рисунками и 15 таблицами, состоит из введения, шести глав (обзор литературы, материал и методы исследования, 4 главы с результатами), заключения и списка литературы, в котором приведено 275 источников, из которых 174 иностранных авторов.

Глава 1

УСЛОВИЯ РАЗВИТИЯ УРАТНОГО НЕФРОЛИТИАЗА И ПОДХОДЫ К ЕГО КОРРЕКЦИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Патофизиологические факторы, способствующие развитию

уратного нефролитиаза

Первым исследователем, описавшим МК (рисунок 1), является Karl Scheel. Произошло это в 1776 году, когда из конкремента, обнаруженного в мочевом пузыре, он выделил вещество с кислотными свойствами. Karl Scheel назвал его «литической кислотой». George Pearson и Antoine Fourcray позднее переименовали «литическую кислоту» в «мочевую», чтобы подчеркнуть наличие этого вещества в нормальной моче и его отсутствие в других камнях мочевого тракта [122].

Рисунок 1 - Мочевая кислота

У человека и других высших приматов МК - конечный продукт пуринового метаболизма в связи с отсутствием у них функционирующего печеночного пероксисомального энзима уриказы (уратоксидазы). Это обусловлено рядом мутаций гена, кодировавшего ее функциональную активность, произошедших в ходе эволюционного развития [258]. У большинства млекопитающих фермент

о

H н

уратоксидаза активен и обеспечивает конверсию плохо растворимой МК в хорошо растворимый аллантоин, который, в свою очередь, через аллантаиновую кислоту с помощью аллантоиназы и аллантоиказы деградирует до мочевины и гипоксантина [108]. Отсутствие активной уриказы у человека ведет к значительному повышению уровня солей МК, прежде всего мононатриевого урата, в плазме крови, что обеспечивает предрасположенность человека к развитию подагры и уратного нефролитиаза [139]. Концентрация мононатриевого урата в крови у человека находится в пределах от 2,5 до 7,0 мг/дл (147-420 мкмоль/л), в то время как у других млекопитающих этот показатель в 5-20 раз меньше [73, 122, 124, 149, 189, 260].

Существует несколько условий, определяющих развитие уратного нефролитиаза. Первое - наличие хотя бы одного или нескольких из следующих факторов: чрезмерно кислый рН мочи, гиперурикемия и гиперурикозурия, сниженный объем образующейся мочи. Второе - наличие ряда сопутствующих заболеваний и состояний, таких как подагра, СД 2, а также МС или его отдельные компоненты [36].

Неспецифическим и универсальным фактором, способствующим образованию всех типов почечных конкрементов, является низкий объем мочи [22, 79]. В связи с ограниченной растворимостью МК, повышение её концентрации при сниженном объеме мочи приводит к пересыщению МК и созданию условий, способствующих осаждению МК и мононатриевого урата [114, 227].

Следствием возрастания содержания урата в крови является увеличение его экскреции с мочой с развитием гиперурикозурии. Т. Yй и А. Gutman в своей работе показали строгую линейную зависимость между концентрацией МК в плазме крови и уратным нефролитиазом. У пациентов с уровнем МК в плазме ниже 7 мг/дл микролиты определялись лишь в 9,9% случаев, а при увеличении концентрации МК в плазме до 13 мг/дл и выше, конкременты определялись уже в

53% случаев [273]. Позже многие исследователи подтвердили эти результаты и пришли к выводу о том, что подагра является фактором повышенного риска образования почечных камней [12, 182, 217, 248].

Помимо подагры существуют другие состояния, которые сопровождаются увеличением экскреции МК с мочой. Среди них следует выделить генетический дефект фермента гипоксантин-гуанинфосфорибозил-трансферазы (синдром Леша-Нихана). Этот фермент предотвращает клеточное разрушение пуринов, а нарушение его активности приводит к развитию тяжелой гиперурикемии [73, 186, 213]. Некоторые наследственные заболевания также характеризуются гиперурикемией и могут сопровождаться развитием уратного нефролитиаза. Среди них болезнь Вильсона-Коновалова, Хартнапа, Гирке, синдромы Келли-Зигмиллера, Фанкони [78, 160, 206, 268]. Гиперурикемия может развиваться на фоне химиотерапии при миело- и лимфопролиферативных заболеваниях вследствие катаболизма опухолевых клеток, гемолитической и серповидно-клеточной анемии, полицитемии и псориаза в результате усиленного клеточного оборота [186, 213, 256]. Кроме того, гиперурикемия может быть следствием длительного применения ряда лекарственных препаратов, к которым относятся тиазидовые и петлевые диуретики, ингибиторы карбоангидразы, ряд нестероидных противовоспалительных препаратов, некоторые антибиотики, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, блокаторы ангиотензиновых рецепторов, статины, современные противовирусные средства [73, 123].

Не менее важным патогенетическим фактором, способствующим образованию уратных камней, является гиперурикозурия. При увеличении концентрации МК в первичной моче создаются хорошие условия для ее преципитации в почечном интерстиции с последующей кристаллизацией [73, 203].

К развитию гиперурикозурии могут приводить как генетические причины, так и воздействие приобретенных факторов. Врожденная гиперурикозурия

возникает вследствие нарушений почечного транспорта урата по причине мутаций почечных транспортеров МК [122, 186, 187, 221, 243]. Приобретенная гиперурикозурия может быть обусловлена богатой пуринами диетой и применением урикозурических лекарственных средств, таких как пиразинамид, пробеницид, бензбромарон, сульфинпиразон, фенилбутазон, ацетилсалициловая кислота в больших дозах, лозартан, фенофибрат, аторвастатин [115, 146, 186, 218, 226, 254].

Главным условием формирования уратных микролитов является ацидификация мочи. В крови, рН которой составляет 7,34-7,36, МК находится в ионизированном состоянии в форме растворимого мононатриевого урата. Попадая в условия чрезмерно кислой мочи (рН<5,5), МК становится в 20 раз менее растворимой, чем мононатриевый урат, что резко увеличивает преципитацию и способствует образованию конкрементов [40, 186, 191, 196, 206, 231]. К возникновению повышенной ацидификации мочи может привести нарушение буферной емкости мочи и повышение образования титруемых кислот [19, 180, 212, 231].

1.2. Инсулинорезистентность как фактор развития уратного нефролитиаза

МС включает в себя абдоминальное ожирение, снижение чувствительности периферических тканей к инсулину, повышение уровня инсулина в плазме крови, нарушение липидного и пуринового обмена, а также артериальную гипертензию (АГ) [15, 58]. При этом в основе большинства изменений, составляющих МС, лежит инсулинорезистентность (ИР) [55, 75, 98, 99, 220].

ИР - состояние, которое характеризуется потребностью инсулиночувствительных тканей в более высокой концентрации инсулина чем в норме для реализации его биологических эффектов. Это обусловливает нарастание гиперинсулинемии (ГИ) при ИР [38]. Физиологическая,

метаболическая, эндокринная и неэндокринная ИР может быть обусловлена как генетическими факторами, так и внешними причинами [26].

Феномен ИР изучен недостаточно глубоко. Разнообразие известных этиологических и патогенетических факторов ее развития подтверждает неоднозначность и сложность данного процесса. Порой невозможно достоверно установить, что явилось первопричиной - нозология, вызвавшая ИР, или ИР, послужившая триггером к возникновению заболевания.

В то же время, сегодня не вызывает сомнений связь ИР и других компонентов МС с уратным нефролитиазом [110, 127, 200]. Хотя уратные конкременты составляют лишь 7% от общего числа почечных камней, в различных группах людей этот процент существенно различается [260]. Так, среди пациентов с ожирением мочекислые микролиты составляют 63% от общего числа камнеобразователей [199]. Общая частота МС в РФ у пациентов с подагрой составляет в среднем 57% [94]. Т. Актап и соавт. показали, что уратные микролиты встречаются у 21,9% пациентов с МС и лишь у 4,1% лиц без такового [250]. В ряде исследований установлено, что частота образования уратных камней имеет прямую зависимость от увеличения массы тела или наличия СД 2 [186, 246, 259].

Долгое время исследователи не могли определить патогенетическую связь между уратным нефролитиазом и компонентами МС, однако в настоящее время такая взаимосвязь определена, и в первую очередь это характерно для ИР, СД 2 и абдоминального ожирения. Поиски общего патофизиологического звена в развитии этих состояний позволили выявить чрезмерную ацидификацию мочи, обусловленную нарушением образования и почечного транспорта аммония [225, 230]. Вероятно, основным метаболическим дефектом, обусловливающим нарушение аммониогенеза, является ИР [36]. Важно отметить, что на фоне ИР образование уратных камней далеко не всегда зависит от гиперурикемии. Более того, рядом авторов у пациентов с ИР было показано снижение клиренса МК, что

также указывает на главную роль ацидификации мочи [118, 223, 228, 263]. Хорошо известно, что инсулиновые рецепторы имеются в различных сегментах почки, включая эпителий почечного канальца [195]. Инсулин, активируя собственные рецепторы в эндотелии канальцев почек, стимулирует Na+ZH+обменник 3 типа (NHE3), который переносит аммоний в просвет почечного канальца [128, 174]. В условиях ИР в результате сниженной чувствительности инсулиновых рецепторов почечная экскреция аммония уменьшается [230]. Так что ИР, по-видимому, играет значимую роль в аммониогенезе в клетках почечных канальцев [184].

1.3. Биохимические аспекты развития инсулинорезистентности

В ходе эволюции, по мнению ряда авторов, одним из механизмов адаптации человека к изменениям внешних условий явилась предрасположенность к ИР. Она способствует поддержанию энергетического баланса и нормального функционирования всех органов и систем [247, 275]. Многие физиологические состояния, такие как пожилой возраст, беременность, ночной сон, гиподинамия предрасполагают к ИР [9, 46]. Регулярные физические нагрузки в сочетании с рациональной диетой также способствуют повышению чувствительности тканей к инсулину [142].

В развитии ИР важную роль играет наследственность, доказательством чего служит распространенность ИР в изолированных группах людей, где она может превышать 50% [164]. Наследуемая ИР обусловлена мутациями генов ряда важных белков и ферментов: субстрата инсулинового рецептора (IRS), гликогенсинтазы, гормончувствительной липазы, р3-адренорецепторов, фактора некроза опухолей (TNF-a), разобщающего протеина, а также молекулярными дефектами, приводящими к снижению плотности и активности внутриклеточного транспортера глюкозы GLUT-4 в мышечной ткани [18, 46]. ИР может быть

обусловлена дефектом инсулиновых рецепторов, синтез которых находится под контролем гена ^г [39]. Классическими примерами тяжелой наследуемой ИР являются лепречаунизм, синдром Рабсон-Менденхола, ИР типа А [57, 179]. Более чем 25% практически здоровых лиц без ожирения имеют ИР [220].

Установлено, что ожирение, главным образом абдоминальное, является основным патогенетическим звеном в развитии ИР. В жировой ткани образуются ТЫБ-а, лептин, интерлейкин-6 (1Ь-6), резистин, висфатин, неэстерифицированные жирные кислоты (НЭЖК), которые в свою очередь изменяют чувствительность тканей к инсулину, снижают экскрецию гормона адипонектина, повышающего чувствительность тканей к инсулину [6, 25, 120, 152, 163]. Известно также, что гормоны и биологически активные пептиды, синтезируемые адипоцитами, могут ухудшать передачу инсулинового сигнала и вызывать ИР уже на ранних этапах развития сахарного диабета [177]. Кроме того, в развитии ИР важную роль играют морфофункциональные особенности сальникового и брыжеечного жира [56]. Абдоминальные жировые клетки имеют высокую плотность кортикостероидных, андрогенных и бета-адренорецепторов и относительно низкое количество а-адренорецепторов и инсулиновых рецепторов [18]. Это обеспечивает интенсивный липолиз и обильный выход НЭЖК, которые по воротной вене поступают в печень для синтеза триглицеридов и глюконеогенеза. В результате глюконеогенеза уровень глюкозы в крови увеличивается, что приводит к развитию ГИ и ИР тканей [60, 219]. Повышенный уровень циркулирующих НЭЖК в плазме обеспечивает прямую стимуляцию Р-клеток поджелудочной железы, что также способствует развитию ГИ. Кроме того, НЭЖК снижают деградацию инсулина в печени, уменьшают транспорт глюкозы в клетку, ее фосфорилирование и гликолиз, что также может способствовать развитию ИР и определяется термином «липотоксичность» [67, 193]. Считается, что окружность талии, которая косвенно отражает количество висцеральной жировой ткани, может служить маркером ИР и ГИ [93, 167]

Главные изменения, приводящие к развитию ИР, развиваются на пострецепторном уровне передачи инсулинового сигнала [26]. Существует мнение, что у больных с нарушенной толерантностью к глюкозе и начальными проявлениями СД 2 ИР рассматривается как феномен «токсического действия глюкозы», который выражается в уменьшении транслокации GLUT-4 преимущественно в мышечных клетках [270]. По мере нарастания гликемии и выраженности ИР начинает преобладать пострецепторный дефект, который выражается, прежде всего, в нарушении активности инсулинзависимой гликогенсинтазы и снижении синтеза гликогена [57, 130].

В норме инсулин связывается со специфическими рецепторами на клеточных мембранах большинства тканей. Как известно, инсулиновый рецептор состоит из двух димеров. Каждый димер имеет альфа-субъединицу, которая полностью расположена снаружи мембраны, и трансмембранную бета-субъединицу, которая в своем составе имеет тирозинкиназу. Инсулин, связываясь с альфа-субъединицей, вызывает активацию тирозинкиназы, которая фосфорилирует субстраты инсулинового рецептора. После присоединения фосфата к тирозиновым остаткам IRS активируют другие киназы, которые продолжают цепь фосфорилирования [44].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Перфильев, Вячеслав Юрьевич, 2017 год

Е - Е

КАТ (%) = -^ х 100

Ек

где: Ео - оптическая плотность опытной пробы;

Ек - оптическая плотность контрольной пробы. 2.4.11. Определение активности супероксиддисмутазы СОД - цитозольный фермент, состоящий из двух субъединиц. Она играет важную роль в обезвреживании супероксидного радикала в реакции дисмутации, превращая его в Н202 и кислород. Метод основан на подавлении СОД синтеза нитроформазана - окрашенного продукта окисления нитротетразолия синего супероксид-анионрадикалом [95].

Перед исследованием за 12 часов готовили инкубационную смесь: 37 мг ЭДТА-Ыа, 330 мг нитротетразолия синего и 55 мг феназинметасульфата доводили до 300 мл 0,15 М фосфатным буфером рН 7,8.

Для определения активности СОД в тканях почек в опытную пробирку вносили 1 мл гомогената почки в разведении 1:10 (0,1 мл гомогената почки + 0,9 мл дистиллированной воды), а для определения активности СОД в крови - 1 мл гемолизата в разведении 1:10 (0,1 мл отмытых эритроцитов + 0,9 мл дистиллированной воды). Для коагуляции гемоглобина во все опытные образцы добавляли 0,25 мл хлороформа и 0,5 мл абсолютного спирта. В качестве адсорбента для осажденного гемоглобина использовали КН2Р04, который вносили в пробы по 300 мг. После перемешивания смесь центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 минут. Затем в чистые пробирки вносили по 1,5 мл инкубационной смеси и 0,05 мл 0,15% раствора НАДН в ТРИС-ЭДТА буфере (рН 8,0) и добавляли 0,1 мл супернатанта в опытную пробу и 0,1 мл дистиллированной воды в контрольную. Пробы инкубировали 10 минут при комнатной температуре, а затем измеряли оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 540 нм против дистиллированной воды.

Активность СОД определяли по формуле

Б - Б СОД (%) = -^ х 100

Б

где: Ео - оптическая плотность опытной пробы;

Ек - оптическая плотность контрольной пробы. 2.4.12. Определение активности глутатионпероксидазы ГПО катализирует реакцию восстановления глутатионом нестойких органических гидропероксидов в стабильные оксикислоты. Подобно каталазе ГПО способна утилизировать пероксид водорода [66].

Принцип метода определения активности ГПО заключается в утилизации восстановленного глутатиона при инкубации гемолизата с гидроперекисью трет-

бутила. Для осуществления ферментативной реакции в опытную и контрольную пробирки вносили по 0,2 мл гемолизата (0,05 мл отмытых эритроцитов + 10 мл холодной дистиллированной воды), 0,73 мл сложного 0,1 М ТРИС-НС1 буфера рН 8,5 (в 1 мл буфера содержится 0,1 мг ЭДТА, 0,78 мг NaN3 и 1 мг восстановленного глутатиона). Полученную смесь инкубировали в течение 10 минут при 37оС. Реакцию запускали внесением в опытную пробу 70 мкл раствора гидроперекиси трет-бутила, приготовленного разведением 70% препарата в дистиллированной воде в 500 раз. В контрольные пробы вместо раствора гидроперекиси трет-бутила вносили 70 мкл дистиллированной воды. После инкубации в течение 5 минут при 37оС реакцию останавливали внесением во все пробирки по 0,2 мл 20% раствора ТХУ. Пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут, супернатант использовали для определения количества восстановленного глутатиона аналогично методике, описанной выше. Расчет активности ГПО производили на основании разницы концентрации восстановленного глутатиона в опытной и контрольной пробах и выражали в мкмоль/(мин х г гемоглобина).

2.5. Гистологическое исследование

Материалом исследования служила почка крысы. Проводили поперечное рассечение центрально расположенных участков в области лоханки. В качестве фиксирующей жидкости использовали 10% раствор формалина. Спустя сутки материал подвергали обезвоживанию путем последовательного погружения в растворы этилового спирта возрастающей концентрации и заключали в парафин для приготовления гистологических срезов на санном микротоме МС-2 (Точмедприбор, Украина). Полученные срезы ткани толщиной 4-6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике, заключали в канадский бальзам и изучали с помощью светового микроскопа.

Производили количественный подсчет конкрементов в просвете канальцев почек с использованием программного пакета Axio Vision 4.7 (Carl Zeiss, Germany).

2.6. Методы статистической обработки

Для расчетов и статистической обработки использовались компьютерные программы Microsoft Office Excel 2003 (Microsoft Corporation, США) и Sigma-Stat 3.5 (Systat Software Inc., США). Для сравнения данных в двух группах использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Для сравнения трех групп между собой использовали ранговый анализ вариаций по Краскелу-Уоллису. Для проведения апостериорных попарных сравнений применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Данные представляли в виде медианы и интерквартильного размаха - Me (25%; 75%). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05 [24,74,86].

48

Глава 3

МОДЕЛИРОВАНИЕ УРАТНОГО НЕФРОЛИТИАЗА У КРЫС

На рисунке 4 представлена динамика изменений концентрации урата в плазме крови крыс на фоне ежедневного введения ОК и МК. Из рисунка следует, что в этих условиях наблюдался последовательный рост описываемого показателя. Через 7 дней после начала введений содержание урата в плазме крови составило 0,9 (0,7; 1,4) мг/дл против 0,8 (0,6; 0,9) мг/дл у животных из контрольной группы (р = 0,358), через 14 дней этот показатель вырос до 1,7 (1,2; 2,0) мг/дл (р = 0,004), а к концу периода наблюдения установился на уровне 2,8 (1,8; 3,1) мг/дл (р = 0,003).

Наблюдавшиеся изменения привели к закономерному росту экскреции урата с мочой. На рисунке 5 представлена динамика выделения солей МК с мочой, из которого видно, что рост экскреции урата изменялся параллельно с увеличением его плазменной концентрации. Так, уже через 7 дней после начала введений выделение солей МК с мочой составило 19,9 (16,6; 24,0) мг/дл в сутки против 3,1 (2,5; 3,4) мг/дл у контрольных животных (р = 0,003). К концу второй недели этот показатель увеличился до 55,5 (43,5; 61,4) мг/дл (р = 0,003). После этого, величина выделения МК с мочой стабилизировалась, сохраняясь примерно на одном уровне, и к окончанию эксперимента составила 53,7 (21,5; 65,0) мг/дл (р = 0,014).

Следует отметить, что уже через сутки после начала введения ОК и МК наблюдалось существенное повышение диуреза у всех подопытных животных. Причем тенденция к увеличению мочеотделения сохранялась на протяжении всего эксперимента. При этом отмеченные изменения его уровня происходили параллельно с ростом СКФ, что, по-видимому, внесло вклад в обеспечение диуретической реакции. Так, СКФ в группе контроля составляла 1,4 (1,2; 1,7) мл/мин, к окончанию первой недели этот показатель вырос до 1,9 (1,4; 2,2) мл/мин, (р = 0,126), а через две недели скорость фильтрации у экспериментальных животных увеличилась до 2,8 (2,0; 3,0) мл/мин (р = 0,012 к контролю) и

сохранялась на этом уровне до окончания эксперимента: 2,8 (2,2; 3,1) мл/мин (р = 0,008 к контролю).

Одновременно по ходу эксперимента фиксировались признаки повреждения нефроцитов. Так, из рисунка 6, на котором отражена экскреция белка с мочой, видно, что уже к окончанию первой недели эксперимента этот показатель более чем в два раза превышал цифры контрольной группы: 2,3 (2,0; 2,7) мг против 0,9 (0,7; 1,1) мг (р = 0,003). К концу 2 недели эксперимента упомянутый показатель превосходил контрольные значения уже в три раза и составлял 3,1 (2,5; 4,1) мг (р = 0,003). Через 3 недели экскреция белка с мочой стабилизировалась и составляла 3,2 (2,2 3,4) мг (р = 0,032). Примечательно, что такая же динамика соответствовала выше отмеченным изменениям экскреции МК с мочой.

Факт развившегося уратного нефролитиаза подтвердился характером изменений активности в моче ряда ферментов, отражающих наличие почечного повреждения. Как видно из таблицы 4, активность ЛДГ была значительно повышена на протяжении всего опыта, достигнув максимальных показателей к концу 2-ой недели. Активность НАГ в моче повышалась по ходу эксперимента, достигнув статистически достоверного роста на 14 сутки наблюдения. Иная динамика характеризовала изменения активности в моче ГГТ - этот показатель несколько снижался, особенно на начальной стадии эксперимента.

Как видно из таблиц 5 и 6, в процессе моделирования уратного нефролитиаза происходили некоторые изменения показателей СРО. В почечной ткани (таблица 5) это было наиболее характерно для показателей антиоксидантных ферментов КАТ и ГПО. Так, активность КАТ на 7 сутки эксперимента снижалась на 71%, а ГПО - на 37% по сравнению с аналогичными значениями контрольной группы. В этот период времени также фиксировалась тенденция к снижению активности СОД на 21%, однако этот показатель статистической достоверности не достигал. Зарегистрированное уменьшение активности антиоксидантных ферментов закономерно обеспечивало выраженное снижение ОАА более чем в два раза по сравнению с показателем контрольной группы. Аналогичная динамика в этот период времени была характерна и для

показателя ОПА: на 7-е сутки эксперимента она была снижена в 1,4 раза. Концентрация ВГ в почках в конце первой недели по сравнению с показателями контрольной группы была выше на 32%. Уровень ТБРП в почечной ткани существенно не изменялся.

В целом сходная направленность изменений фиксировалась в этот период и в крови. Как видно из таблицы 6, в конце первой недели эксперимента обращает на себя внимание снижение активности ГПО и СОД в 1,3 и 1,7 раз соответственно по сравнению с таковыми показателями у контрольных животных. Активность КАТ также имела тенденцию к снижению. Существенное угнетение активности СОД и ГПО в эритроцитах крыс обеспечивало снижение ОАА по сравнению с контрольной группой на 21%. Уровень ВГ в эритроцитах на 7-е сутки эксперимента снижался в два раза. ОПА и концентрация ТБРП в этот период времени достоверно не изменялись.

С течением заболевания показатели СРО в крови крыс существенно изменялись. Как видно из таблицы 6, концентрация ТБРП в плазме постепенно нарастала: на 14-е сутки этот показатель установился на уровне контрольных значений, а к 21-м суткам превосходил их более чем в 2 раза. Показатель ОПА на второй неделе эксперимента имел тенденцию к увеличению, а на 21 сутки достигал контрольных значений, при этом статистической достоверности на протяжении всего эксперимента он не достигал. На этом фоне происходила активация СОД. Так, в конце второй недели эксперимента активность СОД была еще существенно сниженной, но затем динамика показателя коренным образом изменилась, был зарегистрирован значительный рост, и к 21-у дню он уже на 36% превосходил контрольные значения. Активность ГПО и КАТ с течением эксперимента не изменялись. Цифры ОАА на 14 сутки устанавливались на уровне, близком к контрольному, однако на 21 сутки эксперимента данный показатель значительно уменьшался. При измерении концентрации ВГ в крови крыс было установлено, что к окончанию второй недели опыта он достиг уровня контрольной группы и оставался неизменным до окончания эксперимента. Показатели СРО в почечной ткани изменялись в меньшей степени, и к окончанию

2-3 недель, преодолев падение первой недели, также стремились к контрольному уровню. Однако концентрация ВГ в почках экспериментальных животных к 14-м суткам эксперимента превосходила показатель контрольной группы в 1,7 раз, а к окончанию эксперимента в 1,4 раза. Лишь активность КАТ в почечной ткани оставалась сниженной на протяжении всего периода наблюдения.

Картина почечного повреждения, характерная для уратного нефролитиаза, подтвердилась в результате гистологического исследования.

Так, уже на 7 сутки моделирования уратного нефролитиаза в единичных расширенных почечных канальцах, эпителий которых выглядел уплощенным, а ядра клеток были уменьшены в размере, были зарегистрированы уратные микролиты (рисунок 7).

При морфологическом исследовании почек крыс к окончанию 2-ой недели эксперимента отмечались выраженные явления воспалительной инфильтрации в канальцах, с преобладанием нейтрофильных лейкоцитов. Отложения солей МК наблюдались в просветах значительно расширенных канальцев преимущественно в составе белковых цилиндров (рисунок 8).

На 21-й день эксперимента в просвете и в эпителии канальцев отмечали множественные уратные микролиты (рисунок 9 и 10). В областях их отложения была видна выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация и разрастание соединительной ткани, с формированием выраженного перитубулярного и периваскулярного нефросклероза.

Отметим, что клубочки на протяжении всего эксперимента не были подвержены морфологическим изменениям.

У животных контрольной группы микроскопическая картина почек соответствовала гистологической норме. Уратные депозиты выявлены не были (рисунок 11).

4 -

3 -

ш

п

го Ц

с ш

^ 2 ^

го с^ н х ш

г 1

о

Контрольная группа 1 неделя

2 неделя

3 неделя

0

Примечание - Точкой отмечена медиана, линиями обозначен интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). Звездочками (*) отмечены достоверные изменения (р<0,05) в сравнении с контрольной группой.

Рисунок 4 - Концентрация мочевой кислоты в плазме крови с экспериментальным уратным нефролитиазом

Контрольная группа 1 неделя

2 неделя

3 неделя

Примечание - Точкой отмечена медиана, линиями обозначен интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). Звездочками (*) отмечены достоверные изменения (р<0,05) в сравнении с контрольной группой.

Рисунок 5 - Экскреция мочевой кислоты с мочой крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом

5 -

4 -

1 -

-г

Контрольная группа 1 неделя 2 неделя 3 неделя

Примечание - Точкой отмечена медиана, линиями обозначен интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). Звездочками (*) отмечены достоверные изменения ф<0,05) в сравнении с контрольной группой.

3

2

0

Рисунок 6 - Экскреция белка с мочой крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом

Таблица 4 - Ферменты-маркеры почечного повреждения в моче крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом

Фермент, и/ммоль креатини на Контрольная группа 1 неделя 2 неделя 3 неделя

ЛДГ 0,4 (0,3; 0,4) 1,5 (1,1; 2,3) р = 0,006 3,1 (1,7; 5,0) р = 0,003 1,2 (0,6; 1,3) р = 0,043

НАГ 0,7 (0,7; 0,8) 1,0 (0,6; 1,1) р = 0,426 1,5 (1,2; 2,0) р = 0,003 1,7 (1,3; 2,0) р = 0,006

ГГТ 74,0 (54,5; 102,3) 27,6 (21,4; 59,3) р = 0,043 65,3 (60,1; 111,3) р = 0,854 42,0 (33,7; 87,9) р = 0,159

Примечание - р - уровень статистической достоверности в сравнении с контрольной группой (критерий Манна-Уитни).

Таблица 5 - Показатели свободно-радикального окисления в почках крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом

ТБРП, мкМ/г ОПА, % ОАА, % ВГ, ммоль/г Антиоксидантные ферменты

КАТ, % СОД, % ГПО, %

Контрольная группа 0,6 (0,4; 0,8) 8,0 (6,9; 8,5) 4,1 (3,3; 6,1) 1,9 (1,6; 2,1) 0,07 (0,03; 0,08) 1,4 (1,1; 2,2) 24,9 (20,4; 32,3)

1-я неделя 0,7 (0,5; 0,8) р = 0,773 5,6 (5,5; 5,7) р = 0,004 1,9 (1,6; 3,6) р = 0,043 2,5 (2,2; 3,0) р = 0,007 0,02 (0,003; 0,04) р = 0,012 1,1 (0,5; 1,7) р = 0,201 15,8 (15,4; 15,9) р = 0,004

2-я неделя 0,4 (0,3; 0,4) р = 0,131 8,2 (7,4; 9,0) р = 0,812 4,6 (3,7; 5,5) р = 0,937 3,2 (3,0; 3,3) р = 0,032 0,02 (0,01; 0,02) р = 0,047 2,2 (2,0; 2,4) р = 0,302 26,4 (22,8; 30,0) р = 0,937

3-я неделя 0,7 (0,4; 0,8) р = 0,911 8,1 (7,4; 9,6) р = 0,526 3,5 (2,8; 4,5) р = 0,351 2,7 (2,3; 2,9) р = 0,005 0,02 (0,01; 0,03) р = 0,010 1,9 (1,7; 2,8) р = 0,248 26,4 (23,1; 31,5) р = 0,682

■л

о

Примечание - р - уровень статистической достоверности в сравнении с контрольной группой (критерий Манна-Уитни).

Таблица 6 - Показатели свободно-радикального окисления в крови крыс с экспериментальным уратным

нефролитиазом

ТБРП, ОПА, % ОАА, % вг, Антиоксидантные ферменты

мкМ/г ммоль/г КАТ, % СОД, % ГПО, %

Контрольная группа 2,4 (0,7; 3,1) 34,6 (26,2; 44,4) 39,1 (36,2; 41,5) 0,4 (0,3; 0,5) 0,8 (0,7; 0,8) 5,0 (4,2; 6,6) 13,0 (10,7; 15,1)

1-я неделя 1,0 (0,9; 19,2) р = 0,934 39,5 (31,6; 51,9) р = 0,536 30,8 (26,3; 37,8) р = 0,015 0,2 (0,2; 0,2) р = 0,007 0,7 (0,6; 0,8) р = 0,536 3,0 (1,5; 5,9) р = 0,127 9,8 (9,0; 12,6) р = 0,029

2-я неделя 2,5 (2,4; 2,6) р = 0,873 73,3 (64,7; 81,8) р = 0,068 42,4 (41,5; 43,3) р = 0,177 0,4 (0,4; 0,4) р = 0,578 0,7 (0,6; 0,8) р = 0,937 2,6 (2,2; 3,0) р = 0,032 14,9 (14,7; 15,1) р = 0,302

3-я неделя 5,2 (4,9; 5,3) р <0,001 33,7 (28,8; 51,8) р = 0,970 32,5 (32,2; 35,1) р = 0,012 0,4 (0,3; 0,4) р = 0,794 0,7 (0,7; 0,7) р = 0,433 6,8 (6,1; 11,0) р = 0,023 13,3 (12,8; 13,6) р = 0,794

Примечание - р - уровень статистической достоверности в сравнении с контрольной группой (критерий Манна-Уитни).

Рисунок 7 - Уратный микролит в канальце почки крысы на 7-й день эксперимента

Примечание - Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 400.

Рисунок 8 - Уратный микролит и воспалительный инфильтрат в канальцах почки крысы на 14-й день эксперимента

Примечание - Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 200.

Рисунок 9 - Уратные микролиты в канальцах почки крысы на 21-й день эксперимента

Примечание - Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 400.

Рисунок 10 - Выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация и явления нефросклероза в ткани почки крысы на 21-й день эксперимента

Примечание - Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 400.

Рисунок 11 - Контрольная группа животных. Уратные депозиты не выявляются

Заключение по разделу

В результате трехнедельного моделирования уратного нефролитиаза получены функциональные, биохимические и морфологические данные, удостоверяющие факт развития уратного нефролитиаза в условиях длительного ингибирования активности уриказы у крыс. Наиболее отчетливыми признаками литогенеза стали: повышение концентрации МК в крови и ее экскреции с мочой, рост протеинурии, усиление активности ферментов-маркеров повреждения почечных тканей и отложение в почках многочисленных уратных микролитов. Таким образом, измерение и статистический анализ динамики указанных параметров нами определены в качестве оптимальной схемы последующей оценки эффективности фармакологической модуляции чувствительности тканей к инсулину для коррекции экспериментального уратного нефролитиаза.

64

Глава 4

ВЛИЯНИЕ МЕТФОРМИНА НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО УРАТНОГО НЕФРОЛИТИАЗА У КРЫС

4.1. РЕЖИМ «ПРОФИЛАКТИКА»

Из рисунков 12 и 13 видно, что длительное введение препарата в профилактическом режиме вызывало выраженное снижение плазменной концентрации МК: контрольная группа - 1,4 (1,2; 1,8) мг/дл, группа «Профилактика» - 1,1 (0,8; 1,2) мг/дл (р = 0,009). На этом фоне закономерно наблюдалось существенное снижение экскреции МК с мочой: контрольная группа - 31,5 (24,5; 33,6) мг, группа «Профилактика» - 19,5 (11,0; 22,9) мг (р = 0,002).

При изучении влияния метформина на функции почек у крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом (таблица 7), отмечалась тенденция к повышению СКФ у животных, получавших метформин в профилактическом режиме, по сравнению с показателями контрольной группы. Кроме того, было установлено, что длительное введение экспериментальным животным метформина приводило к существенному сдвигу рН мочи в щелочную сторону по сравнению с контрольными значениями (таблица 7).

Из той же таблицы видно, что положительное влияние метформина на почку также подтверждается выраженным снижением уровня ЛДГ в моче крыс из группы «Профилактика» более чем в 1,5 раза по сравнению с животными из контрольной группы. Активность ГГТ и НАГ в моче экспериментальных животных статистически значимо не изменялась.

Анализ влияния метформина на процессы СРО в крови крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом показал, что у животных, получавших препарат в профилактическом режиме, к 21-у дню эксперимента фиксировалось значительное снижение ОПА (таблица 8). Причем важно отметить, что это происходило не за счет активации определявшихся антиоксидантных ферментов, поскольку ОАА, как и активность КАТ, СОД и ГПО

к окончанию экспериментов достоверно не отличалась от таковой у контрольных животных. Концентрации ВГ и ТБРП в опытной группе также не отличались от показателей в группе контроля.

В таблице 9 представлена динамика СРО в почках крыс под влиянием курсового введения метформина. Из таблицы видно, что в этих условиях наблюдалось существенное повышение ОАА почечной ткани и концентрации ВГ. Причем, как видно из той же таблицы 9, сходно с тем, что наблюдалось в крови, обнаруженное нами повышение ОАА в почках под влиянием метформина, происходило не за счет стимуляции антиоксидантных ферментов, так как их активность не отличалась от показателей контрольных крыс. Значения ОПА и ТБРП также не отличались от таковых у контрольных животных.

При количественной оценке числа уратных микролитов в гистологических срезах почек положительное влияние профилактического введения метформина на течение экспериментального уратного нефролитиаза подтвердилось. Как видно из рисунка 14, в опытной группе наблюдалось значительное уменьшение количества мочекислых камней по сравнению с контрольной группой. У животных из группы контроля их число в просвете почечных канальцев составило 19,0 (11,8; 29,0), а в группе «Профилактика» этот показатель снизился до 3,5 (1,0; 6,0), р = 0,002.

с; Л

5

со

га ц

с ш

к

га ср

II

ф

I

о

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

Контрольная группа

Профилактика

Примечание - Точкой отмечена медиана, линиями обозначен интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). Знаком (*) отмечены достоверные изменения (р<0,05) в сравнении с контрольной группой.

Рисунок 12 - Концентрация мочевой кислоты в плазме крови крыс, получавших метформин в профилактическом режиме, на 21-е сутки эксперимента

к ^

^ 20

си ^

о

^ 15

О 15

10 -

Контрольная группа

Профилактика

5

Примечание - Точкой отмечена медиана, линиями обозначен интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). Знаком (*) отмечены достоверные изменения (р<0,05) в сравнении с контрольной группой.

Рисунок 13 - Экскреция мочевой кислоты с мочой крыс, получавших метформин в профилактическом режиме, на 21-е сутки эксперимента

Таблица 7 - Показатели функции почек у крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом при введении метформина в профилактическом и лечебном режимах

Группа п СКФ, мл/мин рН мочи, ед Активность ЛДГ, и/л

Контроль 14 18,3 (14,8; 21,5) 6,8 (6,5; 6,9) 1,6 (1,1; 2,3)

Профилактика 10 23,6 (20,9; 26,4) 7,9 (7,5; 8,2) 1,0 (0,7; 1,1)

Лечение 10 21,9 (17,0; 28,4) 7,0 (6,6; 7,4) 0,9 (0,7; 1,0)

Критерий Краскела-Уоллиса

Р 0,062 0,003 0,027

Критерий Манна-Уитни

р, «К» и «П» НД 0,002 0,038

р, «К» и «Л» НД 0,102 0,019

р, «П» и «Л» НД 0,030 0,624

Примечание - п - количество животных; р - уровень статистической достоверности. Здесь, как и в таблицах 8 и 9: «К» и «П» - контрольная группа по отношению к группе «Профилактика»; «К» и «Л» - контрольная группа по отношению к группе «Лечение»; «П» и «Л» - группа «Профилактика» по отношению к группе «Лечение»; НД - недостоверный результат.

Таблица 8 - Показатели свободно-радикального окисления в крови крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом при введении метформина в профилактическом и лечебном режимах

ТБРП, мкМ/г ОПА, % ОАА, % вг, ммоль/г Антиоксидантные ферменты

КАТ, % СОД, % ГПО, %

Контрольная группа 5,0 (4,8; 5,1) 67,2 (58,3; 76,8) 34,5 (30,9; 41,7) 0,2 (0,2; 0,3) 0,6 (0,6; 0,7) 18,0 (13,6; 22,9) 13,2 (12,2; 16,0)

Профилактика 5,7 (4,5; 6,4) 45,2 (39,7; 48,1) 32,9 (29,9; 34,7) 0,3 (0,3; 0,3) 0,7 (0,6; 0,7) 17,9 (13,0; 21,5) 13,5 (12,7; 14,8)

Лечение 4,5 (3,8; 5,1) 50,2 (49,7; 54,1) 34,8 (32,7; 37,2) 0,3 (0,3; 0,3) 0,7 (0,5; 0,7) 13,9 (12,7; 23,8) 14,0 (13,9; 14,9)

Критерий Краскела-Уоллиса

Р 0,111 0,004 0,432 0,028 0,930 0,877 0,252

Критерий Манна-Уитни

р, «К» и «П» НД 0,014 НД 0,062 НД НД НД

р, «К» и «Л» НД 0,048 НД 0,012 НД НД НД

р, «П» и «Л» НД 0,003 НД 0,596 НД НД НД

о

Таблица 9 - Показатели свободно-радикального окисления в почках крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом при введении метформина в профилактическом и лечебном режимах

ТБРП, мкМ/г ОПА, % ОАА, % ВГ, ммоль/г Антиоксидантные ферменты

КАТ, % СОД, % ГПО, %

Контрольная группа 0,3 (0,2; 0,3) 4,6 (4,4; 5,9) 2,3 (1,6; 2,8) 1,8 (1,4; 2,3) 0,03 (0,02; 0,04) 2,5 (1,9; 3,1) 14,2 (13,2; 19,6)

Профилактика 0,3 (0,2; 0,4) 5,1 (4,6; 5,5) 4,2 (3,4; 4,6) 2,5 (2,1; 3,2) 0,04 (0,03; 0,05) 3,0 (2,6; 3,3) 16,5 (15,0; 19,6)

Лечение 0,3 (0,2; 0,5) 5,0 (4,6; 5,4) 4,3 (3,6; 4,6) 2,6 (2,2; 2,8) 0,04 (0,02; 0,04) 2,7 (2,1; 3,2) 16,9 (14,6; 18,4)

Критерий Краскела-Уоллиса

Р 0,827 0,939 0,003 0,023 0,427 0,443 0,635

Критерий Манна-Уитни

р, «К» и «П» НД НД 0,004 0,030 НД НД НД

р, «К» и «Л» НД НД 0,004 0,019 НД НД НД

р, «П» и «Л» НД НД 0,894 0,962 НД НД НД

-о о

Примечание - Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 200.

Рисунок 14 - Морфологическая картина почки крысы, получавшей метформин в профилактическом режиме, на 21-й день эксперимента

4.2. РЕЖИМ «ЛЕЧЕНИЕ»

Как видно из рисунков 15 и 16, на фоне введения препарата в лечебном режиме наблюдалось значительное снижение плазменной концентрации МК: контрольная группа - 1,4 (1,2; 1,8) мг/дл, группа «Лечение» - 1,0 (0,7; 1,2) мг/дл (р = 0,013). Это закономерно обеспечило достоверное снижение экскреции МК с мочой в экспериментальной группе: контрольная группа - 31,5 (24,5; 33,6) мг, группа «Лечение» - 15,4 (14,5; 18,7) мг (р = 0,001).

Из таблицы 7 видно, что в группе животных, получавших метформин в режиме «Лечение» наблюдалось увеличение СКФ на 20% по сравнению с показателями контрольных животных. Кроме того, выяснилось, что применение метформина у животных с экспериментальным уратным нефролитиазом привело к сдвигу рН мочи в щелочную сторону на 3% в сравнении с контрольными значениями. Однако статистической достоверности оба показателя не достигали.

При анализе влияния метформина на почку также обращает на себя внимание выраженное снижение уровня ЛДГ, цитозольного фермента канальцевого эпителия, в моче крыс из группы «Лечение» на 47% по сравнению с контролем. Активность ГГТ и НАГ в моче существенно не изменялась.

Анализируя влияние введения метформина в лечебном режиме на процессы СРО в крови (таблица 8), нами было установлено, что, как и в случае профилактического применения препарата, у крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом происходило снижение ОПА. Кроме того, следует отметить, что, в отличие от группы «Профилактика», в группе «Лечение» фиксировалось статистически достоверное повышение концентрация ВГ. Однако, прочие изучаемые нами показатели СРО в группе «Лечение», так же как и в группе «Профилактика», достоверно не отличались от контрольных значений.

Из таблицы 9, в которой представлена динамика СРО в почках крыс под влиянием введения метформина в лечебном режиме, видно, что, как и в случае профилактического введения препарата у экспериментальной группы животных значительно повышалась ОАА и концентрация ВГ по сравнению с контрольными

крысами. Показатели активности изучаемых нами антиоксидантных ферментов не отличались от контрольных значений, что также указывает на неферментный генез повышения ОАА в почках.

Как видно из рисунка 17, на котором изображен гистологический срез почки крысы с экспериментальным уратным нефролитиазом, введение метформина в лечебном режиме позволило значительно уменьшить количество уратных микролитов. Если в контрольной группе количество мочекислых камней в просвете почечных канальцев составило 19,0 (11,8; 29,0), то в группе «Лечение» - 8,0 (5,5; 12,0), р = 0,044.

а 5 т га

Ц

с ш

к ^

га а н

I

ш

I

о

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

Контрольная группа

Лечение

Примечание - Точкой отмечена медиана, линиями обозначен интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). Знаком (*) отмечены достоверные изменения (р<0,05) в сравнении с контрольной группой.

Рисунок 15 - Концентрация мочевой кислоты в плазме крови крыс, получавших метформин в лечебном режиме, на 21-е сутки эксперимента

о т о

о

к ^

^ 20 ф

ср

^

о

^ 15

(О 15

Контрольная группа

Лечение

5

Примечание - Точкой отмечена медиана, линиями обозначен интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). Знаком (*) отмечены достоверные изменения (р<0,05) в сравнении с контрольной группой.

Рисунок 16 - Экскреция мочевой кислоты с мочой крыс, получавших метформин в лечебном режиме, на 21-е сутки эксперимента

Примечание - Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 200.

Рисунок 17 - Морфологическая картина почки крысы, получавшей метформин в лечебном режиме, на 21-й день эксперимента

Заключение по разделу

Применение метформина как в профилактическом, так и в лечебном режиме сопровождалось ослаблением литогенных процессов в почках. При этом в условиях профилактического применения наблюдался достоверный сдвиг рН мочи в щелочную сторону, что согласуется с предположениями о влиянии модуляции чувствительности почечных тканей к инсулину на кислотность мочи. Кроме того, в обоих режимах фиксировалось снижение уровня МК в плазме и моче, ослабление активности ЛДГ, уменьшение интенсивности процессов СРО в крови и почках. Все это закономерно результировалось в существенном снижении количества и размеров уратных конкрементов в почках подопытных животных.

Глава 5

ВЛИЯНИЕ ДАПАГЛИФЛОЗИНА НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО УРАТНОГО НЕФРОЛИТИАЗА У КРЫС

5.1. РЕЖИМ «ПРОФИЛАКТИКА»

На рисунке 18 представлено влияние длительного введения дапаглифлозина на содержание МК в плазме крыс. Из рисунка следует, что введение препарата к окончанию периода наблюдения приводило к значительному снижению концентрации урата в плазме животных по сравнению с контрольными значениями: контрольная группа 1,3 (1,1; 1,8) мг/дл, группа «Профилактика» - 0,8 (0,7; 1,0) мг/дл (р = 0,006). Как видно из рисунка 19, уменьшение концентрации МК в плазме повлекло за собой выраженное падение ее экскреции с мочой: контрольная группа 31,5 (24,5; 33,6) мг, группа «Профилактика» - 14,6 (9,1; 21,1) мг (р = 0,004).

Учитывая важность изменения рН в патогенезе уратного нефролитиаза, необходимо отметить, что применение дапаглифлозина в профилактическом режиме, как следует из таблицы 10, привело к некоторому сдвигу этого показателя в кислую сторону по сравнению с контрольными значениями на 10%.

В экспериментальной группе имелась тенденция к увеличению СКФ по сравнению с показателями контрольной группы (на 25%). Свидетельством благоприятного влияния дапаглифлозина на состояние почечного эпителия явилось представленное в таблице 10 существенное снижение уровня ЛДГ в моче крыс в группе «Профилактика» более чем в 2 раза по сравнению с контрольными значениями. Активность ГГТ и НАГ в моче существенно не изменялись.

При оценке СРО в крови опытных животных обращает на себя внимание уменьшение на 40% показателя ОПА плазмы в экспериментальной группе по сравнению с контрольными значениями (таблица 11). Кроме того, на 21-е сутки эксперимента фиксировался статистически достоверный рост концентрации ВГ в крови. На этом фоне концентрация ТБРП, ОАА и активность антиоксидантных

ферментов в группе животных, получавших дапаглифлозин в профилактическом режиме, не отличалась от контрольных значений.

При анализе показателей СРО в почках, которые отражены в таблице 12, обращает на себя внимание тенденция к увеличению ОАА и концентрации ВГ, а также к снижению ОПА в группе «Профилактика» по сравнению с группой контроля. Концентрация ТБРП в почечной ткани и активность антиоксидантных ферментов у животных, длительно получавших дапаглифлозин в профилактическом режиме, статистически достоверно не изменялись.

Из рисунка 20 видно, что по сравнению с контрольной группой у опытных животных наблюдается значительное уменьшение числа мочекислых камней. Если в контрольной группе количество микролитов в просвете почечных канальцев составило 19,0 (11,8; 29,0), то в группе «Профилактика» этот показатель снизился более чем в 7 раз, составив 2,5 (0,0; 8,0), р = 0,003.

л

о 5 т га

Ц

с ш

к ^

га а н

I

ш

I

о

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

Контрольная группа

Профилактика

Примечание - Точкой отмечена медиана, линиями обозначен интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). Знаком (*) отмечены достоверные изменения (р<0,05) в сравнении с контрольной группой.

Рисунок 18 - Концентрация мочевой кислоты в плазме крови крыс, получавших дапаглифлозин в профилактическом режиме, на 21-е сутки эксперимента

Контрольная группа

Профилактика

Примечание - Точкой отмечена медиана, линиями обозначен интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). Знаком (*) отмечены достоверные изменения (р<0,05) в сравнении с контрольной группой.

Рисунок 19 - Экскреция мочевой кислоты с мочой крыс, получавших дапаглифлозин в профилактическом режиме, на 21-е сутки эксперимента

Таблица 10 - Динамика биохимических показателей при длительном введении дапаглифлозина крысам с экспериментальным уратным нефролитиазом в профилактическом и лечебном режимах

Группа п СКФ, мл/мин рН мочи, ед Активность ЛДГ в моче, и/л

Контроль 14 18,3 (14,8; 20,9) 6,8 (6,5; 6,9) 1,4 (0,8; 2,1)

«Профилактика» 10 22,9 (19,8; 26,5) 6,1 (5,9; 6,2) 0,6 (0,4; 0,8)

«Лечение» 10 19,2 (13,1; 25,5) 5,9 (5,3; 6,6) 0,7 (0,7; 0,8)

Критерий Краскела-Уоллиса

Р 0,252 0,003 0,017

Критерий Манна-Уитни

р, «К» и «П» НД <0,001 0,013

р, «К» и «Л» НД 0,037 0,041

р, «П» и «Л» НД 0,732 0,407

Примечание - п - количество животных; р - уровень статистической достоверности. Здесь, как и в таблицах 11 и 12: «К» и «П» - контрольная группа по отношению к группе «Профилактика»; «К» и «Л» - контрольная группа по отношению к группе «Лечение»; «П» и «Л» - группа «Профилактика» по отношению к группе «Лечение», НД - недостоверный результат.

Таблица 11 - Показатели свободно-радикального окисления в крови крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом при введении дапаглифлозина в профилактическом и лечебном режимах

ТБРП, мкМ/г ОПА, % ОАА, % ВГ, ммоль/г Антиоксидантные ферменты

КАТ, % СОД, % ГПО, %

Контрольная группа 5,0 (4,8; 5,1) 69,8 (63,1; 75,4) 33,9 (31,0; 40,1) 0,3 (0,2; 0,3) 0,6 (0,6; 0,7) 18,0 (14,1; 22,7) 13,3 (12,3; 15,6)

Профилактика 3,8 (3,4; 6,4) 41,9 (38,2; 48,7) 37,7 (32,8; 44,5) 0,3 (0,3; 0,3) 0,7 (0,5; 0,9) 26,3 (21,6; 30,8) 15,2 (13,9; 19,1)

Лечение 8,1 (3,6; 27,4) 50,5 (41,5; 57,9) 37,2 (33,3; 39,1) 0,4 (0,4; 0,4) 0,8 (0,7; 0,9) 22,5 (17,5; 24,1) 15,4 (14,3; 15,8)

Критерий Краскела-Уоллиса

Р 0,228 0,003 0,758 < 0,001 0,081 0,074 0,375

Критерий Манна-Уитни

р, «К» и «П» НД 0,003 НД 0,019 НД НД НД

р, «К» и «Л» НД 0,011 НД < 0,001 НД НД НД

р, «П» и «Л» НД 0,230 НД 0,023 НД НД НД

00

Таблица 12 - Показатели свободно-радикального окисления в почках крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом при введении дапаглифлозина в профилактическом и лечебном режимах

ТБРП, мкМ/г ОПА, % ОАА, % вг, ммоль/г Антиоксидантные ферменты

КАТ, % СОД, % ГПО, %

Контрольная группа 0,3 (0,1; 0,3) 4,7 (4,4; 5,8) 2,3 (1,6; 2,8) 1,7 (1,3; 2,2) 0,02 (0,02; 0,04) 2,4 (1,9; 3,1) 15,4 (13,2; 19,6)

Профилактика 0,3 (0,1; 0,3) 4,3 (3,8; 4,8) 2,8 (2,3; 3,6) 2,1 (2,0; 2,3) 0,03 (0,03; 0,04) 2,4 (2,2; 2,8) 13,9 (12,2; 15,4)

Лечение 0,3 (0,1; 0,4) 5,6 (4,8; 6,3) 4,3 (3,9; 4,9) 2,4 (2,1; 2,7) 0,03 (0,02; 0,04) 3,4 (2,8; 3,8) 19,0 (16,3; 21,5)

Критерий Краскела-Уоллиса

р 0,874 0,026 0,001 0,027 0,338 0,040 0,038

Критерий Манна-Уитни

р, «К» и «П» НД 0,104 0,273 0,080 НД 0,974 0,223

р, «К» и «Л» НД 0,168 0,001 0,023 НД 0,070 0,177

р, «П» и «Л» НД 0,015 0,004 0,142 НД 0,009 0,011

00

Примечание - Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 200.

Рисунок 20 - Морфологическая картина почки крысы, получавшей дапаглифлозин в профилактическом режиме, на 21-й день эксперимента

5.2. РЕЖИМ «ЛЕЧЕНИЕ»

Как видно из рисунка 21, введение дапаглифлозина крысам с экспериментальным уратным нефролитиазом в лечебном режиме к 21-м суткам вызывает значительное снижение концентрации МК в плазме крови экспериментальных животных по сравнению с контрольными показателями: контрольная группа 1,3 (1,1; 1,8) мг/дл, группа «Лечение» - 0,7 (0,6; 0,8) мг/дл (р = 0,005). Как и ожидалось, это повлекло за собой выраженное уменьшение экскреции МК с мочой в группе животных, получавших дапаглифлозин в лечебном режиме до 8,2 (5,0; 13,0) мг по сравнению с контрольной группой, в которой этот показатель составлял 31,5 (24,5; 33,6) мг (р<0,001) (рисунок 22).

Из таблицы 10 видно, что, как и в группе «Профилактика», у животных с экспериментальным уратным нефролитиазом, получавших дапаглифлозин в лечебном режиме, наблюдался сдвиг рН мочи в кислую сторону на 13% по сравнению с показателем контрольной группы.

Однако, несмотря на это, аналогично профилактическому режиму в условиях введения животным дапаглифлозина в лечебном режиме были зафиксированы явные признаки облегчения течения уратного нефролитиаза. Как следует из той же таблицы, в группе «Лечение» имелась тенденция к увеличению скорости клубочковой фильтрации по сравнению с показателями контрольной группы. О благоприятном эффекте дапаглифлозина на состояние почечного эпителия также косвенно свидетельствует значительное снижение уровня ЛДГ в моче крыс в группе «Лечение» в 2 раза по сравнению с контрольными значениями. Активность ГГТ и НАГ в моче, также как и в группе «Профилактика», существенно не изменялись.

Изучение влияния дапаглифлозина на процессы СРО в крови крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом (таблица 11) показало, что у животных, получавших препарат в лечебном режиме, к 21-у дню эксперимента происходило значительное снижение ОПА по сравнению с группой контроля в 1,4 раза. Кроме того, из той же таблицы видно, что в экспериментальной группе на

этом фоне имело место повышение концентрации ВГ. Однако прочие показатели СРО в крови у животных, получавших дапаглифлозин в лечебном режиме, статистически достоверно не изменялись.

По-видимому, снижение ОПА и увеличение концентрации ВГ в плазме явились следствием повышения ОАА в почечной ткани, которая достигла статистической достоверности в группе «Лечение» (см. таблицу 12). Интересно, что на этом фоне отмечалось значительное повышение концентрации ВГ в почках без выраженного изменения активности антиоксидантных ферментов.

Как видно из рисунка 23, у животных, получавших дапаглифлозин в лечебном режиме, по сравнению с контрольной группой наблюдалось наиболее выраженное уменьшение числа мочекислых камней. Если в контрольной группе морфометрический показатель количества микролитов в просвете почечных канальцев равнялся 19,0 (11,8; 29,0), то в группе «Лечение» их количество значительно уменьшилось и составило 0,0 (0,0; 1,5), р <0,001.

с; Л

ф

5

со

га ц

с ш

к ^

га ср н

I

ф

I

о

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

Контрольная группа

Лечение

Примечание - Точкой отмечена медиана, линиями обозначен интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). Знаком (*) отмечены достоверные изменения (р <0,05) в сравнении с контрольной группой.

Рисунок 21 - Концентрация мочевой кислоты в плазме крови крыс, получавших дапаглифлозин в лечебном режиме, на 21-е сутки эксперимента

Контрольная группа

Лечение

Примечание - Точкой отмечена медиана, линиями обозначен интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). Знаком (*) отмечены достоверные изменения (р <0,05) в сравнении с контрольной группой.

Рисунок 22 - Экскреция мочевой кислоты с мочой крыс, получавших дапаглифлозин в лечебном режиме, на 21-е сутки эксперимента

\

Примечание - Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение 200.

Рисунок 23 - Морфологическая картина почки крысы, получавшей дапаглифлозин в лечебном режиме, на 21-й день эксперимента

Заключение по разделу

В результате проведенных экспериментов оказалось, что длительное применение дапаглифлозина в профилактическом и лечебном режимах существенно облегчает течение экспериментального уратного нефролитиаза. При этом, вопреки первоначальным предположениям, ацидификация мочи не уменьшалась, а увеличивалась. Однако, несмотря на это, количество уратных микролитов в почках многократно снижалось, что сопровождалось значительным уменьшением уровня МК в плазме крови и моче крыс, снижением активности ЛДГ в моче и угнетением процессов СРО в крови и почках. Это позволяет предположить, что антилитогенное действие дапаглифлозина реализуется не через стимуляцию инсулин-зависимого аммониогенеза, а иными путями.

Глава 6

ВЛИЯНИЕ ПИОГЛИТАЗОНА НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО

УРАТНОГО НЕФРОЛИТИАЗА У КРЫС

6.1. РЕЖИМ «ПРОФИЛАКТИКА»

На рисунке 24 представлена концентрация МК в плазме лабораторных животных с экспериментальным уратным нефролитиазом. Из рисунка следует, что длительное введение пиоглитазона в профилактическом режиме вызывает достоверное снижение концентрации МК в плазме: контрольная группа 1,3 (1,1; 1,5) мг/дл, группа «Профилактика» - 1,1 (0,9; 1,1) мг/дл (р = 0,007). Из рисунка 25 видно, что снижение МК в плазме крови повлекло за собой уменьшение экскреции МК с мочой: контрольная группа 25,5 (22,5; 34,9) мг, группа «Профилактика» - 7,3 (6,4; 9,0) мг (р <0,001).

Длительное применение пиоглитазона в профилактическом режиме у крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом, как видно из таблицы 13, привело к существенному сдвигу рН мочи в щелочную сторону по сравнению с контрольными значениями на 15%.

Кроме того, нами были зафиксированы явные признаки облегчения течения уратного нефролитиаза. Как видно из той же таблицы 13, на фоне профилактического режима введения пиоглитазона животным с экспериментальным уратным нефролитиазом фиксировался рост СКФ на 32% по сравнению с таковым показателем контрольной группы, который, однако, не достигал статистической достоверности. Косвенным свидетельством благоприятного влияния пиоглитазона на состояние почечного эпителия служит также тенденция к снижению уровня ЛДГ в моче крыс экспериментальной группы по сравнению с показателями группы контроля. Активность ГГТ и НАГ в моче существенно не изменялась.

Из таблицы 14 видно, что в результате проведенных экспериментов было зафиксировано значительное снижение ОПА плазмы животных, получавших

пиоглитазон в режиме «Профилактика» по сравнению с контрольными значениями. Концентрация ТБРП в плазме крови животных из опытной группы также была достоверно ниже таковой в контрольной группе в 1,3 раза. Данные изменения фиксировались на фоне значительного повышения общей антиоксидантной активности крови опытных животных по сравнению с контрольной группой. Однако из той же таблицы видно, что концентрация ВГ и активность антиоксидантных ферментов в крови экспериментальных животных достоверно не отличалась от таковых показателей в группе контроля.

При анализе процессов СРО в почках (таблица 15) обращает на себя внимание значительное увеличение ОАА почечной ткани в 2 раза по сравнению с контрольными показателями. Описанные изменения закономерно повлекли за собой достоверное повышение уровня ВГ в почках на 27% по сравнению с группой контроля. Интересно, что на этом фоне активность антиоксидантных ферментов в экспериментальной группе не отличалась от контрольных значений.

Благоприятное действие пиоглитазона на течение экспериментального нефролитиаза подтвердилось в результате количественного подсчета уратных микролитов в гистологических срезах почек. В опытной группе наблюдали значительное уменьшение числа мочекислых камней по сравнению с контрольной группой (рисунок 26). Так, в контрольной группе количество микролитов в просвете почечных канальцев составило 19,0 (11,8; 29,0), в группе «Профилактика» этот показатель снизился почти вдвое до 9,5 (6,0; 10,0) (р = 0,035).

л

о 5 т га

Ц

с ш

к ^

га а н

I

ш

I

о

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

Контрольная группа

Профилактика

Примечание - Точкой отмечена медиана, линиями обозначен интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). Знаком (*) отмечены достоверные изменения (р <0,05) в сравнении с контрольной группой.

Рисунок 24 - Концентрация мочевой кислоты в плазме крови крыс, получавших пиоглитазон в профилактическом режиме, на 21-е сутки эксперимента

Контрольная группа

Профилактика

Примечание - Точкой отмечена медиана, линиями обозначен интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). Знаком (*) отмечены достоверные изменения (р <0,05) в сравнении с контрольной группой.

Рисунок 25 - Экскреция мочевой кислоты с мочой крыс, получавших пиоглитазон в профилактическом режиме, на 21-е сутки эксперимента

Таблица 13 - Показатели содержания мочевой кислоты и функции почек у крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом при введении пиоглитазона в профилактическом и лечебном режимах

Группа п СКФ, мл/мин рН мочи, ед Активность ЛДГ в моче, и/л

Контроль 14 16,8 (14,4; 22,2) 6,8 (6,6; 7,4) 1,0 (0,6; 1,6)

Профилактика 10 22,2 (15,6; 26,5) 7,8 (7,5; 8,6) 1,1 (0,6; 1,5)

Лечение 10 23,7 (19,9; 31,3) 7,5 (7,2; 8,0) 1,1 (0,7; 1,2)

Критерий Краскела-Уоллиса

Р 0,034 0,011 0,915

Критерий Манна-Уитни

р, «К» и «П» 0,168 0,013 НД

р, «К» и «Л» 0,014 0,058 НД

р, «П» и «Л» 0,307 0,064 НД

Примечание - п - количество животных; р - уровень статистической достоверности. Здесь, как и в таблицах 14 и 15, «К» и «П» - контрольная группа по отношению к группе «Профилактика»; «К» и «Л» - контрольная группа по отношению к группе «Лечение»; «П» и «Л» - группа «Профилактика» по отношению к группе «Лечение»; НД - недостоверный результат.

Таблица 14 - Показатели свободно-радикального окисления в крови крыс с экспериментальным уратным нефролитиазом при введении пиоглитазона в профилактическом и лечебном режимах

ТБРП, мкМ/г ОПА, % ОАА, % вг, ммоль/г Антиоксидантные ферменты

КАТ, % СОД, % ГПО, %

Контрольная группа 9 4,9 ^(4,5; 5,1) 75,1 (66,4; 83,8) 33,7 (31,0; 41,6) 0,3 (0,2; 0,4) 0,6 (0,6; 0,7) 18,0 (12,5; 21,7) 13,4 (12,6; 14,7)

Профилактика 3,8 (3,4; 4,2) 42,0 (35,7; 45,4) 29,7 (28,9; 31,7) 0,4 (0,3; 0,5) 0,7 (0,6; 0,7) 16,9 (16,6; 17,9) 13,7 (13,5; 14,2)

Лечение 3,2 (3,0; 3,9) 52,2 (51,1; 53,7) 35,2 (33,6; 37,4) 0,4 (0,3; 0,5) 0,7 (0,6; 0,8) 16,5 (15,9; 17,4) 14,4 (14,0; 14,8)

Критерий Краскела-Уоллиса

Р <0,001 <0,001 0,004 0,032 0,414 0,790 0,158