Получение биоаналитических реагентов на основе полимерных дисперсий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.06, кандидат химических наук Генералова, Алла Николаевна

• Генералова, Алла Николаевна
• кандидат химических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат химических наук Генералова, Алла Николаевна

Введение.

Глава I. Литературный обзор.

1.1. Основные принципы биоаналитических исследований.

1.2. Получение полимерных микросфер для биологических исследований.

1.2.1. Способы получения окрашенных полимерных суспензий.

1.2.2. Синтез полимерных суспензий с альдегидными группами на 17 поверхности.

1.3. Применение полимерных микросфер в биоанализе.

1.3.1. Полуколичественные методы (тесты), проводимые при участии 30 частиц полимерных суспензий.

1.3.2. Количественные методы (анализы), основанные на использовании 34 микросфер полимерных суспензий.

1.3.3.Комплексные методы анализа биоспецифических взаимодействий, 38 проявляемых с помощью частиц полимерных суспензий.

Глава II. Экспериментальная часть.

II. 1. Исходные вещества. 52 Н.2. Методы исследования.

Глава III. Результаты и их обсуждение.

III. 1 Синтез полимерных микросфер.

111.1.1. Получение полиакролеиновых микросфер в присутствии 68 ксантеновых красителей.

III. 1.2. Получение суспензий полиакролеина в присутствии 82 поверхностно-активных веществ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение биоаналитических реагентов на основе полимерных дисперсий»

Полимерные синтетические микросферы с узким распределением частиц по размерам применяют в различных областях науки и техники, например, в качестве калибровочных эталонов в электронной и оптической микроскопии, при подсчете аэрозольных частиц, при малоугловой рефракции рентгеновских лучей, для счета вирусных частиц, для стимулирования клеточного продуцирования антител и их очистки, в качестве модельных коллоидных систем для изучения их реологии, стабильности, седиментации и т.д. [1-4]. В последние годы частицы монодисперсных суспензий нашли широкое применение в качестве носителей биологических лигандов при создании реагентов для биоаналитических исследований, основанных на детекции специфических взаимодействий биообъектов. Основные требования, которым в этом случае должны удовлетворять полимерные частицы - это биологическая, химическая и коллоидная устойчивость в физиологических жидкостях, узкое распределение частиц по размерам, возможность образования прочной связи белков и других биолигандов с поверхностными функциональными группами частиц суспензий. Кроме того, необходимо уметь получать дисперсии с заданными размерами частиц, которые определяют их применение в различных видах анализа с визуальной или инструментальной детекцией результатов биоспецифических реакций [4].

Таким образом, цель данной работы состояла в синтезе полимерных микросфер, содержащих специальные метки (флуоресцентные, хромофорные, дигитонин) для детекции нуклеиновых кислот, гербицида (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты) и холестерина при биоаналитических исследованиях.

Глава I. Литературный обзор.

1.1. Основые принципы биоаналитических исследований.

В настоящее время существует большое количество методов, позволяющих определять наличие или концентрацию биохимических лигандов в исследуемых биологических образцах. Определяемый лиганд, как правило, играет важную роль в биохимических процессах, или позволяет диагностировать заболевание, тип крови и многое другое. Значительное место среди данных методов занимают анализы, основанные на специфическом, высокоаффинном взаимодействии между детектируемым лигандом и реагентом, содержащим антилиганд. К этой паре лиганд-антилиганд могут быть отнесены биоспецифические взаимодействия «антиген-антитело», «биотин-стрептавидин», «углевод-лектин», «иммуноглобулин-белок А», «транспортный белок-рецепторный белок», «холестерин-дигитонин», «комплементарные олиго- и полинуклеотид» и другие, в образовании которых участвуют электростатические и межмолекулярные силы, действующие на близком расстоянии, а также стереоспецифическая комплементарность молекул [5]. Эти взаимодействия положены в основу иммунохимических методов, гибридизационного анализа нуклеиновых кислот, маркирования компонентов клеточных мембран и т.д.

Принцип работы иммунодиагностических тестов основан на иммунохимической реакции между антигеном (веществом, несущим признаки генетически чужеродной информации для данного вида организма) и антителами (белками, относящимися к классу иммуноглобулинов, продуцируемыми клетками иммунной системы организма в ответ на появление антигена) с образованием комплекса «антиген-антитело» [6]. Связывание с ацтигеном сопровождается изменениями конформационной структуры антител и приводит к реализации эффекторных функций, которые способствуют удалению антигена из организма. Антитела соединяются с антигеном И-концевым участком молекулы антитела -Бф-фрагментом, содержащим антигенсвязывающий центр. Реакция «антиген-антитело» основана на принципе взаимного узнавания, обусловленном комплементарностью активных центров антитела и детерминантных групп (эпитопов) антигена [7].

Реакция образования такого комплекса является высокоиммуноспецифичной, т.е. на появление в организме определенного антигена иммунная система вырабатывает антитела строго определенного строения, способные взаимодействовать только с этим антигеном. Константа аффинности антител к индивидуальным антигенам составляет 1041012 М"1 [8]. Вследствие того, что и антиген, и антитело могут взаимодействовать одновременно с несколькими молекулами, образуются пространственные сетки, узлами которых служат молекулы антигена.

Образование сеток-агломератов, а, следовательно, и обнаружение того или иного вида антигенов, может быть зарегистрировано различными методами, например, спектрофотометрии, турбидиметрии, нефелометрии, лазерной автокорреляционной спектроскопии и т.д. Использование для обнаружения комплекса «антиген-антитело» специального дорогостоящего оборудования создает заметные трудности для широкого применения указанных методов при диагностике заболеваний. Связывание антигенов (антител) с полимерным носителем, который выполняет индикаторную функцию, позволяет даже невооруженным глазом обнаружить появление комплексов как скопление агломератов частиц носителя, что значительно упрощает проведение анализа, основанного на биоспецифическом взаимодействии «антиген-антитело» [4].

Иммунохимические методы анализа позволяют с уникальной специфичностью анализировать в биологических образцах содержание определенных антигенов, которые свидетельствуют о присутствии инфекционных объектов или аномальных продуктов жизнедеятельности клеток организма, например, характерных для клеток злокачественных новообразований. Значительная часть антигенов является белками, и различия в антигенных свойствах отражают изменения в первичных структурах этих белков в области антигенных детерминант. Наличие таких различий автоматически означает и различие в соответствующих участках генов, т.е. молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или информационных матричных рибонуклеиновых кислот (РНК), кодирующих образование этих белков. В этих случаях узнавание антигенов с помощью иммунохимических методов может быть заменено узнаванием соответствующих участков нуклеиновых кислот [9]. С этой целью может быть использовано уникальное свойство последних образовывать специфические комплексы с нуклеиновыми же кислотами, имеющими комплементарные к ним последовательности. Свойство комплементарности было впервые сформулировано Уотсоном и Криком в 1953 г., когда они предложили пространственную структуру ДНК в виде двойной спирали, т.е. двух полимерных полинуклеотидных цепей, образующих две спирали, навитые вокруг общей оси. Проведенный ими стереохимический анализ показал, что две цепи будут стабилизированы в единой структуре, если они устроены так, что против каждого остатка аденина и цитозина одной цепи находятся соответственно тимин и гуанин в другой. При этом создаются особо благоприятные условия для образования водородных связей между этими гетероциклическими фрагментами нуклеотидных остатков [10].

Имеющиеся оценки говорят о том, что некоторая последовательность нуклеотидов длиной порядка 20 звеньев может быть с помощью комплементарной последовательности дискриминирована от такой же последовательности, отличающейся всего на один нуклеотид. Такие последовательности получили название ДНК-зондов или РНК-зондов. Поиск определенных нуклеиновых кислот и определение их количества по связыванию с ДНК-зондами получил название гибридизационного анализа [11].

Ключевыми моментами метода гибридизационного анализа нуклеиновых кислот являются техника проведения эксперимента и способы детекции образовавшихся гибридов. Детекция осуществляется с помощью метки, вводимой в ДНК-зонд. Чаще всего

32 125 35 в качестве меток используют радиоактивные изотопы Р, I, Б. Однако, такие зонды нестабильны, небезопасны в работе, дорогостоящи [12]. Эти недостатки ограничивают возможность применения данного способа визуализации реакции гибридизации, особенно в диагностических целях. В связи с этим более перспективными являются нерадиактивно меченые зонды [13]. Метка, с помощью которой происходит детекция после образования гибридов, может быть введена непосредственно в нуклеотидную последовательность, использующуюся в качестве зондов, но для большинства нерадиоактивных методов характерно использование непрямого мечения зондов. В этом случае в зонд вводят специфические лиганды (метки), а после гибридизации лиганды могут быть обнаружены с помощью лиганд-специфических белков. Наибольшее развитие получили методы, основанные на присоединении к зондам остатков биотина (рис.1.1), т.к. он характеризуется сродством (аффинностью) к белку стрептавидину (1015 М-1) и образует устойчивый комплекс «биотин-стрепта-видин» [14]. Визуализация данного комплекса может быть осуществлена с помощью ферментов, частиц коллоидного золота, ионами европия (Еи+3) и т.д. [15, 16], а также при использовании наполненных флуоресцентным красителем полимерных микросфер с функциональными группами на поверхности, которые могут взаимодействовать с первичными аминогруппами белка (стрептавидина).

Одним из способов детекции биоспецифических реакций «антиген-антитело» и «биотин-стрептавидин» заключается в том, что антиген (антитело) или стрептавидин иммобилизуют на полимерные частицы, в результате чего реакцию между компонентами данных пар, которая в этом случае носит название реакции латексной агглютинации, можно наблюдать визуально [4]. Неудобство визуального наблюдения этой реакции состоит в том, что трудно определить конечную точку реакции, так как обычная полимерная суспензия высоким

СН2)4-С-ОН

Рис.1.1. Биотин. имеет белый цвет, который плохо воспринимается глазом. Для устранения этого недостатка было предложено использовать окрашенные латексы [17], которые позволяют повысить чувствительность метода.

Одним из процессов, во многом определяющим развитие таких заболеваний, как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, является накопление холестерина в плазматических мембранах различных клеток организма. Холестерин (рис. 1.2.) относится к классу стероидов и является одним из важных компонентов биомембран, который играет определяющую роль в их функционировании [18]. Нарушение сбалансированности транспорта холестерина в клетку и из нее служит главной причиной развития атеросклероза [19, 20]. Однако, сведений о количестве и закономерностях распределения холестерина в плазмолемме клеток в норме и при заболевании недостаточно. Известные в настоящее время методы определения либо требуют большого количества биологического материала [21], либо характеризуются низкой специфичностью [22], либо для выявления холестерина необходимо его присутствие в клетке в значительных количествах, [23, 24]. Все это требует создания простого и доступного метода оценки содержания холестерина и изучения его топографии распределения в мембранах клеток.

В начале 20-го века Виндаус открыл, что холестерин образует со стероидным гликозидом - дигитонином (рис 1.3.)- нерастворимый в спиртовых растворах комплекс, содержащий эквимолярные количества обоих компонентов [25]. Реакция комплексообразования обладает высокой стереоспецифичностью [26].

Рис.1.2. Холестерин.

Аддукт холестерина с дигитонином (холестерин-дигитонид) имеет незначительную растворимость. Благодаря этому дигитонин является наиболее подходящим сапонином для осаждения холестерина.

В некоторых работах предпочтительную роль при взаимодействии компонентов аддукта отдают гидрофобному взаимодействию циклопентапергидрофенантренового цикла [27], а в других рассматривают их как соединения включения [28]. Соединения включения

Ксилоза Галактоза Глюкоза

Рис. 1.3. Дигитонин это "комплекс", в котором один компонент "хозяин" образует кристаллическую решетку, имеющую полости в форме длинных туннелей или каналов, в которых располагаются другие молекулы, "гости". Между "гостем" и "хозяином" не образуется ковалентной связи. Если полость в решетке "хозяина" замкнута со всех сторон так, что молекулы "гости" захвачены как в клетке, такие соединения известны как "клатраты" или "клеточные соединения". Соединения включения занимают промежуточное положение между твердыми растворами внедрения и истинными химическими соединениями. Они образуются за счет стереоспецифической комплементарности, т.е.пространственной связи между молекулой или кристаллической решеткой молекулы "хозяина" и молекулой - "гостем". Включаемое вещество по своей пространственной конфигурации должно соответствовать полости "хозяина" [28]. Н Н

Наиболее перспективным представляется создание маркера холестерина, в котором специфический лиганд будет связан с таким носителем, который можно будет непосредственно регистрировать методами электронной микроскопии. В настоящее время в качестве носителей используют макромолекулы (гемоцианин), биологические частицы (вирусы, бактерии), частицы коллоидного золота [29, 30]. В то же время имеются все данные для создания количественного метода определения холестерина в мембранах клеток на основе полимерных носителей, содержащих в своем составе дигитонин, способный специфически связываться с холестерином.