Определение фосфорорганических нитроароматических инсектицидов с помощью респираторной активности микробных клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Гулий, Ольга Ивановна

• Гулий, Ольга Ивановна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гулий, Ольга Ивановна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Пестициды, свойства, применение и определение.

ГЛАВА 2. Метаболизм пестицидов микроорганизмами.

ГЛАВА 3. Биосенсорные системы для определения пестицидов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 4. Материалы и методы

ГЛАВА 5. Респираторная активность микробных клеток по отношению 63 к пара-нитрофенолу

5.1. Респираторная активность микробных клеток Pseudomonas putida 64 C-l 1 по отношению к пара-нитрофенолу

5.2.Респираторная активность микробных клеток Pseudomonas putida 79 БА-11 по отношению к пара-нитрофенолу

ГЛАВА 6. Иммобилизация микробных клеток Pseudomonas putida БА- 93 11, Pseudomonas putida C-l 1 и Acinetobacter calcoaceticum А-122.

6.1.Иммобилизация микробных клеток методом включения в 97 полимерный носитель

6.2.Иммобилизация клеток на поверхности носителя

6.3.Сравнение способов иммобилизации и условий хранения биокатализаторов

ГЛАВА 7. Определение фосфорорганических нитроароматических 130 инсетицидов метафоса и сумитиона с помощью респираторной активности микробных клеток Pseudomonas putida БА-11, Pseudomonas putida C-l 1 и Acinetobacter calcoaceticum А

ГЛАВА 8. Определение метафоса, сумитиона и пара-нитрофенола в 143 модельных образцах с помощью респираторной активности микробных клеток Pseudomonas putida БА-11, Pseudomonas putida C-l 1 и

Acinetobacter calcoaceticum A

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Определение фосфорорганических нитроароматических инсектицидов с помощью респираторной активности микробных клеток»

Проблемы охраны окружающей среды стимулируют разработку новых методов для количественного определения токсических соединений. Одно из перспективных направлений разработки аналитических приборов для детекции ксенобиотиков в водных экосистемах связано с созданием микробных биосенсоров [Семенчук с соавт., 2000]. Биосенсоры - это относительно новый класс миниатюрных аналитических устройств, в которых высокоспецифические биохимические реакции формируют аналитический сигнал, связанный с концентрацией определяемого компонента. Биосенсор как аналитический прибор состоит из чувствительного биологического элемента (целые организмы, ткани, клетки, органеллы, мембраны, ферменты, рецепторы, антитела, нуклеиновые кислоты) и системы детекции. Взаимодействие определяемого вещества и биологического элемента приводит к изменению физико-химических параметров системы, регистрация которых осуществляется специальным датчиком [Туманов, Коростылева, 1990]. Биосенсорные системы анализа характеризуются высокой чувствительностью, возможностью определять сложные органические соединения в многокомпонентных смесях, простотой и высокой скоростью анализа. В работе рассматриваются биосенсорные системы на основе кислородного электрода Кларка.

Исследования в области биосенсоров показали, что в качестве биологически чувствительного элемента в сенсорах целесообразно использовать микробные клетки. Это связано с тем, что многие гетеротрофные микроорганизмы способны использовать в качестве единственного источника углерода и энергии определенное органическое соединение. Различные виды микроорганизмов обладают ферментными системами, катализирующими деструкцию или трансформацию тех или иных соединений, в том числе и ксенобиотиков [Карасевич, 1982].

Интенсивная химизация сельского хозяйства приводит к ежегодному поступлению в биосферу различных химических веществ, в том числе и пестицидов. Органические соединения фосфора являются одной из важнейших 6 групп современных пестицидов [Мельников, 1995], к которым относятся такие инсектициды, как метафос и сумитион. В связи с этим существует необходимость контроля этих веществ и продуктов их гидролиза в объектах окружающей среды. На данный момент существуют сенсорные методы анализа фосфорорганических инсектицидов, основанные на ингибировании ацетил-холинэстеразной активности. В тоже время сведения о работах по созданию микробных сенсорных систем для определения фосфорорганических нитро-ароматических инсектицидов метафоса и сумитиона на основе респираторной активности микробных клеток в литературе отсутствуют.

Известны бактериальные культуры, способные использовать пара-нитрофенол в качестве единственного источника углерода и энергии. Такая особенность микроорганизмов обусловлена наличием в клетках ферментов системы подготовительного метаболизма, способствующих утилизации пара-нитрофенола путем окислительных реакций. Известно сходство в структурной формуле метафоса, сумитиона и пара-нитрофенола. С большой вероятностью можно допустить, что в случае сходных по химической структуре субстратов механизм действия оксигеназ будет одним и тем же [Карасевич, 1992]. В связи с этим можно предположить, что пути метаболизма метафоса, сумитиона и пара-нитрофенола будут близки. Поэтому проводилось определение метафоса и сумитиона с помощью респираторной активности микробных клеток, обладающих ферментами подготовительного метаболизма пара-нитрофенола.

Актуальность проблемы

Актуальность проблемы диссертационного исследования связана с широким применением в сельском хозяйстве нитроароматических фосфорорганических инсектицидов, таких как метафос и сумитион, обладающих широким спектром действия на большинство насекомых-вредителей и применимых в большинстве регионов России и стран СНГ. Одним из продуктов гидролиза нитроароматических фосфорорганических инсектицидов является пара-нитрофенол - высоко токсическое соединение, широко применяемое в химической промышленности. 7

Существует проблема определения пестицидов в различных объектах окружающей среды. В настоящее время для этого используются аналитические методы: газожидкостная хроматография, хроматография в тонком слое и др. Обладая рядом достоинств, данные методы анализа характеризуются сложностью исполнения, требуют большого количества расходуемых реактивов и дорогостоящего оборудования. Поэтому разработка методических основ для определения нитроароматических фосфорорганических инсектицидов с помощью респираторной активности микробных клеток позволит создать новую группу методов определения этого класса соединений.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось создание новых методических подходов для количественного определения нитроароматических фосфорорганических инсектицидов на основе респираторной активности микробных клеток, обладающих ферментативной системой подготовительного метаболизма пара-нитрофенола.

В связи с этим были поставлены следующие задачи исследования:

1. Исследовать респираторную активность микробных клеток штаммов Pseudomonas putida С-11 и Pseudomonas putida БА-11 по отношению к пара-нитрофенолу. Провести подбор сред культивирования микробных клеток и оптимизировать условия проведения анализа для получения максимальной респираторной активности в отношении субстрата.

2. Изучить возможность создания биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток штаммов Pseudomonas putida C-ll, Pseudomonas putida БА-11 и Acinetobacter calcoaceticum А-122. Рассмотреть методы иммобилизации микробных клеток с помощью адсорбции и способом включения в гель. Определить условия сохранения специфической респираторной активности свободных и иммобилизованных на разных носителях клеток в отношении пара-нитрофенола.

3. Определить респираторную активность свободных и иммобилизованных в гель агар-агара микробных клеток Pseudomonas putida C-ll, 8

Pseudomonas putida БА-11 и Acinetobacter calcoaceticum A-122 по отношению к метафосу, сумитиону и пара-нитрофенолу.

4. Изучить возможность количественного определения фосфороргани-ческих нитроароматических инсектицидов метафоса, сумитиона и пара-нитрофенола в модельных объектах с помощью респираторной активности микробных клеток Pseudomonas putida C-ll, Pseudomonas putida БА-11 и Acinetobacter calcoaceticum A-122.

5. Провести сравнительное количественное определение содержания метафоса в коммерческом препарате метафоса с помощью данных газожидкостной хроматографии и респираторной активности микробных клеток штаммов Pseudomonas putida C-ll, Pseudomonas putida БА-11 и Acinetobacter calcoaceticum A-122.

Научная новизна работы

Впервые показана возможность определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона при помощи респираторной активности микробных клеток, обладающих ферментами подготовительного метаболизма пара-нитрофенола и способных утилизировать пара-нитрофенол в качестве единственного источника углерода. Проведен подбор сред культивирования клеток для получения максимально активной биомассы по отношению к пара-нитрофенолу. Оптимизированы условия проведения анализа специфической респираторной активности микробных клеток. Изучены условия сохранения клетками респираторной активности в отношении определяемых соединений. Построены калибровочные кривые для количественного определения метафоса, сумитиона и пара-нитрофенола по изменению специфической респираторной активности клеток в отношении данных субстратов. Показано, что респираторная активность клеток в отношении метафоса и сумитиона значительно выше, по сравнению с активностью клеток в отношении пара-нитрофенола. Проведен сравнительный анализ применяемых методов иммобилизации клеток, в результате которого показано, что включение клеток в гель агар-агара позволяет максимальное время сохранять 9 их специфическую респираторную активность. Изучены условия сохранения респираторной активности свободными и иммобилизованными клетками.

Установлена возможность количественного определения метафоса, су-митиона и пара-нитрофенола в модельных объектах. Проведено количественное определение содержания метафоса в его коммерческом препарате на основе полученных результатов газожидкостной хроматографии и специфической респираторной активности клеток по отношению к чистому препарату метафоса.

Практическая ценность работы

Разработан способ индикации и количественного определения метафоса и сумитиона в водных растворах с помощью специально подготовленных микробных клеток и кислородного электрода типа Кларка. Разработаны способы иммобилизации микробных клеток, сохраняющих биодеструктивную активность по отношению к данным соединениям. По результатам работы был оформлен патент на изобретение (заявка на получение патента РФ №2000111945/13 (012357) положительное решение от 17.05.01г.), материалы работы используются при проведении практических занятий на кафедре биофизики факультета нелинейных процессов Саратовского государственного университета им. Н.Г.Чернышевского, кафедре экологии Саратовского государственного технического университета, кафедре микробиологии с вирусологией и микробиологией Саратовского государственного медицинского университета, кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы Института ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И.Вавилова.

По результатам диссертации были изданы методические рекомендации по определению некоторых фосфорорганических нитроароматических инсектицидов с помощью респираторной активности микробных клеток в водных объектах для студентов старших курсов и аспирантов, специализирующихся в области микробиологии и биохимии, рекомендованы учебно-методической комиссией ветеринарного факультета СГАУ им. Н.И.Вавилова (протокол № 49 от 9 апреля 2001 г.)

10

На защиту выносятся следующие положения:

1. Микробные клетки, способные использовать пара-нитрофенол в качестве единственного источника углерода изменяют специфическую респираторную активность (СРА) в присутствии пара-нитрофенола. СРА клеток этих штаммов может быть использована для количественного определения пара-нитрофенола.

2. Микробные клетки штаммов Pseudomonas putida БА-11, Pseudomonas putida C-l 1 и Acinetobacter calcoaceticum А-122, обладающие системой подготовительного метаболизма пара-нитрофенола способны изменять СРА по отношению к нитроароматическим фосфоорганическим инсектицидам мета-фосу и сумитиону. СРА клеток этих штаммов можно использовать для количественного определения метафоса и сумитиона.

3. Иммобилизация клеток штаммов Pseudomonas putida БА-11, Pseudomonas putida C-l 1 и Acinetobacter calcoaceticum А-122, обладающих системой подготовительного метаболизма пара-нитрофенола, позволяет получать микробные биокатализаторы, сохраняющие СРА по отношению к пара-нитрофенолу.

4. Иммобилизация микробных клеток штаммов Pseudomonas putida БА-11, Pseudomonas putida С-11 и Acinetobacter calcoaceticum А-122, обладающих системой подготовительного метаболизма пара-нитрофенола, включением в полисахаридный гель агар-агара, сохраняет респираторную активность клеток в отношении метафоса, сумитиона и пара-нитрофенола. Микробные биокатализаторы на основе включенных в гель агар-агара клеток штаммов Pseudomonas putida БА-11, Pseudomonas putida С-11 и Acinetobacter calcoaceticum А-122, обладающие системой подготовительного метаболизма пара-нитрофенола, сохраняют от 27 до 48 суток СРА по отношению к пара-нитрофенолу в зависимости от используемого штамма и температуры хранения.

5. Биокатализаторы на основе микробных клеток Pseudomonas putida БА-11, Pseudomonas putida C-l 1 и Acinetobacter calcoaceticum А-122 позволяют

11 количественно определять метафос, сумитион и пара-нитрофенол в модельных образцах.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на Всероссийских и Международных конференциях: Euroconference "Bacterial-Material/Radionuclide Interaction" (Rossendor/Dresden, Germany, December 1998); Научная конференция профессорско-преподавательского состава и аспирантов СГАУ им. Н.И.Вавилова по итогам научно-исследовательской и учебно-методической iL работы за 1999 год (январь-февраль 1999, Саратов); 9 European Congress on Biotechnology (July, 1999, Belgium); Всероссийская заочная конференция "Перспективы развития Волжского региона" (май 2000, Тверь); International Symposium on Environmental Biotechnology 2000 (Kyoto Japan July 2000); Ce-минар-презентация инновационных научно-технических проектов биотехно-логии-2000 (сентябрь 2000, Пущино); Международная научная конференция "Экологические и гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон" (октябрь 2000, Санкт-Петербург); Научная конференция, посвященная двадцатилетию создания ИБФРМ РАН (ноябрь 2000, Саратов); Международная научно-практическая конференция "Проблеми I пер-спективи очищения та повторного використання води" (листопад 2000, Харыав); Научная конференция профессорско-преподавательского состава и аспирантов СГАУ им. Н.И.Вавилова по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2000 год (февраль 2001, Саратов).

Работа была частично поддержана грантами Президента РФ № 01-1599421 и CRDF REC-006.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 176 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 186 страницах машинописного текста, включающего 36 рисунков и 7 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Гулий, Ольга Ивановна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что респираторная активность микробных клеток, обладающих ферментативной системой подготовительного метаболизма пара-нитрофенола может быть использована для количественного определения нитроароматических фосфорорганических инсектицидов метафоса и сумитиона.

2. Оптимальными условиями культивирования микробных клеток Р. рии<Ла БА-11 и Р. риИс1а С-11 для получения их максимальной респираторной активности по отношению к пара-нитрофенолу является их культивирование на мясо-пептонном агаре с последующим инкубированием в фосфатном буферном растворе с рН 7,45 (Р. риШа С-11) и 8,1 (Р. риМа БА-11) в течение 2 часов. Оптимимзированы условия проведения анализа специфической респираторной активности микробных клеток Р. риШа БА-11 и Р. риН<Яа С-11 в отношении пара-нитрофенола

3. Установлено, что клетки штаммов Р. риИс1а БА-11 и Р. риМа С-11 обладают конститутивной ферментативной системой подготовительного метаболизма пара-нитрофенола. Исследована селективность респираторного ответа клеток Р. риИс1а БА-11 и Р. риМа С-11, показано, что штамм Р. риШа БА-11 обладает наиболее высокой селективностью при определении пара-нитрофенола.

4. Изучена возможность иммобилизации микробных клеток Р. риШа С-11, Р. рийс1а БА-11 и А. сакоасейсит А-122. Показано, что метод иммобилизации путем включения клеток в гель агар- агара является наиболее предпочтительным. Иммобилизованные микробные клетки длительно (48, 40 и 27 суток для штаммов Р. риШа С -11, Р. риШа БА-11 и А. сакоасеИсит А-122, соотвественно) сохраняют специфическую респираторную активность.

5. Показана возможность количественного определения инсектицидов метафоса и сумитиона, а также пара-нитрофенола с помощью респираторной активности свободных и иммобилизованных в гель агар-агара микробных

169 клеток Р. риШа С-11, Р. риШа БА-11 и А. сакоасеИсит А-122. Линейный диапазон активности свободных и иммобилизованных в гель агар-агара клеток Р. риШа С-11 и Р. риМа БА-11 находится в диапазоне концентраций пара-нитрофенола - 0,5-2,5 мМ; метафоса - 0,5-3,0 мМ и сумитиона - 0,5-3,5 мМ для обоих штаммов. Для свободных и иммобилизованных в гель агар-агара клеток штамма А сакоасеИсит А-122 линейный диапазон активности находится в интервале концентраций пара-нитрофенола 0,5-1,0 мМ; метафоса - 0,5-2,0 мМ, и сумитиона - 0,5-2,5 мМ.

6. Проведено сравнительное количественное определение содержания основного вещества в коммерческом препарате метафоса с помощью газожидкостной хроматографии и респираторной активности свободных и иммобилизованных в гель агар-агара микробных клеток штаммов Р. риНс1а С-11, Р. риНс1а БА-11 и А. сакоасейсит А-122. Концентрации метафоса, определенные с помощью респираторной активности клеток всех изучаемых штаммов были аналогичны результатам хроматографического анализа.

7. Показана возможность количественного определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона, а также и пара-нитрофенола в модельных водных объектах с помощью респираторной активности свободных и иммобилизованных в гель агар-агара микробных клеток штаммов Р. риШа С-11, Р. риИЛа БА-11 и А. сакоасейсит А-122.

170

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Общепризнанно, что применение химических средств защиты растений позволяет сохранить значительную часть урожая и повысить качество получаемых сельскохозяйственных продуктов [Мельников, 1995]. Интенсивная химизация сельского хозяйства приводит к ежегодному поступлению в биосферу различных химических веществ, в том числе и пестицидов. Органические соединения фосфора являются одной из важнейших групп современных пестицидов [Мельников, 1995], к которым относятся такие инсектициды как метафос и сумитион. В связи с этим существует необходимость контроля этих веществ и продуктов их деградации в объектах окружающей среды. На фоне возрастающего антропогенного загрязнения окружающей среды пестицидами, биологические методы детекции и очистки природных объектов становятся весьма актуальными. Применяемые в настоящее время способы определения микроколичеств пестицидов основаны на различных физико-химических методах: спектрофотометрии, газожидкостной хроматографии, хроматографии в тонком слое и т.д. [Лурье, 1984] не в состоянии решить проблемы быстрой детекции, т.к. все они характеризуются сложностью исполнения, требуют большого количества расходуемых реактивов, дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала.

В последнее время возрастает интерес к биосенсорным аналитическим системам, выгодно отличающимся высокой чувствительностью и специфичностью, относительной дешевизной и простотой, высокой скоростью определения и возможностью осуществления анализа "ш situ". Биосенсоры сочетают в себе биологически чувствительный элемент (клетки, ферменты, ткани, антитела и др.) и физико-химический детектор биологического сигнала (электрохимический, оптический, колориметрический, акустический и др.). Наиболее широко распространены биосенсорные системы с электрохимическими детекторами (амперометрическими и потенциометрическими электродами) на основе ферментов и целых клеток.

156

Биосенсоры уже используются в медицине, ветеринарии, фармацевтической и биотехнологической промышленности. Активно разрабатываются и внедряются биосенсорные способы экологического контроля: для оценки общей токсичности стоков, качества пищевых продуктов и питьевой воды, определения отдельных токсичных соединений (фенолов, фосфорорганиче-ских соединений, нитратов, цианидов и многих др.). На данный момент существуют сенсорные методы анализа фосфорорганических инсектицидов, основанные на ингибировании ацетилхолинэстеразной активности. В тоже время сведений о работах по созданию микробных сенсорных систем для определения фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона на основе респираторной активности микробных клеток в литературе отсутствуют.

Известны бактериальные культуры, способные использовать ПНФ в качестве единственного источника углерода и энергии. Такая особенность микроорганизмов обусловлена наличием в клетках ферментов системы подготовительного метаболизма, способствующие утилизации ПНФ путем окислительных реакций. Известно сходство в химической структурной формуле метафоса, сумитиона и ПНФ. С большой вероятностью можно допустить, что в случае сходных по химической структуре субстратов механизм действия оксигеназ будет одним и тем же [Карасевич, 1992]. В связи с этим можно предположить, что пути метаболизма метафоса, сумитиона и ПНФ будут близки. Поэтому проводилось определение фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса и сумитиона с помощью респираторной активности микробных клеток, обладающих ферментами подготовительного метаболизма ПНФ. Путь деградации фосфорорганических нитроароматических инсектицидов метафоса, паратиона, сумитиона идет с образованием пара-нитрофенола. Описаны два пути биотрансформации пара-нитрофенола в бактериальной клетке. Первый - идет с образованием в качестве промежуточного продукта гидрохинона, в дальнейшем происходит расщепление ароматического кольца гидрохинона с образованием полуальдегида гидроксимуконовой кислоты, а также малеилацетиловой и кетоадипиновой

157 кислот. Другой путь - трансформация пара-нитрофенола непосредственно в 4-нитропирокатехин, который в дальнейшем подвергается ферментативным превращениям с образованием оксигидрохинона.

С целью разработки микробной биосенсорной системы для определения метафоса, сумитиона и ПНФ в водной среде, нами использовались бактериальные культуры, обладающие ферментами, гидролизующими ПНФ и способные утилизировать последний в качестве единственного источника углерода и энергии: штаммов Pseudomonasputida C-l 1, Pseudomonasputida БА-11 и Acinetobacter calcoaceticum А-122.

Поскольку окислительные реакции у аэробных микроорганизмов проходят с участием молекулярного кислорода, в качестве детектора биологического сигнала нами решено было использовать чувствительный к кислороду электрод Кларка.

С помощью кислородного электрода определялась респираторная активность микробных клеток в буферном растворе и в растворе, содержащем определяемые соединения.

Разность значений респираторной активности клеток в присутствии исследуемого субстрата и без него, приведенная к массе использованных микробных клеток, обозначалась как специфическая респираторная активность (СРА) и выражалась в мкА / мин * мг сухого веса клеток. СРА микробных клеток использовалась нами для определения присутствия и установления концентрации метафоса, сумитиона и ПНФ в водных растворах.

Проводился подбор сред культивирования микробных клеток штаммов Р. putida С-11 и Р. putida БА-11 для получения их максимальной респираторной активности в отношении ПНФ. Было установлено, что клетки штаммов Р. putida С-11 и Р. putida БА-11 сохраняли респираторную активность по отношению к ПНФ при их выращивании на мясо-пептонном агаре без добавления ПНФ. С нашей точки зрения это свидетельствует, что клетки данных штаммов обладают конститутивной ферментативной системой подготовительного метаболизма ПНФ и для них нет необходимости предварительного культивирования на среде, содержащей ПНФ. Для проявления клетками

158 штаммов P. putida С-И и P. putida БА-11 максимальной CPA в отношении ПНФ, их биомассу, выращенную на полноценной питательной среде (МПА), необходимо проинкубировать в фосфатном буфере с рН 7,45 (P. putida С-11) и 8,1 (P. putida БА-11) без добавления ПНФ в течение 2-х часов. При инкубации клеток в аналогичных условиях с добавлением ПНФ наблюдалось снижение активности, по-видимому, вследствии ингибирующего действия ПНФ на CPA клеток.

На следующем этапе исследований изучалось влияние различных факторов на проведение анализа респираторной активности микробных клеток в отношении ПНФ: концентрации клеток в измерительной ячейке, рН-среды, температуры анализа.

Первоначально для каждой бактериальной культуры была выявлена оптимальная концентрация клеток в ячейке. Она составила для клеток P. putida С-11 - 0,6-1,32 г сухого веса/л; для P. putida БА-11 - 0,4-1,2 г сухого веса/л. Использование большего количества биомассы было лимитировано ограниченным количеством кислорода в ячейке.

Изучение влияния рН на CPA клеток штамма P. putida С-11 показало, что они проявляют высокую активность в отношении ПНФ при рН 7,45 фосфатного буфера. Клетки штамма P. putida БА-11 проявляли максимальную респираторную активность в отношении ПНФ при рН 8,1.

Изучение влияния температуры на CPA клеток микроорганизмов в отношении изучаемого субстрата показало что, оптимальной температурой проведения анализа является 35 °С для обоих штаммов.

Используя оптимальные условия культивирования микробных клеток и условия анализа их респираторной активности, были построены зависимости респираторного ответа клеток от концентрации ПНФ. Зависимости CPA клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 имели линейный характер в диапазоне концентраций ПНФ 0,5-2,5мМ для обоих штаммов. Минимальная определяемая концентрация ПНФ для штаммов P. putida С-11 и P. putida БА-11 составляет 0,1 мМ.

159

Далее нами изучалась селективность респираторного ответа микробных клеток. Было показано, что клетки P.putida С-11 обладают CPA в отношении гидрохинона, 2,4-динитрофенола, м-нитрофенола и ПНФ. CPA в отношении фенола, бензоамида и никотинамида клетки практически не обладали, вероятно из-за отсутствия ферментов подготовительного метаболизма данных соединений. Клетки штамма P.putida БА-11 проявляют активность в отношении м-нитрофенола и ПНФ, это свидетельствуют о том, что клетки штамма P.putida БА-11 могут быть использованы для селективного определения ПНФ и, возможно, мета-нитрофенола в смесях ароматических соединений. Тот факт, что клетки штамма P. putida С-11 реагируют на гидрохинон, а клетки штамма P. putida БА-11 такой активности не проявляют, вероятно, связано с тем, что подготовительный путь метаболизма ПНФ в микробных клетках штамма P.putida БА-11 осуществляется через образование 4-нитропирокатехина, а в микробных клетках P. putida С-11 - через образование гидрохинона с последующим разрывом ароматического кольца.

Изучение способов сохранения респираторной активности микробных клеток в отношении ПНФ показало, что оптимальными условиями для сохранения респираторной активности клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 явилось хранение при 4 °С.

Иммобилизация микробных клеток является необходимым этапом для создания биосенсорных систем, она позволяет создать высокую концентрацию клеток, предотвращает их вымывание из биореактора, защищает от высоких концентраций токсичных компонентов сточных вод. Существует значительное количество подходов для иммобилизации клеток, но наиболее часто используется - включение в гель и адсорбция на поверхности носителя. Для имобилизации методом включения клеток в гель использовались несколько традиционных носителей - полиакриламидный гель (ПААГ), крио-полиакриламидный гель (криоПААГ) и природный полисахарид агар-агар. Другие традиционные носители - каппа-каррагенан и альгинат кальция не применялись вследствие низкой механической прочности получаемого геля.

160

Для иммобилизации путем адсорбции использовался природный коммерческий носитель "лессорб" и хроматографическая бумага.

Ранее предпринимались попытки использовать респираторную активность свободных микроорганизмов штамма Acinetobacter calcoaceticum А-122 для количественного определения ПНФ [Ignatov et al.1999; Хоркина, 1998] и был определен индуцибельный характер синтеза ферментов подготовительного метаболизма ПНФ [Сингирцев, 1996].

Была исследована возможность создания биокатализатора на основе включенных в гель природного полисахарида агар-агар клеток Р.putida С-11, Р.putida БА-11 и А. calcoaceticum А-122. Такой выбор обусловлен отсутствием токсичности агар-агара для иммобилизованных клеток и простотой метода их иммобилизации. Было показано, что оптимальная концентрация клеток в гранулах геля для штамма Р.putida С-11 является 0,38-0,4 г сухого веса клеток/л объема биокатализатора, а для Р.putida БА-11 - 0,26-0,3 г сухого веса клеток/л объема биокатализатора, для клеток А. calcoaceticum А-122 - 0,40,45 г сухого веса клеток/л объема биокатализатора. При увеличении микробной нагрузки клеток в гранулах увеличивалось эндогенное дыхание, а, следовательно, было сложнее регистрировать СРА иммобилизованных клеток по отношению к ПНФ. Концентрационная зависимость СРА иммобилизованных в гель агар-агара клеток в отношении ПНФ сохраняла линейный характер, как и для свободных клеток, в интервале 0,5-2,5 мМ для Р.putida С-11 и Р.putida БА-11 и 0,5-1,0 мМ для А. calcoaceticum А-122. Активность клеток после иммобилизации несколько снижалась по сравнению со свободными, что объясняется, по-видимому, инактивацией части клеток при их иммобилизации, но диапазон линейной зависисимости СРА клеток по отношению к ПНФ соответствовал линейному диапазону свободных клеток.

Одним из широко используемых полимерных носителей является поли-акриламидный гель (ПААГ). Однако, включение клеток в ПААГ может сопровождаться быстрым отмиранием части популяции вследствии высокой токсичности компонентов геля и высокой температурой при полимеризации. При иммобилизации клеток Р. putida С-11, Р. putida БА-11 и А. calcoaceticum

161

А-122 в ПААГ CPA по отношению к ПНФ и эндогенная респираторная активность практически отсутствовала. Вариантом ячеистых носителей являются полиакриламидные криогели, образующиеся при замораживании, когда в роли порообразователей выступают кристаллы льда. Включение клеток в криоПА-АГ по сравнению с ПААГ, увеличивает количество жизнеспособных клеток, поэтому было проведено исследование иммобилизации микробных клеток в криоПААГ. Нам удалось оптимизировать микробную нагрузку в гранулах криоПААГ для клеток P. putida БА-11, она составляет 3,7-3,9 г/л, однако, CPA клеток штамма P.putida С-11 и A. calcoaceticum А-122 в случае их иммобилизации в криоПААГ по отношению к ПНФ отсутствовала и оптимизация микробной нагрузки не проводилась. Тем не менее, в связи с тем, что CPA иммобилизованных клеток была низка построение калибровочной кривой не проводилось.

Адсорбционные методы иммобилизации относятся к числу наиболее простых и, как правило, слабо влияют на ферментативную систему клеток. В наших исследованиях проводилась иммобилизация клеток методом адсорбции на таких носителях, как «лессорб» и хроматографическая бумага.

Количество адсорбированных клеток рассчитывалась исходя из их эндогенного дыхания, которое прямо пропорционально количеству клеток, закрепившихся на носителе (т.е. строилась калибровочная кривая зависимости эндогенной респираторной активности клеток от их количества, которая использовалась для оценки количества клеток, адсорбированных на носителе).

Процедура иммобилизации на "лессорбе" состояла в смешивании при подходящих условиях клеток и носителя. Было установлено, что оптимальным временем иммобилизации для клеток всех штаммов является 30 мин. Оптимум рН среды составил 7,45 для клеток P. putida С-11, 8,1 для P. putida БА-11 и 6,8-7,6 для A. calcoaceticum А-122, что совпадает с оптимальными значениями анализа респираторной активности соответствующих величин для свободных клеток исследуемых штаммов. В экспериментах использовались образцы, содержащие 50 мг "лессорба". Оптимальная концентрация

162 клеток в исходной суспензии составила 2,9-3,4 г/л P. putida С-11, 2,1-2,9 г/л P.putida Б А-11 и 1,1-1,5 г/л A.calcoaceticum А-122.

На следующем этапе наших исследовалась иммобилизация клеток на хроматографической бумаге. Расчет количества адсорбированных клеток с помощью эндогенного дыхания проводился аналогично, как и при иммобилизации клеток на «лессорбе». Оптимальная концентрация клеток была признана для штамма P. putida С-11- 2,7-3,4 г/л, для P. putida БА-11 -2,3-3,3 г/л и для A.calcoaceticum А-122 - 0,6-1,0 г/л.

Для клеток, иммобилизованных на «лессорбе» и хроматографической бумаге были построены калибровочные кривые CPA по отношению к ПНФ. При исследовании CPA иммобилизованных на «лессорбе» и хроматографической бумаге клеток изучаемых штаммов было показано, что линейный диапазон активности клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 сохранялся в пределе 0,5-2,5 мМ, и для клеток A.calcoaceticum А-122 - этот интервал составлял 0,5-1,0 мМ ПНФ, как и для свободных клеток. При иммобилизации клеток A.calcoaceticum А-122 на "лессорбе" диапазон определяемых концентраций ПНФ расширяется по сравнению со свободными клетками и находится в интервале 0,5-1,5 мМ.

Одной из важных задач при исследовании CPA иммобилизованных клеток в отношении исследуемых субстратов является определение условий хранения биокатализаторов. Было установлено, что максимально долго клетки всех штамов сохраняли CPA по отношению к ПНФ при их иммобилизации в гель агар-агара (P. putida С-11, P. putida БА-11 и A.calcoaceticum А-122 - 48, 40 и 27 суток соответственно при оптимальной температуре хранения +4°С). Необходимо отметить, в процессе хранения биокатализаторов линейный диапазон зависимости CPA клеток по отношению к ПНФ при всех использованных способах иммобилизации сохранялся в том же диапазоне, что и для свободных клеток соотвествующих штаммов.

Было показано, что воспроизводимость респираторного ответа клеток изучаемых штаммов по отношению к ПНФ достаточно полно проходила при иммобилизации путем включения в гель и адсорбции на инертных носителях.

163

Полученные данные показали, что включение клеток в агаровые гели позволяет длительное время сохранять активность по отношению к ПНФ для штамма P. putida С-11, P. putida БА-11 и A.calcoaceticum А-122 по сравнению с другими опробованными носителями. Однако, активность клеток A.calcoaceticum А-122 в отношении ПНФ исчезала быстрее, чем у других описанных штаммов, что, вероятно, связано с индуцибельным характером синтеза ферментов подготовительного метаболизма ПНФ данного штамма. Включение в гелевые носители, в нашем случае агар-агар, имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами иммобилизации, к которым относятся достаточно точный расчет активности клеток в отношении определяемого вещества и сохранение в течение длительного времени клеками своей CPA в отношении субстрата.

Поскольку активный центр фермента часто проявляет достаточно широкую специфичность по отношению к близким по структуре соединениям, мы предположили, что клетки данных штаммов могут быть использованы для определения ряда соединений, в состав которых входит нитроароматиче-ское кольцо [Мельников 1987]. К таким соединениям относятся нитроарома-тические фосфоорганиеские инсектициды, такие как метафос и сумитион. Исследовался респираторный отклик клеток всех штаммов по отношению к чистым препаратам инсектицидов метафоса и сумитиона (производства фирмы "Эколан" г.Москва). Был проведен дополнительный контроль чистоты препарататов метафоса и сумитиона с помощью газо-жидкостной хроматографии.

Построены концентрационные зависимости CPA клеток исследуемых штаммов в отношении метафоса и сумитиона. Из представленных данных показано, что зависимости CPA клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 имели линейный характер в диапазоне концентраций метафоса 0,5-3,0 мМ и сумитиона лежит в интервале 0,5-3,5 мМ для обоих штаммов. Концентрационная зависимость клеток A. calcoaceticum А-122 в отношении инсектицида метафоса имеет линейный характер в интервале 0,5-2,0 мМ, а для сумитиона линейный диапазон концентрациий находится в интервале 0,5-2,5 мМ. Мини

164 мальная определяемая концентрация сумитиона составляет 0,01 мМ, метафо-са 0,05 мМ для клеток всех изучаемых штаммов. Полученные концентраци-оннае зависимости CPA клеток изучаемых штаммов могут быть использованы в качестве калибровочных кривых для определения изучаемых инсектицидов в водных средах. Сравнивая полученные данные зависимостей CPA клеток P. putida С-11, P. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122 в отношении чистых препаратов метафоса, сумитиона и ПНФ, видно, что линейные диапазоны концентрации зависимости CPA клеток по отношению к инсектицидам и ПНФ совпадали в диапазоне концентраций 0,5-2,5 мМ для клеток клеток Р. putida С-11 и P. putida БА-11 и в интервале 0,5-1,0 мМ для клеток клеток А. calcoaceticum А-122. Таким образом, увеличение диапазона определяемых концентраций метафоса по сравнению с ПНФ происходит приблизительно на 20% для клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 и приблизительно на 25% для A.calcoaceticum А-122; для сумитиона увеличение диапазона определяемых концентраций по сравнению с активностью клеток в отношении ПНФ происходит на приблизительно 40% .для клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 и приблизительно на 30% для A. calcoaceticum А-122. Такое увеличение диапазона определяемых концентраций, вероятно, связано с большим сродством данных субстратов (инсектицидов) к ферментативной системе подготовительного метаболизма ароматических соединений в бактериальной клетке. Из полученных данных можно отметить, что для анализа инсектицидов метафоса и сумитиона наиболее предпочтительными являются клетки штаммов Р. putida С-11 и P. putida БА-11 в связи с тем, что у них диапазон определяемых концентраций и величина респираторного отклика выше, чем у клеток A.calcoaceticum А-122.

В связи с тем, что для создания микробных биокатализаторов наиболее предпочтительным методом иммобилизации микробных клеток признан метод включения клеток в гель природного полисахарида агар-агара исследовался респираторный отклик этих биокатализаторов. Используя оптимальные для каждой бактериальной культуры условия получения биокатализатора с максимальной активностью в отношении ПНФ, проводили определение CPA

165 иммобилизованных в гель агар-агара клеток при различных концентрациях метафоса и сумитиона. При определении CPA иммобилизованных в гель агар-агара клеток изучаемых штаммов было показано, что линейный диапазон активности клеток P. putida С-11 и P. putida БА-11 в отношении инсектицида метафоса сохранялся в пределе 0,5-3,0 мМ, а для клеток A.calcoaceticum А-122 этот интервал составлял 0,5-2,0 мМ, как и для свободных клеток. Линейный диапазон концентрационной зависимости CPA по отношению к су-митиону иммобилизованных в гель агар-агара клеток P. putida С-11 и Р. putida БА-11 находится в интервале концентраций 0,5-3,5 мМ, а для клеток A.calcoaceticum, А-122 - 0,5-2,5 мМ. Характер зависимости респираторной активности клеток по отношению к сумитиону сохраняется, как и для свободных клеток. Из сравнения зависимостей CPA иммобилизованных в гель агар-агара клеток P. putida С-11, P. putida БА-11 и A.calcoaceticum А-122 по отношению к исследуемым инсектицидам и ПНФ следует, что линейные диапазоны концентрации зависимостей CPA совпадали в том же диапазоне, что и для свободных клеток 0,5-2,5 мМ (P. putida С-11, P. putida БА-11) и 0,5-1,0 мМ (A. calcoaceticum А-122).

Нами был исследован коммерческий препарат инсектицида метафоса (производства Волгоградского химического комбината), в котором с помощью метода газо-жидкостной хроматографии предварительно была определена концентрация метафоса, которая состовляла 14 мМ/л. Одновременно исследовалась респираторная активность клеток P. putida С-11, P. putida БА-11 и A.calcoaceticum А-122 по отношению к данному препарату.

Содержание метафоса в образце рассчитывалась исходя из ранее полученной калибровочной кривой для чистого препарата метафоса и сравнивалась с данными, полученными с помощью газо-жидкостной хроматографии. Сопоставляя результаты активности клеток в отношении исследуемых субстратов, был сделан вывод, что CPA клеток в отношении технического и чистого препаратов метафоса практически совпадают. Затем было исследовано изменение респираторной активности иммобилизованных в гель агар-агара клеток P. putida С-11, P. putida БА-11 и A.calcoaceticum А-122 по отношению

166 к техническому препарату метафоса. Данные количественного анализа содержания основного вещества в коммерческом препарате метафоса , полученные при помощи газохроматографического анализа и специфической респираторной активности клеток, были практически аналогичны. Результаты анализа с применением иммобилизованных клеток были идентичны свободным клеткам. Таким образом, показана возможность определения активного соединения в технической препарате метафоса с помощью CPA как свободных, так и иммобилизованных клеток P. putida С-11, P. putida БА-11 и A.calcoaceticum А-122. Сравнение определяемых концентраций метафоса в коммерческом препарате с помощью CPA клеток в отношении чистого препарата метафоса и с помощью газо-жидкостной хроматографии показало, что величины определяемых концентраций совпадают, это свидетельствует о точности проведенного нами анализа.

В результате циркуляции пестицидов в окружающей среде они присутствуют в атмосфере, почве, растениях и воде [Шевченко М.А., 1989]. Несмотря на низкую стабильность фосфорорганических пестицидов, время пребывания их в воде может оказаться вполне достаточным для поступления не-разложившихся препаратов в воду В связи с этим, нами определялась во-можность количественного определения инсектицидов метафоса и продуктов их гидролиза в речной воде. Пробы речной воды отбирались из реки Волги в районе Саратова. В предварительных исследованиях было показано, что активность клеток в отношении данной пробы отсутствовала. Нами были смоделированы образцы, содержащие коммерческий метафос, чистый препарат сумитиона и ПНФ и проведен их анализ по респираторной активности клеток. Определенные по изменению респираторной активности микробных клеток концентрации метафоса, сумитиона и ПНФ хорошо коррелировали с истинными значениями концентраций. В результате исследований показана возможность детектировать метафос, сумитион или ПНФ с помощью клеток изучаемых штаммов. То есть, в случае применения клеток штаммов P. putida С-11, P. putida БА-11 и A. calcoaceticum А-122 можно регистрировать токсические соединения, попадающие в окружающую среду при применении фосфо

167 органических нитроароматических пестицидов и образующиеся при их деградации. Практически, на обрабатываемой территории, применяют, как правило, один вид фосфорорганического нитроароматического инсектицида, поскольку спектры их действия очень близки и поэтому нет необходимости идентификации этих соединения между собой. Селективность респираторного ответа клеток трех штаммов в отношении ряда ароматических соединений изучалась и представлена (Глава 5,6), [Хоркина, 1998], вследствие чего можно сделать вывод, что изучаемые нами клетки бактериальных штаммов Р. ри-ИсЬ С-11, Р. риМа БА-11 и А. сакоасейсит А-122 проявляют достаточно высокую активность только в отношении близких по химической структуре ароматическим соединениям, содержащим в своем составе нитрогруппу, к которым и относятся пара-нитрофенол, мета-нитрофенол, метафос, сумитион. Штамм Р. риИс1а БА-11 обладает наиболее высокой селективностью и может быть использован для количественного определения ПНФ и, возможно, мета-нитрофенола.

Таким образом, впервые была показана возможность определения ме-тафоса и сумитиона с помощью респираторной активности микробных клеток в модельных образцах. Показана возможность определения содержания метафоса в техническом препарате метафоса с помощью респираторной активности микробных клеток. Полученные данные подтверждены результатами газожидкостной хроматографии. Проведен количественный анализ модельных водных образцов, содержащих метафос, сумитион и ПНФ. Полученные нами результаты могут быть положены в основу разработки микробной биосенсорной системы для определения содержания метафоса, сумитиона и ПНФ в водных растворах. Такая биосенсорная система найдет применение в анализе содержания данных ксенобиотиков в водных средах.

168

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гулий, Ольга Ивановна, 2001 год

1. Брусеников И.П. Объемы химических обработок возросли //Защита и карантин растений.-1998.-№3.-С.9.

2. Березин И.В. Иммобилизованные ферменты Современное состояние и перспективы. М.:МГУД976.- Том 1.-296с.

3. Варфоломеев С.Д. Биосенсоры // Соросовский образовательный журнал.-1997.-№1.-С.45-49.

4. Вебб К. Иммобилизованные клетки // Экологическая биотехнология. Пер. с англ. Л.:Химия.- 1990.-С.166-189

5. Вошедский H.H. Проблема требует решения // Защита и карантин растений.-1998.-№3 .-С. 12-14.

6. Вудворд Дж (ред) Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. М.: Мир.-1988.-215с.

7. Гаранькина Н.Г., Павленко В.В. Деградация фосфорорганических пестицидов дрожжами. Сборник тезисов. Пущино.-1988.-С.23.

8. Гиндилис А.Л., Курочкин И.Н. Потенциометрические электроды для определения холина, бутирилхолина и ингибиторов холинэстераз, //Приклад, биохим. и микробиол.-1998.-Т.34, №3.-С.326-331

9. Гоголева Л.А. Микробиологические методы защиты окружающей среды. Сборник тезисов. Пущино.-1988.-С.8.

10. Грушко Я.М. Вредные органические соединения в промышленных сточных водах. Справочник. Л.: Химия. - 1982. - 215 с.

11. Давиденко H.H. В целях охраны окружающей среды // Защита и карантин растений.-1998.-№8.-С.39-41.

12. Даниельсон Бенгт, Мосбах Клаус. Теория и практика колориметрических сенсоров // Биосенсоры : основы и приложения. Тернер Э., Карубе И., Уилсон Дж. (ред.) -М.: Мир, 1992. С.457-487.

13. Ефременко В.И., Столбин C.B., Греков Л.И. Биосенсоры и аспекты их использования (обзор) // Приклад, биохим. и микробиол.-1990.-Т.26, №1.-С.14-18.171

14. Закладной Г. А. Зерно и вредители несовместимы. Химическая дезинфекция зерна // Защита и карантин растений.-1998.-№9.-С.32-35.

15. Игнатов О.В. Деструкция некоторых ксенобиотиков иммобилизованными клетками микроорганизмов-деструкторов. Дис. канд. биол. наук. Саратов,1991.-116с.

16. Каспаров В.А., Промоненков В.К. Применение пестицидов за рубежом. М.: Агропромиздат.-1990.-224с.

17. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М.: Наука.-1982.-144с.

18. Кларк JI.C. Ферментный электрод // Биосенсоры : основы и приложения. Тернер Э., Карубе И., Уилсон Дж. (ред.) -М.: Мир, 1992. С. 11-19.

19. Клисенко М.А. (ред.) Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Колос.-1983.Т.2.-416 с.

20. Клисенко М.А. (ред.) Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Агропромиздат.1992.Т. 1.-567 с.

21. Клисенко М.А. (ред.) Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М.: Агропромиздат.-1992.Т.2.-416 с.

22. Коренман Я.И. Ароматические соединения- экоаналитические проблемы //Соросовский образовательный журнал.- 1999.-№12.-С.35-39.

23. Корженевич В.И., Игнатов О.В., Миронов А.Д., Кривопалов Ю.В., Барковский A.JT. Активность штаммов деструкторов ароматических соединений, иммобилизованных в гранулах агарового геля. // Прикл. биохимия и икробиология.-1991.-Т. 27, №3.-С.365-369.

24. Корпан Я.И., Ельская A.B. Микробные сенсоры: достижения, проблемы, перспективы // Биохимия.-1995.-Т.60.- С. 1988-1998.

25. Кулис Ю.Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов. Вильнюс: Мокслас.- 1981.- 200 с.172

26. Кулис Ю.Ю., Разумас В.Й. Биоамперометрия. Вильнюс.:Мокслас. -1986.-215 с.

27. Куценогий К.П., Киров Е.И., Кнорр И.Б., Алексеев A.A., Макаров В.И., Самсонов Ю.Н., Чанкина О.В., Богатырев Н.Р., Башев А.Н. Пестициды в экосистемах: проблемы и перспективы. Новосибирск.-1994.-142с.-(Сер.:Экология:. Вып.ЗЗ).

28. Либерштейн И.И. (ред.) Взаимодействие пестицидов с микроорганизмами. Кишинев.:Штиница.-1984.-365с.

29. Лунев М.И. Пестициды и охрана агрофитоцинозов, М.:Колос.-1992.-269с.

30. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных вод. М.:Химия.-1984.-448с.

31. Майер-Боде Г. Остатки пестицидов. Инсектициды: Пер. с немец.-М.:Мир.-1966.-350с.

32. Мартыненко В.И., Промоненков В.К. и др. Пестициды.Справочник. М.:Агропромиздат.- 1992.- 368 с.

33. Махиня А.П. Сравнительные гигиенические и санитарно-токсикологические исследования изомеров нитрофенола в связи с их нормированием в воде водоемов. //Промышленное загрязнение водоемов: АМН СССР.-Вып. 9.-М.: Медицина.- 1969.-С.84-96.

34. Мееров Г.И. Радиометрические методы определения активности ферментов. М.: Атомиздат.-1974. 61 с.

35. Мельников H.H. Химия пестицидов. М.: Химия- 1968.-495с.

36. Мельников H.H. Пестициды, химия, технология и применение. М.:Химия- 1987.-400с.

37. Мельников H.H. Пестициды и регуляторы роста растений. Справочник.М.-1995 .-400с.

38. Мельников H.H., Мельникова Г.М., Пестициды в современном мире.//Соросовский образовательный журнал.-1997.-№4.-С.ЗЗ-37.

39. Методы общей бактериологии.-Т.2.М.:Мир.1984.-472с.173

40. Наумова Р.П. Микробный метаболизм неприродных соединений. -Казань: КГУ.-1985.-240 с.

41. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной биологии М.:Мир.-1987.-440с

42. Новожилов К.В., Семенова H.H., Петрова Т.М. Конструирование экологически устойчивых агроэкосистем //Защита растений и экологическая безопасность.-1993.-№ 12.- С. 12-18.

43. Новожилов К.В., Семенова H.H., Петрова Т.М. Моделирование поведения пестицидов в окружающей среде. //Защита растений и экологическая безопасность.-1999.-№ 12.- С.8-13.

44. Нуйкина И.Р. Использование микроорганизмов в очистке биосферы от остатков пестицидов. Сборник тезисов. Пущино.-1988.-С. 45-46.

45. Памужак Н.Г. Протравливание семян кукурузы //Защита и карантин растений.-1999.-№ 1 .-С. 16-17.

46. Пат. №2131925С1 РФ. МКИ 4 С12 Q 1/34 Тест для интегральной оценки состояния загрязнения морской и пресной воды. /Мензорова Н.И., Рассказов В.А.-1999.-2с.

47. Попов П.Ф.,Шукшин Ф.П. Применение смесей пестицидов и минеральных удобрений на посевах //Агрохимический вестник.-1998.-№1.-С.42-43.

48. Ракитский В.Н. Безопасных пестицидов не бывает //Защита и карантин растений.-1998.-№ 7.-С.10.

49. Попова Л.Ю., Луцкая Н.И., А.Г.Жуков, Брильков A.B., Печуркин Н.С. Микробные тест-системы для оценки степени токсичности химических соединений.- Красноярск.-1991 .-33с.

50. Решетилов А.Н. Модели биосенсоров на основе потенциометрических и амперометрических преобразователей: применение в медицине, биотехнологии и экологическом мониторинге //Приклад, биохим. и микробиол. -1996. -Т. 32, N 1. -С. 78-93.174

51. Решетилов А.Н., Яковлев М.К., Горемиков A.B., Ильясов П.В. Многоканальный микробный биосенсорный анализатор нитрофенолов и ионов нитрита. //Тезисы. Пущино.-2000.-С.95.

52. Рыбальский Н.Г., Чаплина И.Г. Иммобилизованные клетки. Обзорная информация, Серия: Биотехнология, М.:ВНИИПИ.-1990.-108с.

53. Сингирцев И.Н. Микробная деструкция нитрофенолов. Дис. канд. биол. наук. Саратов, 1996. -167 с.

54. Синицин А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М., Изд-во МГУ. -1994.-288с.

55. Советский энциклопедический словарь.-М.: Сов.энциклопедия.-1986.-1600с.

56. Список пестицидов и ядохимикатов, разрешенных к применению в Российской Федерации. Приложение к журналу "Защита и карантин растений".-2000г.

57. Сорочинский В.В., Курганов Б.И. Биосенсоры для определения органических соединений //Приклад, биохим. и микробиол.- 1997.-Т. 33, №6,-С.579-596.

58. Сорочинский Л.В. Слагаемые успеха // Защита и карантин растений,-1998.-№6.-С.10.

59. Сорочинский В.В., Курганов Б.И., Биосенсоры для определения органических соединений.Сенсоры углеводов, ароматических, гетероциклических и других органических соединений/ //Приклад, биохимия и микробиология.-1998.-Т.34, №1.-С.22-42.

60. Столяров М.В. Саранча на юге России. //Защита и карантин растений .-1998.-№3.-С.16-17.175

61. Тернер Э., Карубе И.,.Уилсон Дж. (ред.) Биосенсоры: основы и приложения. М.:Мир.-1992.-614 с.

62. Туманов A.A., Коростылева Е.А. Ферментативные методы определения фосфорорганических соединений в природных и сточных водах. //Химия и технология воды.-1989.- Т.11, №4. С.329-336.

63. Туманов A.A., Коростылева Е.А. Биосенсоры в анализе объектов окружающей среды.//Аналитическая химия.-1990.- Т.45, №7. -С.1304-1312.

64. Федоров А.Ю., Волченко Е.В. Сингирцев И.Н., Корженевич В.И., Шуб Г.М. Хранение штаммов промышленных микроорганизмов, включенных в полимерные матрицы. //Прикладныя биохимия и микробиологи.-2000.-Т.36, №1.-С.59-67.

65. Хиггинс И., Д. Бест и Дж. Джонс (ред.) Биотехнология. Принципы и применение: Пер. с англ. М.: Мир.- 1988.—480с.

66. Химическая энциклопедия.М.: Большая российская энциклопедия.-1983.-Т.З.-С.285-286.

67. Хоркина H.A. Исследование биодеструктивной активности микроорганизмов при метаболизме токсичных соединений. Дис. канд.биол.наук.- Саратов. ВНИПЧИ "Микроб" 1998.

68. Чернова Т.А., Перебитюк А. Н. Способность к деградации ароматических соединений у клубеньковых бактерий Сборник тезисов. Пущино.-1988.-С.75-76.

69. Шевченко М.А., Таран П.А., Гончарук В.В. Очистка природных и сточных вод от пестицидов. Л. :Химия.-1989.- 184с.

70. Яковлева Г.Ю., Зарипова С.К., Наумова Р.П. Микробная трансформация р-нитрофенола в условиях лимита кислорода. //Новые направления биотехнологии: Тез. докл. VI конф. РФ.-Пущино,-1994.-С. 57.

71. Agency for Toxic Substances and Disease Registry.-1990 (Oct.). Toxicological Profile for Methyl Parathion. Public Health Service, US Dept. of Health and Human Services, Washington, DC

72. Andres R.T.; Narayanaswamy,R. Fiberoptic Pesticide Biosensor Based on Covalently Immobilized Acetylcholinesterase and Thymol Blue //TALANTA.-1997.-Vol. 44, Is. 8.-P. 1335-1352

73. ARC Monographs on the Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans, Vol. 30, 1983. Supplement 7. -1987

74. Begum G., Vijayaraghavan S. Effect of acute exposure of the organophosphate insecticide Rogor on some biochemical aspects of Clarias batrachus (Linnaeus), Environmental Research.- 1999.- Vol 80, Iss l.P.80-83.

75. Beltran J., Lopez F.J., Cepria O., Hernandez F. Solid-phase microextraction for quantitative analysis of organophosphorus pesticides in environmental water samples//Journal of Chromatography A.-1998.-Vol 808, Iss 1-2.-P.257-263.

76. Bernabei M.; Chiavarini S.; Cremisini C.; Palleschi G. Anticholinesterase Activity Measurement by a Choline Biosensor Application in Water Analysis. // Biosens.Bioelectron. -1993.-Vol.8, Is.5. - P.265-271.

77. Beyersdorf-Radeck B, Riedel K., Karlson U., Bachmann ТТ., Schmid RD. Screening of xenobiotic compounds degrading microorganisms using biosensor techniques.// Microbiol Res.- 1998.-Nov;153(3).-P. 239-45

78. Bier F.F.; Stocklein W.; Bocher M.; Bilitewski U.; Schmid R.D. Use of a Fiber Optic Immunosensor for the Detection of Pesticides.// Sensor.Actuator.B.Chem. -1992.-Vol.7,Is. 1 -3 .-P.509-512.177

79. Birol G., Doruker P., Kirdar B., Onsan Z.I., Ulgen K., Mathematical description of ethanol fermentation by immobilised Saccharomyces cerevisiae., // Process Biochemistry.- 1998.- Vol 33, Iss 7.-P.763-771

80. Botre F.; Lorenti G.; Mazzei F.; Simonetti G.; Porcelli F.; Botre C.; Scibona G. Cholinesterase Based Bioreactor for Determination of Pesticides. // Sensor.Actuator.B.Chem .-1994.- V.19, Is. 1-3 -P.689-693.

81. Brecht A.; Piehler J.; Lang G.; Gauglitz G. Direct Optical Immunosensor for Atrazine Detection//ANAL.CHIM.ACTA.- 1995.-Vol.311,Is.3. P.289-299.

82. Byfleld M.P., Abuknesha R.A. Biochemical aspects of biosensors // Biosens. and Bioelectron. -1994.-Vol.9, N45.-P.373-400.

83. Brown MA, Brix. KA. Review of health consequences from high-, intermediate- and low-level exposure to organophosphorus nerve agents //Applied Toxicology.-1998.- Vol 18, Iss 6.-P.393-408.

84. Byfield M.P., Abuknesha R.A. Biochemical aspects of biosensors // Biosens. and Bioelectron. 1994. -Vol.9.- N 4-5. -P. 373-400.178

85. Campanella L.; Cocco R.; Sammartino M.P.; Tomassett M. A New EnzymeInhibition Sensor for Organophosphorous Pesticides Analysis // Sci.Total.Envir.-1992.-Vol.123, Is.aug. -P.l-16.

86. Campanella L., Beone T., Sammartino M.P. and Tomassetti M. Determination of phenol in wastes and water using an enzyme sensor. //Analyst.- 1993.-№ 118.-P.979-986.

87. Campanella L.; Colapicchioni C.; Favero G.; Sammartino M.P.; Tomassetti M. Organophosphorus Pesticide (Paraoxon) Analysis Using Solid-State Sensors // Sensor.Actuator.B.Chem.- 1996.-Vol.33,Is.l-3.-P.25-35.

88. Cathy Cornett Page Author, October 20, 2000 [e-mail] © 2000, University of Minnesota. All rights reserved.http: // umbbd. ahc. umn.edu/ pthn / pthnmap.html

89. Diaz A.N.; Peinado M.C.R. Sol-Gel Cholinesterase Biosensor for Organophosphorus Pesticide Fluorometric Analysis// Sensor.Actuator.B.Chem.-1997.-Vol.39,Is. 1 -3 .-P.426-431.

90. Dennielson,M.J., Hall,J.M. and Turner,A.P.F. Gas-phase microbiosensor for monitoring phenol vapor at Ppb levels. //Anal.Chem.-1995.-№ 67.-P.3922-3927.

91. Diaz A.N.; Sanchez F.G.; Bracho V.; Lovillo J.; Aguilar A. Enzymatic Determination of Fenitrothion by Cholinesterase and Acetylcholinesterase on Fluorogenic Substrates. // FreseniusJ.Anal.Chem.- 1997.-Vol. 35, Is.7. P. 958961.

92. Domeny Z., Smogrovicova D., Gemeiner P., Sturdik E., Patkova J., Malovikova A. Continuous secondary fermentation using immobilised yeast. // Biotechnology Letters.- 1998.- Vol 20, Iss 11.- P.1041-1045.

93. Eldefrawi M.E.; Eldefrawi A.T.; Anis N.A.; Rogers K.R.; Wong R.B.; Valdes J.J. Fiberoptic Immunosensors for Detection of Pesticides.// ACS.SYMP.SER. -1995.-Vol. 586:197-209.-P. 197-209.

94. Environmental Health Criteria 145. Methyl parathion. World Health Organization, Geneva.- 1993.179

95. Farm Chemicals Handbook, 70th ed. (1984). Eds.: Meister, R. T., Berg, G. L., Sine, C., Meister, S. and Poplyk J., Meister Publishing Co.

96. Felter S. and Dourson M. Human and Ecological Risk Assessment: The Inexact Science of Risk Assessment (and Implications for Risk Management)Toxicology Excellence for Risk Assessment, Cincinnati, OH.-1998.-Vol. 4, N. 2.-P. 245-251.

97. Germanier R., Wuhrmann K. Uber den aeroben microbiellen Abbau aromatischer Nitroverbindungen. // Path. Microbiol.-1963.-Vol.26, № 5.-P.569-578.

98. Griffiths D. and Hall G. Biosensors-what real progress is being made? //Trends in biotechnology -1993.- Vol.11, №4 (111).- P. 122-130.

99. Gundersen K., Jensen H.L. A soil bacterium decomposing aromatic nitrocompounds. //Acta Agric.Scand.-1956.-Vol.6.-P. 100-114.

100. Hallenbeck, W.H. &. Cunningham-Burns K.M. Pesticides and human health. New York: Springer-Verlag. 14.- 1985.

101. Harding, W.C. Pesticide profiles, part one: insecticides., and miticides. Univ. Maryland, Coop. Ext. Serv. Bull. 267. -1979. -30p.

102. Hasan H.A.H., Fungal utilization of organophosphate pesticides and their degradation by Aspergillus flavus and A-sydowii in soil. //Folia Microbiologica.-1999.-Vol 44, Iss 1.-P.77-84.

103. Hasegawa S. Vandercook C.E., Choi G.Y., Herman I., Ou P. Limonoid debittering of citrus juice sera by immobilized cells Corynebactetium fascians //Journal of Food Science.-1991.-Vol.50,-N2.-P.330-332

104. Hatakeyama S. Assessment of overall pesticide effects on river ecosystems. Pesticides and the Future.-1998.- P.315-332.180

105. Hartley, D. and Kidd H., The agrochemicals handbook. Nottingham, England: Royal Society of Chemistry.- 1983.

106. Hayes, W.J. and Laws E.R (ed.). Handbook of Pesticide Toxicology. Classes of Pesticides. Academic Press, Inc., NY.- 1990.- Vol. 3.

107. Hayes W.J., Wayland Jr., Pesticides studied in man. Baltimore, MD: Williams & Wilkins.-1982. Mut. Res. 103 (l).-P.71-76.

108. Hiskia A.E., Atmajidou M.E., Tsipi D.F. Determination of organophosphorus pesticide residues in Greek virgin olive oil by capillary gas chromatography. // Agricultural and Food Chemistry.-1998.-Vol 46, Iss 2.-P.570-574.

109. Hogenboom A.C., Steen RJCA, Niessen WMA, Brinkman UAT. Potential of short-column liquid chromatography with tandem mass spectrometric detection for the rapid study of pesticide degradation //Chromatographia.- 1998.- Vol 48, Iss 7-8.-P.475-480.

110. Howard P.H. Handbook of Environmental Fate and Exposure Data for Organic Chemicals, Vol. Ill: Pesticides. Lewis Publishers, Chelsea, MI.- 1989.

111. Jain R.K., Dreisbach J.H., Spain J.C. Biodégradation of p-nitrophenol via 1,2,4-benzentriol by an Arthrobacter sp. //Appl. Environ. Microbiol.-1994.-Vol. 60, № 8.- P.3030-3032.

112. Jensen H.L., Lautrup-Larsen G. Microorganisms that decompose nitro-aromatic compounds with special referens to dinitro-orto-cresol. //Acta Agric. Scand.-1967.-Vol. 17, № 2-3 .-P. 115-126.181

113. Jeanty G.; Marty J.L. Detection of Paraoxon by Continuous-Flow System Based Enzyme Se//Biosens.Bioelectron.- 1998.-Vol.13, Is.2. -P.213-218.

114. Kadiyala V., Smets B.F., Chandran K., Spain J.C. High affinity p-nitrophenol oxidation by Bacillus sphaericus JS905., //FEMS Microbiology Letters.- 1998.-Vol 166, Iss l.-P.l 15-120.

115. Karube I. Microbial sensor. //J.Biotechnol.-1990.-Vol.l5, N3.- P. 255-267

116. Kim D.H., Heo G.S., Lee D.W. Determination of organophosphorus pesticides in wheat flour by supercritical fluid extraction and gas chromatography with nitrogen-phosphorus detection //Journal of Chromatography A.-1998.- Vol 824, Iss 1.-P.63-70.

117. Krawczyk T.K.V. Analytical Applications of Inhibition of Enzymatic-Reactions. // Chem.Anal. 1998.-Vol. 431.2.- P. 135-158.

118. Ksenevich T.I.; Beloglazov A.A.; Nikitin P.I.; Kalabina N.A.; Zaitsev,S.Y. Study of Biochemical Reactions in Thin Organic Films by Means of Evanescent Optical-Wave // APPL.SURF.SCI. -1996.-Vol.92, Is.feb.-P.426-430.

119. Kumaran S.;Morita M. Application of a Cholinesterase Biosensor to Screen for Organophosphorus Pesticides Extracted from Soil // TALANTA.- 1995.-Vol.42,Is. 4.-P.649-655.

120. Kumar P.K.R., Schugerl K., Immobilization of genetically engineering cells: a new strategy for higher stability //J. Biotechnol.-1990.-Vol.l4.-N.3.-P.255-273.

121. Lee S.; Suzuki M.; Tamiya E.; Karube I. Sensitive Bioluminescent Detection of Pesticides Utilizing a Membrane Mutant of Escherichia-Coli and Recombinant-DNA Technology//Anal.Chim. Acta.- 1992.-Vol.257,Is.2.- P. 183- 188.

122. Leung K.T., Tresse O., Errampalli D., Lee H., Trevors J.T., Mineralization of p-nitrophenol by pentachlorophenol-degrading Sphingomonas spp., // FEMS Microbiology Letters.-1997.-Vol 155, Iss l.-P. 107-114.

123. Madhavi D.R., Umamaheswari A., Venkateswarlu K. Effective concentrations of nitrophenolics toward growth yield of selected microalgae and cyanobacteria isolated from soil. //:Ecotoxicol Environ SafL-1995.-Dec, Iss.3.- P. 205-208.

124. Marty J-L, Sode K.and Karube I. Biosensor for detection of organophosphate and carbamate insecticides. //Electroanalysis.-1992.-N4.- P.249-252.

125. McTavish Hugh, Page Author, November 02, 2000, [e-mail] ©2000, University of Minnesota All rights reserved, http://umbbd.ahc.umn.edu/nphe/nphemap.html

126. Meister R. T., Berg G. L, Sine C., Meister S., and Poplyk J., eds. . Farm Chemicals Handbook, 70th ed. Meister Publishing Co., Willoughby, OH.- 1984.

127. Meister, R.T. (ed.). Farm Chemicals Handbook. Willoughby, OH: Meister Publishing Co.- 1987.

128. Meister R.T. (ed.). Farm Chemicals Handbook '92. Meister Publishing Company, Willoughby, OH.- 1992.

129. Menezes M.L., Felix G. On line extraction and separation of bendiocarb, methomyl, methylparathion, and pentachlorophenol pesticides from raw milk. //Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies.- 1998.-Vol 21, Iss 18.-P.2863-2871.

130. Mills P.K., Correlation analysis of pesticide use data and cancer incidence rates in California counties. Archives of Environmental Health.-1998.-Vol 53, Iss 6.-P.410-413.183

131. Mionetto N.jRouillon R., Marty J-L . Inhibition of acetylcholinesterase by organophosphorus and carbamates compounds. Studies on free and immobilized enzymes.//. Wasser-Abwasser-Forsch.-1992.-N.25 .-P. 171 -174.

132. Morgan, D.P. Recognition and management of pesticide., sonings, 3rd ed. U.S. Environmental Protection.- 1982.

133. Munnecke D.M., Hsieh D.P. From Parathion to Diethylthiophosphoric acid and p-Nitrophenol, // Appl Environ Microbiol.-1976.- 3 l(l).-P.63-69.

134. Nyholm N., Kristensen P. Screening methods for assessment of biodegradability of chemicals in seawater—results from a ring test. // Ecotoxicol Environ. 1992.- Vol. 23, Iss. 2.- P. 161-167.

135. Omkar Dr. Biosensors and their application // Everyman's Sci. -1993. -Vol. 28,N4.-P. 119-123.

136. Ortega F., Domínguez E., Jonssonpettersson G., Gorton L. Amperometric biosensor for the determination of phenolic-compounds using a tyrosinase graphite electrode in a flow-injection system // J. Biotechnol. -1993. -Vol.31. -P.289-300.

137. Palleschi G.; Bernabei M.; Cremisini C.; Mascini M. Determination of Organophosphorus Insecticides with a Choline Electrochemical Biosensor. // Sensor.Actuator.B.Chem.- 1992.-Vol.7, Is.1-3.- P.513-517.

138. Reshetilov A.N., Khomutov S.M., Egorov A.M. FET-Based Immunosensor for Human IgG Detection. Abstracts of Itemational Simposium on Biosensors, March 4-8.-1992.- Moscow. -P.34.184

139. Rechetilov A.N., Iliasov P.V., Filonov A.E., Gayazov R.R., Kosheleva I.A. and Boronin A.M. Pseudomonas-putida as a Receptor Element of Microbial Sensor for Naphthalene Detecion. // Process Biochem.-1997, 32(6).-P.487-493

140. Rokesh J.K., Dreisbach J.H., Spain J.C. Biodégradation of p-nitrophenol via 1,2,4-benzetriol by an Arthrobacter sp. //Appl. And Environ. Microbiol.-1994.- Vol. 60, № 8.-P.3030-3032.

141. Sancho E., Ferrando M.D., Lleo C., AndreuMoliner E. Pesticide toxicokinetics in fish: Accumulation and elimination., Ecotoxicology and Environmental Safety.-1998.- Vol 41, Iss 3.-P.245-250.

142. Secaucus N.J., MSDS for Methyl Parathion. OHS Inc., Occupational Health Services, Inc. 1991 (Feb. 25).

143. Semple KT, Cain RB, Schmidt S., Biodégradation of aromatic compounds by microalgae. //FEMS Microbiology Letters.- 1999,- Vol 170, Iss 2.-P.291-300.

144. Siddaramappa S.-B.R., Rajaram K.P., Sethunathan N.Degradation of paration by bacteria izolated from flooded soil. //Appl. Microbiol.-1973.-Vol.26, № 6.-P.846-849.

145. Spain J.C., Wyss O., Gibson D.T. Enzymatic oxidation of p-nitrophenol. //Biochem. and Biophys. Res. Commun.-1979.-Vol.88, № 2.-P.634-641.185

146. Spain J.C., Gibson D.T. Pathway for Biodégradation of p-nitrophenol in Moraxella sp. //Appl. and Environ.Microbiol.-1991.-Vol.57, №3.-P.812-819.

147. Syracuse N.Y., SCS/ARS/CES Pesticide Properties Database: Version 2.0 (Summary). USDA Soil Conservation Service, U.S. Department of Agriculture, Soil Conservation Service. 1990 (Nov.).

148. Szymczyk K., Malczewska M. Gas chromatography analysis of organophosphorous pesticides in plant samples. // Chromatographia.-1998.-Vol 48, Iss 1-2.-P.156-157

149. The British Crop Protection Council, The Pesticide Manual: A World Compendium, 7th ed. (1983). Ed.: Worthing C.R.,Croydon, England.-695p.

150. Thomson, W. T. Agricultural chemicals book 1: insecticides, acaricides, and ovicides. Revised ed. Thomson., Publ., Indianapolis, IN. -1976.-232p.

151. Thouand G., Friant P., Bois F., Cartier A., Maul A., Block J.C. Bacterial inoculum density and probability of para-nitrophenol biodegradability test response. // Ecotoxicol Environ.-1995.- Vol.30, Iss.3.- P.274-282

152. Tresse O., Errampalli D., Kostrzynska M., Leung K.T., Lee H., Trevors J.T., Elsas J.D. van. Green fluorescent protein as a visual marker in a p-nitrophenol degrading Moraxella sp., //FEMS Microbiology Letters.- 1998.- Vol 164, Iss l.-P. 187-193.

153. US Environmental Protection Agency. (Fall). National Pesticide Survey: 4-Nitrophenol. Office of Water, Office of Pesticides and Toxic Substances, US EPA, Washington, DC.- 1990.

154. Villatte F.; Marcel V.;Estradamodaca S.;Fournier D. Engineering Sensitive Acetylcholinesterase for Detection of Organophosphate and Carbamate Insecticides //BIOSENS.BIOELECTRON.- 1998.-Vol.13, Is.2.- P.157-164.

155. Witte C.P., Blasco R., Castillo F. Microbial photodegradation of aminoarenes metabolism of 2-amino-4-nitrophenol by Rhodobacter capsulatus. //Applied Biochemistry and Biotechnology.-1998.- Vol 69, Iss 3.- P.191-202.

156. Worthing, C.R. The pesticide manual: A world compendium. 8th The British Crop Protection Council. Croydon England.-1987.российское агентствопо патентам и товарным знакам (роспатент)

157. ФЕДЕРАЛЬНЫЙ ИНСТИТУТ 1РОМЫШЛЕННОЙ СОБСТВЕННОСТИгжковская наб., 30, корп. 1, Москва, Г-59, ГСП-5, 123995 елефон 240 60 15. Телекс 114818 ПДЧ. Факс [phone]. ОТ

158. Наш № 2000111945/13(012357)переписке просим ссылаться на номер заявки и щить дату получения данной корреспонденции1. Ф И п С1 7 МАЙ ¿00! ОТДЕЛ №131. Форма №01ИЗ,ПМ-98(74)

159. ВГобОО, г. Саратов, ул. Советская,60, Саратовский ГАУ им. Вавилова, УНПЦ «Волгоагротехника», патентная группаL