Получение противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека в эксперименте и изучение их биологических свойств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Долматов, Владимир Юрьевич

• Долматов, Владимир Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Долматов, Владимир Юрьевич

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Эпидемиология и этиопатогенез сибиреязвенной инфекции.

1.2. Клинические проявления сибирской язвы и лечение инфицированных людей.

1.3. Технологические аспекты получения препаратов па основе иммуноглобулинов человека для лечения инфекционных заболеваний.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Материалы исследования.

2.2. Технологические приёмы выделения иммуноглобулинов из донорской плазмы

2.3. Технология заготовки иммунной плазмы.

2.4. Методы определения физико-химических, химических, биохимических, иммунохимических и биологических параметров препаратов.

2.5. Методы экспериментальной оценки превентивных свойств, профилактической и лечебной эффективности.

2.6. Статистический анализ.

Результаты исследования и их обсуждение.

Глава 3. Получение противосибиреязвепных иммуноглобулиновых препаратов человека.

3.1. Изучение стабильности антител к протективному антигену сибиреязвенного микроба в процессе фракционирования плазмы.

3.2. Установление уровня антител в иммунном сырье, достаточного для получения специфичных иммуноглобулинов.

3.3. Получение экспериментальных серий препаратов и определение их основных параметров.

Глава 4. Технологические приёмы заготовки иммунного сырья и определение условий его хранения.

4.1. Изучение гуморального ответа доноров на иммунизацию сибиреязвенными вакцинами.

4.2. Оценка стабильности специфической активности иммунной плазмы в процессе хранения.

Глава 5. Изучение биологических и защитных свойств иммуноглобулиновых препаратов.

5.1. Определение спектра антител к различным антигенным детерминантам сибиреязвенного токсина.

5.2. Оценка токсиннейтрализующей активности.

5.3. Изучение профилактической и лечебной эффективности внутривенного иммуноглобулина.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека в эксперименте и изучение их биологических свойств»

Актуальность проблемы

Сибирская язва - тяжёлое инфекционное заболевание, внимание к которому и в России, и во всем мире в последнее время значительно возросло. Это связано, в первую очередь, с угрозой биотерроризма, уже нашедшей практическое воплощение на территории США [89, 103]. Споры возбудителя сибирской язвы — Bacillus anthracis - с точки зрения большинства представителей военных ведомств и ан гитеррористических организаций, на сегодняшний день представляют собой самое опасное самостоятельное биологическое оружие [58]. Кроме того, остаётся высокой вероятность возникновения эпидемий инфекции в результате активизации широко распространённых почвенных резервуаров сибиреязвенного микроба [53].

Основным средством лечения сибирской язвы в настоящее время являются антибактериальные препараты [52]. Однако даже при использовании антибиотиков последнего поколения, передовых методов диагностики и высокотехнологичного оборудования смертность при лёгочной форме инфекции достигает 45 % [108]. Проведение интенсивной химиотерапии может вызывать ряд неблагоприятных побочных эффектов вплоть до летального исхода вследствие масштабного высвобождения токсина при разрушении клеток возбудителя [83, 86]. Единственный антитоксический препарат — противосибиреязвенный лошадиный иммуноглобулин - предназначен для внутримышечного введения, поэтому его применение не позволяет достичь быстрого нарастания антител в крови реципиента до протективного уровня. Современная научная разработка, направленная на ферментативное расщепление молекул иммуноглобулина, содержащихся в препарате, и выделение иммунохимически чистых (РаЬ)2-фрагментов, может привести к созданию антитоксического лекарственного средства, пригодного для внутривенного введения [43]. Однако любые гетерогенные сывороточные препараты обладают сенсибилизирующими свойствами и способны вызывать у людей реакции анафилактического типа [70].

Центральным звеном в патогенезе сибирской язвы признан протективный антиген [84]. Выполняя функцию молекулы-переносчика, он является необходимым компонентом реализации цитотокснческих эффектов летального и отёчного токсинов [90]. Кроме того, протективный антиген в организме млекопитающих индуцирует образование антител, препятствующих развитию сибирской язвы, поэтому представляет собой перспективную антигенную детерминанту с точки зрения получения лечебных иммунобиологических препаратов [92, 101].

Мировой опыт разработки и применения специфичных внутривенных иммуноглобулинов человека свидетельствует об их высокой эффективности и ареактогснности при лечении тяжёлых инфекционных заболеваний различной этиологии [30, 42, 61, 70, 73, 77]. В связи с этим перспективным направлением решения актуальной проблемы лечения людей, заражённых сибирской язвой, является создание аллогенного антитоксического противосибиреязвенного иммуноглобулина, пригодного для внутривенного введения. Основой нового препарата могут стать антитела к протективному антигену В. ап^гасгБ.

Отечественные технологии получения внутривенных иммуноглобулинов предусматривают два варианта снижения антикомплементарной активности: либо ферментативную обработку полупродукта [33], либо его инкубацию в кислой среде [39]. Препараты, полученные с применением этих методов, содержат в то время как немаловажную роль в иммунной защите человека играют также плазменные ^М и 1§Д. Метод дополнительного извлечения иммуноглобулинов всех трёх классов из фракции Б позволяет получать комплексный препарат для энтерального применения.

Разработка нового лекарственного средства достаточно длительна и включает множество этапов, от лабораторных опытов изготовления экспериментальных образцов продукта до клинических испытаний препарата. При этом необходим комплексный подход к решению целого ряда задач.

Следовательно, актуальной проблемой является определение принципиальной возможности получения эффективных противосибиреязвенных препаратов на основе иммуноглобулинов человека.

Цель исследования — получение экспериментальных образцов противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов из плазмы крови человека и изучение их биологических свойств.

Задачи исследования

1. Оценить возможность выделения антител человека к протективному антигену В. anthracis из донорской плазмы, определить минимальную специфическую активность иммунного сырья, достаточную для получения противосибиреязвенных препаратов.

2. Изучить динамику гуморального ответа доноров на иммунизацию комбинированной сибиреязвенной вакциной и ревакцинацию живой вакциной, установить возможный период заготовки и условия хранения иммунной плазмы.

3. Получить из иммунной плазмы по трём различным технологическим схемам концентраты иммуноглобулинов, пригодные для внутривенного и энтерального применения, и определить их биохимические параметры.4. j Изучить спектр антител к различным антигенным детерминантам сибиреязвенного токсина и оценить токсиннейтрализующую активность полученных экспериментальных образцов препаратов in vitro.

5. Определить профилактическую и лечебную эффективность внутривенного иммуноглобулина в эксперименте на животных.

Основные этапы работы выполнены в рамках договора № Ю-д-2002 от 01.07.02 г. между ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росмедтехнологий» (КНИИГиПК) и ФГУ «48 Центральный НИИ Минобороны России» (ЦНИИ МО) о совместном научном исследовании «Разработка технологий и создание аппаратурно-технических линий по производству препаратов против сибирской язвы», а также в рамках научно-исследовательской работы КНИИГиПК по созданию специфичных иммуноглобулинов человека для внутривенного введения (номер государственной регистрации комплексной темы 01200604343).

Научная новизна

Впервые показана возможность получения аллогенного протпвосибиреязвеппого иммуноглобулина, пригодного для внутривенного введения, из плазмы иммунизированных допоров. По материалам исследования подана заявка на патент Российской Федерации «Иммуноглобулин человека противосибпреязвенный для внутривенного введения» 2006129089/20/03/608, приоритет от 10.08.06 г.

Установлен минимальный уровень антител к протективному антигену В. ап1кгас\8 в сырье для получения препарата. Охарактеризована динамика содержания антител в крови доноров, иммунизированных сибиреязвенными вакцинами. Оценена стабильность специфической активности плазмы при хранении.

Показано, что экспериментальные образцы иммуноглобулинов содержат антитела к различным антигенным детерминантам сибиреязвенного токсина. В опыте на культуре клеток определена токсиннейтрализующая активность препаратов.

Доказана профилактическая и лечебная эффективность внутривенного иммуноглобулина в эксперименте.

Практическая значимость работы

Определены требования к иммунному сырью и условия его хранения. Показана возможность использования трёх технологических схем выделения антител из донорской плазмы для получения противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов для внутривенного и энтералыюго применения.

Внедрение результатов исследования в практику

Отработана технология получения иммуноглобулина для внутривенного введения с применением метода инкубации в кислой среде, утверждён производственный регламент ПР-18756307-02-06.

Укомплектована технологическая линия производства специфичных внутривенных иммуноглобулинов человека в отделе препаратов крови ФГУ «КНИИГиПК Росмедтехнологий».

Проведено аппаратурное оснащение экспериментально-производственной лаборатории фракционирования плазмы ЗАО «Иммуно-Гем», сформирована линия по выпуску «Иммуноглобулинового комплексного препарата» (ПР-18756307-03-06) и налажено его промышленное производство.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Однократная вакцинация доноров комбинированной сибиреязвенной вакциной обеспечивает образование антител к протективному антигену В. аМкгаа'я в титре не менее 1:400 у 69 % людей. Заготовку иммунной плазмы целесообразно начинать с пятой недели после иммунизации.

2. Технология этанольного фракционирования донорской плазмы с последующим пепсннолизом полупродукта или его инкубацией в кислой среде позволяет получать иммуноглобулиновые препараты, пригодные для внутривенного введения и содержащие антитела к третьему, • четвёртому доменам протективного антигена, а также к летальному фактору сибиреязвенного микроба.

3. Образцы внутривенного иммуноглобулина при профилактическом и лечебном применении в эксперименте обладают защитным эффектом, сравнимым с действием гипериммунного лошадиного противосибиреязвенного препарата.

Апробация работы

Диссертация апробирована на расширенной научно-лабораторной конференции ФГУ «Кировский РЖИ гематологии и переливания крови Росмедтехнологий» 22.05.08 г.

Основные результаты работы доложены на научной конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (г. Киров, 2005 г.), научно-практической конференции молодых учёных «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (г. Киров, 2007 г.), Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.) и Всероссийском совещании «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Епифановские чтения)» (г. Киров, 2008 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 15 работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 105 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трёх глав с изложением результатов собственных исследований, заключения и выводов. Список литературы включает 119 источников, из них 75 отечественных и 44 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и 21 таблицей.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Долматов, Владимир Юрьевич

ВЫВОДЫ

1. Впервые показана принципиальная возможность концентрации антител человека к протективному антигену В. anthracis (заявка на патент РФ № 2006129089/20/03/608). Минимальным уровнем антител во внутривенном иммуноглобулине является титр 1:1600 по результатам иммуноферментного анализа, в исходной плазме - 1:400.

2. Однократная иммунизация доноров сухой или жидкой формой комбинированной сибиреязвенной вакцины обеспечивает циркуляцию антител к протективному антигену на значимом уровне у 69 % людей. Заготовка иммунной плазмы возможна с 5 недели после вакцинации. Антитела стабильны в процессе хранения сырья в течение 12 месяцев при температуре не выше минус 30 °С.

3. По технологии этанольного фракционирования донорской плазмы получены экспериментальные образцы противосибиреязвенных иммуноглобулинов человека. Препараты, произведённые с применением пепсинолиза и инкубации в кислой среде, содержат антитела к протективному антигену В. anthracis в титре 1:1600 и 1:3200 соответственно и отвечают требованиям, предъявляемым к внутривенным иммуноглобулинам. Препарат для энтерального применения, полученный с применением метода извлечения иммуноглобулинов из фракции Б, содержит целевые антитела в титре не менее 1:800.

4. Экспериментальные серии иммуноглобулинов, полученные с применением 3 различных технологических приёмов, содержат антитела к третьему и четвёртому доменам протективного антигена и к летальному фактору сибиреязвенного микроба. Препараты обладают токсиннейтрализующей противосибиреязвенной активностью in vitro.

5. В экспериментах па животных доказана высокая профилактическая и лечебная эффективность внутривенного иммуноглобулина, сопоставимая с защитным эффектом, оказываемым гипериммунным лошадиным глобулином.

92

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время эпидемиологическая ситуация по сибирской язве остаётся неблагоприятной, что обусловлено угрозой активизации почвенных резервуаров возбудителя и осуществления актов биотерроризма с использованием спор В. аШкгаЫз [5, 53, 58]. Висцеральные формы инфекции приводят к летальному исходу в 100 % случаев [38]. Основным средством лечения людей, заражённых сибирской язвой, являются антибиотики [43]. В связи с высокой вероятностью стремительного развития висцеральной формы заболевания пациентам проводят интенсивный курс химиотерапии, пренебрегая возможными негативными побочными реакциями [52]. Однако, опыт отражения террористической атаки в 2001 г. в США показал недостаточную эффективность современных антибактериальных препаратов: летальность при лёгочной форме инфекции достигла 45 %, несмотря на использование передовых методов диагностики, высокотехнологичного медицинского оборудования и информированность общественности о чрезвычайной ситуации [11, 108]. Единственный специфичный препарат - противосибиреязвенный лошадиный глобулин - является гетерологичным и предназначен для внутримышечного введения. Его использование с большой вероятностью вызывает анафилактические реакции, а инъекционный способ применения не обеспечивает быстрого нарастания концентрации антител в крови реципиента до протектнвного уровня [26, 36, 42, 44, 54, 61, 70].

Патогенез сибирской язвы может быть остановлен путём блокирования одного из компонентов экзотоксина В. апШга™ - протектнвного антигена. Неслучайно большинство современных разработок лекарственных средств для борьбы с инфекцией призваны вызывать его дисфункцию [77, 81, 87, 88, 96, 97, 98, 105, 109, 114]. Опыт использования специфичных внутривенных иммуноглобулинов при лечении тяжёлых инфекций различной этиологии [42, 61, 70, 73, 77] свидетельствует о возможности решения актуальной проблемы лечения людей, заражённых сибирской язвой, путём разработки технологии получения противосибиреязвенного иммуноглобулина человека. Основой препарата могут стать антитела к протективному антигену В. ап&гас18. Представляется также перспективным получение комплексного пммуноглобул и нового препарата, содержащего антитела к протективному антигену и предназначенному для энтерального применения. Такое лекарство может быть эффективно за счёт содержания иммуноглобулинов не только класса в, но и классов М и А, а также за счёт способа введения, позволяющего доставлять антитела непосредственно к очагу поражения: перорально при гастроинтестинальной форме и накожно при кожной форме сибирской язвы.

В процессе сепарирования 9 порций плазмы, заготовленной от иммунизированных доноров, продемонстрирована стабильность антител к протективному антигену при фракционировании и доказана принципиальная возможность их концентрации. Потери специфической активности зарегистрированы только при осаждении фракции А8. Их величина составила 3 %. На остальных стадиях процесса переход целевых антител в отходы не зафиксирован. Полученные растворы иммуноглобулинов содержали антитела в среднем титре 1:2400, кратность их концентрации составила 2,3. В иммуноэлектрофорезе и электрофорезе выявлена незначительная примесь альбумина к основной фракции у-глобулинов (^О).

Высоким уровнем противосибиреязвенного иммунитета признана 75 % выживаемость, что соответствует индексу ПС 0,4 [14, 15]. Существует строгая корреляция между ПС и уровнем антител к ПА: индекс 0,4 соответствует титру 1:1600 5 % раствора [21]. Номинальная концентрация белка в ВВИТ также равна 5 %, следовательно, достаточным уровнем целевых антител в противосибиреязвенном препарате можно считать титр 1:1600. Значение индекса ПС раствора иммуноглобулинов, полученного в лабораторном опыте фракционирования иммунной плазмы и содержащего 9,9 % белка и антитела к ПА В. аШкгас18 в титре 1:3200, составило 0,4. Таким образом, показана принципиальная возможность получения эффективного противосибиреязвенного ВВИТ.

Опыт разработки технологии получения различных специфичных ВВИТ из иммунной плазмы свидетельствует, что целевые антитела в процессе производства концентрируются не менее чем в 4 раза [42, 70]. Следовательно, минимальным уровнем антител к ПА в иммунной плазме следует считать титр 1:400.

Из 172 л иммунной плазмы, заготовленной методом плазмафереза от иммунизированных доноров, по технологии этанольного фракционирования получено 5 экспериментальных серий иммуноглобулинов человека. Серии № 1 и № 2 произведены с применением пепсинолиза, серия № 3 — с применением инкубации в кислой среде, серии № 4 и № 5 - с применением извлечения иммуноглобулинов из фракции Б. Серии № 1, № 2 и № 3 соответствовали требованиям, предъявляемым к внутривенным препаратам, в том числе по антикомплементарной активности и вирусбезопасности, и содержали антитела к протектнвному антигену в титре 1:1600 - 1:3200. Опытная лиофилизация внутривенного иммуноглобулина не оказала влияния на уровень антител. Это доказывает принципиальную возможность получения противосибиреязвенного препарата в сухой лекарственной форме.

Специфическая активность по истечении более чем 30 месяцев хранения образцов не изменилась, что свидетельствует о высокой стабильности целевых антител. Например, активность внутривенного иммуноглобулина против клещевого энцефалита, антистафилококкового и противостолбнячного уменьшалась примерно вдвое в течение 24 месяцев [42, 61].

Серии № 4 и № 5 соответствовали требованиям, предъявляемым к иммуноглобулиновым препаратам для эптерального применения, в том числе по вирусбезопасности, и содержали антитела к протектнвному антигену В. аЫкгаыя в титре 1:800 - 1:1600. Отношение иммуноглобулинов трёх основных классов (^в : ^М : ^А) составило 4 : 1 : 1 в серии № 4 и 1,5 : 3 : 1 в серии № 5.

Для определения возможности заготовки иммунной плазмы изучен гуморальный ответ 61 донора на первичную иммунизацию комбинированной сибиреязвенной вакциной и 8 доноров на ревакцинацию живой вакциной. Целевые антитела на значимом уровне, го есть в титре 1:400 или более, выявлены у 69 % вакцинированных впервые людей. Этот показатель несколько ниже, чем установленный ранее для доноров противоклещевой плазмы (73 %) [42] и противодифтерийной (85 %) [73], но всё же достаточный для заготовки иммунного сырья. Иммунологически неактивными оказались 13 % доноров; у 18 % специфическая активность крови не достигла достаточного для заготовки иммунной плазмы уровня.

Значимый уровень целевых антител был зарегистрирован в среднем через 5 недель после вакцинации, что продолжительнее аналогичного периода времени развития активной антителопродукции доноров антисинегнойной (1 месяц) [37] и противодифтерийной плазмы (30 суток) [73]. Средняя суммарная продолжительность регистрации антител к протективному антигену в титре не менее 1:400 составила 10 недель. Статистически значимых различий между гуморальным иммунным ответом доноров на введение сухой или жидкой формы вакцины, а также между иммунореактивностью мужчин и женщин не выявлено.

Целевые антитела в крови ревакцинированных доноров на значимом уровне были зарегистрированы уже через неделю после введения вакцины. Суммарная продолжительность регистрации специфической активности, достаточной для получения иммунной плазмы, составила 35 недель. Таким образом, ревакцинация существенно расширяет сырьевую базу для изготовления противосибиреязвенных иммуноглобулиновых препаратов человека.

С целью определения стабильности антител к протективному антигену в процессе хранения плазмы образцы сыворотки иммунизированных доноров, специфическая активность которых была значимой, замораживали и выдерживали при температуре не выше минус 30 °С. По истечении не менее 6, 9, 12 или 20 месяцев сыворотку размораживали и определяли в ней содержание целевых антител. Всего исследовано 28 образцов, из них 21 с исходным титром

1:800 и 7 с исходным титром 1:400. Через 6, 9 и 12 месяцев среднее содержание целевых антител сохранялось на исходном уровне. Снижение специфической активности зарегистрировано через 20 месяцев хранения сыворотки, причём во всех случаях падение титров было равно одному шагу разведения, что не превышает ошибку метода ИФА. Путём расчёта парного критерия Стьюдента уменьшение содержания антител к протективному антигену через 20 месяцев признано статистически значимым. Следовательно, срок хранения иммунного сырья не должен превышать 1 год после заготовки при температуре не выше минус 30 °С.

Методами иммуноблоттиига и иммуноферментного анализа во всех 5 сериях препаратов выявлены антитела к летальному фактору, а также к третьему, и четвёртому доменам протективного антигена В. апЖгас18. Результаты исследования позволяют сделать заключение о возможной принадлежности антител к протективному антигену иммуноглобулинам всех трёх основных классов, а антител к летальному фактору - преимущественно 1§М.

Противосибиреязвенная токсиннейтрализующая активность на культуре чувствительных клеток выявлена для всех экспериментальных серий иммуноглобулинов. В разведении 1:5 серии № 1, № 2 и № 4 нейтрализовали летальный токсин почти полностью, а серии № 3 и № 5 показывали примерно 140 % результат. В литературе, посвящённой оценке токсиннейтрализующей активности моноклональных антител [11, 81, 96, 114], подобный эффект не описан. Данный феномен можно объяснить активацией или ингибированием клеточных процессов по Рс-рецепторному механизму. Связываясь с рецепторами типа РсуБШ, специфичными к иммунным комплексам, система молекул «антиген - антитело» могла интенсифицировать, например, синтез и экскрецию цитокинов или, напротив, блокировать реакции апоптоза, повышая тем самым процент выживших клеток. Серии № 1, № 2 и № 4 аналогичного влияния на клетки не оказывали, видимо, вследствие нарушения эффекторных функций молекул ^О.

В экспериментах па 18 морских свинках и 38 кроликах изучена профилактическая и лечебная эффективность внутривенного иммуноглобулина. По результатам опытов сделан вывод о сопоставимых защитных свойствах иммуноглобулинового препарата человека и лошадиного противосибиреязвенного глобулина. Перспективность применения аллогенного препарата обусловлена отсутствием анафилактической реакции у реципиента и высокой допустимой дозой введения.

Таким образом, в результате проведённого исследования получено 5 экспериментальных серий иммуноглобулинов человека, содержащих антитела к третьему и четвёртому доменам протективного антигена и к летальному фактору В. anthracis. Препараты нейтрализовали сибиреязвенный токсин in vitro и оказывали выраженный защитный эффект при заражении экспериментальных животных спорами различных штаммов В. anthracis. Параметры серий № 1, № 2 и № 3 соответствовали требованиям, предъявляемым к внутривенным препаратам, специфическая активность была стабильна при хранении образцов в течение 31 месяца и лиофилизации. Параметры серий № 4 и № 5 соответствовали требованиям, предъявляемым к комплексным иммуноглобулиновым препаратам для энтерального применения. Установлено минимальное и достаточное содержание целевых антител в противосибиреязвенном внутривенном иммуноглобулине и исходной плазме. Показано, что при заготовке иммунного сырья можно использовать сухую и жидкую форму комбинированной сибиреязвенной вакцины. Определён возможный период заготовки и условия хранения плазмы.

91

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Долматов, Владимир Юрьевич, 2008 год

1. Абалакин В. А. Применение иммунологической адсорбции в гетерогенном иммуноферментном анализе при определении антител к протективным детерминантам Bacillus anthracis II Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1987. - № 11. — С. 90-94.

2. Аверченков В.М., Палагин И.С. Внутривенные иммуноглобулины: механизмы действия и возможности клинического применения // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2004. -№ 3. - С. 273-281.

3. Алёшкин В.А., Борисова И.В., Быко-Янко Г.В. Способ получения иммуноглобулинового препарата для профилактики и терапии бактериальных и вирусных заболеваний // Патент RU 2084229.

4. Алешкин В. А., Лютов А.Г. Препарат иммуноглобулина для внутривенного введения и способ его получения // Патент RU 2122864.

5. Алёшкин В.А., Лютов А.Г., Афанасьев С.С. и др. Место иммуноглобулиновых препаратов в лечении и реабилитации инфекционных больных // Новые лекарственные препараты. 2003. -№ 4. - С. 6 - 32.

6. Анастасиев В.В. Иммуноглобулин для внутривенного введения. — Нижний Новгород: Издательство НГМА, 2000. 168 с.

7. Анастасиев В.В. Применение иммуноглобулинов. Нижний Новгород: Издательство НГМИ, 1993. - 27 с.

8. Ашмарин И.П., Воробьёв A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. — Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. — 180 с.

9. Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Селиверстов В.В. Сибирская язва (антракс). Новые страницы в изучении старой болезни. Владимир: Посад, 2001.

10. Бектимиров Т.А. Иммунопрофилактика сибирской язвы // Вакцинация.2002. № 3. - С. 11.

11. Белова Е.В. Особенности иммунного ответа на протективный антиген и летальный фактор В. anthracis: подходы к созданию вакцины нового поколения: дис. канд. биол. наук: 03.00.07 / Белова Елена Валентиновна. Оболенск, 2006. - 145 с.

12. Бесядовский P.A., Иванов К.В., Козюра А.К. Справочное руководство для радиобиологов. М., 1978.

13. Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Метод оценки противосибиреязвенного иммунитета по превентивным свойствам сыворотки // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1972. - № 6. — С. 124 -134.

14. Бургасов П.Н., Рожков Г.И., Тамарин A.JL и др. Метод оценки иммунитета по превентивным свойствам сыворотки крови и новая эффективная схема иммунизации людей против сибирской язвы // Информационный сборник. 1965. - № 1. - С. 5 - 33.

15. Владимиров В.Г. Расчет количества лекарственных препаратов на поверхность тела как один из способов определения равноэффективных доз для животных и человека //Фармакология и токсикология. 1976. -№1. - С.123 - 128

16. Гланц С. Медико-биологическая статистика / Перевод с английского. — М.: Практика, 1999. 459 с.

17. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырьё / 11-е изд., доп. М.: Медицина, 1990.-400 с.

18. Егоров A.M. Теория и практика иммунофермептного анализа / Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. и др. М.: Высшая школа, 1991. -288 с.

19. Инструкция по применению сывороток диагностических моноспецифических против IgG (H+L), IgG (Н), IgM (Н), IgA (Н) человека, сухих: Утверждена заместителем председателя Гскомсанэпиднадзора РФ 27.01.95 г.

20. Инструкция по контролю стерильности консервирующей крови, её компонентов, препаратов, консервированного костного мозга, кровезаменителей и консервирующих растворов: Утверждена первым заместителем Министра здравоохранения РФ 22.05.1995 г.

21. Инструкция по применению вакцины сибиреязвенной живой сухой для подкожного и скарификационного применения: Утверждена Главным государственным санитарным врачом РФ 17.03.2002 г.

22. Инструкция по применению вакцины сибиреязвенной комбинированной сухой и жидкой для подкожного применения: Утверждена Главнымгосударственным санитарным врачом РФ 03.2002 г.

23. Инструкция по применению глобулина противосибиреязвенного лошадиного жидкого: Утверждена Главным государственным санитарным врачом РФ 28.03.2000 г.

24. Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для определения титров антител к протсктивному антигену сибиреязвенного микроба в сыворотке крови человека: Утверждена начальником НИИ микробиологии МО РФ 28.04.2004 г.

25. Инструкция по проведению автоматического донорского плазмафереза на аппарате «Автоферез-С»: Утверждена заместителем Министра здравоохранения РФ 19.05.1999 г.

26. Инструкция по проведению донорского плазмафереза: Утверждена первым заместителем министра здравоохранения РФ 29.05.1995 г.

27. Информационный листок фирмы «Биотест Фарма ГмбХ», Германия // Вестник гематологии. 2006. - № 3. - С. 2.

28. Ипатенко Н.Г. Сибирская язва / Ипатенко Н.Г., Гаврилов В.А., Зелепукин B.C. и др. М.: Колос, 1996. - 335 с.

29. Казанцев А.П., Матковский B.C. Справочник врача-инфекциониста. М.: Медицина, 1973. - 240 с.

30. Киселёва И.А., Анастасиев В.В., Чадаев В.А. и др. Особенности получения иммуноглобулина для внутривенного введения: Иммуноглобулины и другие препараты крови. Л., 1976. - С. 47 - 54.

31. Клиническое применение иммуноглобулина для внутривенного введения ГАБРИГЛОБИН Пособие для врачей. М., 2007. - 20 с.

32. Козлов В.К. Сепсис: этиология, иммунопатогенез, концепция современной иммунотерапии. СПб., 2006.

33. Кораблёва H.H., Хоре H.H. Влияние гемотрансфузионной терапии на специфический противостолбнячный иммунитет // Гематология и трансфузиология. 1989. - № 3. - С. 26 - 29.

34. Лазыкина A.B. Технологические приёмы получения концентратоваллоантител к эндотоксину Pseudomonas aerugienosa: дис. канд. биол. наук: 03.00.04, 14.00.29 / Лазыкина Анна Викторовна. Киров, 1999. -161 с.

35. Лобзин Ю.В., Волжанин В.М., Захаренко С.М. Сибирская язва // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. — Т. 4, №2.-С. 104- 127.

36. Лютов А.Г., Алёшкин В.А., Тюриков Ю.М. и др. Изучение переносимости и клинической эффективности Габриглобина нового отечественного иммуноглобулина для внутривенного введения // Новое в трансфузиологии. - 2002. - № 33. - С. 61 - 72.

37. Мальцева О.В. Разработка технологии получения и изучение свойств иммуноглобулина против клещевого энцефалита для внутривенного введения: дис. канд. биол. наук: 03.00.04 / Мальцева Ольга Валерьевна. Киров, 2002. - 128 с.

38. Маринин Л.И., Степанов A.B., Алёшкин В.А. и др. Мониторинг сибирской язвы. — М., 1999. 186 с.

39. Мирошниченко В.П. Сибирская язва // Днсування та д1агностика. 2001. -№ 1.

40. Мостовская Е.В. Оптимизация технологии получения жидкой формы иммуноглобулина для внутривенного введения: дис. канд. биол. наук:1400.36, 14.00.29 /Мостовская Елена Викторовна. -М., 2004. 137 с.

41. МУК 3.3.2.1063-01 Определение антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения: Утверждены Главным государственным санитарным врачом РФ 12.07.2001 г.-М.: Минздрав России, 2001.- 16 с.

42. О внедрении в практику работы службы крови в Российской Федерации метода карантинизации свежезамороженной плазмы: Приказ МЗ РФ от 07.05.2003 г. № 193.

43. О внесении изменения в Приказ Минздрава России от 07.05.03 г. № 193: Приказ МЗиСР РФ от 21.02.2005 г. № 147.

44. Об утверждении порядка медицинского обследования донора крови и её компонентов: Приказ МЗ РФ от 14.09.2001 г. № 364.

45. Онищенко Г.Г. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфектологии / Онищенко Г.Г., Алёшкин В. А., Афанасьев С.С. и др. М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2002. - 608 с.

46. Онищенко Г.Г. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики / Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999.-448 с.

47. Пименов Е.В., Кожухов В.В., Строчков Ю.И. Создание вакцин против сибирской язвы // Природа. 2000. - № 10. - С. 4 - 12.

48. Попов В.Г., Щербаков Г.Я., Маринин Л.И. и др. Профилактика и терапия сибиреязвенной инфекции // Сборник докладов I Российского симпозиума по биологической безопасности. -М., 2003.

49. ПР № 01966992-04-05. Промышленный регламент на производствопрепарата Иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита: Утверждён директором ФГУ «КНИИГиПК Росздрава» 10.01.2006 г.

50. Регламент производства № 1 Иммуноглобулина нормального человека для внутривенного введения: Утверждён директором НИИ гематологии и переливания крови 12.11.1999 г.

51. Регламент производства № 1502-04 Глобулин противосибиреязвенный лошадиный жидкий. Том 2: Утверждён начальником НИИ микробиологии МО РФ 09.04.03 г.

52. Рубинштейн Э. Биотерроризм: значение антимикробных препаратов // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. - Т. 3, №4.-С. 290-300.

53. Руководство по инфекционным болезням / Под ред. Лобзина Ю.В. -СПб.: Фолиант, 2000. 932 с.

54. Русанов В.М., Левин И. Лечебные препараты крови. М.: Медпрактика-М, 2004. 284 с.

55. Сапожникова B.C. Разработка и изучение свойств антистафилококкового и противостолбнячного иммуноглобулинов для внутривенного введения: дис. канд. биол. наук: 03.00.04 / Сапожникова Вера Сергеевна. — Киров, 1990.- 195 с.

56. Сапожникова B.C., Шарыгнн С.Л. Способ получения иммуноглобулина для внутривенного введения // Патент RU 2068695.

57. Смирнов К. Микробы делятся с ближними // Новая газета. — 2005. -№ 79. С. 20.

58. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Сравнительный анализ молекулярно-генетических особенностей генов и их эволюционных преобразований у возбудителей холеры, чумы и сибирской язвы // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2006. № 2. — С. 9 - 19.

59. Типовой комплексный регламент производства белковых препаратов плазмы донорской крови: Утверждён заместителем Министра здравоохранения СССР 21.12.1979 г.

60. ФС 42-0091-02 Плазма для фракционирования: Утверждена руководителем Департамента государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ 27.09.2002 г. 9 с.

61. ФС 42-3159-95 Иммуноглобулин нормальный человека для внутривенного введения: Утверждена Заместителем начальника инспекции Государственного контроля качества лекарственных средств и медицинской техники 03.07.95 г.

62. ФСП 42-0194-4884-03 «ГАБРИГЛОБИН ^ ®», раствор для инфузий (Иммуноглобулин человека нормальный): Утверждена генеральным директором ЗАО «Иммуно-Гем» 03.12.2003 г.

63. Шарыгин С.Л. Препараты внутривенных иммуноглобулинов из донорской плазмы для терапии бактериальных и вирусных инфекций (получение и клиническое применение): дис. докт. мед. наук: 14.00.29 / Шарыгин Сергей Леонидович. Киров, 1997. - 286 с.

64. Шемякин И.Г., Пухальский А.Л., Степаншина А.Н. и др. Профилактический и терапевтический эффекты а 1-кислого гликопротеина у мышей, инфицированных В. аМкгаа'я II Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2005. № 10. - С. 440 - 445.

65. Шкуратова О.В. Разработка научно-методических основ технологии производства специфического препарата для лечения больных дифтерией: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.07 / ФГУ «НПО «Вирион». Уфа, 2002. - 23 с.

66. Agrawal A., Pulendran В. Anthrax lethal toxin: a weapon of multisystem destruction // Cell. Mol. Life Sci. 2004. - Vol. 61. - P. 2859 - 2865.

67. Arnon S.S., Schechter R., .Maslanka S.E. et al. Human Botulism Immune Globulin for the Treatment of Infant Botulism // N. Engl. J. Med. 2006. -Vol. 354.-P. 462-471.

68. Baillie L., Hibbs S., Tsai P. et al. Role of superoxide in the germination of Bacillus anthracis endospores // FEMS Microbiol Lett. 2005. - Vol. 245. -P. 33 - 38.

69. Batty S., Chow E.M., Kassam A. et al. Inhibition of mitogen-activated protein kinase signalling by Bacillus anthracis lethal toxin causes destabilization of interleukin-8 mRNA // Cell. Microbiol. 2006. - Vol. 8. - P. 130 - 138.

70. Bonuccelli G., Sotgia F., Frank P.G. et al. Anthrax Toxin Receptor (ATR/TEM8) is Highly Expressed in Epithelial Cells Lining the Toxin's Three Sites of Entry (Lung, Skin, and Intestine) // Am. J. Physiol. 2005.

71. Brossier F., Levy M., Landier A. et al. Functional analysis of Bacillus anthracis protective antigen by using neutralizing monoclonal antibodies //1.fect. Immun. 2004. - Vol. 72. - P. 6313 - 6317.

72. Cleret A., Quesnel-Hellmann A., Vallon-Eberhard A. et al. Lung dendritic cells rapidly mediate anthrax spore entry through the pulmonary route // J. Immunol. 2007. - Vol. 178. - P. 7994 - 8001.

73. Collier R.J., Young J.A. Anthrax toxin // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2003. -Vol. 19.-P. 45 -70.

74. Dixon T.C., Meselson M., Guillemin J. et al. Anthrax // The New England journal of medicine. 1999. - Vol. 341. - P. 815-826.

75. Hanna P. Lethal toxin actions and their consequences // Journal of applied microbiology. 1999. - Vol. 87. - P. 285 - 287.

76. Huber M., Vor Dem Esche U., Grunow R. et al. Generation of mouse polyclonal and human monoclonal antibodies against Bacillus anthracis toxin // Drugs Exp. Clin. Res. 2005. - Vol. 31. - P. 35 - 43.

77. Hull A.K., Criscuolo C.J., Mett V. et al. Human-derived, plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax // Vaccine. 2005. - Vol. 23. -P. 2082-2086.

78. Jernigan J.A., Stephens D.S., Ashford D.A. et al. Bioterrorism-Related Inhalational Anthrax: The First 10 Cases Reported in the United States // Emerging infectious diseases. 2001. - Vol. 7. - P. 933 - 944.

79. Juris S.J., Melnyk R.A., Bolcome R.E. 3rd et al. Cross-linked forms of the isolated N-terminal domain of the lethal factor are potent inhibitors of anthrax toxin // Infect. Immun. 2007. - Vol. 75. - P. 5052 - 5058.

80. Kang T.J., Fenton M.J., Weiner M.A. et al. Murine macrophages kill the vegetative form of Bacillus anthracis // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73. -P. 7495-7501.

81. Karginov V.A., Robinson T.M., Riemenschneider J. et al. Treatment ofanthrax infection with combination of ciprofloxacin and antibodies to protective antigen of Bacillus anthracis // FEMS Immunol. Med. Microbiol. -2004,-Vol. 40.-P. 71-74.

82. Krantz B.A., Trivedi A.D., Cunningham K. et al. Acid-induced Unfolding of the Amino-terminal Domains of the Lethal and Edema Factors of Anthrax Toxin // J. Mol. Biol. 2004. - Vol. 344. - P. 739 - 756.

83. Lacy D.B., Wigelsworth D.J., Melnyk R.A. et al. Structure of heptameric protective antigen bound to an anthrax toxin receptor: a role for receptor in pH-dependent pore formation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - Vol. 101.-P. 13147-13151.

84. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680 - 685.

85. Lim N.K., Kim J.H., Oh M.S. et al. An anthrax lethal factor-neutralizing monoclonal antibody protects rats before and after challenge with anthrax toxin // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73. - P. 6547 - 6551.

86. Maynard J.A., Maassen C.B., Leppla S.H. et al. Protection against anthrax toxin by recombinant antibody fragments correlates with antigen affinity // Nat. Biotechnol. 2002. - Vol. 20. - P. 597 - 601.

87. Mohamed N., Clagett M., Li J. et al. A high-affinity monoclonal antibody to anthrax protective antigen passively protects rabbits before and after aerosolized Bacillus anthracis spore challenge // Infect. Immun. 2005. — Vol. 73.-P. 795-802.

88. Mourez M. Anthrax toxins // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 2004.

89. Peterson J.W., Comer J.E., Baze W.B. et al. Human monoclonal antibody AVP-21D9 to protective antigen reduces dissemination of the Bacillus anthracis Ames strain from the lungs in a rabbit model // Infect. Immun.2007. Vol. 75. - P. 3414 - 3424.

90. Pimental R.A., Christensen K.A., Krantz B.A. et al. Anthrax toxin complexes: heptameric protective antigen can bind lethal factor and edema factor simultaneously // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. - Vol. 322. -P. 258 - 262.

91. Pittman P.P., Leitman S.F., Barrera Oro J.G. et al. Protective antigen and toxin neutralization antibody patterns in anthrax vaccinees undergoing serial plasmapheresis // Clinical and diagnostic laboratory immunology 2005. — Vol. 12. - P. 713-721.

92. Quinn C.P., Dull P.M., Semenova V. et. al. Immune responses to Bacillus anthracis protective antigen in patients with bioterrorism-related cutaneous or inhalation anthrax // J. Infect. Dis. 2004. - Vol. 190. - P. 1228 - 1236.

93. Sastry K.S, Tuteja U., Batra H.V. Generation and characterization of monoclonal antibodies to protective antigen of Bacillus anthracis // Indian J. Exp. Biol.-2003.-Vol. 41.-P. 123 128.

94. Scobie H.M., Young J.A. Interactions between anthrax toxin receptors and protective antigen // Curr. Opin. Microbiol. 2005. - Vol. 8. - P. 106 - 112.

95. Shen Y., Zhukovskaya N.L., Guo Q. et al. Calcium-independent calmodulin binding and two-metal-ion catalytic mechanism of anthrax edema factor // EMBO J. 2005.

96. Spencer R.C. Bacillus anthracis // Journal of Clinical Pathology. 2003. -Vol. 56.-P. 182- 187.

97. Subramanian G.M., Cronin P.W., Poley G. et al. A phase 1 study of PAmAb, a fully human monoclonal antibody against Bacillus anthracis protective antigen, in healthy volunteers // Clin. Infect. Dis. 2005. - Vol. 1. - P. 12 - 20.

98. Tada H., Shiho O., Kuroshima K. et al. An improved colorimetric assay for interleukin 2 // J. Immunol. Methods. 1986. - Vol. 93, № 2. - P. 157 - 165.

99. Tournier J.N., Quesnel-Hellmann A., Mathieu J. et al. Anthrax Edema Toxin Cooperates with Lethal Toxin to Impair Cytokine Secretion during Infection of Dendritic Cells // J. Immunol. 2005. - Vol. 174. - P. 4934 - 4941.

100. Turgeon A.F., Hutton B., Dean A. et al. Meta-analysis: intravenous immunoglobulin in critically ill adult patients with sepsis // Ann. Intern. Med. 2007. - Vol. 6. - P. 193 - 203.

101. Weiss S., Kobiler D., Levy H. et al. Immunological correlates for protection against intranasal challenge of Bacillus anthracis spores conferred by a protective antigen-based vaccine in rabbits // Infect. Immun. 2006. - Vol. 1. -P. 394 -398.

102. Wild M.A., Xin H., Maruyama T. et al. Human antibodies from immunized donors are protective against anthrax toxin in vivo // Nat. Biotechnol. 2003. -Vol. 11.-P. 1305 - 1306.

103. Williamson E.D., Hodgson I., Walker N.J. et al. Immunogenicity of recombinant protective antigen and efficacy against aerosol challenge with anthrax // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73. - P. 5978 - 5987.

104. Zhang S., Cunningham K., Collier R.J. Anthrax protective antigen: efficiency of translocation is independent of the number of ligands bound to the prepore // Biochemistry. 2004. - Vol. 43. - P. 6339 - 6343.

105. Zhang S., Finkelstein A., Collier R.J. Evidence that translocation of anthrax toxin's lethal factor is initiated by entry of its N terminus into the protective antigen channel // Proc. Natl. Acad. Sci .USA. 2004.

106. Zhang S., Udho E., Wu Z. Et al. Protein translocation through anthrax toxin channels formed in planar lipid bilayers // Biophys. J. 2004. - Vol. 17.

107. Zhao P., Liang X., Kalbflcisch J. et al. Neutralizing monoclonal antibody against anthrax lethal factor inhibits intoxication in a mouse model // Hum. Antibodies. 2003. - Vol. 12. - P. 129 - 135.