Получение производных высоко- и низкомолекулярного хитозана: физико-химические свойства и биологическая активность тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.06, кандидат химических наук Степнова, Евгения Александровна

• Степнова, Евгения Александровна
• кандидат химических наук
• 2009

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение производных высоко- и низкомолекулярного хитозана: физико-химические свойства и биологическая активность»

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.9

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.10

1.1 Природные полисахариды хитин и хитозан: строение, физико-химические свойства и применение.10

1.1.1. Строение и физико-химические свойства.10

1.1.2. Области применения хитозана.13

1.1.2.1. Применение хитозана и его производных в медицине.13

1.1.2.2. Доставка лекарственных средств.15

1.1.2.3. Применение хитозана в косметике.15

1.1.2.4. Применение хитозана в пищевой промышленности.16

1.1.2.5. Очистка сточных вод.16

1.2. Получение хитина и хитозана из различных источников .16

1.2.1. Выделение хитозана из ракообразных и моллюсков.18

1.2.2. Получение хитина и хитозана из грибов.21

1.2.3. Получение хитина и хитозана из других источников. 23

1.3. Способы деполимеризации хитозана.23

1.3.1. Химические способы деполимеризации.23

1.3.1.1 Кислотный гидролиз.23

1.3.1.2. Окислительная деполимеризация.25

1.3.1.2.1. Перекись водорода.25

1.3.1.2.2. Азотистая кислота.27

1.3.2. Ферментативные способы деполимеризации хитозана .28

1.4. Активность хитозана и его производных.29

1.4.1. Антибактериальная активность.30

1.4.2. Фунгицидная активность хитозана и его производных. 33

1.4.3. Противовирусная активность хитозана.36

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.38

2.1. Материалы и методы.38

2.1.1. Исходные материалы.38

2.1.2. Определение молекулярной массы.38

2.1.3. Культуры для противомикробных тестов.39

2.1 АОпределение фунгицидной активности.39

2.1.5. Прорастание конидий F. oxysporum.40

2.1.6. Измерение поверхностного натяжения растворов.40

2.1.7. Динамическое рассеяние света.40

2.1.8. Определение пенообразующей способности растворов.41

2.1.9. Измерение вязкости растворов.42

2.1.10. Спектрофотометрические измерения.42

2.2. Выделение хитина и получение хитозана.43

2.3. Получение М-[2(3)-(додец-2,-ен-1'-ил) сукциноил] хитозана.43

2.4. Получение Щ2(3)-(додец-2'-ен-Г-ил)сукциноил] хитина .44

2.5. Титрование N-[2(3)-( додец-2'-ен-Г-ил)сукциноил]хитина .44

2.6. Кватернизация хитозана. .44

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.46

3.1. Выделение хитина из различных источников и получение хитозана.46

3.1.1. Измельчение.47

3.1.2. Депротеинизация.48

3.1.3. Деминерализация.49

3.1.4. Обесцвечивание.53

3.1.5. Деацетилирование.54

3.2. Синтез гидрофобномодифицированных хитозанов и изучение их свойств.59

3.2.1. Модификация хитозана (2-додецен-1-ил)янтарным ангидридом.59

3.2.2. Анализ полученных соединений.61

3.2.3. Изучение реологических свойств растворов N-[2(3)-(додец-2'-ен-1'-ил) сукциноил] хитозана.66

3.2.4. Поверхностно-активные свойства растворов N-[2(3)-(додец-2'-ен-Г-ил) сукциноил] хитозана.69

3.2.5. Изучение пенообразующих свойств №[2(3)-(додец-2'-ен-l'-ил) сукциноил] хитозана в водных растворах.70

3.2.6. Изучение ассоциации №[2(3)-додец-2'-ен-1'-ил) сукциноил]хитозана в водных растворах.73

3.3. Деполимеризация хитозана и К-[2(3)-(додец-2,-ен-1,-ил) сукциноил] хитозана.74

3.4. Кватернизация хитозана, олигохитозана и ^[2(3)-(додец-2'-ен-1'-ил) сукциноил] хитозана.79

3.4.1. История проблемы.79

3.4.2. Метод смешанных ангидридов.84

3.4.3. Карбодиимидный метод.85

3.4.4. Использование 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина в методе смешанных ангидридов.86

3.4.5. Получение и изучение строения кватернизованных хитозанов.88

3.4.5.1. Кватернизацш хитозана.88

3.4.5.2. Кватернизация Н-[2(3)-додец-2'-ен-Г-ил) сукциноил]хитозана .95

3.5. Биологическая активность хитозана и ]Ч-[2(3)-додец-2'-ен-1'-ил) сукциноил]хитозана.102

3.5.1. Описание тестируемых микроорганизмов.104

3.5.2. Результаты определения микробиологической активности.108

3.5.2.1. Фунгистатическая активность низкомолекулярного хитозана .108

3.5.2.2. Фунгицидная и антибактериальная активность низкомолекулярного хитозана и его производных.119

3.5.2.3. Бактерицидная активность низкомолекулярного хитозана и его Ы-[2(3)-додец-2'-ен-Г-ил) сукциноил] производного.122

4. ВЫВОДЫ.126

5. ЛИТЕРАТУРА.128

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Хитозан - нетоксичный, биодеградируемый полимер. Несмотря на то, что хитозан привлекает внимание ученых уже сравнительно давно, свойства этого уникального полимера до конца не изучены.

В ряде областей применение хитозана ограничено из-за его высокого молекулярного веса и, как следствие, низкой растворимости в воде и разбавленных кислотах, а также высокой вязкости растворов даже при низких концентрациях хитозана. Медицинское применение нашли хитозаны низкого молекулярного веса с высокой растворимостью и низкой вязкостью водных растворов при физиологических значениях рН. Микробиологическая активность хитозана была определена в отношении ряда микроорганизмов. Однако эти исследования показали, что биологическая активность хитозана сложным образом зависит от его молекулярного веса и степени ацетилиро-вания. Указанные факторы влияют не только на растворимость хитозана, но и на взаимодействие макромолекул хитозана с клеточной стенкой микроорганизмов. Амфифильные производные хитозана, которые находят применение в качестве загустителей, поверхностно-активных веществ и пенообразователей обладают пониженной растворимостью по сравнению с самим хитозаном. В связи с этим получение новых производных хитозана, обладающих повышенной растворимостью и биологической активностью, является актуальной научной и практической задачей.

Цели и задачи исследования. Целью работы являлось получение амфи-фильных производных высоко- (ВМ) и низкомолекулярного (НМ) хитозана, изучение их физико-химических и биологических свойств в сравнении с немодифицированным хитозаном. Для достижения данной цели нами были определены основные задачи:

1. проанализировать имеющиеся источники хитина и выбрать предпочтительные источники и параметры их обработки для получения хитозана;

2. согласно выбранным параметрам осуществить переработку биоотходов, содержащих хитин;

3. разработать методику получения амфифильных производных хитоза-на, обладающих повышенной растворимостью, и изучить их основные физико-химические свойства;

4. разработать методику модификации хитозана и его амфифильных производных путем селективного введения бетаиноильных групп для увеличения растворимости при физиологических значениях рН;

5. разработать методику получения и получить серию низкомолекулярных хитозанов и их амфифильных производных для изучения влияния молекулярной массы и степени замещения на их свойства;

6. исследовать активность полученных соединений против ряда бактерий, дрожжей и грибов.

Научная новизна работы

1. Разработана оригинальная технология получения амфифильно-го производного хитозана - 1\Г-[2(3)-(додец-2-ен-1-ил)сукциноил]хитозана, обладающего повышенной растворимостью, и изучены его физико-химические свойства;

2. Предложен новый метод кватернизации хитозана и его амфифильных производных с использованием 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина в качестве конденсирующего агента, который позволяет вводить бетаиноильные группы селективно по аминогруппам хитозана и получать производные хитозана растворимые при физиологических значениях рН;

3. Впервые обнаружено и подтверждено химическими и физико-химическими методами, что 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин способен взаимодействовать с аминогруппами хитозана с образованием М-(этоксикарбонил)хитозана;

4. Впервые получен ряд амфифильных производных низкомолекулярного хитозана и показана зависимость их физико-химических свойств и биологической активности от степени замещения.

Практическая значимость работы

1. Показано, что среди ряда исследованных источников хитина предпочтительным источником для получения хитозана медицинского назначения является гладиус кальмара;

2. Разработана методика получения низкомолекулярного хитозана с высокими выходами и низкой полидисперсностью из производимого в больших количествах высокомолекулярного хитозана;

3. Получены амфифильные и кватернизованные производные хитозана, которые могут быть использованы в качестве носителей биологически активных веществ. Гидрофобные лекарственные средства могут быть солюбилизированы внутри агрегатов таких частиц, а противоположно заряженные (анионные) полиэлектролиты, такие как ДНК, могут образовывать комплексы с такими производными при физиологических значениях рН;

4. Показано, что полученные соединения обладают высокой биологической активностью по отношению к некоторым видам бактерий и грибов, особенно по отношению к Candida kruisei и Penicillium ver-moesenii.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Восьмой и Девятой Международных конференциях «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», Казань, 14-16 июня 2006 и Ставрополь, 13-17 октября 2008, VI съезде биотехнологов России, Пущино, 6-7 декабря 2006, Молодежной конференции "Молекулярный дизайн и синтез веществ с заданной физиологической активностью", 15 ноября 2006, МГУ; на молодежном конкурсе ИНЭОС РАН 2006. Работа была удостоена 1 премии имени академика П.П. Шорыгина на ежегодном конкурсе работ молодых ученых в области хитина и хитозана Российского хитинового общества в 2007 году.

Личный вклад соискателя.

Экспериментальные исследования выполнены автором самостоятельно. Определение молекулярных масс и антибактериальной активности хитоза-нов проводили совместно с лабораторией инженерии ферментов проф. Варламова В.П. (Центр Биоинженерии РАН). Выделение хитозана из креветки южноатлантической (Cragnon cragnon), кальмара (Loligo vulgaris), каракатицы (Sepia officinalis), моллюсков (Mytilus galloprovincialis и Cerastroderma edule) проводили на базе Лаборатории патологии растений (Департамент морских наук и прикладной биологии, Университет г. Аликанте, Испания). Определение размера частиц кватернизованных хитозанов проводили на базе Лаборатории фармацевтического факультета института Луи Пастера, г. Страсбург, Франция.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 6 статей в рецензируемых российских (3) и зарубежных журналах (3), 1 статья в сборнике трудов Российского хитинового общества, 2 тезисов докладов на научный конференциях.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, раздела с обсуждением экспериментальных результатов, методической части, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 38 рисунков, библиографию из 153 наименований.

Заключение диссертации по теме «Высокомолекулярные соединения», Степнова, Евгения Александровна

4. ВЫВОДЫ

1. Показано, что перспективным источником для получения хитина является гладиус кальмара.

2. Разработана методика получения амфифильных производных хитозана, содержащих додеценильные и карбоксильные группы и обладающих повышенной растворимостью, и изучены их основные физико-химические свойства;

3. Разработана методика кислотного гидролиза хитозана и получен ряд низкомолекулярных хитозанов с Mw 0.7—20 кДа, а также низкомолекулярные производные хитозана, содержащие N-(додеценил)сукциноильные группы, с низкой полидисперсностью 1,2-1,9 и выходом 50-70 %;

4. Взаимодействием хитозана и его амфифильных производных, содержащих додеценильные группы, с бетаином при действии 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина разработана новая методика кватернизации этих соединений, что позволяет использовать их при физиологических значениях рН;

5. Впервые показана возможность взаимодействия конденсирующего агента 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина с аминогруппами хитозана, приводящего к образованию N-этоксикарбонилхитозана;

6. Изучена фунгицидная и бактерицидная активость низкомолекулярных хитозанов и их додеценилсукциноильных производных по отношению к ряду фитопатогенных грибов, к дрожжеподобным грибам C.krusei и ряду Грам-положительных и Грам-отрицательных бактерий. Показано, что максимальной активностью обладают амфифильные производные хитозана, содержащие 5-9 мол.% додеценильных групп. При сравнении активности ряда низкомолекулярных хитозанов по отношению к

Penicillium vermoesenii было продемонстрировано, что наибольшей активностью обладают хитозаны с молекулярной массой от 4 до 10 кДа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Степнова, Евгения Александровна, 2009 год

1. Larry L.H. Biomaterials: a forecast for the future // Biomaterials. - 1998.-V.19.-P. 1419.

2. Cauchie H-M.Chitin production by arthropods in hydrosphere // Hydrobiolo-gia.- 2002.-V. 470. P. 63.

3. Гамзазаде А.И. Структурная неоднородность как фактор изменчивости свойств хитина и хитозана // приведено в «Хитин и хитозан. Получения, свойства и применение» Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П.-М: Наука.-2002.-С. 112-118.

4. Tolaimate A., Desbrieres J., Rhazi М., Alagui A., Vincendon М., Vottero P., On the influence of deacetylation process on the phycochemical characteristics of chitosan from squid chitin // Polymer.- 2001.-V.41, №7.- C. 2463.

5. Zhang M., Haga A., Sekiguchi H., Hirano S. Structure of insect chitin isolated from beetle larva cuticle and silkworm (Bombyx mori) pupa exuvia// Int. J. Biological Macromolecules.- 2000.-V.-27, №1.- P. 99.

6. Феофилова Е.П. //Клеточная стенка грибов-М.; Наука.- 1983.-С. 248.

7. Нудьга JI.A. Производные хитина и хитозана и их свойства // приведено в «Хитин и хитозан. Получения, свойства и применение» Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П.-М: Наука.- 2002.-С. 141-177.

8. Тихонов B.E. Определение терминов в области хитина и хитозана // Материалы Девятой Международной конференции Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана Ставрополь, 13-17 октября, 2008.-, С. 42-48.

9. Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli С., Terbojevich М. Chitin chemistry upgrading renewable resource // Carbohydrates in Europe.- 1997.- V.I.- C. 10.

10. Baxter A., Dillon M., Taylor K.D.A., Roberts G.A.F. Improved method for IR determination of the degree of N-acetylation of chitosan // Int. J. Biol. Mac-romol.- 1992.-V.14.-P. 166.

11. Maghami G.A., Roberts G.A.F. Studies on the adsorption of anionic dyes on chitosan // Macromol. Chem. 1988.- V. 189.- P 2239.

12. Domard A. Circular dichroism study on Nacetylglucosamine oligomers // Int. J. Biol. Macromol.- 1986.- V.8.- P. 243.

13. Domard A. pH and c.d. measurements on a fully deacetylated chitosan: application to Cun-polymer interactions // Int. J. Biol. Macromol.- 1987.- V.9.-P. 98.

14. Wei Y.C., Hudson S.M. Binding of sodium dodecyl sulfate to a polyelectro-lyte based chitosan // Macromolecules.- 1993.- V.26.- P. 4151.

15. Sashiwa H., Saimoto H., Shigemasa Y., Ogawa R., Tokura S. Distribution of the acetamido group in partially deacetylated chitins // Carbohydr. Polym.-1991.-V.16.-P.291.

16. Sashiwa H., Saimoto H., Shigemasa Y., Tokura S. N-Acetyl group distribution in partially deacetylated chitins prepared under homogeneous conditions // Carbohydr. Res.- 1993.- V. 242.- P. 167.

17. Raymond L., Morin F.G., Marchessault R.H. Degree of deacetylation of chitosan using conductometric titration and solid-state NMR // Carbohydr. Res.-. 1993.- V.243.- P. 331.

18. Niola F., Basora N., Chornet E., Vidal P.F. A rapid method for the determination of the degree of N-acetylation of chitin-chitosan sample by acid hydrolysis and HPLC // J. Therm. Anal.- 1983.- V.28.- P. 189.

19. Majeti N.V., Kumar R. A rewiew of chitin and chitosan applications // Re-act.&Funct. Polym.- 2000.- V. 46.- P. 1.

20. Kumar А. В. V., Tharanathan R. N., A comparative study on depolymeriza-tion of chitosan by proteolyc enzymes // Carbohydrate polymers.- 2004.-V. 58, №3.-P. 275.

21. Pangburn S.H., Trescony P.V., Heller J. Lysozyme degradation of partially deacetylated chitin, its films and hydrogels // Biomaterials.- 1982.-V. 3, № 2.- P. 105.

22. Ильина A.B., Варламов В.П. Полиэлектролитные комплексы хитозана обзор //Прикладная биохимия и микробиологияю.- 2005.- 41 № 1.- С. 5.

23. Biangini G., Bertani A., Muzzarelli R., Damadei A., DiBenedetto G., Belligolli A., Riccotti R., Zucchini C., Rizzoli C. Wound management with N-carboxybutyl chitosan // Biomaterials.- 1991.- V.72, № 3.- P. 281.

24. Ilium L., Gill J., Hinchcliffe M., Fisher A.N., Davis S.S. Chitosan as novel nasal delivery system for vaccines // Adv. Drug Deliv. Rev.- 2001.- V. 51.-P. 81.

25. Thanou M., Florea B.I., Geldof M., Junginger H.E., Borchard G. Quater-nized chitosan oligomers as novel gene delivery vectors in epithelial cell lines // Biomaterials.- 2002.- V. 23, P. 153.

26. Kim Y.H., Gihm S.H., Park C. R. Structural characteristics of size-controlled self-aggregates of deoxycholic acid-modified chitosan and their application as a DNA delivery carrier // Bioconjugate Chem.- 2001.- V. 12.-P. 932.

27. Knorr D. Recovery and utilization of chitin and chitosan in food processing waste management // Food Technol.-1991.-Jan.- P. 114.

28. Nair K.G.R., Madhavan P. Chitosan for removal of mercury from water // Fishery Tech.- 1984.- V. 21.- P. 109.

29. Percot A., Vilton C. & Domard A. Optimiation of chitin extraction from shrimp shells // Biomacromolecules.- 2003.- V. 4.- P. 12.

30. Aye K.N.& Stevens W.F. Improved chitin production by pretreatment of shrimp shells // Journal of Chemical Technology and Biotechnology.- 2004.-V.79.- P. 421.

31. Kurita K., Tada Т., Ishii S., Nishimura S-I.& Shimoda K. Squid chitin as potential alternative chitin source: deacetylation behavior and characteristic properties // Journal of Polymer science Part A: Polymer chemistry.- 1993.- V. 31.- P. 485.

32. Zentz F., Bedouet L., Almeida M. J., Milet C., Lopez E. & Giraud M. Characterization and quantification of chitosan extracted from nacre of the abalone Haliotis tuberculata and the oyster Pinctada maxima // Marine Biotechnology.-2001.- V.3.- P. 36.

33. Куприна Е.Э., Водолажская C.B. Способы получения и активации хитина и хитозана // приведено в «Хитин и хитозан. Получения, свойства и применение» Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П.-М: Наука.- 2002.- С. 44-63.

34. Zaworska М. & Konieczna Е. The influence of supplemental components in nutrient medium on chitosan formation by the fungus Absidia orchidi // Applied Microbiology and Biotechnology.- 2001.- V. 56.- P. 220.

35. Andrade V. S., Neto B.B., Souza W. & Campos-Takaki G. M. A factorial design analisis of chitin production by Cunninghamella elegans // Canadian Journal of Microbiology.- 2000.-V. 46.- P. 1042.

36. Nadarajah К., Kader J., Mazmira M. & Paul D. C. Production of chitosan by fungi // Pakistan Journal of Biological Sciences.- 2001.- V. 4, № 3.- P. 263.

37. Da Silva-Amorim R.V., Souza W., Fukushima K. & Campos-Takaki G. M. Faster chitosan production by Mucoralean strains in submerged culture // Brazilian Journal of Microbiology.- 2001.- V. 32.- P. 20.

38. Hu K-J., Hu J-L., Ho K-P. & Yeung K-W. Screening of fungi for chitosan producers and copper adsorption capacity of fungal chitosan and chitosanaceous materials // Carbohydrate Polymers.- 2004.- V. 58.- P. 45.

39. Synowiecki J.& Al-Khateeb N.A.Q. Mycelia of Mucor rouxii as a source of chitin and chitosan // Food Chemistry.- 1997.- V. 60, № 4.- P. 605.

40. Немцев C.B., Зуева О.Ю., Хисматуллин Р.Г., Хисматуллин М.Р., Лари-ков В.В., Варламов В.П. Хитозан из подмора пчел- новый продукт пчел // Пчеловодство.- 2001.- V. 5.- С. 50.

41. Феофилова Е. П. Ключевая роль хитина в образовании клеточной стенки грибов // приведено в «Хитин и хитозан. Получения, свойства и применение» Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П.-М: Наука.- 2002.- С. 91-99.

42. Varum К.М., Ottoy М.Н., Smidsrod О. Acid hydrolysis of chitosan // Carbhyd. Polymers.- 2001.- V. 46.- P. 89.

43. Nagasawa K., Tohira Y., Tanoura N. Reaction between carbohydrates and sulfuric acids // Carbohydr. Res.- 1971.-V. 18.- P. 95.

44. Hasegawa M., Isogai A., Onabe F. Preparation of low-molecular-weight chitosan using phosphoric acid // Carbohydr. Polym.- 1993.- V. 20.- P. 279.

45. Qin C.Q., Du Y.M., Xiao L. Effect of hydrogen peroxide treatment on the molecular weight and structure of chitosan // Polymer Degradation and Stability.-2002.- V. 76.- P. 211.

46. Liang K., Chang В., Tai M.-C. and Cheng F.-H. Kinetics and Products of the Degradation of Chitosan by Hydrogen // J.Agric. Food Chem.- 2001.- V. 49.-P. 4845.

47. Tian F., Liu Y., Ни K., Zhao В. Study of the depolymerization behavior of chitosan by hydrogen peroxide // Carbohydrate Polymers.- 2004,- V. 57.- P. 31.

48. Муллагалиев И.Р., Кабальнова H.H., Галиаскарова Г.Г., Покало Е.И., Шерешовец В.В., Монаков Ю.Б. Окислительная деструкция хитозана при озонировании // Журнал прикладной химии.- 1997.- Т. 70, №10.- С. 1709.

49. Tommeraas К., Varum К. М., Christensen В. Е., Smidsrod О. Preperation and characterisation of oligosaccharides produced by nitrous acid depolymerisa-tion of chitosans // Carbohydr. Research.- 2001.- V. 333,- P. 137.

50. Allan G., Peyron M. Molecular weight manipulation of chitosan I: kinetics of depolymerization by nitrous acid // Carbohydr. Research. 1995.- V. 277.- P. 257.

51. Howard M.B., Ekborg N.A., Weiner R.M., Hutcheson S.W. Detection and characterization of chitinases and other chitin-modifying enzymes // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.- 2003.- V. 30, №11.- P. 627.

52. Zang H., Neau S.H. In vitro degradation of chitosan by commercial enzyme preparation: effect of molecular weight and degree of deacetylation // Biomate-rials.- 2001.- V. 22.-P. 1653.

53. Zang H., Du Y., Hu Y., Mitsutomi M., Aiba S. Preparation of chitooligo-saccharides from chitosan by a complex enzyme // Carbohyd. Res.- 1999.- V. 320.-P. 257.

54. Kumar A.B., Varadaraj R.G., Lalitha R.G., Yharanathan R.N. Low molecular weight chitosans: preparation with aid of papain and characterization // Bio-chim. Biophy. A.- 2004.- V. 1670.- P. 137.

55. Muzarelli R.A.A., Wenshui X., Tomasetti M., Ilari P. Depolymerization of chitosan and substituted chitosans with the aid of a wheat germ lipase preparation //Enz. Microb. Technol.- 1995.- V. 17, № 6.- P. 541.

56. Kittur F., Kumar A.B., Gowda L.R., Tharanathan R.N. Chitosanolysis by pectinase isozyme of Aspergillus niger- a non-specific activity // Carbohydr. Po-lym.- 2003.-V. 53.-P. 191.

57. Ragnhild J., Kjell N, Varum M.& Smidsrod O. Degradation of fully water-soluble, partially N-acetylated chitosans with lysozyme // Carbohydr. Polymers.-1994.- V. 23.- P. 253.

58. Varum K.M., Holme H.K., Izume ml, Stokke B.T.& Smidsrod O. Determination of enzymatic hydrolysis specifity of partially N-acetylated chitosans // Biochemica et Biophysica Acta.- 1996.- V., 1291.- P. 5.

59. Давыдова B.H., Ермак И.М., Гобарча В.И. Взаимодействие бактериальных эндотоксинов с хитозаном. Влияние структуры эндотоксина, молекулярной массы хитозана и ионной силы раствора на процесс комплексоооб-разования // Биохимия.- 2000.- V. 65.- Р. 1278.

60. Vaara М. Agents that increase the permeability of the outer membrane // Microbiol. Revs.- 1992.- V. 56, №3.- P. 395.

61. Wang G.H. Inhibition and inactivation of five species of foodborne pathogens by chitosan // J. Food Prot.- 1992.- V. 55.- P. 916.

62. Yalpani M., Johnson F., Robinson L.E. Antimicrobial activity of some chitosan derivatives // In: Brine С J., Sandford P.A., Zikakis J.P. (Eds.), Advances in Chitin and Chitosan.- 1992.- Elsever, London, P. 543-548.

63. Tsai G.J., Su W.H. Antimicrobial activity of shrimp chitosan against Escherichia coli // J. Food Prot.- 1999.- V. 62.- P. 239.

64. No K.H., Park N.Y., Lee S.H., Meyers S.P. Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights // International J of Food Microbiology.- 2002.- V. 74.- P. 65.

65. Jeon Y.J., Park P.J., Kim S.K. Antimicrobial effect of chitooligosaccharides produced by bioreactor // Carbohydr. Polym.- 2001.- V. 44.- P. 71.

66. Jung B.-O., Kim C.-H., Choi K.-S., Lee Y. M., Kim J.-J. Preparation of am-phiphilic and their antimicrobial activities // Applied Polymer Science.- V. 72, № 3.-P. 1713.

67. Jia Z., Shen D., Xu W. Synthesis and antibacterial activities of quaternary ammonium salt of chitosan // Carbohydrate Research.- 2001.- V. 333.- P. 1.

68. Ignatova M., Starbova K., Markova N., Malonova N., Rashkov I. Elec-trospun nano-fibre mats with antibacterial properties from quaternised chitosan and poly(vinylalcohol) // Carbohydrate Research.- 2006.- V. 341.-P. 2098.

69. Benhamou N. Elicitor-induced plant defence pathways // Trends Plant Sci.-1996.- V.I.- P. 233.

70. Cheah L.H., Page B.B.C., Sheperd R. Chitosan coating for inhibition of sclerotina carrots //N. Z. J. Crop Hort. Sci.- 1997.- V. 25. P. 89.

71. Liu X.F., Guan Y.L., Yang D.Z., Li Z., Yao K.D. Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan // J. Appl. Polym. Sci.- 2001.- V. 79.-P. 1324.

72. Stossel P., Leuba J. A. Effect of chitosan, chitin and some amminosugars on growth of various soilborne phytopathogenic fungi // Physiopathology.- 1984.- V. Ill, № 1.- P. 82.

73. Cuero R.G., Osuji G., Washington A, N-carboxymethylchitosan inhibition of aflatoxin production: role of zinc // Biotechnol. Lett.- 1991.- V. 13, № 6.- P. 441.

74. Laflamme P., Benhamou N., Bussieres G., Dessureault M. Differential effect of chitosan on root rot fungal pathogens in forest nurseries // Can J. Bot. 1999.-V. 77.- P. 1460.

75. El Ghaouth A., Pannampalam R., Castaigne F., Arul J. Chitosan Coating to Extend the Storage Life of Tomatoes // J. Hortscience.- 1992.- V. 27.- P. 1016.

76. Reddy В., Arul J., Angers P., Couture L. Chitosan Treatment of Wheat Seeds Induces Resistance to Fusarium graminearum and Improves Seed Quality // J. Agric. Food Chem.- 1999.- V. 47, № 3,- P. 1208.

77. Freepons D. // In Application of Chitin and Chitosan; Goosen M.F.A., Ed.; Technomic.- 1997.- Basel, Swizerland.- P. 129.

78. Guo Z., Chen R., Xing R., Liu S., Wang P., Li C., Li P. Novel derivatives of chitosan and their antifungal activities in vitro // Carbohydrate Research.- 2006.-V. 341.- P. 351.

79. Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C., Tarsi R., Miliani M., Gabbanelli F., Cartolari M. Fungistatic activity of modified chitosans against Saprolegnia parasitica // Biomacromolecules.- 2001,- V. 2.- P. 165.

80. Чирков C.H. Противовирусные свойства хитозана // приведено в «Хитин и хитозан. Получения, свойства и применение» Под ред. Скрябина К.Г., Вихоревой Г.А., Варламова В.П.-М: Наука.- 2002.- С. 327-338.

81. Pospieszny Н., Chirkov S., Atabekov J. Induction of antiviral resistance in plant by chitosan // Plant. Sci.-1991- V. 79.- P. 64.

82. Сургучова Н.А., Варитсев Ю.А., Чирков Н.А. Хитозан ингибитор системных вирусных инфекций картофеля и томатов // Журнал Российского фитопатологического обществаю- 2000.- Т. 1.- Р. 59.

83. Pospieszny Н., Atabekov J. Effect of chitosan on the hypersensitive reaction of bean to alfalfa mosaic virus // Plant Sci.- 1989.- V. 62.- P. 29.

84. Gama Sosa M.A., Fazely F., Koch J.A. N-Carboxymethylchitosan-N,0-sulfate as an anti-HTV-l agent // Biochem. Biophys. Res. Comm.- 1991.- V. 174, № 2.- P. 489.

85. Pastor de Abram A. Qitina у Quitosano: abtencion, carecterizacion у aplicaciones // Pontifica Universidad Catolica del Peru.- 2004.- Lima-Peru.- P. 105.

86. Babak V G., Rinaudo M., Desbrieres J., Vikhoreva G.A., Michalski M.G. The effect of alkyl length of a polysoap on the surface activity of its complexes with cationic surfactants // Mendeleev Commun.- 1997.-V 4.- P. 149.

87. Philippova O.E., Volkov E.V., Sitnikova N.L., Khokhlov A.R. Two types of hydrophobic aggregates in aqueous solutions of chitosan and its hydrophobic derivative // Biomacromolecules.- 2001.- V. 2.- P. 483.

88. Miwa A., Ishibe A., Nakano M., Yamahira Т., Itai S., Jinno S., Kawahara H., Development of novel chitosan derivatives as micellar carriers of Taxol // Pharm. Res.- 1998.-V. 15.-P. 1844.

89. Lee K.Y., Kim J.-H., Kwon I.C., Jeong S.Y. Self-aggregates of deoxy-cholic acid-modified chitosan as a novel carrier of Adriamycin // Colloid Po-lym.Sci.- 2000.- V. 278.- P. 1216.

90. Lee K.Y., Kwon I.C., Kim J.-H., Jo W.H., Jeong S.Y. Preparation of chitosan self-aggregates as a gene delivery system // J. Controlled Release.- 1998.- V. 51.- P. 213.

91. Sakairi N. Synthesis of a novel polymeric surfactant by reductive N-alkylation of chitosan with 3-O-dodecyl-D-glucose // Polymer.- 2004.- V. 45,- P. 837.

92. Saito K., Tanioka A. Polyamphoteric membrane study: potentiometric behaviour of succinyl chitosan aqueous solution // Polymer.- 1996,- V. 37.- P. 5117.

93. Kato Y., Onishi H., Machida Y. Depolymerization of N-succinyl-chitosan by hydrochloric acid // Carbohydr. Res.- 2002.- V. 337.- P. 561.

94. Holme K.R., Perlin A.S. Chitosan N-sulfate: a water-soluble poyelectro-lyte // Carbohydr. Res.- 1997.- V. 302.- P. 7.

95. Hu Y., Jiang X., Ding Y., Ge H., Yuan Y., Yang C. Synthesis and characterization of chitosan-poly(acrylic acid) nanoparticles // Biomaterials.- 2002.-V. 23.-P. 3193.

96. Hirano S., Ohe Y., Ono H. Selective N-acylation of chitosan // Carbohydr. Res.- 1976.-V 47.- P. 315.

97. Babak V.G., Desbrieres J., Tikhonov V.E. Dynamic surface tension and dilational viscoelasticity of adsorption layers of a hydrophobically modified chitosan // Colloids and Surface A: Physicochemical and Engeneering Aspects.-2005.-V. 255.-P. 119.

98. Desbrieres J., Rinaudo M., Babak V., Vikhoreva G. Surface activity of water soluble amphiphilic chitin derivatives // Polym. Bull.- 1997- V. 39.- P. 209.

99. Babak V., Lukina I., Vikhoreva G., Desbrieres J., Rinaudo M. Inter-facial properties of dynamic association between chitin derivatives and surfactants // Colloids & Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects.- 1999.- V. 147.-P. 139.

100. Babak V.G., Desbrieres J. Dilational viscoelasticity of the adsorption layers of hydrophobically modified chitosans // Mendeleev Commun.- 2005.- P. 35.

101. Благодатских И.В., Молодцова Ю.А., Позднякова Ю.А., Щеголихина О.И., Хохлов А.Р. Нанодисперсные системы как переходное состояние при формировании кристаллических органометаллосилоксанов // Коллоидный журнал.- 2008.- V. 70, № 4.- Р. 447.

102. Muzzarelli R., Tarsi R., Filippini О., Giovanetti E., Biagini G., & Varaldo P.E. Antimicrobial properties of N-carboxy-butylchitosan // Antimicrobial Agents & Chemotherapy.- 1990.- V. 34.- P. 2019.

103. Rhoades J., & Roller S. Antimicrobial actions of degraded and native chitosan against spoilage organisms in laboratory media and foods // Applied & Environmental Microbiology.- 2000.- V. 66.- P. 80.

104. Muzzarelli R.A.A., Muzzarelli C., Tarsi R., Miliani M., Gabbanelli F. & Cartolari M. Fungistatic activity of modified chitosans against Saprolegnia parasitica // Biomacromolecules.- 2001.- V. 2.- P. 165.

105. Badawy M.E.I, Rabea E.I., Rogge T.M., Stevens C.V., Smagghe G., Steur-baut W.& Hofte M. Synthesis and fungicidal activity of new N,0-acyl chitosan derivatives // Biomacromolecules.-2004.- V. 5.- P. 589.

106. Rabea E.I., Badawy M.E.T., Stevens C.V., Smagghe G. & Steurbaut W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action // Biomacromolecules.- 2003.- V.4.- P. 1457.

107. Чирков С.Н. Противовирусная активность хитозана (обзор) II, Прикладная биохимия и микробиология.- 2002.- V. 38.- Р.1.

108. Tokura S., Ueno К., Miyazaki S. & Nishi N. Molecular weight dependent antimicrobial activity by chitosan // Macromolecular Symposiums.- 1997.- V. 120, P. 1.

109. Gerasimenko D.V., Avdienko I.D., Bannikova G.E., Zueva O.Y. & Var-lamov V.P. Antibacterial effects of water-soluble low-molecular-weight chitosans on different microorganisms // Applied Biochemistry & Microbiology.-2004.- V. 40.- P. 253.

110. Zheng L.-Y. & Zhu J.-F. Study on antimicrobial activity of chitosan with different molecular weight // Carbohydrate Polymers.- 2003.- V. 54.- P. 527.

111. Kyung W.K., Thomas R.L., Chan L.& Park H. Antimicrobial activity of native chitosan, degraded chitosan and O-carboxymethylated chitosan // Journal of Food Protection.- 2003.- V. 66.- P. 1495.

112. Khill С J., Kennedy J.F., Mistry J., Miraffab M., Smart G., Groocock M. R., Williams H.J. Acid hydrolysis of commercial chitosan II J. Chem. Technol. Biotechnol.- 2005.- V. 80.- P. 1291.

113. Belleau В., Malek G.J. New convenient reagent for peptide syntheses // J.Am Chem Soc.- 1968.- V. 90.- P. 1651.

114. Hang R., Du Y., Yang J., Fan L. Influence of functional groups on the in vitro anticoagulant activity of chitosan sulfate // Carbohydrate Res.- 2003.- V. 338.- P. 483.

115. Lim S.-H., Hudson S.M. Synthesis and antimicrobial activity of a water soluble chitosan derivative with a fiber-reactive group // Carbohydrate Res.-2004.- V. 339.- P. 313.

116. Rabea E.A., Badawy M.E.-T., Stevens C.V., Smagghe G., Steurbaut W. Chitosan as Antimicrobial Agent: Applications and Mode of Action // Bio-molecules.- 2003.- V. 4.- P. 1457.

117. Jia Z., Shen D., Xu W. Synthesis and antibacterial activities of quaternaty ammonium salt of chitosan // Carbohydrate Research.- 2001.- V. 333.- P. 1.

118. Muzzarelli R.A.A., Tanfani F. The N-permethylation of chitosan and the preparation of N-trimethyl chitosan iodide // Carbohydrate Polymers.- 1985.- V. 5.- P. 297.

119. Sieval A.B., Thanou M., Kotze A.F., Verhoef J.C., Brussie J., Junginger H.E. Preparetion and NMR characterization of highly substituted N-trimethyl chitosan chloride // Carbohydrate Polymers.- 1998.- V. 36.- P.157.

120. Snyman D., Hamman J.H., Kotze J.E., Rollings J.E., Kotze A.F. The relationship between the absolute molecular weight and the degree of quaternisation of N-trimethyl chitosan chloride // Carbohydrate Polymers.- 2002.- V. 50.-P. 145.

121. Hamman J.H., Kotze A.F. Effect of the type of base and number of reaction steps on the degree of quaternization and molecular weight of N-trimethyl chitosan chloride // Drug Development and Industrial Pharmacy.- 2001.- V. 27, № 5. P. 373.

122. Polnok A., Borchard G., Verhoef J.C., Sarisuta N., Junginger H.E. Influence of methylation process on the degree of quaternization of N-trimethyl chitosan chloride // Eur.J.Pharm.Biopharm.- 2004.- V. 57.- P. 77.

123. Dung P.L., Milas M., Rinaudo M., Desbrieres J. Water soluble derivatives obtained by controlled chemical modifications of chitosan // Carbohydrate Polymers.- 1994.-V. 24. P. 209.

124. Domard A., Rinaudo M., Terrassin C. New method for the quaternization of chitosan // Int J.Biol.MacromoL- 1986.-V. 8.-P. 105.

125. Domard A., Rinaudo M., Terrassin C. 13C and !H n.m.r. spectroscopy of chitosan and N-trimethyl chloride derivatives // Int.J.Biol.Macromol.- 1987.- V. 9. P. 233.

126. Нудьга Л.А., Плиско E.A., Данилов C.H. Цианэтилирование хитозана // Ж.Общ.Хим.- 1973.- V. 43.- Р. 2756.

127. Loubaki Е., Sicsic S., LeGoffic F. Modification chimique du chitosan avec la 5-gluconolactone la P-propiolactone et le glycidol // Eur.Polymer J.- 1989.- V. 25.- P. 379.

128. Loubaki E., Ourevitch M., Sicsic S. Chemical modification of chitosan by glycidyl trimethylammonium chloride. Characterization of modifiedchitosan by С and H-NMR spectroscopy // Eur.Polymer J.- 1991.- V. 27.- P. 311.

129. Ling X., Mu F., Yuming D., Rong-Hua H. Controlled synthesis of gly-cidyltrimethylammonium chloride chitosan // Wuhan Peop. Rep. China. Fenxi Kexue Xuebao.- 2004.- V. 20, № 4.- P. 357.

130. Beilstein Handbuch Der Organische Chemie , ed. F.Richter, Verlag von Julius // Springer.- 1929.- V. 4. P.- 10.

131. Johnson S.L. and Morrison D.L. Kinetics and mechanism of decarboxylation of N-arylcarbamates, Evidence for kinetically important zwitterionic car-bamic acid species of short lifetime // J. Amer. Chem. Soc.- 1972.-V. 94.- P. 1323.

132. Hirai A., Odani H., Nakajima A. Determination of degree of deacetylation of chitosan by !H NMR spectroscopy // Polym Bull.- 1991.- V. 26, № 1.- P. 87.

133. Ben-Ishai D. and Berger A. Cleavage of N-Carbobenzoxy Groups by dry Hydrogen Bromide and Hydrogen Chloride // J. Org. Chem.- 1952.- V. 17.- P. 1564.

134. Spinelli V. A., Laranjeira C.M.and Favere V. Т. Preparation and characterization of quaternary chitosan salt: adsorption equilibrium of chromium(VI) ion // React.& Func Polym.- 2004.- V. 61.- P. 347.

135. Stepnova E.A., Tikhonov V.E., Babushkina T.A., Klemenkova Z.S., Yam-skov I.A. Unexpected reaction chitosan with EEDQ // Mendeleev Commun.-2006.- V. 16, №5.-p. 271.

136. Elliott M.L.; Brodchat Т.К.; Uchida J.Y.; Simone G.W. Compendium of Ornamental Palm Diseases and Disorders //APS Press: MN.- 2004.- USA.

137. Aragaki A.,; Broschat Т.К., Chase A.R., Ohr H.D, Simone G.W., Uchida J. Diseases and Disorders of Ornamental Palms //, APS Press: St.Paul.-1991.-USA.